Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար: Բրաուզերի տարբերակը, որը դուք օգտագործում եք, սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ին: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Մարդու աղիքների մորֆոգենեզը հաստատում է 3D էպիթելի միկրոճարտարապետության և տարածական կազմակերպման գաղտնաբառի առանձնահատկությունները: Այս եզակի կառուցվածքը անհրաժեշտ է աղիների հոմեոստազը պահպանելու համար՝ պաշտպանելով ցողունային բջիջների տեղը բազալային կրիպտում էկզոգեն մանրէաբանական անտիգեններից և դրանց մետաբոլիտներից: մակերես: Հետևաբար, 3D էպիթելի կառուցվածքների վերստեղծումը կարևոր նշանակություն ունի in vitro աղիքների մոդելների կառուցման համար: Հատկանշական է, որ օրգանական միմետիկ աղիքը չիպի վրա կարող է հրահրել աղիքային էպիթելի ինքնաբուխ 3D մորֆոգենեզ՝ ուժեղացված ֆիզիոլոգիական գործառույթներով և բիոմեխանիկական պրոտոգենով ապահովելու համար: աղիքներ միկրոհեղուկ չիպի վրա, ինչպես նաև Transwell ներկառուցված հիբրիդային չիպի վրա: Մենք նկարագրում ենք սարքի պատրաստման մանրամասն մեթոդներ, Caco-2 կամ աղիքային օրգանոիդ էպիթելի բջիջների մշակումը սովորական պարամետրերում, ինչպես նաև միկրոհեղուկ հարթակում, 3D մորֆոգենեզի ինդուկցիա և այս 3D էպիթելային էպիթելիայի բազմակի պատկերավորման պրոտոգենիզմի բնութագրումը: Մեր in vitro մորֆոգենեզի մեթոդը օգտագործում է ֆիզիոլոգիապես համապատասխան կտրվածքային սթրես և մեխանիկական շարժում և չի պահանջում բարդ բջիջների ճարտարագիտություն կամ մանիպուլյացիա, որը կարող է գերազանցել գոյություն ունեցող այլ մեթոդներին: և դեղագործական կիրառություններ։
Փորձերը ցույց են տալիս, որ աղիքային էպիթելի Caco-2 բջիջները, որոնք մշակված են աղիքների վրա 1,2,3,4,5 կամ երկշերտ միկրոհեղուկ սարքերում6,7 կարող են ենթարկվել ինքնաբուխ 3D մորֆոգենեզի in vitro՝ առանց հիմքում ընկած մեխանիզմի հստակ ըմբռնման: Մեր վերջին ուսումնասիրության մեջ մենք պարզեցինք, որ մորֆոգենային սարքերի հեռացումը անհրաժեշտ է բազո-կողմնակի մակերևույթից D-ից: մորֆոգենեզ in vitro, որը ցուցադրվել է Caco-2-ի և հիվանդից ստացված աղիքային օրգանոիդների կողմից:Էպիթելային բջիջները վավերացվել են: Այս հետազոտության ընթացքում մենք հատուկ ուշադրություն ենք դարձրել Wnt հզոր անտագոնիստի՝ Dickkopf-1-ի (DKK-1) բջիջների արտադրության և կոնցենտրացիայի բաշխման վրա, աղիքների վրա և փոփոխված միկրոհեղուկ սարքերում, որոնք պարունակում են Transwell ներդիրներ, որոնք կոչվում են «Հիբրիդ Չիպ»: Սեկրեցված փխրուն սպիտակուցը 1 կամ Soggy-1) չիպի վրա գտնվող աղիքներում արգելակում է մորֆոգենեզը կամ խաթարում է նախակառուցված 3D էպիթելային շերտը, ինչը ենթադրում է, որ մշակույթի ընթացքում անտագոնիստական ​​սթրեսը պատասխանատու է աղիքային մորֆոգենեզի համար in vitro: Հետևաբար, գործնական մոտեցումը նվազագույն էպիթելային ինտերֆեյսի համար էպիթելային միջերեսին հասնելու համար է: կողային խցիկ՝ ակտիվ լվացման միջոցով (օրինակ՝ աղիքների վրա չիպի վրա կամ հիբրիդային չիպի վրա) կամ դիֆուզիայի միջոցով:
Սույն Արձանագրության մեջ մենք տրամադրում ենք մանրէազերծող միկրոդեկիլյան եւ Transwell- ի ներդիրների եւ Transwell- ի ներդիրի հիբրիդային չիպսեր (Transwell- ի համար) աղիքային էպիթելի բջիջների պատրաստման մանրամասն մեթոդներ (PDMS) - 7., 7 բ / 9) եւ առաջացած 3D Morphogenesis in vitro (Քայլ 10): , եւ բիոմեխանիկական միկրոատեղի աղիքային կենսաքիմիական եւ վերարտադրությունը .in vitro. IAL աճ, երկայնական հյուրընկալող-միկրոբիապես մշակույթներ, պաթոգեն վարակի, բորբոքային վնասվածք, էպիթելի պատնեշի դիսֆունկցիա եւ պրոբիոտիկ-հիմնված թերապիա օրինակ:
Մեր արձանագրությունը կարող է օգտակար լինել գիտնականների լայն շրջանակի համար՝ հիմնական (օրինակ՝ աղիքային լորձաթաղանթի կենսաբանություն, ցողունային բջիջների կենսաբանություն և զարգացման կենսաբանություն) և կիրառական հետազոտություններ (օրինակ՝ դեղորայքի նախակլինիկական փորձարկում, հիվանդությունների մոդելավորում, հյուսվածքների ճարտարագիտություն և գաստրոէնտերոլոգիա) լայն ազդեցությամբ: նախատեսում ենք, որ մեր տեխնիկական ռազմավարությունը կարող է տարածվել լսարաններին, ովքեր ուսումնասիրում են բջիջների ազդանշանների դինամիկան աղիների զարգացման, վերածննդի կամ հոմեոստազի ժամանակ: Բացի այդ, մեր արձանագրությունը օգտակար է վարակի հետաքննության համար տարբեր վարակիչ գործակալների, ինչպիսիք են Նորովիրուս 8-ը, Ծանր սուր շնչառական համախտանիշը, Coronavirus 2 (SARS-CoV-strioff-Salm, 2-րդ, սալօնֆրիոուրիում): խոլերա.Հիվանդությունների պաթոլոգիայի և պաթոգենեզի լսարանները նույնպես օգտակար են: Աղիքային միկրոֆիզիոլոգիայի համակարգի օգտագործումը կարող է թույլ տալ երկայնական համատեղ մշակույթ 10 և հետագա գնահատել հյուրընկալող պաշտպանությունը, իմունային պատասխանները և պաթոգեն հետ կապված վնասվածքների վերականգնումը աղեստամոքսային տրակտում: 11: 11: pouchitis-ը կամ գրգռված աղիքի համախտանիշը կարող են նմանակվել, երբ 3D աղիքային էպիթելի շերտերը պատրաստվում են՝ օգտագործելով հիվանդի աղիքային էպիթելի 3D շերտերը, այդ հիվանդությունները ներառում են վիլուսային ատրոֆիա, կրիպտերի կրճատում, լորձաթաղանթի վնասում կամ խանգարված էպիթելի արգելք: Բիոպսիա կամ ավելի բարձր ցողունային մոդելի բիոպսիա: Հիվանդության միջավայրում, ընթերցողները կարող են մտածել հիվանդության հետ կապված բջիջների տեսակների ավելացման մասին, ինչպիսիք են հիվանդի ծայրամասային արյան մոնոմիջուկային բջիջները (PBMCs), 3D աղիքային վիլուս-կրիպտային միկրոճարտարապետություն պարունակող մոդելներին:հյուսվածքային հատուկ իմունային բջիջներ, 5.
Քանի որ 3D էպիթելի միկրոկառուցվածքը կարող է ֆիքսվել և վիզուալացվել առանց հատվածավորման գործընթացի, տարածական տրանսկրիպտոմիկայի և բարձր լուծաչափի կամ գերլուծաչափման պատկերման վրա աշխատող հեռուստադիտողները կարող են հետաքրքրված լինել էպիթելի խորշերի վրա գեների և սպիտակուցների տարածական ժամանակային դինամիկայի մեր քարտեզագրմամբ:Հետաքրքրված է տեխնոլոգիայով: Պատասխանում է մանրէների կամ իմունային գրգռիչներին: Ավելին, հյուրընկալող-մանրէաբանական երկայնական զրույցը 10, 14, որը համակարգում է աղիքային հոմեոստազը, կարող է հաստատվել աղիների լորձաթաղանթի 3D շերտում` տարբեր մանրէաբանական տեսակների, մանրէաբանական համայնքների կամ ֆեկալային միկրոբիոտա-փորոտիների համատեղ մշակմամբ:հարթակում: Այս մոտեցումը հատկապես գրավիչ է լորձաթաղանթի իմունոլոգիան, գաստրոէնտերոլոգիան, մարդու միկրոբիոմը, կուլտուրոմիկան և կլինիկական մանրէաբանությունը ուսումնասիրող լսարանը, որը ձգտում է լաբորատորիայում մշակել աղիների նախկինում չմշակված միկրոբիոտա: Եթե մեր in vitro մորֆոգենեզի արձանագրությունը կարող է հարմարեցվել ընդլայնվող մշակութային ձևաչափերին, ինչպիսիք են 244, բազմաբնույթ ափսեի մեջ: Արձանագրությունը կարող է տարածվել նաև սննդի արդյունաբերության համար դեղագործական, կենսաբժշկական կամ բարձր թողունակության զննման կամ վավերացման հարթակներ մշակողներին: Որպես սկզբունքի ապացույց, մենք վերջերս ցույց տվեցինք մուլտիպլեքս բարձր թողունակության մորֆոգենեզի համակարգի իրագործելիությունը, որը կարող է ընդլայնվել 24-հորատանցքային, բազմակի ափսեի ձևաչափով: Հետևաբար, մեր in vitro մորֆոգենեզի մեթոդի վավերացումը կարող է արագացվել և պոտենցիալ ընդունվել բազմաթիվ հետազոտական ​​լաբորատորիաների, արդյունաբերության կամ կառավարության և կարգավորող գործակալությունների կողմից՝ հասկանալու համար in vitro աղիքային մորֆոգենեզի բջջային վերածրագրավորումը տրանսկրիպտոմիկ մակարդակում՝ դեղերի կամ կենսաթերապևտիկ միջոցների փորձարկման համար։ աղիքային մորֆոգենեզի գործընթացի վերարտադրելիությունը.
Մարդկանց առնչվող փորձարարական սահմանափակ թվով մոդելներ են օգտագործվել աղիքային էպիթելի մորֆոգենեզը ուսումնասիրելու համար՝ հիմնականում պայմանավորված 3D մորֆոգենեզ in vitro-ում առաջացնելու կիրառելի արձանագրությունների բացակայության պատճառով: Կարևորն այն է, որ ճշգրիտ չեն որոշում մարդու զարգացման գործընթացները: Այս մոդելները նաև շատ սահմանափակ են բազմակողմ մասշտաբային եղանակով փորձարկվելու իրենց ունակությամբ: Հետևաբար, in vitro 3D հյուսվածքների կառուցվածքները վերականգնելու մեր արձանագրությունը գերազանցում է կենդանիների in vivo մոդելներին, ինչպես նաև այլ ավանդական ստատիկ 2D բջիջների մշակույթի մոդելներին: ծպտյալ-վիլուս առանցքը՝ ի պատասխան տարբեր լորձաթաղանթների կամ իմունային գրգռիչների: 3D էպիթելի շերտերը կարող են տարածք տրամադրել՝ ուսումնասիրելու, թե ինչպես են մանրէաբանական բջիջները մրցակցում ձևավորելու տարածական խորշեր և էկոլոգիական էվոլյուցիա՝ ի պատասխան հյուրընկալող գործոնների (օրինակ՝ ներքին և արտաքին լորձի շերտերը, IgA-ի սեկրեցումը և հակամանրէային էպիթելային պեպտիդները, ինչպես են թույլ տալիս3Fur. կառուցում է իր համայնքները և սիներգետիկորեն արտադրում է մանրէաբանական մետաբոլիտներ (օրինակ՝ կարճ շղթայական ճարպաթթուներ), որոնք ձևավորում են բջջային կազմակերպությունը և ցողունային բջիջների խորշերը բազալային կրիպտներում։
Ի լրումն աղիքային էպիթելի 3D կառուցվածքների ստեղծման մեր մեթոդին, կան մի քանի in vitro մեթոդներ: Աղիքային օրգանոիդ մշակույթը հյուսվածքների ինժեներական ժամանակակից տեխնիկա է, որը հիմնված է հատուկ մորֆոգեն պայմաններում աղիքային ցողունային բջիջների մշակման վրա23,24,25: փակ է օրգանոիդում և, հետևաբար, սահմանափակ է լուսային բաղադրիչների ներմուծումը, ինչպիսիք են մանրէաբանական բջիջները կամ էկզոգեն անտիգենները:Օրգանոիդ լույսերի հասանելիությունը կարող է բարելավվել՝ օգտագործելով միկրոներարկիչ,26,27, սակայն այս մեթոդը ինվազիվ է և աշխատատար և դրա իրականացման համար պահանջում է մասնագիտացված գիտելիքներ: Ավելին, ստատիկ պայմաններում հիդրոգելային փայտամածներում պահպանվող ավանդական օրգանոիդ մշակույթները ճշգրիտ չեն արտացոլում ակտիվ բիոմեխանիկան:
Մի քանի հետազոտական ​​խմբերի կողմից կիրառված այլ մոտեցումներ օգտագործում են նախակառուցված 3D հիդրոգելային փայտամածներ՝ ընդօրինակելու աղիների էպիթելի կառուցվածքը՝ գելի մակերեսի վրա աճեցնելով մարդու աղիքային մեկուսացված բջիջներ: Ստեղծեք հիդրոգելային փայտամածներ՝ օգտագործելով 3D տպագրված, միկրոֆրացված կամ լիտոգրաֆիկորեն պատրաստված կաղապարներ: գրադիենտներ, ստեղծելով էպիթելի կառուցվածքի բարձր հարաբերակցությամբ և ստրոմա-էպիթելի խաչաձև խոսակցություն՝ ստրոմային բջիջներ ներառելով փայտամածի մեջ: Այնուամենայնիվ, նախակառուցված փայտամածների բնույթը կարող է կանխել ինքնաբուխ մորֆոգենետիկ գործընթացի ցուցադրումը: Ֆիզիոլոգիական ֆունկցիա: Մեկ այլ վերջին ուսումնասիրություն օգտագործեց հիդրոգելային փայտամածներ միկրոհեղուկ հարթակում և աղիքային էպիթելի կառուցվածքներ՝ օգտագործելով լազերային փորագրման տեխնիկա: մեխանոկենսաբանական շարժումներ: Նույն խմբի 3D տպագրության տեխնիկան կարողացավ ստեղծել աղիքների մանրանկարչություն ինքնաբուխ մորֆոգենետիկ պրոցեսներով: Չնայած խողովակի ներսում աղիքների տարբեր հատվածների բարդ ստեղծմանը, այս մոդելում բացակայում են նաև լուսային հեղուկի հոսքը և մեխանիկական դեֆորմացիան: Բացի այդ, մոդելի գործունակությունը կարող է սահմանափակվել, հատկապես, երբ տպագրությունը կարող է սահմանափակվել բջջային բջիջների ամբողջական պայմաններում: Փոխարենը, մեր առաջարկած արձանագրությունն ապահովում է աղիքների ինքնաբուխ մորֆոգենեզ, ֆիզիոլոգիապես համապատասխան կտրվածքային սթրես, բիոմեխանիկա, որը ընդօրինակում է աղիքների շարժունակությունը, անկախ գագաթային և բազալերային խցիկների հասանելիություն և մոդուլյարության բարդ կենսաբանական միկրոմիջավայրերի վերստեղծում: Հետևաբար, մեր in vitro 3D մորֆոգենեզի ձևավորման պրոտոկոլի գոյություն ունեցող մեթոդները կարող են ապահովել ավելի քան մեկ այլ մեթոդ:
Մեր արձանագրությունն ամբողջությամբ կենտրոնացած է 3D էպիթելի մորֆոգենեզի վրա՝ մշակույթում միայն էպիթելային բջիջներով և ոչ մի այլ տեսակի շրջակա բջիջներով, ինչպիսիք են մեզենխիմալ բջիջները, էնդոթելիային բջիջները և իմունային բջիջները: gut-on-a-chip-ը և hybrid-on-a-chip-ը մեզ թույլ են տալիս վերստեղծել ալիքային 3D էպիթելի շերտը, լրացուցիչ կենսաբանական բարդությունները, ինչպիսիք են էպիթելային-մեզենխիմալ փոխազդեցությունները33,34, արտաբջջային մատրիցով (ECM) նստվածքը 35 և, մեր մոդելում, գաղտնալսող ցողունային բջիջները համարվում են գաղտնալսող բջիջների առանձնահատկությունները: ֆիբրոբլաստները) մեզենխիմում առանցքային դեր են խաղում ECM սպիտակուցների արտադրության և աղիքային մորֆոգենեզի կարգավորման մեջ in vivo35,37,38: Մեզենխիմալ բջիջների ավելացումը մեր մոդելին մեծացնում է մորֆոգենետիկ գործընթացը և բջիջների կցման արդյունավետությունը: աղիքների միկրոմիջավայրում: Ավելին, անոթային բաղադրիչները, որոնք կարող են կապվել հյուսվածքների մոդելների միջև, նախապայման են, երբ հյուսվածքների մոդելները նախագծված են բազմաօրգանական փոխազդեցությունները ցուցադրելու համար: Հետևաբար, էնդոթելիային բջիջները կարող են ներառել ավելի ճշգրիտ ֆիզիոլոգիական առանձնահատկությունները օրգանի մակարդակի լուծաչափով: Հիվանդից ստացված իմունային արձագանքման հակահարմարվողական բջիջները նույնպես կարևոր են: k, և հյուսվածքային իմունիտետ՝ աղիքային հիվանդության նմանակման համատեքստում:
Հիբրիդային չիպերի օգտագործումն ավելի պարզ է, քան աղիքներ-չիպի ​​վրա, քանի որ սարքի կարգավորումն ավելի պարզ է, և Transwell-ի ներդիրների օգտագործումը թույլ է տալիս աղիքային էպիթելի մասշտաբային մշակումը: Այնուամենայնիվ, առևտրում հասանելի պոլիեսթեր թաղանթներով Transwell ներդիրները առաձգական չեն և չեն կարող նմանակել պերիստալտիկական շարժումները: գագաթային մասում առանց կտրվածքի լարվածության: Ակնհայտ է, որ գագաթային հատվածի ստատիկ հատկությունները հազվադեպ են հնարավորություն տալիս երկարաժամկետ բակտերիաների համատեղ մշակում հիբրիդային չիպերում: Թեև մենք կարող ենք ուժեղ կերպով հրահրել 3D մորֆոգենեզ Տրանսվելի ներդիրներում հիբրիդային չիպերի օգտագործման ժամանակ, չիպսերի ֆիզիոլոգիապես համապատասխան պոտենցիալ բիոմեխանիկայի կիրառումը կարող է սահմանափակել չիպերի ներուժը:
Մարդկային կրիպտ-փեղկեր առանցքի ամբողջական վերակառուցումը աղիքներ-չիպի ​​և հիբրիդ-չիպի ​​վրա կուլտուրաներում լիովին հաստատված չէ: Քանի որ մորֆոգենեզը սկսվում է էպիթելի միաշերտից, 3D միկրոճարտարապետությունները պարտադիր չէ, որ տրամադրեն մորֆոլոգիական նմանություն կրիպտալ տիրույթին մեր գաղտնալսման տիրույթի մոտ գաղտնալսված բնավորությամբ: ներծծված 3D էպիթելի, գաղտնարանը և վիլլային շրջանները հստակ սահմանազատված չէին: Թեև չիպի ավելի բարձր վերին ալիքները հանգեցնում են միկրոինժեներական էպիթելի բարձրության բարձրացմանը, առավելագույն բարձրությունը դեռևս սահմանափակված է ~300-400 μm-ով: Մարդու աղիքային ծպտյալների իրական խորությունը՝ փոքր և մեծ, փոքր և մեծ ծպտյալներում՝ 1~4, փոքր և մեծ: բարակ աղիքային վիլլի ~600 մկմ41:
Պատկերային տեսանկյունից 3D միկրոճարտարապետությունների in situ գերլուծական պատկերը կարող է սահմանափակվել չիպի վրա աղիքներով, քանի որ օբյեկտիվ ոսպնյակից մինչև էպիթելի շերտը պահանջվող աշխատանքային հեռավորությունը կազմում է մի քանի միլիմետր: Այս խնդիրը հաղթահարելու համար կարող է պահանջվել հեռավոր օբյեկտ: Ավելին, MS-ի բարակ սպեցիֆիկականությունը պայմանավորված է պատկերի համար: Ավելին, քանի որ չիպի վրա աղիքների շերտ առ շերտ միկրոսարքավորումը ներառում է յուրաքանչյուր շերտի միջև մշտական ​​կպչում, չափազանց դժվար է բացել կամ հեռացնել վերին շերտը՝ էպիթելի շերտի մակերեսային կառուցվածքը ուսումնասիրելու համար: Օրինակ՝ օգտագործելով սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակ (SEM):
PDMS-ի հիդրոֆոբությունը սահմանափակող գործոն է եղել միկրոհեղուկի վրա հիմնված ուսումնասիրություններում, որոնք վերաբերում են հիդրոֆոբ փոքր մոլեկուլներին, քանի որ PDMS-ը կարող է ոչ հատուկ կերպով կլանել այդպիսի հիդրոֆոբ մոլեկուլները: PDMS-ի այլընտրանքները կարող են դիտարկվել այլ պոլիմերային նյութերի հետ միասին: Այլընտրանք, դիտարկվում է PDMS-ի մակերեսային փոփոխությունը (օրինակ՝ պոլիգլիպ32-ի 4-ից ծածկույթը) նվազագույնի հասցնել հիդրոֆոբ մոլեկուլների կլանումը:
Վերջապես, մեր մեթոդը լավ բնութագրված չէ բարձր թողունակության ցուցադրման կամ «բոլորին հարմար» օգտատիրոջ համար հարմար փորձարարական հարթակի տրամադրման տեսանկյունից: Ներկայիս արձանագրությունը պահանջում է ներարկիչի պոմպ յուրաքանչյուր միկրոսարքի համար, որը տեղ է զբաղեցնում CO2 ինկուբատորում և կանխում է լայնածավալ փորձերը: ծակոտկեն ներդիրներ, որոնք թույլ են տալիս շարունակական համալրել և հեռացնել բազալերային միջավայրերը):
Մարդու աղիքային էպիթելի 3D մորֆոգենեզը in vitro-ում օգտագործելու համար մենք օգտագործեցինք միկրոհեղուկ չիպային աղիքային սարք, որը պարունակում է երկու զուգահեռ միկրոալիքներ և առաձգական ծակոտկեն թաղանթ՝ լուսանցք-մազանոթային միջերես ստեղծելու համար: Երկու հարթակներում էլ մարդկային աղիքային տարբեր էպիթելի բջիջների մորֆոգենեզը կարելի է ցույց տալ՝ կիրառելով հոսքի ուղղորդված մանիպուլյացիա՝ հիմքի կողային հատվածից մորֆոգենի անտագոնիստները հեռացնելու համար: Ամբողջ փորձարարական պրոցեդուրան (Նկար 1) բաղկացած է հինգ մասից. բջիջներ (Caco-2 բջիջներ) կամ մարդու աղիքային օրգանոիդներ;արկղեր 2-5), (iii) աղիքային էպիթելի բջիջների կուլտուրա աղիքային չիպերի կամ հիբրիդային չիպերի վրա (քայլեր 6-9), (iv) 3D մորֆոգենեզի ինդուկցիա in vitro (քայլ 10) և (v)) 3D էպիթելի միկրոկառուցվածքը բնութագրելու համար (քայլեր 11-24-ից ներքևում մշակված է էպիթելի միկրոկառուցվածքը) in vitro մորֆոգենեզ՝ համեմատելով էպիթելի մորֆոգենեզը տարածական, ժամանակային, պայմանական կամ ընթացակարգային հսկողության հետ:
Մենք օգտագործել ենք երկու տարբեր մշակութային հարթակներ՝ ուղիղ ալիքներով կամ ոչ գծային խճճված ալիքներով աղիքներ, կամ հիբրիդային չիպեր, որոնք պարունակում են Transwell (TW) ներդիրներ միկրոհեղուկ սարքի մեջ, որը պատրաստված է ինչպես նկարագրված է ներդիրում 1-ում, և քայլ 1 -5. «Device Fabrication»-ը ցույց է տալիս մեկ չիպի պատրաստման հիմնական քայլերը (HubridCells Chip-ի հիբրիդային աղբյուրը» aco-2 կամ մարդու աղիքային օրգանոիդներ) և այս արձանագրության մեջ օգտագործվող մշակման ընթացակարգը:"In vitro morphogenesis"-ը ցույց է տալիս ընդհանուր քայլերը, որոնցում Caco-2-ը կամ օրգանոիդից ստացված էպիթելի բջիջները աճեցվում են աղիքային չիպի կամ հիբրիդային չիպի Transwell ներդիրների վրա, որին հաջորդում է 3D ներդիրների ինդուկցիան և կիրառման յուրաքանչյուր աստիճանի ձևաչափի կառուցվածքի ձևավորումը: Օրինակներ, թե ինչպես կարող են օգտագործվել աղիքային էպիթելի շերտերը, օրինակ՝ բջիջների տարբերակման բնութագրման, աղիքների ֆիզիոլոգիայի ուսումնասիրությունների, հյուրընկալող-մանրէաբանական էկոհամակարգերի ստեղծման և հիվանդությունների մոդելավորման մեջ: Իմունֆլյուորեսցենտային պատկերները «Բջջային տարբերակում»-ում, որոնք ցույց են տալիս միջուկները, F-actin-ը և MUC3D-ը, որը գեներացնում է աղիքային չիպային նշանը2-ի վրա արտահայտված MUC3D-ը: առկա է գավաթային բջիջներում և լորձաթաղանթի մակերևույթներից արտազատվող լորձում: Աղիքների ֆիզիոլոգիայում լյումինեսցենտային պատկերները ցույց են տալիս լորձը, որն արտադրվում է սիալաթթվի և N-ացետիլգլյուկոզամինի մնացորդների ներկման արդյունքում՝ օգտագործելով ցորենի բողբոջների լյումինեսցենտային ագլյուտինին: ցույց է տալիս E. coli-ի համակուլտուրան, որն արտահայտում է կանաչ լյումինեսցենտային սպիտակուցը (GFP) միկրոինժեներական 3D Caco-2 էպիթելային բջիջների հետ: Աջ վահանակը ցույց է տալիս GFP E. coli-ի տեղայնացումը՝ համատեղ մշակված 3D Caco-2 էպիթելի բջիջների հետ, որին հաջորդում է իմունոֆլյուորեսցենտային ներկումը (F-diratseiilling (առողջ սնուցող) աղիքների բորբոքման չիպսերը ֆիզիոլոգիական մարտահրավերի տակ բակտերիալ անտիգեններով (օրինակ՝ լիպոպոլիսաքարիդ, LPS) և իմունային բջիջներով (օրինակ՝ PBMC;կանաչ): Caco-2 բջիջները մշակվել են 3D էպիթելային շերտ ստեղծելու համար: Սանդղակի շերտագիծ, 50 մկմ: Ներքևի տողում գտնվող պատկերները. «Բջիջների տարբերակումը» հարմարեցված է հղման թույլտվությամբ:2.Օքսֆորդի համալսարանի հրատարակչություն;Վերարտադրվել է Ref.5-ի թույլտվությամբ:ԳԱԱ;«Host-Microbe Co-Culture»՝ հարմարեցված 3-ի թույլտվությամբ:ԳԱԱ;«Հիվանդությունների մոդելավորում»՝ հարմարեցված հղումից թույլտվությամբ։5.ԳԱԱ.
Ե՛վ աղիքային չիպի վրա, և՛ հիբրիդային չիպերը արտադրվել են PDMS կրկնօրինակների միջոցով, որոնք քանդվել են սիլիկոնային կաղապարներից փափուկ լիտոգրաֆիայի միջոցով1,44 և SU-8-ով ձևավորված: Յուրաքանչյուր չիպի միկրոալիքների ձևավորումը որոշվում է՝ հաշվի առնելով հիդրոդինամիկան, ինչպիսիք են կտրվածքային լարվածությունը և հիդրոդինամիկական ճնշումը1,4,12: համադրված զուգահեռ ուղիղ միկրոալիքներ, վերածվել է չիպի վրա բարդ աղիքների (Ընդլայնված տվյալներ Նկ. 1b), որը ներառում է մի զույգ կոր միկրոալիքներ՝ առաջացնելով հեղուկի մնալու ժամանակի ավելացում, ոչ գծային հոսքի ձևեր և մշակված բջիջների բազմասռնիային դեֆորմացիա (նկ. 2a. on-a-chips-ը կարող է ընտրվել: Մենք ցույց ենք տվել, որ խճճված Gut-Chip-ը նաև ուժեղորեն հրահրում է 3D մորֆոգենեզը նմանատիպ ժամանակային շրջանակում էպիթելի աճի նույն աստիճանով, համեմատած սկզբնական Gut-Chip-ի հետ, անկախ աճեցված բջիջների տեսակից: Հետևաբար, 3D մորֆոգենեզը հրահրելու համար, գծային և բարդ ձևավորումը PD-ի վրա փոխակերպվում է PD-ի վրա: SU-8-ի օրինաչափությունները ապամոնտաժելուց հետո տրամադրեցին բացասական հատկանիշներ (Նկար.2ա): Չիպի վրա աղիքներ ստեղծելու համար պատրաստված վերին PDMS շերտը հաջորդաբար միացվեց ծակոտկեն PDMS թաղանթին և այնուհետև հավասարեցվեց ստորին PDMS շերտի հետ՝ անդառնալի միացման միջոցով՝ օգտագործելով պսակը մաքրող սարք (նկ. 2b–f): Հիբրիդային չիպեր ստեղծելու համար, բուժված PDMS կրկնօրինակները կարող էին միաձուլվել ապակեպատ սարքերի մեջ, որոնք կպչում էին միաձուլված ապակու մեջ: s (Նկար 2h և Ընդլայնված Տվյալներ Նկ. 2): Կապակցման գործընթացն իրականացվում է PDMS-ի կրկնօրինակի և ապակու մակերեսները թթվածնային պլազմայով կամ պսակով մշակելով: Սիլիկոնե խողովակին կցված միկրոֆաբրիկացված սարքի մանրէազերծումից հետո սարքի կարգավորումը պատրաստ էր իրականացնելու 3D մորֆոգենեզի 2-րդ պատկերը:
ա, SU-8 նախշերով սիլիցիումի կաղապարներից PDMS-ի մասերի պատրաստման սխեմատիկ նկարազարդում: Չմշակված PDMS լուծույթը լցվել է սիլիկոնային կաղապարի վրա (ձախից), բուժվել 60 °C-ում (միջին) և քանդվել (աջ): Ձուլված PDMS-ը կտրվել է կտորներով և մաքրվել հետագա օգտագործման համար: կաղապար, որն օգտագործվում է PDMS ծակոտկեն թաղանթ պատրաստելու համար.d, վերին և ստորին PDMS բաղադրիչների և չիպի վրա հավաքված աղիքային սարքի լուսանկարների շարք.e, վերին, թաղանթային և ստորին PDMS բաղադրիչների դասավորվածության սխեման: Յուրաքանչյուր շերտ անդառնալիորեն կապված է պլազմայի, շերեփուկի ծալքավոր սարքի հետ: ed microchannels and vacuum chambers.g, Setup of gut-on-a-chip for microfluidic cell culture-ի համար: Սիլիկոնե խողովակով և ներարկիչով հավաքված չիպի վրա պատրաստված աղիքները տեղադրվել են ծածկի վրա: Չիպային սարքը դրվել է 150 մմ Petri ափսեի կափարիչի վրա՝ մշակման համար: և 3D մորֆոգենեզ՝ օգտագործելով հիբրիդային չիպեր: Աղիքային էպիթելի բջիջների 2D մոնաշերտերը մշակման համար պատրաստված անկախ ներդիրները տեղադրվել են հիբրիդային չիպի մեջ՝ աղիքային 3D մորֆոգենեզը հրահրելու համար: Միջոցը ներծծվում է միկրոալիքների միջով բջջային շերտի տակ, որը հաստատվել է Transmission reprinted cm1-ից:Էլսեվիեր.
Այս արձանագրության մեջ Caco-2 բջջային գիծը և աղիքային օրգանոիդներն օգտագործվել են որպես էպիթելային աղբյուրներ (նկ. 3ա): Բջիջների երկու տեսակներն էլ մշակվել են անկախ (Վանդակ 2 և Ներդիր 5) և օգտագործվել ECM-ով պատված աղիքների կամ տրանսվելների ներդիրների ECM-ով ծածկված միկրոալիքները սերմանելու համար: 10-րդ և 50-րդ հատվածները) T-կոլբայում հավաքվում են տրիպսինացման հեղուկի միջոցով տարանջատված բջիջների կախոցներ պատրաստելու համար (տուփ 2): Աղիքային բիոպսիաներից կամ վիրաբուժական հատումներից ստացված աղիքային օրգանոիդները աճեցվել են Matrigel-ի փայտամած գմբեթներում 24 հորատանցքային թիթեղներում, որը պարունակում է 24 հորատանցքային թիթեղներ, որոնք պարունակում են ստրուկտիվային բիոպսիա: pondin, and Noggin) և աճի գործոնները, որոնք պատրաստված են նկարագրված ներդիրում 3-ում, լրացվում էին ամեն օր, մինչև օրգանոիդները հասնեին ~500 մկմ տրամագծով: Լիովին աճեցված օրգանոիդները հավաքվում և տարանջատվում են առանձին բջիջների մեջ՝ ցանելու համար աղիքների կամ Transwell ներդիրների վրա չիպի վրա (ներդիր 5): , հաստ աղիքի քաղցկեղ կամ նորմալ դոնոր), ախտահարման տեղանքը (օրինակ՝ ախտահարում ընդդեմ ոչ ախտահարված տարածքի) և աղեստամոքսային տրակտի տեղակայումը տրակտում (օրինակ՝ տասներկումատնյա աղիքի, ժիժունում, ileum, կույր աղիք, հաստ աղիք կամ ուղիղ աղիք)։
ա, աղիքային չիպի մեջ աղիքային մորֆոգենեզի ինդուկցիայի աշխատանքի ընթացքը: Caco-2 մարդու աղիքային էպիթելը և աղիքային օրգանոիդները օգտագործվում են այս արձանագրության մեջ՝ 3D մորֆոգենեզը ցուցադրելու համար: Մեկուսացված էպիթելի բջիջները սերմնացվեցին պատրաստի աղիքների վրա չիպի սարքում (չիպի պատրաստում) և ամրացվեցին (չիպի պատրաստում) բջիջները: թաղանթ 0 (D0), գագաթային (AP) հոսքը սկսվում և պահպանվում է առաջին 2 օրվա ընթացքում (հոսք, AP, D0-D2): Բազոկողային (BL) հոսքը սկսվում է նաև ցիկլային ձգվող շարժումների հետ մեկտեղ (ձգում, հոսք, AP և BL), երբ ձևավորվում է ամբողջական 2D միաշերտ: ֆոգենեզ, D5): Ֆազային կոնտրաստ պատկերները ցույց են տալիս Caco-2 բջիջների ներկայացուցչական մորֆոլոգիան յուրաքանչյուր փորձարարական քայլում կամ ժամանակային կետում (կտրող գրաֆիկ, 100 մկմ): Չորս սխեմատիկ դիագրամներ, որոնք ցույց են տալիս աղիքների մորֆոգենեզի համապատասխան կասկադները (վերևի աջ): Սխեմատիկ գծիկներով սլաքները ցույց են տալիս հեղուկի մակերևույթի EMco-ի վերին պատկերի ուղղությունը: ft): Ներդիրը, որն ընդգծում է խոշորացված տարածքը (սպիտակ գծավոր տուփը) ցույց է տալիս վերականգնված միկրովիլիները 3D Caco-2 շերտի վրա (աջ):c, հաստատված Caco-2 3D-ի հորիզոնական ճակատային տեսք, կլաուդին (ZO-1, կարմիր) և շարունակական վրձինի եզրային թաղանթներ, որոնք պիտակավորված են F-ակտինի (կանաչ) միջուկային միջուկի (կանաչ) միջուկային բջիջների վրա: ամորձիների չիպեր: Միջին սխեմատիկ մատնանշող սլաքները ցույց են տալիս կիզակետային հարթության գտնվելու վայրը յուրաքանչյուր համաֆոկալ տեսքի համար:d, 3-րդ, 7-րդ, 9-րդ, 11-րդ և 13-րդ օրերին ֆազային կոնտրաստի մանրադիտակով ստացված չիպի վրա մշակված օրգանոիդների մորֆոլոգիական փոփոխությունների ժամանակային ընթացքը: 7.f օրը վերցված հատված, ծածկված իմունֆլյորեսցենտային պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս ցողունային բջիջների մարկերներ (LGR5;Մագենտա), գավաթային բջիջներ (MUC2; կանաչ), F-ակտին (մոխրագույն) և միջուկներ (ցիան) աղիքային չիպերի վրա աճեցված 3 օրվա ընթացքում, համապատասխանաբար (ձախ) և 13-օրյա (միջին) օրգանոիդներ էպիթելի շերտի վրա: Տես նաև Ընդլայնված տվյալների Նկար 3-ը, որն ընդգծում է LGR5-ի պատկերը, որը ցույց է տալիս epithelial շերտի վրա միկրոօրգանիզմներ: 3D օրգանոիդային էպիթելի ure (աջից)՝ հաստատված աղիքներում չիպի վրա՝ ներկելով պլազմային թաղանթը CellMask ներկով (աջից) կուլտուրայի 13-րդ օրը: Սանդղակի սանդղակը 50 մկմ է, եթե այլ բան նշված չէ:բ Վերատպված է հղումից թույլտվությամբ:2.Օքսֆորդի համալսարանի հրատարակչություն;գ Հարմարեցված է տեղեկանքի թույլտվությամբ.2.Օքսֆորդի համալսարանի հրատարակչություն;e և f հարմարեցված թույլտվությամբ՝ հղումով:12 Under Creative Commons License CC BY 4.0.
Չիպի վրա աղիքներում անհրաժեշտ է փոփոխել PDMS ծակոտկեն թաղանթի հիդրոֆոբ մակերեսը ECM-ի հաջող ծածկույթի համար: Այս արձանագրության մեջ մենք կիրառում ենք երկու տարբեր մեթոդներ՝ փոփոխելու PDMS թաղանթների հիդրոֆոբությունը: ե. Այնուամենայնիվ, օրգանոիդ էպիթելի միկրոհեղուկ մշակույթը պահանջում է մակերևույթի քիմիական վրա հիմնված ֆունկցիոնալացում՝ ECM սպիտակուցների արդյունավետ նստեցման հասնելու համար՝ հաջորդաբար պոլիէթիլենիմին (PEI) և գլյուտարալդեհիդ կիրառելով PDMS միկրոալիքներում: միկրոհեղուկ բջիջների կուլտուրան սկսվում է միայն միջավայրը ներթափանցելով վերին միկրոալիքի մեջ, մինչև բջիջները ձևավորեն ամբողջական միաշերտ, մինչդեռ ստորին միկրոալիքը պահպանում է ստատիկ պայմանները: Մակերեւույթի ակտիվացման և ECM ծածկույթի այս օպտիմիզացված մեթոդը թույլ է տալիս օրգանոիդային էպիթելի կցումը՝ առաջացնելով 3D մորֆոգենեզ PDMS մակերեսի վրա:
Transwell կուլտուրաները նաև պահանջում են ECM ծածկույթ մինչև բջիջների սերմացումը;Այնուամենայնիվ, Transwell կուլտուրաները չեն պահանջում բարդ նախնական մշակման քայլեր՝ ծակոտկեն ներդիրների մակերեսն ակտիվացնելու համար: Transwell ներդիրների վրա Caco-2 բջիջները աճեցնելու համար ծակոտկեն ներդիրների վրա ECM ծածկույթը արագացնում է տարանջատված Caco-2 բջիջների կցումը (<1 ժամ) և ամուր միացման արգելքի ձևավորումը (<1-2 օր): ներդիրներ, կցվում են թաղանթային մակերեսին (<3 ժ) և պահպանվում այնքան ժամանակ, մինչև օրգանոիդները ձևավորեն ամբողջական միաշերտ՝ պատնեշի ամբողջականությամբ:
In vitro 3D մորֆոգենեզը կարող է սկսվել՝ կիրառելով հեղուկի հոսքը հաստատված էպիթելի շերտի բազալերային կողմում: Չիպի վրա էպիթելի մորֆոգենեզը սկսվել է, երբ միջավայրը ներթափանցվել է վերին և ստորին միկրոալիքների մեջ (նկ. 3ա): Ծակոտկեն թաղանթներով կապված բջիջներին բավարար սննդանյութեր և շիճուկ ապահովելու և լուսանցքային կտրվածքային սթրես առաջացնելու համար մենք սովորաբար կիրառում ենք աղիքների մեջ կրկնակի հոսք չիպի վրա: Հիբրիդային չիպերում էպիթելի մոնաշերտեր պարունակող Transwell ներդիրները տեղադրվել են հիբրիդային չիպերի մեջ: Այնուհետև, միջավայրը կիրառվել է ծակոտկեն տրանսալեռնային ներդիրի տակ: երկու մշակութային հարթակներում բազալերային հոսքի մեկնարկից հետո:
Միկրոինժեներական 3D էպիթելի շերտերի մորֆոլոգիական առանձնահատկությունները կարող են վերլուծվել՝ կիրառելով տարբեր պատկերային եղանակներ, այդ թվում՝ ֆազային հակադրության մանրադիտակ, դիֆերենցիալ ինտերֆերենցի կոնտրաստային (DIC) մանրադիտակ, SEM կամ իմունֆլյուորեսցենտային համակցված միկրոսկոպիա (Նկարներ 3 և 4): PDMS-ի և պոլիեսթեր թաղանթների օպտիկական թափանցիկության շնորհիվ և՛ աղիքներ-չիպի ​​վրա, և՛ հիբրիդային չիպային հարթակները կարող են իրական ժամանակում in situ պատկերներ տրամադրել՝ առանց սարքի հատվածի կամ ապամոնտաժման անհրաժեշտության: Իմունֆլյորեսցենտային պատկերացում կատարելիս (Նկարներ 1, 3c, f և 4b-ի տիպիկ ֆիքսված բջիջներով) հաջորդում են Triton X-100-ը և 2% (wt/vol) տավարի շիճուկի ալբումինը (BSA): Կախված բջջի տեսակից, կարող են օգտագործվել տարբեր ֆիքսատիվներ, թափանցող միջոցներ և արգելափակող նյութեր: Առաջնային հակամարմինները, որոնք ուղղված են տոհմից կախված բջիջին կամ տարածաշրջանային մարկերներին, օգտագործվում են մատնանշելու համար բջիջները, որոնք անշարժացված են միջուկի վրա (հետևում են միջուկի վրա երկրորդ հակամարմինները: 4',6-դիամիդինո-2-ֆենիլեն) ինդոլ, DAPI) կամ F-ակտին (օրինակ՝ ֆլյուորեսցենտով պիտակավորված ֆալոիդին): Ֆլյուորեսցենտային վրա հիմնված կենդանի պատկերումը կարող է իրականացվել նաև տեղում՝ լորձի արտադրությունը հայտնաբերելու համար (նկ.1, «Բջջային տարբերակում» և «Աղիքների ֆիզիոլոգիա»), մանրէաբանական բջիջների պատահական գաղութացում (Նկար 1, «Հյուրընկալող-մանրէաբանական համատեղ մշակույթ»), իմունային բջիջների հավաքագրում (նկ. 1, «Հիվանդությունների մոդելավորում») կամ 3D էպիթելի ուրվագծերը, առանձնացնելով էպիթելի մորֆոլոգիան (նկ. 43): Ստորին միկրոալիքային շերտից մեկ շերտ, ինչպես նկարագրված է ref. Ինչպես ցույց է տրված Նկար 2-ում, 3D էպիթելի մորֆոլոգիան, ինչպես նաև միկրովիլիները գագաթային խոզանակի եզրագծի վրա կարող են տեսանելի լինել SEM-ի միջոցով (Նկար 3b): Տարբերակման մարկերների արտահայտությունը կարող է գնահատվել քանակական PCR5 կամ միաբջիջ չիպային բջիջների աճող RNA-ի կամ միաբջիջի 3-փոսիկ RNA բջիջների դեպքում: Brid chips-ը հավաքվում է տրիպսինիզացիայի միջոցով, այնուհետև օգտագործվում է մոլեկուլային կամ գենետիկ վերլուծության համար:
ա, Հիբրիդ չիպի մեջ աղիքային մորֆոգենեզի ինդուկցիայի աշխատանքի ընթացքը: Caco-2-ը և աղիքային օրգանոիդները օգտագործվում են այս արձանագրության մեջ՝ ցուցադրելու 3D մորֆոգենեզը հիբրիդային չիպերի հարթակում: Տարանջատված էպիթելի բջիջները ցանվել են Transwell-ի պատրաստված ներդիրներում (TW prep, տես ստորև բերված պոլիմեմբրանային բջիջները): բոլոր բջիջները մշակվել են ստատիկ պայմաններում (TW մշակույթ): 7 օր հետո մեկ Transwell ներդիրը, որը պարունակում է էպիթելի բջիջների 2D միաշերտ, ինտեգրվել է հիբրիդային չիպի մեջ՝ ներկայացնելու հիմքային հոսք (Flow, BL), որն ի վերջո հանգեցրել է 3D էպիթելային շերտի ստեղծմանը (մարդու օրգանների էպիթելային բջիջների նորմալ միկրոգրաֆիա ցույց տվող հակադրություն բջիջների մորֆոգենեզ): 103 տող) աճող հաստ աղիք յուրաքանչյուր փորձարարական քայլում կամ ժամանակային կետում: Վերին շերտերի սխեմաները ցույց են տալիս փորձնական կոնֆիգուրացիան յուրաքանչյուր քայլի համար:b, հիբրիդային չիպերը (ձախ սխեմատիկ) կարող են հանգեցնել օրգանոիդային էպիթելի բջիջների 3D մորֆոգենեզի՝ վերևից վար կոնֆոկալ միկրոսկոպիայի դիրքով և վերևից տարբեր դիրքերով, վերևից, Z-ի տարբեր դիրքերով:տե՛ս ճիշտ սխեմատիկ և համապատասխան կետագծերը):ցույց է տվել ակնհայտ ձևաբանական բնութագրեր: F-ակտին (ցիան), միջուկ (մոխրագույն): c, օրգանոիդից ստացված էպիթելային բջիջների ֆլյուորեսցենտային կոնֆոկալ միկրոգրաֆներ (3D անկյունային տեսարան)՝ աճեցված ստատիկ Տրանսհելում (TW; ներդիր սպիտակ գծավոր տուփի մեջ) ընդդեմ հիբրիդային չիպի (ամենամեծ ամբողջական պատկերը) համեմատելով 2D 2D լայն կտրվածքով ուղղահայաց տեսքը: ներդիր վերևի աջ անկյունում, «XZ») նաև ցույց է տալիս 2D և 3D առանձնահատկությունները: Սանդղակի սանդղակը, 100 μm.c Վերատպված է հղման թույլտվությամբ:4.Էլսեվիեր.
Վերահսկումները կարող են պատրաստվել նույն բջիջները (CACO-2 կամ աղիքային orestinoid էպիթելի բջիջներ) երկկողմանի միաձուլման պայմաններով պայմանական պայմաններով:
Փափուկ լիտոգրաֆիայի գործընթացը պետք է իրականացվի մաքուր սենյակում: Չիպի յուրաքանչյուր շերտի (վերին և ստորին շերտեր և թաղանթներ) և հիբրիդային չիպերի համար օգտագործվել են տարբեր ֆոտոդիմակներ և պատրաստվել առանձին սիլիկոնային վաֆլիների վրա, քանի որ միկրոալիքների բարձրությունները տարբեր են եղել: Չիպի վերին և ստորին միկրոալիքների թիրախային բարձրությունները չիպի վրա աղիքի վերին և ստորին միկրոալիքների թիրախային բարձրությունը կազմում է 500 մկմ: 200 մկմ.
Տեղադրեք 3 դյույմանոց սիլիկոնային վաֆլի ացետոնով ափսեի մեջ: Մեղմորեն պտտեք ափսեը 30 վայրկյան, այնուհետև օդով չորացրեք վաֆլան: Տեղափոխեք վաֆլը IPA-ով ափսեի մեջ, այնուհետև 30 վրկ պտտեք ափսեն մաքրելու համար:
Պիրանհայի լուծույթը (ջրածնի պերօքսիդի և խտացված ծծմբաթթվի խառնուրդ, 1:3 (vol/vol)) կարող է ընտրովի օգտագործվել սիլիցիումի վաֆլի մակերեսից օրգանական մնացորդների հեռացումը առավելագույնի հասցնելու համար:
Piranha-ի լուծույթը չափազանց քայքայիչ է և առաջացնում է ջերմություն: Անվտանգության լրացուցիչ միջոցներ են անհրաժեշտ: Թափոնների հեռացման համար թույլ տվեք լուծույթը սառչել և տեղափոխել մաքուր, չոր թափոնների տարայի մեջ: Օգտագործեք երկրորդական տարաներ և պատշաճ կերպով դրոշմեք թափոնների տարաները: Խնդրում ենք հետևել հաստատության անվտանգության ուղեցույցներին ավելի մանրամասն ընթացակարգերի համար:
Ջրազրկեք վաֆլիները՝ դրանք դնելով 200 °C տաք ափսեի վրա 10 րոպե: Ջրազրկելուց հետո վաֆլը հինգ անգամ թափահարեցին օդում, որպեսզի սառչի:
Լցնել ~ 10 գ ֆոտոռեզիստ SU-8 2100 մաքրված սիլիկոնային վաֆլի կենտրոնի վրա: Օգտագործեք պինցետ, որպեսզի ֆոտոռեզիստը հավասարաչափ տարածեք վաֆլի վրա: Երբեմն վաֆլը դրեք 65°C տաք ափսեի վրա, որպեսզի ֆոտոդիմացկունը ավելի քիչ կպչուն լինի և ավելի դյուրին տարածվի: Մի դրեք վաֆլան անմիջապես տաք ափսեի վրա:
SU-8-ը հավասարաչափ բաշխվել է վաֆլի վրա՝ պտտվող ծածկույթով: Ծրագրեք SU-8-ի մուտքային պտույտը 5–10 վրկ՝ տարածելու համար 500 պտ/րոպում 100 պտ/վրկ արագացումով: Հիմնական պտույտը սահմանեք 200 μm բարձրության վրա, հասնելով 50 մկմ հաստությամբ 1,500 ռ/րոպի համար (50 մկմ հաստությամբ 1,500 rpm-ի համար): Չիպի վրա փորոտիքի վերին շերտը, տես ստորև «Կրիտիկական քայլերը») սահմանված է 300 պտ/վրկ արագությամբ 30 վայրկյան 1200 պտ/րոպում:
Հիմնական պտտման արագությունը կարող է ճշգրտվել ըստ սիլիկոնային վաֆլի վրա SU-8 նախշի թիրախային հաստության:
Չիպի վրա աղիքների վերին շերտի համար 500 մկմ բարձրությամբ SU-8 նախշեր ստեղծելու համար այս տուփի պտտվող ծածկույթը և փափուկ թխման քայլերը (7 և 8) հաջորդաբար կրկնվել են (տես քայլ 9)՝ ստեղծելով SU-8 250 մկմ հաստությամբ երկու շերտ, որը կարելի է շերտավորել այս տուփի մեջ՝ 1 քայլով և ժոօզուրով: բարձր.
Փափուկ թխեք SU-8 պատված վաֆլիները՝ զգուշորեն դնելով վաֆլիները տաք ափսեի վրա 65 °C ջերմաստիճանում 5 րոպե, այնուհետև միացրեք կարգավորումը 95 °C և ինկուբացրեք ևս 40 րոպե:
Վերին միկրոալիքում SU-8 օրինաչափության 500 մկ բարձրության հասնելու համար կրկնեք 7-րդ և 8-րդ քայլերը՝ 250 մկմ հաստությամբ երկու SU-8 շերտեր ստեղծելու համար:
Օգտագործելով UV Mask Aligner, կատարեք լամպի փորձարկում՝ ըստ արտադրողի հրահանգների՝ վաֆլի ազդեցության ժամանակը հաշվարկելու համար:
Լուսարձակման ժամանակը որոշելուց հետո, լուսադիմակը տեղադրեք ուլտրամանուշակագույն դիմակի հավասարեցնողի դիմակ կրիչի վրա և տեղադրեք ֆոտոդիմակը SU-8 պատված վաֆլի վրա:
Տեղադրեք ֆոտոդիմակի տպագրված մակերեսը ուղղակիորեն սիլիկոնային վաֆլի SU-8 պատված կողմի վրա՝ նվազագույնի հասցնելու ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման ցրումը:
SU-8 ծածկված վաֆլի և լուսադիմակը ուղղահայաց բացահայտեք 260 մՋ/սմ2 ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցության տակ կանխորոշված ​​ազդեցության ժամանակի համար (տե՛ս այս տուփի քայլ 10-ը):
Ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումից հետո SU-8 ծածկված սիլիկոնային վաֆլիները թխվել են 65°C ջերմաստիճանում 5 րոպե և 95°C ջերմաստիճանում 15 րոպե յուրաքանչյուր տաք ափսեի վրա՝ 200 մկմ բարձրությամբ նախշեր պատրաստելու համար: Թխելուց հետո ժամանակը երկարացրեք 95°C-ում մինչև 30 րոպե՝ 500 մ բարձրությամբ նախշեր պատրաստելու համար:
Մշակողը լցնում են ապակյա ամանի մեջ, և թխած վաֆլը դրվում է ճաշատեսակի մեջ: SU-8 մշակողի ծավալը կարող է տարբեր լինել՝ կախված ապակե ափսեի չափից: Համոզվեք, որ օգտագործեք այնքան SU-8 ծրագրավորող՝ չբացահայտված SU-8-ն ամբողջությամբ հեռացնելու համար: Օրինակ՝ 150 մմ տրամագծով ապակյա աման օգտագործելիս 1 լ 208 մ ծավալով 1 լ 5 մլ տարողությամբ ապակե աման: մեղմ ռոտացիա:
Ողողեք մշակված կաղապարը ~10 մլ թարմ մշակողով, որին հաջորդում է IPA՝ լուծույթը ցողելով պիպետտի միջոցով:
Վաֆլը դրեք պլազմային մաքրիչի մեջ և 1,5 րոպեով ենթարկեք թթվածնային պլազմայի (մթնոլորտային գազ, թիրախային ճնշում 1 × 10−5 Torr, հզորությունը 125 Վտ) 1,5 րոպե:
Վաֆլերը դրեք վակուումային չորացուցիչի մեջ, որի ներսում ապակե սլայդ կա: Վաֆլիները և սլայդները կարող են տեղադրվել կողք կողքի: Եթե վակուումային չորացուցիչը ափսեի միջոցով բաժանված է մի քանի շերտերի, ապա սլայդները տեղադրեք ստորին խցիկում, իսկ վաֆլիները՝ վերին խցիկում: Կաթեք 100 μL trichlorosil, H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H2,H) ապակին սահեցրեք և վակուում կիրառեք սիլանիացման համար:
Սառեցված Caco-2 բջիջների սրվակը հալեցրեք 37°C ջրի բաղնիքում, այնուհետև հալված բջիջները տեղափոխեք T75 կոլբայի մեջ, որը պարունակում է 15 մլ 37°C նախապես տաքացված Caco-2 միջավայր:
Caco-2 բջիջները ~ 90% միախառնման դեպքում նախ տաքացրեք Caco-2 միջավայրը, PBS և 0,25% տրիպսին/1 մՄ EDTA 37°C ջրային բաղնիքում:
Շնչեք միջավայրը վակուումային ասպիրացիայի միջոցով: Բջիջները երկու անգամ լվացեք 5 մլ տաք PBS-ով` կրկնելով վակուումային ասպիրացիա և ավելացնելով թարմ PBS: