Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
Szükség van egy megbízható in vitro rendszerre, amely pontosan képes reprodukálni a szív fiziológiás környezetét a gyógyszervizsgálatokhoz.Az emberi szívszövettenyésztő rendszerek korlátozott elérhetősége a szívre gyakorolt ​​gyógyszerek hatásának pontatlan értelmezéséhez vezetett.Itt kifejlesztettünk egy szívszövettenyésztési modellt (CTCM), amely elektromechanikusan stimulálja a szívszeleteket, és fiziológiás nyúláson megy keresztül a szívciklus szisztolés és diasztolés fázisában.12 napos tenyésztés után ez a megközelítés részben javította a szívmetszetek életképességét, de nem őrizte meg teljesen szerkezeti integritásukat.Ezért kismolekulájú szűrés után azt találtuk, hogy 100 nM trijódtironint (T3) és 1 μM dexametazont (Dex) a táptalajunkhoz adva 12 napig megőrizte a metszetek mikroszerkezetét.A T3/Dex kezeléssel kombinálva a CTCM rendszer a transzkripciós profilokat, az életképességet, a metabolikus aktivitást és a szerkezeti integritást a friss szívszövetével azonos szinten tartotta 12 napig.Ezenkívül a szívszövet túlzott megnyúlása a tenyészetben hipertrófiás szívjelátvitelt indukál, bizonyítékot szolgáltatva arra, hogy a CTCM képes utánozni a szívfeszülés által kiváltott hipertrófiás állapotokat.Összefoglalva, a CTCM képes modellezni a szív fiziológiáját és patofiziológiáját tenyészetben hosszú időn keresztül, lehetővé téve a megbízható gyógyszerszűrést.
A klinikai kutatások előtt olyan megbízható in vitro rendszerekre van szükség, amelyek pontosan képesek reprodukálni az emberi szív élettani környezetét.Az ilyen rendszereknek utánozniuk kell a megváltozott mechanikai nyújtást, pulzusszámot és elektrofiziológiai tulajdonságokat.Az állatmodelleket általában a szívfiziológia szűrési platformjaként használják, és korlátozott megbízhatósággal tükrözik a gyógyszerek emberi szívre gyakorolt ​​​​hatását1,2.Végső soron az Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) egy olyan modell, amely rendkívül érzékeny és specifikus a különböző terápiás és farmakológiai beavatkozásokra, és pontosan reprodukálja az emberi szív fiziológiáját és patofiziológiáját3.Egy ilyen rendszer hiánya korlátozza a szívelégtelenség új kezelési módjainak felfedezését4,5, és a gyógyszeres kardiotoxicitáshoz vezetett, ami a piacról való kilépés egyik fő oka6.
Az elmúlt évtizedben nyolc nem kardiovaszkuláris gyógyszert vontak ki a klinikai használatból, mert QT-intervallum-megnyúlást okoznak, ami kamrai aritmiához és hirtelen halálhoz vezet7.Így egyre nagyobb szükség van megbízható preklinikai szűrési stratégiákra a kardiovaszkuláris hatékonyság és toxicitás felmérésére.A humán indukált pluripotens őssejt-eredetű kardiomiociták (hiPS-CM) közelmúltban történő alkalmazása a gyógyszerszűrésben és a toxicitási tesztelésben részleges megoldást kínál erre a problémára.A hiPS-CM-ek éretlen természete és a szívszövet többsejtű komplexitásának hiánya azonban ennek a módszernek a fő korlátai.A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy ez a korlátozás részben leküzdhető, ha korai hiPS-CM-et használnak szívszöveti hidrogélek kialakítására röviddel a spontán összehúzódások kezdete után, és fokozatosan növelik az elektromos stimulációt az idő múlásával.Ezek a hiPS-CM mikroszövetek azonban nem rendelkeznek a felnőtt szívizom érett elektrofiziológiai és kontraktilis tulajdonságaival.Ezenkívül az emberi szívszövet szerkezete összetettebb, különböző sejttípusok heterogén keverékéből áll, beleértve az endothel sejteket, neuronokat és stroma fibroblasztokat, amelyeket extracelluláris mátrix fehérjék specifikus készletei kapcsolnak össze.A nem kardiomiocita populációk11, 12, 13 heterogenitása a felnőtt emlősök szívében jelentős akadályt jelent a szívszövet egyedi sejttípusok felhasználásával történő modellezésében.Ezek a fő korlátozások hangsúlyozzák az ép szívizomszövet fiziológiás és patológiás körülmények között történő tenyésztésére szolgáló módszerek kidolgozásának fontosságát.
Az emberi szív tenyésztett vékony (300 µm) metszete az ép emberi szívizom ígéretes modelljének bizonyult.Ez a módszer hozzáférést biztosít az emberi szívszövethez hasonló teljes 3D-s többsejtű rendszerhez.2019-ig azonban a tenyésztett szívmetszetek használatát korlátozta a tenyészet rövid (24 órás) túlélése.Ez számos tényezőnek köszönhető, beleértve a fizikai-mechanikai nyújtás hiányát, a levegő-folyadék határfelületet és az egyszerű közegek használatát, amelyek nem támogatják a szívszövet szükségleteit.2019-ben több kutatócsoport kimutatta, hogy a mechanikai tényezők beépítése a szívszövettenyésztő rendszerekbe meghosszabbíthatja a tenyészet élettartamát, javíthatja a szív expresszióját, és utánozhatja a szívpatológiát.Két elegáns tanulmány 17 és 18 azt mutatja, hogy az egytengelyű mechanikai terhelés pozitív hatással van a szív fenotípusára a tenyésztés során.Ezek a vizsgálatok azonban nem alkalmazták a szívciklus dinamikus háromdimenziós fizikai-mechanikai terhelését, mivel a szívmetszeteket vagy izometrikus húzóerő 17 vagy lineáris auxotóniás terhelés 18 terhelte.A szövetnyújtás ezen módszerei számos szívgén elnyomását vagy a kóros nyújtási válaszokkal kapcsolatos gének túlzott expresszióját eredményezték.Nevezetesen, Pitoulis et al.19 kifejlesztett egy dinamikus szívszelet-tenyésztőfürdőt a szívciklus rekonstrukciójához erőátalakító visszacsatolás és feszültséghajtások segítségével.Bár ez a rendszer pontosabb in vitro szívciklus-modellezést tesz lehetővé, a módszer bonyolultsága és alacsony teljesítménye korlátozza ennek a rendszernek az alkalmazását.Laboratóriumunk a közelmúltban kifejlesztett egy egyszerűsített tenyésztési rendszert, amely elektromos stimulációt és optimalizált táptalajt használ a sertés- és emberi szívszövet metszeteinek életképességének 6 napig tartó megőrzésére20,21.
A jelenlegi kéziratban egy szívszövettenyésztési modellt (CTCM) írunk le, amely a sertésszív olyan metszeteit használja, amelyek humorális jelzéseket tartalmaznak, hogy összefoglalják a háromdimenziós szívfiziológiát és a szívciklus alatti patofiziológiai tágulást.Ez a CTCM olyan szintre növelheti a preklinikai gyógyszer-előrejelzés pontosságát, amelyet korábban soha nem értek el azáltal, hogy költséghatékony, közepes áteresztőképességű szívrendszert biztosít, amely utánozza az emlős szívének fiziológiáját/patofiziológiáját a preklinikai gyógyszertesztekhez.
A hemodinamikai mechanikai jelek kritikus szerepet játszanak a kardiomiociták működésének fenntartásában in vitro 22, 23, 24.Jelenlegi kéziratunkban kifejlesztettünk egy CTCM-et (1a. ábra), amely képes utánozni a felnőtt szívkörnyezetet azáltal, hogy fiziológiás frekvenciákon (1,2 Hz, 72 ütés/perc) elektromos és mechanikus stimulációt indukál.A szövetek túlzott megnyúlásának elkerülése érdekében a diasztolé alatt 3D nyomtatót használtak a szövet méretének 25%-os növelésére (1b. ábra).A C-PACE rendszer által kiváltott elektromos ingerlést úgy időzítették, hogy a szisztolés előtt 100 ms-mal induljon el egy adatgyűjtő rendszer segítségével a szívciklus teljes reprodukálására.A szövettenyésztő rendszer programozható pneumatikus működtetőelemet (LB Engineering, Németország) használ a rugalmas szilikon membrán ciklikus kiterjesztésére, hogy a felső kamrában a szívszeletek tágulását okozza.A rendszer nyomásátalakítón keresztül egy külső levegővezetékre volt csatlakoztatva, amely lehetővé tette a nyomás (± 1 Hgmm) és az idő (± 1 ms) pontos beállítását (1c. ábra).
a Rögzítse a szövetmetszetet a kékkel jelölt 7 mm-es tartógyűrűhöz az eszköz tenyészkamrájában.A tenyészkamrát vékony rugalmas szilikon membrán választja el a légkamrától.Helyezzen egy tömítést az egyes kamrák közé a szivárgás elkerülése érdekében.A készülék fedelén grafitelektródák találhatók, amelyek elektromos stimulációt biztosítanak.b A nagy szöveteszköz, a vezetőgyűrű és a tartógyűrű sematikus ábrázolása.A szövetmetszeteket (barna) a túlméretezett készülékre helyezzük úgy, hogy a vezetőgyűrűt a készülék külső szélén lévő horonyba helyezzük.A vezető segítségével óvatosan helyezze a szövet akril ragasztóval bevont tartógyűrűt a szívszövet szakaszára.c Grafikon, amely az elektromos stimuláció idejét mutatja a légkamra nyomásának függvényében, amelyet egy programozható pneumatikus működtető (PPD) vezérel.Adatgyűjtő eszközt használtak az elektromos stimuláció szinkronizálására nyomásérzékelők segítségével.Amikor a tenyészkamrában a nyomás eléri a beállított küszöböt, impulzusjelet küld a C-PACE-EM, hogy kiváltsa az elektromos stimulációt.d Négy CTCM képe az inkubátor polcán elhelyezve.Négy eszköz csatlakozik egy PPD-hez pneumatikus körön keresztül, és nyomásérzékelőket helyeznek be a hemosztatikus szelepbe, hogy figyeljék a pneumatikus kör nyomását.Minden eszköz hat szövetmetszetet tartalmaz.
Egyetlen pneumatikus működtetővel 4 CTCM eszközt tudtunk vezérelni, amelyek mindegyike 6 szövetmetszetet tudott tárolni (1d. ábra).A CTCM-ben a légkamrában lévő légnyomás a folyadékkamrában szinkron nyomássá alakul, és a szívszelet fiziológiás tágulását idézi elő (2a ábra és 1. kiegészítő film).A szöveti nyúlás értékelése 80 Hgmm-nél.Művészet.a szövetmetszet 25%-os megnyúlását mutatta (2b. ábra).Ez a százalékos nyúlás 2,2–2,3 µm fiziológiás szarkomerhossznak felel meg a normál szívszakasz kontraktilitása esetén17, 19, 25.A szövetek mozgását egyéni kamerabeállításokkal értékeltük (1. kiegészítő ábra).A szövetek mozgásának amplitúdója és sebessége (2c., d. ábra) megfelelt a szívciklus alatti nyúlásnak és a szisztolés és diasztolés idejének (2b. ábra).A szívszövet nyúlása és sebessége a kontrakció és relaxáció során 12 napig állandó maradt a tenyészetben (2f. ábra).Az elektromos stimuláció kontraktilitásra gyakorolt ​​hatásának értékelésére a tenyésztés során kidolgoztunk egy módszert az aktív deformitás meghatározására árnyékolási algoritmus segítségével (kiegészítő 2a, b ábra), és meg tudtuk különböztetni az elektromos stimulációval és anélküli deformációkat.A szív ugyanaz a része (2f. ábra).A vágás mozgatható tartományában (R6-9) az elektromos stimuláció során a feszültség 20%-kal magasabb volt, mint az elektromos stimuláció hiányában, ami az elektromos stimulációnak a kontraktilis funkcióhoz való hozzájárulását jelzi.
A légkamra nyomásának, a folyadékkamra nyomásának és a szövetmozgás méréseinek reprezentatív nyomai megerősítik, hogy a kamra nyomása megváltoztatja a folyadékkamra nyomását, ami a szövetszelet megfelelő mozgását okozza.b A szövetmetszet százalékos megnyúlásának (kék) reprezentatív nyomai, amelyek megfelelnek a százalékos nyúlásnak (narancs).c A szívszelet mért mozgása összhangban van a mozgás mért sebességével.(d) A ciklikus mozgás (kék vonal) és a sebesség (narancssárga pontozott vonal) reprezentatív pályái a szív egy szeletében.e Ciklusidő (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), összehúzódási idő (n = 19 szelet csoportonként), relaxációs idő (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), szövetmozgás (n = 25 ) számszerűsítése.szelet)/csoport különböző sertésekből), szisztolés csúcssebesség (n = 24(D0), 25(D12) szelet/csoport különböző sertésekből) és csúcs relaxációs ráta (n=24(D0), 25(D12) szelet/csoport különböző sertésekből).A kétfarkú Student-féle t-próba egyetlen paraméterben sem mutatott szignifikáns különbséget.f (piros) és (kék) elektromos stimuláció nélküli (kék) szövetmetszetek reprezentatív törzselemzési nyomai, ugyanabból a metszetből származó szövetmetszetek tíz regionális területe.Az alsó panelek az elektromos stimulációval és anélküli szövetmetszetekben mutatkozó feszültség százalékos különbségének számszerűsítését mutatják tíz területen különböző metszetekből. (n = 8 szelet/csoport különböző sertésekből, Kétfarkú Student t-tesztet végeztünk; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 szelet/csoport különböző sertésekből, Kétfarkú Student t-tesztet végeztünk; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,5). (n = 8 metszet/csoport különböző sertésekből, kétfarkú Student-féle t-teszt; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 metszet/csoport, különböző sertésekből, kétfarkú Student-féle t-teszt; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
Korábbi statikus biomimetikus szívszelet-tenyésztő rendszerünkben [20, 21] elektromos stimuláció alkalmazásával és a táptalaj összetételének optimalizálásával 6 napon keresztül megőriztük a szívszeletek életképességét, működését és szerkezeti integritását.10 nap elteltével azonban ezek a számok meredeken csökkentek.Hivatkozunk a korábbi statikus biomimetikus tenyésztési rendszerünkben tenyésztett metszetekre, 20, 21 kontroll körülmények között (Ctrl), és a korábban optimalizált táptalajt használjuk MC-körülményekként és tenyésztésre szimultán mechanikai és elektromos stimulációval (CTCM).hívott .Először is megállapítottuk, hogy az elektromos stimuláció nélküli mechanikus stimuláció nem elegendő a szövetek életképességének 6 napig tartó fenntartásához (kiegészítő 3a, b ábra).Érdekes módon az STCM-et alkalmazó fiziomechanikai és elektromos stimuláció bevezetésével a 12 napos szívmetszetek életképessége ugyanaz maradt, mint a friss szívmetszetekben MS körülmények között, de Ctrl körülmények között nem, amint azt az MTT analízis is mutatja (1. ábra).3a).Ez arra utal, hogy a mechanikus stimuláció és a szívciklus szimulációja kétszer olyan sokáig képes életképesnek tartani a szöveti metszeteket, mint a korábbi statikus tenyésztési rendszerünkben.A szöveti metszetek szerkezeti integritásának felmérése azonban a szív troponin T és connexin 43 immunjelölésével azt mutatta, hogy a connexin 43 expressziója szignifikánsan magasabb volt az MC szövetekben a 12. napon, mint a kontrollokban ugyanazon a napon.Azonban a connexin 43 egységes expressziója és a Z-korong képződése nem maradt meg teljesen (3b. ábra).Mesterséges intelligencia (AI) keretrendszert használunk a szövet szerkezeti integritásának számszerűsítésére26, egy képalapú mélytanulási folyamatot, amely troponin-T és connexin festésen alapul43, hogy automatikusan számszerűsítse a szívszeletek szerkezeti integritását és fluoreszcenciáját a lokalizáció erőssége szempontjából.Ez a módszer egy konvolúciós neurális hálózatot (CNN) és egy mély tanulási keretrendszert használ a szívszövet szerkezeti integritásának megbízható számszerűsítésére automatizált és elfogulatlan módon, a hivatkozásban leírtak szerint.26. Az MC szövet jobb szerkezeti hasonlóságot mutatott a 0. naphoz képest a statikus kontroll metszetekhez képest.Ezenkívül a Masson-féle trikróm festés szignifikánsan alacsonyabb százalékos fibrózist mutatott ki MS-körülmények között, mint a tenyésztés 12. napján a kontroll körülmények között (3c. ábra).Míg a CTCM a 12. napon a szívszövet metszeteinek életképességét a friss szívszövetéhez hasonló szintre növelte, nem javította jelentősen a szívmetszet szerkezeti integritását.
egy oszlopdiagram a friss szívszeletek (D0) vagy szívszelet-tenyészet MTT-életképességének számszerűsítését mutatja 12 napon keresztül statikus tenyészetben (D12 Ctrl) vagy CTCM-ben (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC) < különböző szeletekből #0; 0001 D0-hoz képest és **p < 0,01 D12-hez képest Ctrl). egy oszlopdiagram a friss szívszeletek (D0) vagy szívszelet-tenyészet MTT életképességének számszerűsítését mutatja 12 napon keresztül statikus tenyészetben (D12 Ctrl) vagy CTCM-ben (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) < ANO#0/group tesztet végeztek el különböző ANO#0 szeletekből; .0001 D0-hoz képest és **p < 0,01 D12-hez képest Ctrl).a hisztogram az MTT friss szívmetszetek (D0) vagy a szívmetszet tenyésztésének életképességének számszerűsítését mutatja 12 napig statikus tenyészetben (D12 kontroll) vagy CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-hoz képest és **p < 0,01 D12-hez képest Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测行单向 ANOVA 测试；伌10 测试；与#0#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12アCtrl 相比，**phisztogram, amely az MTT életképességének mennyiségi meghatározását mutatja friss szívmetszetekben (D0) vagy 12 napig statikus tenyészetben tenyésztett szívmetszetekben (D12 kontroll) vagy CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontroll)), 12 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-hoz képest, **p < 0,01 D12-hez képest Ctrl).b Troponin-T (zöld), connexin 43 (piros) és DAPI (kék) frissen izolált szívmetszetekben (D0) vagy statikus körülmények között (Ctrl) vagy CTCM körülmények között (MC) 12 napig tenyésztett szívmetszetekben reprezentatív immunfluoreszcencia képek (üres skála = 100 µm). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia mérése (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas ANOVA tesztet végeznek; ####p < 0,0001 D0-hoz képest és ****p < 0,0001 D0-hoz képest). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia mérése (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeznek; ####p < 0,0001 D0-hoz képest és ****p < 0,001 D1201-hez képest). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 MCпгзо Ctrl 2, (D12) разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравне12). A szívszövet szerkezeti integritásának számszerűsítése mesterséges intelligenciával (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA teszt; ####p < 0,0001 vs. D0 és ****p < 0,001-hez képest).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyutas 且 渔0 #0p0D;#. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) szelet/csoport, mindegyik különböző sertésből, egyirányú 丁渔 ANOVAp0#0####D0; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl MCппр, 7 (D1/2рес1) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению2). Mesterséges intelligencia a szívszövet szerkezeti integritásának számszerűsítésére (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) metszet/csoport különböző sertésekből, egyirányú ANOVA-teszt; ####p<0,0001 vs. .D0 Összehasonlításképpen ****p < 0,0201 D-vel összehasonlítva). c Reprezentatív képek (balra) és mennyiségi meghatározás (jobbra) a Masson-féle trikróm festéssel festett szívszeletekhez (skála = 500 µm) (n = 10 szelet/csoport egyenként különböző sertésből, egyutas ANOVA-tesztet végeznek; Ctrl D < 0,0001-hez képest***p < 0,0001-hez képest). c Reprezentatív képek (balra) és mennyiségi meghatározás (jobbra) a Masson-féle trikróm festéssel festett szívszeletekhez (Scale bare = 500 µm) (n = 10 szelet/csoport egyenként különböző sertésekből, egyutas ANOVA-tesztet végeznek; #### p < 0,000,01-hez képest Ctrl***p < 0,000,01-hez képest). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихром штаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тени0 p10 поронний тени0 p1 поронний тени0 p1 поронний тени0 ANOVA; и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c A Masson-féle trikróm festéssel festett szívmetszetek reprezentatív képei (balra) és mennyiségi meghatározása (jobbra) (bevonat nélküli skála = 500 µm) (n = 10 metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-tesztet végeztünk; #### p < 0 ,0001 Ctrl 0 ,0001 < 0,0001 összehasonlítva a D0 és D0 értékekkel). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（伈右）（裸尺0）（裸尺0）切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 伎D0 相比， 与D1 相比， . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 尸 躸 裦度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 个 个 个 00. ####0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихром ая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью # однофактор; # #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c A Masson-féle trikróm festéssel festett szívmetszetek reprezentatív képei (balra) és mennyiségi meghatározása (jobbra) (vak = 500 µm) (n = 10 metszet/csoport, mindegyik más sertésből, egyirányú varianciaanalízissel tesztelve; ### # p < 0,0001 ***0, 1 összehasonlítva D0-val, 0001 *** 0,2 D0-hoz képest).A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
Feltételeztük, hogy kis molekulák hozzáadásával a táptalajhoz javítható a szívizomsejtek integritása és csökkenthető a fibrózis kialakulása a CTCM tenyésztése során.Ezért a kis molekulákra szűrtük a statikus kontrolltenyészeteinket20, 21 a zavaró tényezők kis száma miatt.Ehhez a szűréshez a dexametazont (Dex), a trijódtironint (T3) és az SB431542-t (SB) választottuk.Ezeket a kis molekulákat korábban hiPSC-CM tenyészetekben használták a szívizomsejtek érésének indukálására a szarkomer hossz, a T-tubulusok és a vezetési sebesség növelésével.Ezenkívül a Dex (egy glükokortikoid) és az SB is ismerten elnyomja a gyulladást29,30.Ezért megvizsgáltuk, hogy ezen kis molekulák egy vagy kombinációja javítja-e a szívszakaszok szerkezeti integritását.A kezdeti szűréshez az egyes vegyületek dózisát a sejttenyésztési modellekben általánosan használt koncentrációk (1 μM Dex27, 100 nM T327 és 2,5 μM SB31) alapján választottuk ki.12 napos tenyésztés után a T3 és a Dex kombinációja optimális kardiomiocita szerkezeti integritást és minimális rostos remodellinget eredményezett (4. és 5. kiegészítő ábra).Ezen túlmenően a T3 és Dex kétszeres vagy kétszeres koncentrációjának használata káros hatásokat váltott ki a normál koncentrációkhoz képest (kiegészítő 6a, b ábra).
A kezdeti szűrést követően 4 tenyésztési körülmény fej-fej összehasonlítását végeztük (4a. ábra): Ctrl: a korábban leírt statikus tenyészetünkben tenyésztett szívmetszetek az optimalizált táptalajunk segítségével;20.21 TD: T3 és Ctrl s Dex hozzáadva szerdán;MC: CTCM-ben tenyésztett szívmetszetek a korábban optimalizált táptalajunk segítségével;és MT: CTCM T3 és Dex hozzáadásával a táptalajhoz.12 napos tenyésztés után az MS és MT szövetek életképessége ugyanaz maradt, mint a friss szövetekben, amelyet MTT vizsgálattal értékeltünk (4b. ábra).Érdekes módon a T3 és Dex hozzáadása a transzwell tenyészetekhez (TD) nem eredményezett szignifikáns javulást az életképességben a Ctrl körülményekhez képest, ami azt jelzi, hogy a mechanikai stimuláció fontos szerepet játszik a szívmetszet életképességének fenntartásában.
egy kísérleti tervdiagram, amely bemutatja a mechanikai stimuláció és a T3/Dex-kiegészítés hatásainak értékelésére használt négy tenyésztési körülményt 12 napon keresztül. b Az oszlopdiagram az életképesség számszerűsítését mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Ctrl, TD, MC és MT), összehasonlítva a friss szívszeletekkel (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) < ANOS/0, #p teszt különböző szeletekből. 0001, ###p < 0,001 D0-hoz képest és **p < 0,01 D12-hez képest Ctrl). b Az oszlopdiagram az életképesség számszerűsítését mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Ctrl, TD, MC és MT), összehasonlítva a friss szívszeletekkel (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) < ANOS/0, #p teszt különböző szeletekből. 0001, ###p < 0,001 a D0-hoz képest és **p < 0,01 a D12 ctrl-hez képest). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 nap вания (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D122 (D12 MT)) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < по сравнению с D0 и **p < 0,01 пнеюю2). b Az oszlopdiagram az életképesség számszerűsítését mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (kontroll, TD, MC és MT), összehasonlítva a friss szívszelvényekkel (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), 12 (D12 MC) különböző szakaszokból ANO #0 p; 01, ###p < 0,001 vs. D0 és **p < 0,01 a D12 Ctrl-hoz képest). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15D)D12D15) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，###p < **0.0001，###p < 丌p01.0.0D01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими со свежими срез0дими срез0д8n), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D12, 0,0001, p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram, amely mind a 4 tenyésztési körülményt (kontroll, TD, MC és MT) mutatja a friss szív metszetekhez (D0) képest (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD és D12 MT), különböző sertésekből 12 (D12 MC) metszet/csoport, egyutas ANOVA teszt; D ####p1<,0.##0p1. **p<0,01 vs. kontroll D12). c Az oszlopdiagram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Ctrl, TD, MC és MT) friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 6 szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-tesztet végeztünk; ###p < 0,001, ***p < 0,2 és 0,2 D0-hoz képest). c Az oszlopdiagram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja a tenyésztés után 12 nappal mind a 4 tenyésztési körülmény között (Ctrl, TD, MC és MT) friss szívszeletekhez (D0) képest (n = 6 szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-tesztet végeztünk; ###p < 0,001, ***p < 0,2 és 0,2 D0-hoz képest). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во вочественную во во4 все (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свежими от разных свежими срезами сердца, ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c A hisztogram a glükózfluxus mennyiségi meghatározását mutatja 12 nappal a tenyésztés után mind a 4 tenyésztési körülmény között (kontroll, TD, MC és MT) friss szívmetszetekkel (D0) összehasonlítva (n = 6 metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-tesztet végeztünk; ###p < 0,001 a D0-hoz és 0.2***01-hez képest). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 儩儹夡夡 相掐2，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 丌 渌 渌 2 0,001，与D0相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片来自 猪试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после култивирования култивирования рования (контроль, TD, MC és MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разныных, от разныных сердца ены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c A glükózfluxus mennyiségi meghatározását 12 nappal a tenyésztést követően mind a 4 tenyésztési körülményre (kontroll, TD, MC és MT) friss szívmetszetekhez (D0) képest (n = 6 metszet/csoport, különböző sertésekből, egyoldalú ANOVA-teszteket végeztek-e, ###p < 0,001***p, 1-hez képest 0,001).d Friss (kék), 12. napon MC (zöld) és 12. napon MT (piros) szövetek törzselemzési diagramja tíz regionális szövetmetszetben (n = 4 szelet/csoport, egyirányú ANOVA teszt; nem volt szignifikáns különbség a csoportok között).e Vulkán diagram, amely eltérően expresszált géneket mutat friss szívmetszetekben (D0) a statikus körülmények között (Ctrl) vagy MT körülmények között (MT) 10-12 napig tenyésztett szívmetszetekhez képest.f Szarkomer gének hőtérképe az egyes tenyésztési körülmények között tenyésztett szívmetszetekhez.A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
A zsírsav-oxidációról a glikolízisre való átállástól való metabolikus függőség a kardiomiociták dedifferenciálódásának egyik jellemzője.Az éretlen szívizomsejtek elsősorban glükózt használnak az ATP-termeléshez, és hipoplasztikus mitokondriumaik vannak kevés cristae-vel5,32.A glükózfelhasználási elemzések azt mutatták, hogy MC és MT körülmények között a glükózfelhasználás hasonló volt a 0. napi szövetekhez (4c. ábra).A Ctrl minták azonban jelentős növekedést mutattak a glükóz felhasználásban a friss szövetekhez képest.Ez azt jelzi, hogy a CTCM és a T3/Dex kombinációja fokozza a szövetek életképességét és megőrzi a 12 napig tenyésztett szívmetszet metabolikus fenotípusát.Ezenkívül a törzselemzés azt mutatta, hogy a törzsi szintek ugyanazok maradtak, mint a friss szívszövetben 12 napig MT és MS körülmények között (4d. ábra).
A CTCM és a T3/Dex általános hatásának elemzésére a szívszelet szövetének globális transzkripciós tájára vonatkozóan RNAseq-t végeztünk mind a négy különböző tenyésztési körülményből származó szívszeleteken (1. kiegészítő adat).Érdekes módon az MT metszetek nagy transzkripciós hasonlóságot mutattak a friss szívszövettel, 13 642 génből csak 16 expresszálódott eltérően.Azonban, amint azt korábban bemutattuk, a Ctrl szeletek 1229 eltérően expresszálódó gént jelenítettek meg 10–12 napos tenyésztés után (4e. ábra).Ezeket az adatokat a szív és a fibroblaszt gének qRT-PCR-je erősítette meg (kiegészítő 7a-c ábra).Érdekes módon a Ctrl szekciók a szív- és sejtciklus gének leszabályozását és a gyulladásos génprogramok aktiválódását mutatták.Ezek az adatok arra utalnak, hogy a dedifferenciálódás, amely általában a hosszú távú tenyésztés után következik be, teljesen gyengül MT körülmények között (kiegészítő 8a, b ábra).A szarkomer gének alapos tanulmányozása azt mutatta, hogy csak MT körülmények között maradnak meg a szarkomert (4f. ábra) és az ioncsatornát (kiegészítő 9. ábra) kódoló gének, ami megvédi őket a Ctrl, TD és MC feltételek melletti elnyomástól.Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mechanikai és humorális stimuláció (T3/Dex) kombinációjával a szívszelet-transzkriptom 12 napos tenyésztés után is hasonló maradhat a friss szívszeletekhez.
Ezeket a transzkripciós megállapításokat alátámasztja az a tény, hogy a szívmetszetekben lévő kardiomiociták szerkezeti integritása MT körülmények között őrzi meg legjobban 12 napig, amint azt az ép és lokalizált 43-as konnexin mutatja (5a. ábra).Ezenkívül a fibrózis a szívmetszetekben MT körülmények között szignifikánsan csökkent a Ctrl-hoz képest, és hasonlóan a friss szívmetszetekhez (5b. ábra).Ezek az adatok azt mutatják, hogy a mechanikai stimuláció és a T3/Dex kezelés kombinációja hatékonyan megőrzi a szív szerkezetét a tenyészetben lévő szívmetszetekben.
a troponin-T (zöld), connexin 43 (piros) és DAPI (kék) reprezentatív immunfluoreszcens képei frissen izolált szívmetszetekben (D0) vagy 12 napig tenyésztve mind a négy szívmetszet tenyésztési körülmény között (skála = 100 µm).). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia mérése (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeznek; ####p < 0,0001 összehasonlítva D0 és *5 < 0,0 és *5 < 0,01 értékkel. ). A szívszövet szerkezeti integritásának mesterséges intelligencia mérése (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) szelet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA tesztet végeznek; #### p < 0,0001 D0 és *5 < 0,0001 összehasonlításban D0 és *5p < 0,0. ). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 71D,2D10) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению <****01 п0,0 ио5p с D0 п0,0 сравнению с D12 Ctrl). A szívszövet szerkezeti integritásának számszerűsítése mesterséges intelligencia segítségével (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) metszet/csoport különböző sertésekből, egyutas ANOVA-teszt elvégzve; ##****## p < 0,0001 D0-hoz képest és *p < 0,0-hoz képest *p < 0,0.0).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、、5（D12 TD、D12 MC 和焺区蛺和D12 MT（工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000112比对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc12 mc工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 盔 咸*p < 0.05；相比）.A szívszövet szerkezeti integritásának számszerűsítése mesterséges intelligencia segítségével különböző sertésekben (n = 7 (D0 és D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC és D12 MT) metszet/csoport) egyutas ANOVA teszttel;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 D0-hoz képest és *p < 0,05 vagy ****p < 0,0001 D12-hez képest Ctrl). b Reprezentatív képek és számszerűsítés a Masson-féle trikróm festéssel festett szívszeletekhez (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) szelet/csoport elvégzése különböző sertésekből származó <0 #0 #0 teszt; D0 és ***p < 0,001, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hoz képest). b Reprezentatív képek és számszerűsítés a Masson-féle trikróm festéssel festett szívszeletekhez (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) szelet/csoport elvégzése különböző sertésekből származó <0 #0 #0 teszt; D0 és ***p < 0,001, vagy ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hoz képest). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителеным красителеным ка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется #0, выполняется #0#0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b A Masson-féle trikróm festéssel festett szívmetszetek reprezentatív képei és mennyiségi meghatározása (skála sáv = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) metszet/csoport különböző sertésekből, egyirányú D*** v.0.0VA és <##s#0#p.1; 0,001 vagy ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm（D01＀nD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析，方差分析；方差分析；####p0D12. 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 100 µ0 n = 100 µm ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 组，进行单因素方差单因素方差 <䯁因素方差 #. ***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом = Массца (тим0ромом Массца) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ*** ANOVA; ####p < не 0,0,0сра1 пе0,0юсрас ,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b A Masson-féle trikrómmal festett szívmetszetek reprezentatív képei és mennyiségi meghatározása (skála sáv = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD és D12 MC), 9 (D12 MT) metszet különböző sertésekből/csoport, egy ANOVA-módszer ***0-hoz képest 0,1-hez képest #0,0.1. ****p < 0,0001 a D12 Ctrl-hoz képest).A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
Végül a CTCM szívhipertrófiát utánzó képességét a szívszövet megnyúlásának növelésével értékelték.A CTCM-ben a légkamra csúcsnyomása 80 Hgmm-ről 80 Hgmm-re nőtt.Művészet.(normál nyúlás) 140 Hgmm-ig Cikksz.(6a. ábra).Ez a nyújtás 32%-os növekedésének felel meg (6b. ábra), amelyet korábban a hipertrófiában tapasztalthoz hasonló szarkomerhossz eléréséhez szükséges megfelelő százalékos nyúlásként mutattak be.A szívszövet nyúlása és sebessége a kontrakció és relaxáció során állandó maradt a tenyésztés hat napja alatt (6c. ábra).Az MT állapotokból származó szívszövetet normál nyújtásnak (MT (normál)) vagy túlnyúlásnak (MT (OS)) vetettük alá hat napon keresztül.Már négy nap tenyésztés után az NT-ProBNP hipertrófiás biomarker szignifikánsan megemelkedett a tápközegben MT (OS) körülmények között, összehasonlítva MT (normál) körülményekkel (7a. ábra).Ezenkívül hatnapos tenyésztés után a sejtméret az MT-ben (OS) (7b. ábra) szignifikánsan megnőtt az MT szív metszeteihez képest (normál).Ezenkívül az NFATC4 nukleáris transzlokációja jelentősen megnövekedett a túlfeszített szövetekben (7c. ábra).Ezek az eredmények a hiperdisztencia utáni patológiás remodelling progresszív fejlődését mutatják, és alátámasztják azt az elképzelést, hogy a CTCM eszköz platformként használható a nyújtás által kiváltott szívhipertrófia jelátvitel tanulmányozására.
A légkamra nyomásának, a folyadékkamra nyomásának és a szövetmozgás méréseinek reprezentatív nyomai megerősítik, hogy a kamra nyomása megváltoztatja a folyadékkamra nyomását, ami a szövetszelet megfelelő mozgását okozza.b Reprezentatív nyúlási százalékos és nyújtási sebességgörbék normálisan megnyúlt (narancssárga) és túlnyúlt (kék) szövetmetszetekhez.c Oszlopdiagram, amely mutatja a ciklusidőt (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), az összehúzódási időt (n = 18-19 szelet csoportonként, különböző sertésekből), a relaxációs időt (n = 19 szelet csoportonként, különböző sertésekből) ), a szövetmozgás amplitúdóját (n = 14 szelet/csoport), a borsó sebessége = 1 különböző sertésből/csoport sertés) és csúcsrelaxációs rátája (n = 14 (D0), 15 (D6) ) metszet/csoport) különböző sertésekből), a kétfarkú Student-féle t-teszt egyetlen paraméterben sem mutatott ki szignifikáns különbséget, ami azt jelzi, hogy ezek a paraméterek állandóak maradtak 6 napos tenyésztés során túlfeszültség mellett.A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
az NT-ProBNP koncentrációjának oszlopdiagramja a tápközegben MT normál nyújtás (Norm) vagy túlfeszítés (OS) körülmények között tenyésztett szívszeletekből (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből, összehasonlítva a 0-val normál 0-val, 0 . az NT-ProBNP koncentrációjának oszlopdiagramja a tápközegben, MT normál nyújtás (Norm) vagy túlfeszítés (OS) körülmények között tenyésztett szívszeletekből (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4 MTOS) szelet/csoport összehasonlítása különböző sertésekből, **p ANO-val <0;0; 0,0, kétirányú).Az NT-ProBNP koncentrációjának kvantitatív hisztogramja táptalajban normál MT stretch (norm) vagy overstretch (OS) körülmények között tenyésztett szívszeletekből (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm és D4).MTOS) szelet / csoport különböző sertésekből, kétfaktoros varianciaanalízis;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析，p < 0,01）. az NT-ProBNP koncentrációjának mennyiségi meghatározása MT normál nyújtás (Norm) vagy overstretch (OS) körülmények között tenyésztett szívszeletekben (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) különböző 猪的幇片䏐叐幌叐䏐双动; **a normál nyújtással összehasonlítva, p < 0,01).hisztogram Az NT-ProBNP koncentrációjának mennyiségi meghatározása normál MT stretch (norm) vagy túlnyúlás (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) és D4 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből származó szívszeletekben, kétirányú varianciaanalízis;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 a normál nyújtáshoz képest). b Reprezentatív képek a troponin-T-vel és WGA-val festett szívszeletekhez (balra) és a sejtméret mennyiségi meghatározásához (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző szeletből, különböző sertésekből, Kétfarkú Student t-tesztet összehasonlítunk 0 normál értékkel; ****0p <1). b Reprezentatív képek a troponin-T-vel és WGA-val festett szívszeletekhez (balra) és a sejtméret mennyiségi meghatározásához (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző szeletből, különböző sertésekből, Kétfarkú Student t-tesztet összehasonlítunk 0 normál értékkel. ****0p <1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количентативные изображения срезов сердца ва) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится, два- проводится ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentatív képek a troponin-T-vel és AZP-vel festett szívmetszetekről (balra) és a sejtméret kvantifikációjáról (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sejt/csoport 10 különböző metszetből, különböző sertésekből, kétfarkú Student-féle t-tesztet 0-hoz viszonyítottunk, 0-0 strin1-hez. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片片的代脏切片的代辨揃30D OS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学玌有尾学生t比，****p < 0,0001）. b Reprezentatív képek calcarein-T-vel és WGA-val festett szívszeletekről (balra) és sejtméretről (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 különböző szeletből (D6 MTNorm)). 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественкаn (количественкаn) срезов сердца = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, ****тьа, 0 двусторонние критю по1,0 денСритери; сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T-vel és AZP-vel festett szívmetszetek reprezentatív képei (balra) és a sejtméret mennyiségi meghatározása (jobbra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 különböző metszetből, különböző sertésekből) Sejtek/csoport, kétfarkú kritérium Student's t;****p < 0,0001 a normál törzshez képest). c Reprezentatív képek a 0. és a 6. napon troponin-T-re és NFATC4-re immunjelölt MTOS szívszeletekre, valamint az NFATC4 transzlokációjának kvantifikálása a CM-ek magjaiba (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) szelet/csoport különböző diáksertésekből, *t-teszt 0.0 ; c Reprezentatív képek a 0. és a 6. napi MTOS szívszeletek troponin-T-re és NFATC4-re immunjelölve, valamint az NFATC4 transzlokációjának kvantifikálása a CM-ek magjaiba (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből , *t-ptai <0 ; c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т иммуномеченых для тропонина-Т и нерастина, ченерастина слокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свинерихдрийстояСннияетсо *p < 0,05). c Reprezentatív képek szívmetszetekről 0 és 6 napos MTOS-nél, troponin-T-re és NFATC4-re immunjelölve, valamint az NFATC4 transzlokáció kvantifikálása a barlangos sejtek magjában (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) szelet/csoport különböző sertésekből) két-ttai tesztet végzett Student;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第 6 天 和第 天 和第 天 和第 天 和第 天 于 䌼卪 表 性 图的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 曂〼 5 p) 0. c Reprezentatív képek a calcanin-T és az NFATC4 immunjelölő 第0天和第6天MTOS szívszeletekről, valamint az NFATC4 különböző NFATC4 易位至CM sejtmagból的quantity化 (n = 4 (D0), 痴凤 3, 涴 MTOS 3)双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропониномаркировки тропонином-Т и NFATCражения срезов сердца MTOS кации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюде <, Стьюде <, Стьюде). c Reprezentatív képek az MTOS szívszeletekről a 0. és 6. napon a troponin-T és NFATC4 immunjelöléshez és az NFATC4 transzlokáció mennyiségi meghatározásához a CM sejtmagjában különböző sertésekből (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) szelet/csoport, kétfarkú t.0 ;A hibasávok az átlagot ± szórást jelentik.
A transzlációs kardiovaszkuláris kutatásokhoz olyan sejtmodellek szükségesek, amelyek pontosan reprodukálják a szív környezetét.Ebben a tanulmányban egy CTCM-eszközt fejlesztettek ki és jellemeztek, amely képes stimulálni a szív ultravékony szakaszait.A CTCM rendszer fiziológiailag szinkronizált elektromechanikus stimulációt és T3 és Dex folyadékdúsítást tartalmaz.Amikor a sertés szívmetszeteit e tényezők hatásának tették ki, életképességük, szerkezeti integritásuk, metabolikus aktivitásuk és transzkripciós expressziójuk ugyanaz maradt, mint a friss szívszövetben 12 napos tenyésztés után.Ezenkívül a szívszövet túlzott megnyúlása a szív hipertrófiáját okozhatja, amelyet hiperextenzió okoz.Összességében ezek az eredmények alátámasztják a fiziológiás tenyésztési körülmények kritikus szerepét a normális szívfenotípus fenntartásában, és platformot biztosítanak a gyógyszerszűréshez.
Számos tényező járul hozzá a kardiomiociták működéséhez és túléléséhez szükséges optimális környezet megteremtéséhez.E tényezők közül a legnyilvánvalóbbak (1) intercelluláris kölcsönhatásokhoz, (2) elektromechanikus stimulációhoz, (3) humorális faktorokhoz és (4) metabolikus szubsztrátokhoz kapcsolódnak.A fiziológiás sejt-sejt kölcsönhatásokhoz több sejttípus komplex, háromdimenziós hálózatára van szükség, amelyet egy extracelluláris mátrix támogat.Az ilyen összetett sejtkölcsönhatások nehezen rekonstruálhatók in vitro az egyes sejttípusok együtt tenyésztésével, de könnyen megvalósíthatók a szívmetszetek organotípusos természetével.
A kardiomiociták mechanikus nyújtása és elektromos stimulációja kritikus fontosságú a szív fenotípusának fenntartásához33, 34, 35.Míg a mechanikai stimulációt széles körben alkalmazzák a hiPSC-CM kondicionálására és érlelésére, a közelmúltban számos elegáns tanulmány kísérletet tett a szívszeletek mechanikai stimulálására egytengelyű terhelés alkalmazásával.Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy a 2D egytengelyű mechanikai terhelés pozitív hatással van a szív fenotípusára a tenyésztés során.Ezekben a vizsgálatokban a szív szakaszait vagy izometrikus húzóerőkkel17, vagy lineáris auxotóniás terhelésekkel18 terhelték, vagy pedig a szívciklust erőátalakító visszacsatolás és feszültséghajtások segítségével hozták létre.Ezek a módszerek azonban egytengelyű szövetnyúlást alkalmaznak környezeti optimalizálás nélkül, ami számos szívgén elnyomását vagy a kóros nyúlási válaszokkal kapcsolatos gének túlzott expresszióját eredményezi.Az itt leírt CTCM olyan 3D elektromechanikus ingert biztosít, amely a természetes szívciklust utánozza a ciklusidő és a fiziológiás nyúlás tekintetében (25% nyújtás, 40% szisztolés, 60% diasztolés és 72 ütés percenként).Bár ez a háromdimenziós mechanikai stimuláció önmagában nem elegendő a szövetek integritásának fenntartásához, a humorális és mechanikai stimuláció kombinációja T3/Dex használatával szükséges a szövetek életképességének, működésének és integritásának megfelelő fenntartásához.
A humorális tényezők fontos szerepet játszanak a felnőtt szív fenotípusának módosításában.Ezt hangsúlyozták a HiPS-CM vizsgálatok, amelyekben T3-at és Dex-et adtak a táptalajhoz a sejtek érésének felgyorsítása érdekében.A T3 befolyásolhatja az aminosavak, cukrok és kalcium szállítását a sejtmembránokon keresztül36.Ezenkívül a T3 elősegíti az MHC-α expresszióját és az MHC-β leszabályozását, elősegítve a gyors rángatózású myofibrillumok képződését érett kardiomiocitákban, összehasonlítva a magzati CM lassú rángatózó miofibrillumaival.A hypothyreosisban szenvedő betegek T3 hiánya a myofibrilláris sávok elvesztését és a tónusfejlődés csökkenését eredményezi37.A Dex a glükokortikoid receptorokra hat, és kimutatták, hogy növeli a szívizom kontraktilitását izolált perfundált szívekben;38 ez a javulás a kalciumlerakódás-vezérelt belépésre (SOCE) 39,40 kifejtett hatásnak tulajdonítható.Ezenkívül a Dex a receptoraihoz kötődik, és széles intracelluláris választ okoz, amely elnyomja az immunfunkciót és a gyulladást30.
Eredményeink azt mutatják, hogy a fizikai mechanikai stimuláció (MS) javította az általános tenyésztési teljesítményt a Ctrl-hoz képest, de nem tudta fenntartani az életképességet, a szerkezeti integritást és a szív expresszióját 12 napon keresztül a tenyészetben.A Ctrl-hoz képest a T3 és Dex hozzáadása a CTCM (MT) tenyészetekhez javította az életképességet, és hasonló transzkripciós profilokat, szerkezeti integritást és metabolikus aktivitást tartott fenn friss szívszövettel 12 napig.Ezen túlmenően a szöveti nyúlás mértékének szabályozásával az STCM segítségével egy hiperextenzió által kiváltott szívhipertrófia modellt hoztak létre, amely szemlélteti az STCM rendszer sokoldalúságát.Meg kell jegyezni, hogy bár a szív remodellációja és fibrózisa általában érintetlen szerveket érint, amelyek keringő sejtjei biztosítják a megfelelő citokineket, valamint fagocitózist és egyéb remodelling faktorokat, a szív egyes szakaszai továbbra is utánozhatják a fibrotikus folyamatot stresszre és traumára adott válaszként.miofibroblasztokba.Ezt korábban ebben a szívszelet modellben értékelték.Meg kell jegyezni, hogy a CTCM paraméterei a nyomás/elektromos amplitúdó és frekvencia változtatásával modulálhatók, hogy szimuláljanak számos állapotot, például tachycardiát, bradycardiát és mechanikus keringési támogatást (mechanikus terheletlen szív).Ez a rendszert közepes teljesítményűvé teszi a kábítószer-tesztek számára.A CTCM azon képessége, hogy modellezi a túlfeszültség által kiváltott szívhipertrófiát, megnyitja az utat e rendszer személyre szabott terápia céljából történő teszteléséhez.Összefoglalva, a jelen tanulmány azt mutatja, hogy a mechanikus nyújtás és a humorális stimuláció kritikus fontosságú a szívszöveti metszetek tenyésztésének fenntartásához.
Bár az itt bemutatott adatok azt sugallják, hogy a CTCM nagyon ígéretes platform az ép szívizom modellezésére, ennek a tenyésztési módszernek vannak bizonyos korlátai.A CTCM tenyészet fő korlátja, hogy folyamatos dinamikus mechanikai feszültségeket ró a szeletekre, ami kizárja a szívszelet-összehúzódások aktív nyomon követését minden egyes ciklus során.Ezenkívül a szívszakaszok kis mérete (7 mm) miatt korlátozott a szisztolés funkció értékelése a tenyésztési rendszereken kívül hagyományos erőérzékelőkkel.A jelenlegi kéziratban részben leküzdjük ezt a korlátot, ha az optikai feszültséget a kontraktilis funkció indikátoraként értékeljük.Ez a korlátozás azonban további munkát igényel, és a jövőben orvosolni lehet a szívszeletek működésének optikai megfigyelésére szolgáló módszerek bevezetésével a tenyészetben, például optikai térképezéssel kalcium- és feszültségérzékeny festékek használatával.A CTCM másik korlátja, hogy a működő modell nem manipulálja a fiziológiai stresszt (elő- és utóterhelés).A CTCM-ben a nyomást ellentétes irányban indukálták, hogy a 25%-os fiziológiás nyúlást reprodukálják a diasztoléban (teljes nyújtás) és a szisztoléban (az összehúzódás hossza az elektromos stimuláció során) nagyon nagy szövetekben.Ezt a korlátozást a jövőbeni CTCM-tervekben meg kell szüntetni a szívszövetre mindkét oldalról gyakorolt ​​megfelelő nyomással, és a szív kamráiban előforduló pontos nyomás-térfogat összefüggések alkalmazásával.
Az ebben a kéziratban közölt túlnyúlás által kiváltott remodelling a hipertrófiás hipersztrekciós jelek utánzására korlátozódik.Így ez a modell segíthet a nyújtás által kiváltott hipertrófiás jelátvitel vizsgálatában, anélkül, hogy humorális vagy neurális tényezőkre lenne szükség (amelyek ebben a rendszerben nem léteznek).További vizsgálatok szükségesek a CTCM multiplicitásának növeléséhez, például az immunsejtekkel való együtttenyésztés, a keringő plazma humorális faktorok és a beidegzés neuronális sejtekkel történő együtttenyésztés esetén javítja a CTCM-mel történő betegségmodellezés lehetőségeit.
Tizenhárom sertést használtunk ebben a vizsgálatban.Az összes állatkísérletet az intézményi irányelveknek megfelelően hajtották végre, és a Louisville Egyetem Intézményi Állatgondozási és -használati bizottsága jóváhagyta.Az aortaívet leszorítottuk, és a szívet 1 liter steril cardioplegiával perfundáltuk (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH 7,4-ig); a szíveket jéghideg cardioplegic oldatban tároltuk, amíg jégen nem szállították a laborba, ami általában <10 perc. a szíveket jéghideg cardioplegic oldatban tároltuk, amíg jégen nem szállították a laborba, ami általában <10 perc. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обынично <br> a szíveket jéghideg kardioplegiás oldatban tároltuk a laboratóriumba jeges szállításig, ami általában kevesebb mint 10 percig tart.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. A szíveket jégen tartsa cardioplegia, amíg el nem szállítják jégen a laboratóriumba, általában <10 perc.
A CTCM eszközt a SolidWorks számítógéppel segített tervező (CAD) szoftverben fejlesztették ki.A tenyésztőkamrák, osztók és légkamrák CNC átlátszó akril műanyagból készülnek.A 7 mm átmérőjű támasztógyűrű középen nagy sűrűségű polietilénből (HDPE) készült, és van egy O-gyűrű-horony, amely az alatta lévő adathordozó tömítésére használt szilikon O-gyűrűhöz illeszkedik.Vékony szilícium-dioxid membrán választja el a tenyészkamrát az elválasztó lemeztől.A szilikon membrán lézerrel van vágva 0,02" vastag szilikon lapból, keménysége 35 A.Az alsó és felső szilikon tömítések lézerrel vannak vágva 1/16" vastag szilikon lapból, keménységük pedig 50 A.A 316L-es rozsdamentes acél csavarok és szárnyas anyák a blokk rögzítésére és a légmentes tömítés kialakítására szolgálnak.
A dedikált nyomtatott áramköri lapot (PCB) úgy tervezték, hogy integrálható legyen a C-PACE-EM rendszerrel.A NYÁK-on található svájci gépi csatlakozóaljzatok ezüstözött rézhuzalokkal és az elektródákba csavart bronz 0-60 csavarokkal csatlakoznak a grafitelektródákhoz.A nyomtatott áramköri lapot a 3D nyomtató fedelébe helyezzük.
A CTCM eszközt egy programozható pneumatikus működtető (PPD) vezérli, amely a szívciklushoz hasonló szabályozott keringési nyomást hoz létre.A légkamrában lévő nyomás növekedésével a rugalmas szilikon membrán felfelé tágul, és a közeget a szövet helye alá kényszeríti.Ezután a szövet területe megnyúlik a folyadék kilökésével, ami utánozza a szív fiziológiás tágulását a diasztolé alatt.A relaxáció csúcsán grafitelektródákon keresztül elektromos stimulációt alkalmaztak, ami csökkentette a légkamrában uralkodó nyomást és a szövetmetszetek összehúzódását okozta.A cső belsejében van egy hemosztatikus szelep nyomásérzékelővel, amely érzékeli a légrendszerben lévő nyomást.A nyomásérzékelő által érzékelt nyomás a laptophoz csatlakoztatott adatgyűjtőre kerül.Ez lehetővé teszi a nyomás folyamatos ellenőrzését a gázkamrában.Amikor elérte a maximális kamranyomást (standard 80 Hgmm, 140 Hgmm OS), az adatgyűjtő eszközt arra utasították, hogy küldjön egy jelet a C-PACE-EM rendszernek, hogy 2 ms-ig kétfázisú feszültségjelet generáljon, 4 V-ra állítva.
Szívmetszeteket vettünk, és a tenyésztési körülményeket 6 lyukban a következőképpen végeztük el: Tegyük át a begyűjtött szíveket az átvivőedényből egy hideg (4 °C) cardioplegiát tartalmazó tálcára.A bal kamrát steril pengével izoláltuk és 1-2 cm3-es darabokra vágtuk.Ezeket a szövetblokkokat szövetragasztóval szövethordozókhoz rögzítettük, és Tyrode-oldatot tartalmazó vibráló mikrotomos szövetfürdőbe helyeztük, és folyamatosan oxigénnel (3 g/l 2,3-butándion-monooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM gluszén (0,447 mM gluszén (D-1047 g), m-ES 10 M1)) 2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M oldat), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M oldat), 1 liter ddH2O-ig.A vibrációs mikrotomot úgy állítottuk be, hogy 300 µm vastag szeleteket vágjon 80 Hz-es frekvenciával, 2 mm-es vízszintes vibrációs amplitúdóval és 0,03 mm/s sebességgel.A szövetfürdőt jéggel vettük körül, hogy az oldatot hidegen tartsuk, és a hőmérsékletet 4 °C-on tartjuk.Vigyük át a szövetmetszeteket a mikrotomfürdőből egy folyamatosan oxigénezett Tyrode oldatot tartalmazó inkubációs fürdőbe jégen, amíg elegendő metszetet nem kapunk egy tenyésztőlemezhez.Transwell tenyészetekhez a szövetmetszeteket steril, 6 mm széles poliuretán hordozóra rögzítettük, és 6 ml optimalizált táptalajba helyeztük (199 táptalaj, 1x ITS-kiegészítő, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkáli és 2x antibiotikum-gombaellenes).Elektromos stimulációt (10 V, frekvencia 1,2 Hz) alkalmaztunk a szövetmetszeteken a C-Pace segítségével.A TD körülményekhez friss T3-at és Dexet adtunk 100 nM és 1 μM koncentrációban minden táptalajcsere alkalmával.A táptalajt naponta háromszori csere előtt oxigénnel telítjük.A szövetmetszeteket inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on és 5% CO2 mellett.
A CTCM tenyészetekhez a szövetmetszeteket egy egyedi készítésű 3D nyomtatóra helyezték egy Petri-csészében, amely módosított Tyrode-oldatot tartalmazott.Az eszközt úgy tervezték, hogy a szívszelet méretét a tartógyűrű területének 25%-ával növelje.Ez azért történik, hogy a szív szakaszai ne nyúljanak meg a Tyrode-oldatból a tápközegbe való áthelyezés után és a diasztolé alatt.Hisztoakril ragasztóval 300 µm vastag metszeteket rögzítettünk egy 7 mm átmérőjű tartógyűrűre.Miután a szövetmetszeteket a tartógyűrűhöz rögzítette, vágja le a felesleges szövetmetszeteket, és helyezze vissza a hozzácsatolt szövetmetszeteket a Tyrode oldatos jégfürdőbe (4°C), amíg elegendő metszet nem készül egy eszközhöz.Az összes eszköz teljes feldolgozási ideje nem haladhatja meg a 2 órát.Miután 6 szövetmetszetet rögzítettek a tartógyűrűjükhöz, a CTCM eszközt összeállítottuk.A CTCM tenyészkamra előre meg van töltve 21 ml előre oxigénezett tápközeggel.Vigye át a szövetmetszeteket a tenyészkamrába, és pipettával óvatosan távolítsa el a légbuborékokat.Ezután a szövetmetszetet a lyukba vezetik, és finoman a helyére nyomják.Végül helyezze az elektróda kupakját a készülékre, és vigye át az eszközt az inkubátorba.Ezután csatlakoztassa a CTCM-et a levegőcsőhöz és a C-PACE-EM rendszerhez.A pneumatikus működtető kinyílik, és a levegőszelep kinyitja a CTCM-et.A C-PACE-EM rendszert úgy konfigurálták, hogy 4 V feszültséget adjon le 1,2 Hz-en kétfázisú ingerlés közben 2 ms-ig.A tápközeget naponta kétszer, az elektródákat pedig naponta egyszer cseréltük, hogy elkerüljük a grafit felhalmozódását az elektródákon.Ha szükséges, a szövetmetszeteket ki lehet venni a tenyésztő lyukakból, hogy az alájuk esett légbuborékokat eltávolítsák.Az MT-kezelés körülményeihez a T3/Dex-et frissen adtuk hozzá minden táptalajcsere alkalmával 100 nM T3 és 1 µM Dex mellett.A CTCM eszközöket inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on és 5% CO2-on.
A szívszeletek nyújtott pályáinak eléréséhez speciális kamerarendszert fejlesztettek ki.Tükörreflexes fényképezőgépet (Canon Rebel T7i, Canon, Tokió, Japán) használtak Navitar Zoom 7000 18-108 mm-es makró objektívvel (Navitar, San Francisco, CA).A vizualizációt szobahőmérsékleten végeztük, miután a tápközeget friss táptalajra cseréltük.A kamera 51°-os szögben van elhelyezve, a videófelvétel pedig 30 képkocka/másodperc sebességgel történik.Először nyílt forráskódú szoftvert (MUSCLEMOTION43) használtak az Image-J-vel a szívszeletek mozgásának számszerűsítésére.A maszkot a MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) segítségével hozták létre, hogy meghatározzák a dobogó szívszeletek számára érdekes régiókat a zaj elkerülése érdekében.A manuálisan szegmentált maszkokat a rendszer egy keretsorozatban lévő összes képre alkalmazza, majd átadja a MUSCLEMOTION beépülő modulnak.A Muscle Motion az egyes képkockákban lévő pixelek átlagos intenzitását használja a referencia képkockához viszonyított mozgásának számszerűsítésére.Az adatokat rögzítettük, szűrtük, és a ciklusidő számszerűsítésére, valamint a szívciklus alatti szöveti nyúlás értékelésére használtuk.A rögzített videó utófeldolgozása elsőrendű nulla fázisú digitális szűrővel történt.A szöveti nyúlás (csúcstól csúcsig) mennyiségi meghatározásához csúcstól csúcsig analízist végeztünk, hogy megkülönböztessük a rögzített jel csúcsait és mélypontjait.Ezen túlmenően a detrendelés egy 6. rendű polinom segítségével történik a jeleltolódás kiküszöbölésére.A programkódot a MATLAB-ban fejlesztették ki a globális szövetmozgás, a ciklusidő, a relaxációs idő és az összehúzódási idő meghatározására (44-es kiegészítő programkód).
A nyúláselemzéshez ugyanazokat a videókat használva, amelyeket a mechanikai nyújtásértékeléshez készítettünk, először a MUSCLEMOTION szoftverrel két mozgáscsúcsot (a legmagasabb (felső) és legalacsonyabb (alsó) mozgáspontokat ábrázoló képet követtünk nyomon.Ezután szegmentáltuk a szöveti régiókat, és egyfajta árnyékolási algoritmust alkalmaztunk a szegmentált szövetre (2a. Kiegészítő ábra).A szegmentált szövetet ezután tíz alfelületre osztottuk, és az egyes felületeken jelentkező feszültséget a következő egyenlettel számítottuk ki: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ahol a Sup és Sdown az alakzat távolsága a szövet felső és alsó árnyékától (2b kiegészítő ábra).
A szívmetszeteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 48 órán keresztül.A rögzített szöveteket 10%-os és 20%-os szacharózban dehidratáltuk 1 órán át, majd 30%-os szacharózban egy éjszakán át.A metszeteket ezután optimális vágási hőmérsékletű keverékbe (OCT-vegyület) ágyaztuk, és fokozatosan lefagyasztottuk izopentán/szárazjég fürdőben.Tárolja az OCT beágyazó blokkokat -80 °C-on az elválasztásig.A tárgylemezeket 8 μm vastagságú metszetként készítettük el.
Az OCT szívmetszetről való eltávolításához melegítse a tárgylemezeket fűtőblokkon 95 °C-on 5 percig.Adjon hozzá 1 ml PBS-t minden tárgylemezhez, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, majd permeálja át a metszeteket úgy, hogy 0,1% Triton-X-et PBS-ben 15 percig szobahőmérsékleten állít be.A nem specifikus antitestek mintához való kötődésének megakadályozása érdekében adjon hozzá 1 ml 3%-os BSA-oldatot a tárgylemezekhez, és inkubálja 1 órán át szobahőmérsékleten.A BSA-t ezután eltávolítottuk, és a lemezeket PBS-sel mostuk.Jelölje meg az egyes mintákat ceruzával.Primer antitesteket (1:200 arányban hígítva 1%-os BSA-val) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) és troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) adtunk hozzá 90 perc alatt, majd másodlagos hígítást 1:20%-ban használt 1 ellen. a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), nyúl Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) ellen további 90 percig. Háromszor mostuk PBS-sel A célfestés és a háttér megkülönböztetése érdekében csak a másodlagos antitestet használtuk kontrollként. Végül DAPI-t adtunk a sejtmagba, és a vektorba helyeztük a vektorokat és a vektorokat ed körömlakkal. -x nagyítás) és Keyence mikroszkóp 40x nagyítással.
WGA-Alexa Fluor 555-öt (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml PBS-ben használtunk a WGA festéshez, és szobahőmérsékleten 30 percig rögzített metszetekre vittük fel.A lemezeket ezután PBS-sel mostuk, és szudánfeketét adtunk mindegyik tárgylemezhez, és 30 percig inkubáltuk.A tárgylemezeket ezután PBS-sel mostuk, és vectashield beágyazó tápközeget adtunk hozzá.A tárgylemezeket Keyence mikroszkóppal 40-szeres nagyítással tettük láthatóvá.
Az OCT-t eltávolítottuk a mintákból a fent leírtak szerint.Az OCT eltávolítása után merítse a tárgylemezeket Bouin-oldatba egy éjszakára.A lemezeket ezután 1 órán át desztillált vízzel öblítettük, majd 10 percre Bibrich aloe savas fukszin oldatba helyeztük.Ezután a lemezeket desztillált vízzel mostuk, és 10 percre 5% foszfomolibdén/5% foszfovolfrámsav oldatba helyeztük.Öblítés nélkül vigye át a tárgylemezeket közvetlenül az anilinkék oldatba 15 percre.Ezután a tárgylemezeket desztillált vízzel mostuk és 2 percre 1%-os ecetsav oldatba helyeztük.A tárgylemezeket 200 N etanolban szárítottuk és xilolra vittük.A megfestett tárgylemezeket Keyence mikroszkóppal tettük láthatóvá 10-szeres objektívvel.A fibrózis terület százalékos arányát Keyence Analyzer szoftverrel határoztuk meg.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalógusszám V13154, a gyártó protokollja szerint, néhány módosítással.Különösen egy 6 mm átmérőjű sebészeti lyukasztót használtunk az egyenletes szövetméret biztosítására az MTT analízis során.A szöveteket egyenként szélesztettük egy MTT szubsztrátot tartalmazó 12 lyukú lemez lyukaiba a gyártó protokollja szerint.A metszeteket 37 °C-on 3 órán át inkubáljuk, és az élő szövet metabolizálja az MTT szubsztrátot, így lila formázán vegyületet képez.Cserélje ki az MTT-oldatot 1 ml DMSO-val, és inkubálja 37 °C-on 15 percig, hogy a szívmetszetekből kivonja a lila formazánt.A mintákat 1:10 arányban hígítottuk DMSO-ban 96 lyukú, átlátszó fenekű lemezeken, és a lila szín intenzitását 570 nm-en Cytation lemezolvasóval (BioTek) mértük.A leolvasott értékeket a szív minden egyes szeletének súlyára normalizáltuk.
A szívszelet tápközeget 1 μCi/ml [5-3H]-glükózt tartalmazó táptalajra cseréltük (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) a glükózfelhasználási vizsgálathoz a korábban leírtak szerint.4 órás inkubáció után adjunk hozzá 100 µl táptalajt egy nyitott mikrocentrifuga csőhöz, amely 100 µl 0,2 N HCl-t tartalmaz.Ezután a csövet 500 μl dH2O-t tartalmazó szcintillációs csőbe helyeztük, hogy a [3H]2O elpárologjon 72 órán keresztül 37 °C-on.Ezután vegye ki a mikrocentrifuga csövet a szcintillációs csőből, és adjon hozzá 10 ml szcintillációs folyadékot.A szcintillációs számlálásokat Tri-Carb 2900TR folyadékszcintillációs analizátorral (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) végeztük.Ezután kiszámítottuk a glükózfelhasználást, figyelembe véve az [5-3H]-glükóz specifikus aktivitást, a nem teljes egyensúlyt és a hátteret, az [5-3H]-nak jelöletlen glükózra hígulását és a szcintillációs számláló hatékonyságát.Az adatokat a szív szakaszainak tömegére normalizálják.
A szövetek Trizolban történő homogenizálása után RNS-t izoláltunk a szívmetszetekből a Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 használatával a gyártó protokollja szerint.Az RNAsec könyvtár előkészítése, szekvenálása és adatelemzése az alábbiak szerint történt:
Az RNS-könyvtár elkészítéséhez mintánként 1 μg RNS-t használtunk kiindulási anyagként.A szekvenáló könyvtárakat a NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) segítségével állítottuk elő a gyártó ajánlásait követve, és indexkódokat adtunk az attribútumszekvenciákhoz minden mintához.Röviden, az mRNS-t a teljes RNS-ből tisztítottuk poli-T oligonukleotidokhoz kapcsolt mágneses gyöngyök segítségével.A fragmentálást kétértékű kationok segítségével végezzük magas hőmérsékleten NEBNext First Strand szintézis reakciópufferben (5X).Az első szál cDNS-t random hexamer primerek és M-MuLV reverz transzkriptáz (RNáz H-) alkalmazásával szintetizáltuk.A második cDNS-szálat ezután DNS polimeráz I és RNáz H alkalmazásával szintetizálják. A fennmaradó túlnyúlásokat exonukleáz/polimeráz aktivitás hatására tompa végekké alakítják.A DNS-fragmens 3'-végének adenilezése után egy hajtű hurok szerkezetű NEBNext Adaptert csatlakoztatnak hozzá, hogy előkészítsék a hibridizációra.Az előnyösen 150-200 bp hosszúságú cDNS-fragmensek kiválasztásához.A könyvtár fragmentumait AMPure XP rendszerrel (Beckman Coulter, Beverly, USA) tisztítottuk.Ezután 3 μl USER Enzyme-t (NEB, USA) méretszelektált cDNS-sel adapterrel ligálva használtunk 15 percig 37 °C-on, majd 5 percig 95 °C-on a PCR előtt.Ezután a PCR-t Phusion High-Fidelity DNS polimerázzal, univerzális PCR primerekkel és Index (X) primerekkel végeztük.Végül a PCR-termékeket megtisztítottuk (AMPure XP rendszer), és a könyvtár minőségét Agilent Bioanalyzer 2100 rendszeren értékeltük.A cDNS-könyvtárat ezután Novaseq szekvenáló segítségével szekvenáltuk.Az Illumina nyers képfájljait a CASAVA Base Calling segítségével nyers olvasmányokká alakították át.A nyers adatokat FASTQ(fq) formátumú fájlok tárolják, amelyek olvasási szekvenciákat és a megfelelő alapminőségeket tartalmaznak.Válassza a HISAT2 lehetőséget, hogy a szűrt szekvenálási leolvasásokat az Sscrofa11.1 referenciagenomhoz illessze.Általában a HISAT2 bármilyen méretű genomot támogat, beleértve a 4 milliárd bázisnál nagyobb genomokat is, és a legtöbb paraméterhez alapértelmezett értékek vannak beállítva.Az RNA Seq adatok splicing olvasatai hatékonyan igazíthatók a HISAT2-vel, a jelenleg elérhető leggyorsabb rendszerrel, ugyanolyan vagy jobb pontossággal, mint bármely más módszerrel.
A transzkriptumok bősége közvetlenül tükrözi a génexpresszió szintjét.A génexpressziós szinteket a genommal vagy az exonokkal kapcsolatos transzkriptumok (szekvenálási szám) bősége alapján értékeljük.A leolvasások száma arányos a génexpressziós szintekkel, a génhosszal és a szekvenálási mélységgel.Kiszámoltuk az FPKM-et (fragments per ezer bázispár transzkriptum szekvenált egy millió bázispárra), és meghatároztuk a differenciális expresszió P-értékeit a DESeq2 csomag segítségével.Ezután kiszámítottuk a hamis felfedezési arányt (FDR) minden P-értékhez a Benjamini-Hochberg-módszerrel9 a beépített „p.adjust” R-függvény alapján.
A szívmetszetekből izolált RNS-t 200 ng/μl koncentrációban cDNS-vé alakítottuk a Thermo SuperScript IV Vilo Master keverékével (Thermo, katalógusszám: 11756050).A kvantitatív RT-PCR-t Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-lyukú átlátszó reakciólemezzel (Thermo, katalógusszám: 4483319) és microamp optikai ragasztóval (Thermo, katalógusszám: 4311971) végeztük.A reakcióelegy 5 µl Taqman Fast Advanced Master keverékből (Thermo, katalógusszám 4444557), 0,5 µl Taqman Primerből és 3,5 µl H2O-ból állt.Szabványos qPCR-ciklusokat futtattunk, és a CT-értékeket egy Applied Biosystems Quantstudio 5 valós idejű PCR-műszerrel (384-lyukú modul; termékszám: A28135) mértük.A Taqman primereket a Thermo-tól (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0601861), RGL1 (Ss06018m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04243805_u1) Az összes minta géntartása a PDGAH_m értékre normalizálódott.
Az NT-ProBNP tápközeg-kibocsátását az NT-ProBNP kit (sertés) (katalógusszám: MBS2086979, MyBioSource) segítségével értékeltük a gyártó protokollja szerint.Röviden, minden mintából és standardból 250 µl-t adtunk két példányban minden egyes lyukba.Közvetlenül a minta hozzáadása után adjon 50 µl A vizsgálati reagenst minden mérőhelyhez.Finoman rázza fel a lemezt és zárja le tömítőanyaggal.Ezután a tablettákat 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk.Ezután szívja le az oldatot, és négyszer mossa ki a lyukakat 350 µl 1X mosóoldattal, a mosóoldatot minden alkalommal 1-2 percig inkubálja.Ezután adjon hozzá 100 µl B vizsgálati reagenst lyukonként, és zárja le lemeztömítővel.A tablettát finoman összerázzuk, és 37 °C-on 30 percig inkubáljuk.Szívja fel az oldatot, és mossa át a lyukakat ötször 350 µl 1X mosóoldattal.Adjon 90 µl szubsztrát oldatot minden lyukba, és zárja le a lemezt.Adjon 50 µl leállító oldatot mindegyik lyukba.A lemezt azonnal megmértük Cytation (BioTek) lemezleolvasóval, 450 nm-re állítottuk.
Teljesítményelemzéseket végeztünk azon csoportméretek kiválasztásához, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a paraméter 10%-os abszolút változásának kimutatásához 5%-os I. típusú hibaaránnyal. Teljesítményelemzéseket végeztünk azon csoportméretek kiválasztásához, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a paraméter 10%-os abszolút változásának kimutatásához 5%-os I. típusú hibaaránnyal. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнарунеялнен для обнарунежения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Teljesítményelemzést végeztünk azon csoportméretek kiválasztásához, amelyek >80%-os teljesítményt biztosítanak a 10%-os abszolút paraméterváltozás észleléséhez 5%-os I. típusú hibaaránnyal.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和从夯诋进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对瀇变化和从夯诋 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеспечил для обятелоѶ10% ния параметров и 5% частоты ошибок типа I. Teljesítményelemzést végeztünk egy olyan csoportméret kiválasztásához, amely >80% teljesítményt biztosít a 10% abszolút paraméterváltozás és 5% I. típusú hibaarány észleléséhez.A kísérlet előtt véletlenszerűen választottuk ki a szövetmetszeteket.Valamennyi elemzés állapotvak volt, és a mintákat csak az összes adat elemzése után dekódoltuk.Az összes statisztikai elemzés elvégzéséhez GraphPad Prism szoftvert (San Diego, CA) használtunk. Minden statisztika esetében a p-értékeket szignifikánsnak tekintettük 0,05 alatti értékeknél. Az összes statisztika esetében a p-értékeket 0,05-nél kisebb értékeknél tekintettük szignifikánsnak. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Az összes statisztika esetében a p-értékeket 0,05-nél kisebb értékeknél tekintettük szignifikánsnak.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Az összes statisztika esetében a p-értékeket 0,05-nél kisebb értékeknél tekintettük szignifikánsnak.Az adatokon kétirányú Student-féle t-próbát végeztünk, mindössze 2 összehasonlítással.Egy- vagy kétutas ANOVA-t használtunk a több csoport közötti szignifikancia meghatározására.Az utólagos tesztek végrehajtásakor Tukey korrekcióját alkalmazták a többszörös összehasonlítások figyelembevételére.Az RNAsec adatok speciális statisztikai megfontolásokkal járnak az FDR és a p.adjust kiszámításakor, a Módszerek részben leírtak szerint.
A tanulmány tervezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg a természetkutatási jelentés absztraktot, amely ehhez a cikkhez kapcsolódik.