Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Դուք օգտագործում եք զննարկչի տարբերակ՝ CSS-ի սահմանափակ աջակցությամբ:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Բացի այդ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Ցուցադրում է միանգամից երեք սլայդներից բաղկացած կարուսել:Օգտագործեք «Նախորդ» և «Հաջորդ» կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդներով շարժվելու համար, կամ օգտագործեք վերջում գտնվող սլայդերի կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդների միջով անցնելու համար:
Արյունաուղեղային պատնեշը և արյունաուղեղային արգելքը կանխում են կենսաթերապևտիկ նյութերը կենտրոնական նյարդային համակարգում իրենց թիրախներին հասնելու համար՝ դրանով իսկ խոչընդոտելով նյարդաբանական հիվանդությունների արդյունավետ բուժմանը:Նոր ուղեղի փոխադրողներին in vivo հայտնաբերելու համար մենք ներկայացրեցինք T7 ֆագային պեպտիդային գրադարան և սերիական հավաքագրեցինք արյուն և ողնուղեղային հեղուկ (CSF)՝ օգտագործելով առնետների գիտակից մեծ լողավազանի մոդելը:Հատուկ ֆագային կլոնները մեծապես հարստացան ՔՀՀ-ում ընտրության չորս փուլերից հետո:Անհատական ​​թեկնածու պեպտիդների փորձարկումը ցույց է տվել CSF-ի ավելի քան 1000 անգամ հարստացում:Պեպտիդային միջնորդությամբ ուղեղին հասցնելու կենսաակտիվությունը հաստատվել է ուղեղային ողնուղեղում ամիլոիդ-β-ի մակարդակի 40% նվազմամբ՝ օգտագործելով BACE1 պեպտիդային արգելակիչը՝ կապված հայտնաբերված նոր տարանցիկ պեպտիդին:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ in vivo ֆագերի ընտրության մեթոդներով հայտնաբերված պեպտիդները կարող են օգտակար փոխադրամիջոցներ լինել մակրոմոլեկուլների ուղեղին թերապևտիկ ազդեցություն ունեցող համակարգային առաքման համար:
Կենտրոնական նյարդային համակարգի (CNS) նպատակային թերապիայի հետազոտությունը հիմնականում կենտրոնացած է օպտիմիզացված դեղամիջոցների և գործակալների հայտնաբերման վրա, որոնք ցուցադրում են կենտրոնական նյարդային համակարգի թիրախավորման հատկությունները, ավելի քիչ ջանքեր գործադրելով այն մեխանիզմների հայտնաբերման վրա, որոնք խթանում են դեղամիջոցի ակտիվ առաքումը ուղեղ:Սա սկսում է փոխվել այժմ, քանի որ դեղերի առաքումը, հատկապես խոշոր մոլեկուլները, ժամանակակից նյարդագիտության դեղամիջոցների զարգացման անբաժանելի մասն են կազմում:Կենտրոնական նյարդային համակարգի միջավայրը լավ պաշտպանված է ուղեղի անոթային պատնեշի համակարգով, որը բաղկացած է արյունաուղեղային արգելքից (BBB) ​​և արյունաուղեղային արգելքից (BCBB)1, ինչը դժվարացնում է ուղեղին դեղեր հասցնելը1,2:Ենթադրվում է, որ գրեթե բոլոր խոշոր մոլեկուլային դեղամիջոցները և փոքր մոլեկուլային դեղամիջոցների ավելի քան 98%-ը դուրս են գալիս ուղեղից3:Այդ իսկ պատճառով շատ կարևոր է բացահայտել ուղեղի տրանսպորտային նոր համակարգերը, որոնք ապահովում են թերապևտիկ դեղամիջոցների արդյունավետ և հատուկ առաքում դեպի Կենտրոնական նյարդային համակարգի 4,5:Այնուամենայնիվ, BBB-ն և BCSFB-ը նաև հիանալի հնարավորություն են ներկայացնում դեղերի առաքման համար, քանի որ դրանք ներթափանցում և ներթափանցում են ուղեղի բոլոր կառույցները նրա լայնածավալ անոթների միջոցով:Այսպիսով, ուղեղին առաքման ոչ ինվազիվ մեթոդների կիրառման ներկայիս ջանքերը հիմնականում հիմնված են ընկալիչների միջնորդավորված տրանսպորտի մեխանիզմի վրա (PMT)՝ օգտագործելով էնդոգեն BBB6 ընկալիչը:Չնայած տրանսֆրին ընկալիչի ուղու կիրառմամբ վերջին կարևոր ձեռքբերումներին7,8, անհրաժեշտ է կատարելագործված հատկություններով առաքման նոր համակարգերի հետագա զարգացում:Այդ նպատակով մեր նպատակն էր բացահայտել պեպտիդները, որոնք կարող են միջնորդել CSF-ի տեղափոխումը, քանի որ դրանք սկզբունքորեն կարող են օգտագործվել մակրոմոլեկուլներ CNS հասցնելու կամ ընկալիչների նոր ուղիներ բացելու համար:Մասնավորապես, ուղեղի անոթային համակարգի հատուկ ընկալիչները և փոխադրողները (BBB և BSCFB) կարող են ծառայել որպես պոտենցիալ թիրախներ կենսաթերապևտիկ դեղամիջոցների ակտիվ և հատուկ առաքման համար:Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկը (CSF) քորոիդային պլեքսուսի (CS) արտազատող արտադրանք է և անմիջական շփման մեջ է ուղեղի միջաստղային հեղուկի հետ ենթապարախնոիդային տարածության և փորոքային տարածության միջոցով4:Վերջերս ցույց է տրվել, որ ենթապարախնոիդալ ողնուղեղային հեղուկը չափից դուրս ցրվում է ուղեղի միջաստղային հատված9:Մենք հուսով ենք մուտք գործել պարենխիմային տարածություն՝ օգտագործելով այս ենթապարախնոիդային ներհոսքի տրակտը կամ անմիջապես BBB-ի միջոցով:Դրան հասնելու համար մենք իրականացրել ենք in vivo ֆագերի ընտրության կայուն ռազմավարություն, որն իդեալականորեն նույնացնում է այս երկու տարբեր ուղիներից որևէ մեկով տեղափոխվող պեպտիդները:
Այժմ մենք նկարագրում ենք in vivo ֆագերի ցուցադրման հաջորդական մեթոդ՝ CSF նմուշառմամբ՝ զուգորդված բարձր թողունակության հաջորդականությամբ (HTS)՝ գրադարանային ամենաբարձր բազմազանությամբ նախնական ընտրության փուլերը վերահսկելու համար:Սքրինինգ է իրականացվել գիտակից առնետների վրա՝ մշտապես տեղադրված մեծ ցիստեռնով (CM) կաննուլայով՝ արյան աղտոտումից խուսափելու համար:Կարևորն այն է, որ այս մոտեցումը ընտրում է ինչպես ուղեղի թիրախավորումը, այնպես էլ պեպտիդները, որոնք ունեն տրանսպորտային ակտիվություն ուղեղային անոթային պատնեշով:Մենք օգտագործեցինք T7 ֆագեր՝ իրենց փոքր չափի պատճառով (~60 նմ)10 և առաջարկեցինք, որ դրանք հարմար են վեզիկուլների տեղափոխման համար, որոնք թույլ են տալիս միջբջջային հատել էնդոթելային և/կամ էպիթելային-մեդուլլա պատնեշը:Պանինգի չորս փուլից հետո ֆագերի պոպուլյացիաները մեկուսացվեցին՝ ցույց տալով ուժեղ in vivo CSF-ի հարստացում և ուղեղային միկրոանոթների միացում:Կարևորն այն է, որ մենք կարողացանք հաստատել մեր բացահայտումները՝ ցույց տալով, որ նախընտրելի և քիմիապես սինթեզված լավագույն թեկնածու պեպտիդներն ի վիճակի են սպիտակուցային բեռը տեղափոխել ողնուղեղային հեղուկ:Նախ, CNS-ի ֆարմակոդինամիկական ազդեցությունները հաստատվել են առաջատար տարանցիկ պեպտիդը BACE1 պեպտիդի արգելակողի հետ համատեղելով:Ի հավելումն այն բանի, որ in vivo ֆունկցիոնալ սքրինինգի ռազմավարությունները կարող են բացահայտել ուղեղի փոխադրման նոր պեպտիդները՝ որպես արդյունավետ սպիտակուցային բեռնափոխադրողներ, մենք ակնկալում ենք, որ նմանատիպ ֆունկցիոնալ ընտրության մոտեցումները նույնպես կարևոր կդառնան ուղեղի փոխադրման նոր ուղիները բացահայտելու համար:
Հիմք ընդունելով ափսե ձևավորող միավորները (PFU), ֆագերի փաթեթավորման փուլից հետո նախագծվել և ստեղծվել է պատահական 12-մեր գծային T7 ֆագ պեպտիդների գրադարան՝ մոտավորապես 109 բազմազանությամբ (տես Նյութեր և մեթոդներ):Կարևոր է նշել, որ մենք ուշադիր վերլուծել ենք այս գրադարանը նախքան in vivo panning-ը:Ֆագերի գրադարանի նմուշների ՊՇՌ ուժեղացումը՝ օգտագործելով փոփոխված պրայմերներ, ստեղծեց ամպլիկոններ, որոնք ուղղակիորեն կիրառելի էին HTS-ի համար (Լրացուցիչ նկ. 1ա):Շնորհիվ ա) HTS11 հաջորդականության սխալների, բ) պրայմերների որակի վրա ազդեցության (NNK) 1-12 և գ) վայրի տիպի (wt) ֆագի (կմախքի ներդիրների) առկայության սպասման գրադարանում, հաջորդականության զտման ընթացակարգ է իրականացվել՝ հանելու միայն ստուգված հաջորդականության տեղեկատվությունը (Լրացուցիչ Նկ.):Զտիչի այս քայլերը վերաբերում են HTS հաջորդականության բոլոր գրադարաններին:Ստանդարտ գրադարանի համար ընդհանուր առմամբ ստացվել է 233,868 ընթերցում, որոնցից 39%-ը անցել է ֆիլտրի չափանիշները և օգտագործվել գրադարանի վերլուծության և հետագա փուլերի ընտրության համար (Լրացուցիչ նկար 1c–e):Ընթերցումները հիմնականում բազմապատիկ էին 3 բազային զույգերի երկարությամբ՝ 36 նուկլեոտիդների գագաթնակետով (Լրացուցիչ Նկ. 1c), հաստատելով գրադարանի դիզայնը (NNK) 1-12:Հատկանշական է, որ գրադարանի անդամների մոտավորապես 11%-ը պարունակում էր 12-չափ, վայրի տիպի (wt) ողնաշարի PAGISRELVDKL ներդիր, և հաջորդականությունների գրեթե կեսը (49%) պարունակում էր ներդիրներ կամ ջնջումներ:Գրադարանային գրադարանի HTS-ը հաստատեց գրադարանում պեպտիդների բարձր բազմազանությունը. պեպտիդների հաջորդականությունների ավելի քան 81%-ը հայտնաբերվել է միայն մեկ անգամ և միայն 1,5%-ն է ≥4 օրինակով (Լրացուցիչ նկար 2ա):Ամինաթթուների (aa) հաճախականությունները ռեպերտուարի բոլոր 12 դիրքերում լավ փոխկապակցված են NKK-ի այլասերված ռեպերտուարի կողմից առաջացած կոդոնների քանակի համար սպասվող հաճախականությունների հետ (Լրացուցիչ նկար 2b):Այս ներդիրներով կոդավորված aa մնացորդների դիտվող հաճախականությունը լավ փոխկապակցված է հաշվարկված հաճախականության հետ (r = 0,893) (Լրացուցիչ նկար 2c):Ներարկման համար ֆագային գրադարանների պատրաստումը ներառում է էնդոտոքսինի ուժեղացման և հեռացման քայլերը:Նախկինում ցույց է տրվել, որ սա պոտենցիալ նվազեցնում է ֆագային գրադարանների բազմազանությունը12,13:Հետևաբար, մենք հաջորդականացրինք ափսեով ուժեղացված ֆագային գրադարանը, որը ենթարկվել էր էնդոտոքսինի հեռացման և համեմատեցինք այն սկզբնական գրադարանի հետ՝ գնահատելու AA-ի հաճախականությունը:Ուժեղ փոխկապակցվածություն (r = 0,995) նկատվել է սկզբնական ավազանի և ուժեղացված և մաքրված լողավազանի միջև (Լրացուցիչ նկար 2d), ինչը ցույց է տալիս, որ T7 ֆագի օգտագործմամբ թիթեղների վրա ուժեղացված կլոնների միջև մրցակցությունը չի առաջացրել մեծ կողմնակալություն:Այս համեմատությունը հիմնված է յուրաքանչյուր գրադարանում տրիպեպտիդային մոտիվների հաճախականության վրա, քանի որ գրադարանների բազմազանությունը (~ 109) չի կարող ամբողջությամբ ֆիքսվել նույնիսկ HTS-ով:Աա-ի հաճախականության վերլուծությունը յուրաքանչյուր դիրքում բացահայտեց դիրքից կախված փոքր կողմնակալություն մուտքագրված ռեպերտուարի վերջին երեք դիրքերում (Լրացուցիչ նկար 2e):Եզրափակելով, մենք եզրակացրինք, որ գրադարանի որակն ու բազմազանությունը ընդունելի էին, և բազմազանության մեջ նկատվեցին միայն փոքր փոփոխություններ՝ պայմանավորված ընտրության մի քանի փուլերի միջև ֆագերի գրադարանների ուժեղացման և պատրաստման շնորհիվ:
Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի սերիական նմուշառումը կարող է իրականացվել՝ վիրահատական ​​ճանապարհով ներդնելով կանուլա գիտակից առնետների CM-ում՝ հեշտացնելու T7 ֆագի նույնականացումը, որը ներարկվում է ներերակային (iv) BBB-ի և/կամ BCSFB-ի միջոցով (նկ. 1a-b):Մենք օգտագործեցինք երկու անկախ սելեկցիոն թեւեր (թևեր A և B) in vivo ընտրության առաջին երեք փուլերում (նկ. 1c):Մենք աստիճանաբար բարձրացրինք ընտրության խստությունը՝ նվազեցնելով ընտրության առաջին երեք փուլերում ներմուծված ֆագերի ընդհանուր քանակը:Պլանավորման չորրորդ փուլի համար մենք միավորեցինք A և B ճյուղերի նմուշները և կատարեցինք երեք լրացուցիչ անկախ ընտրություն:Այս մոդելում T7 ֆագի մասնիկների in vivo հատկությունները ուսումնասիրելու համար վայրի տիպի ֆագը (PAGISRELVDKL հիմնական ներդիր) ներարկվել է առնետների մեջ պոչի երակի միջոցով:Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից և արյունից ֆագերի վերականգնումը տարբեր ժամանակային կետերում ցույց տվեց, որ համեմատաբար փոքր T7 իկոսաեդրալ ֆագերն ունեին արյան խցիկից արագ նախնական մաքրման փուլ (Լրացուցիչ նկար 3):Ելնելով ընդունված տիտրերից և առնետների արյան ծավալից՝ մենք հաշվարկեցինք, որ ընդամենը մոտավորապես 1% wt:Օգտագործված դոզայից ֆագը հայտնաբերվել է արյան մեջ ներերակային ներարկումից 10 րոպե անց:Այս սկզբնական արագ անկումից հետո չափվել է ավելի դանդաղ առաջնային մաքրում` 27,7 րոպե կիսամյակով:Կարևորն այն է, որ ՔՀՀ խցիկից դուրս են բերվել միայն շատ քիչ ֆագեր, ինչը ցույց է տալիս վայրի տիպի ֆագերի միգրացիայի ցածր ֆոն ՔՀՖ խցիկ (Լրացուցիչ նկար 3):Միջին հաշվով, արյան մեջ T7 ֆագի ընդամենը 1 x 10-3% տիտր և սկզբնական ինֆուզիոն ֆագերի 4 x 10-8% հայտնաբերվել են ողնուղեղային հեղուկում ամբողջ նմուշառման ժամանակահատվածում (0-250 րոպե):Հատկանշական է, որ ողնուղեղային հեղուկում վայրի տիպի ֆագի կես կյանքը (25,7 րոպե) նման էր արյան մեջ դիտվածին:Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ CSF-ի բաժանմունքն արյունից բաժանող պատնեշը անձեռնմխելի է CM-cannulated առնետների մոտ, ինչը թույլ է տալիս in vivo ֆագերի գրադարանների ընտրությունը բացահայտելու կլոնները, որոնք հեշտությամբ տեղափոխվում են արյունից ՔՀՖ խցիկ:
ա) Մեծ ջրավազանից ողնուղեղային հեղուկի (CSF) կրկնակի նմուշառման մեթոդի ստեղծում:բ) Դիագրամ, որը ցույց է տալիս կենտրոնական նյարդային համակարգի (CNS) պատնեշի բջջային դիրքը և ընտրության ռազմավարությունը, որն օգտագործվում է պեպտիդների հայտնաբերման համար, որոնք անցնում են արյունաուղեղային արգելքը (BBB) ​​և արյունաուղեղային արգելքը:գ) In vivo ֆագերի ցուցադրման սքրինինգի սխեմա:Ընտրության յուրաքանչյուր փուլում ֆագերը (կենդանիների նույնացուցիչները նետերի ներսում) ներարկվել են ներերակային:Երկու անկախ այլընտրանքային մասնաճյուղեր (A, B) պահվում են առանձին՝ մինչև ընտրության 4-րդ փուլը։Ընտրության 3-րդ և 4-րդ փուլերի համար ՔՀՀ-ից արդյունահանված յուրաքանչյուր ֆագի կլոն ձեռքով հաջորդականացվել է:դ) Արյունից (կարմիր շրջաններ) և ողնուղեղային հեղուկից (կանաչ եռանկյունիներ) մեկուսացված ֆագերի կինետիկա ընտրության առաջին փուլի ընթացքում երկու կլանված առնետների մեջ T7 պեպտիդային գրադարանի ներերակային ներարկումից հետո (2 x 1012 ֆագ/կենդանի):Կապույտ քառակուսիները ցույց են տալիս արյան մեջ ֆագի միջին սկզբնական կոնցենտրացիան՝ հաշվարկված ներարկված ֆագի քանակից՝ հաշվի առնելով արյան ընդհանուր ծավալը։Սև քառակուսիները ցույց են տալիս արյան ֆագերի կոնցենտրացիաներից ստացված y գծի հատման կետը:(ե, զ) Ներկայացրե՛ք պեպտիդում հայտնաբերված բոլոր հնարավոր համընկնող եռապեպտիդային մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը և բաշխումը:Ցուցադրված է 1000 ընթերցմամբ հայտնաբերված մոտիվների թիվը։Զգալիորեն (p <0,001) հարստացված մոտիվները նշված են կարմիր կետերով։(ե) Հարաբերական ցրված գծապատկեր, որը համեմատում է ներարկված գրադարանի տրիպեպտիդային մոտիվի հարաբերական հաճախականությունը #1.1 և #1.2 կենդանիների արյունից ստացված ֆագերի հետ:զ) Արյան և ողնուղեղային հեղուկի մեջ մեկուսացված կենդանական ֆագերի տրիպեպտիդների #1.1 և #1.2 մոտիվների հարաբերական հաճախականությունները համեմատող հարաբերական ցրում:(g, h) Արյունով հարստացված ֆագի ID-ի հաջորդականության ներկայացում (g) համեմատ ներարկված գրադարանների և CSF-ով հարստացված ֆագի (h) արյան համեմատ երկու կենդանիների in vivo ընտրության փուլից հետո:Մեկ տառանոց կոդի չափը ցույց է տալիս, թե որքան հաճախ է այդ ամինաթթուն հայտնվում այդ դիրքում:Կանաչ = բևեռային, մանուշակագույն = չեզոք, կապույտ = հիմնական, կարմիր = թթվային և սև = հիդրոֆոբ ամինաթթուներ:Նկար 1a, b-ը նախագծվել և պատրաստվել է Էդուարդ Ուրիչի կողմից:
Մենք ներարկեցինք ֆագի պեպտիդային գրադարան երկու CM գործիքային առնետների (կլադեր A և B) և մեկուսացրինք ողնուղեղային հեղուկից և արյունից ֆագ (Նկար 1դ):Գրադարանի սկզբնական արագ մաքրումը ավելի քիչ էր արտահայտված՝ համեմատած վայրի տիպի ֆագերի հետ:Երկու կենդանիների մեջ ներարկված գրադարանի միջին կիսամյակը արյան մեջ եղել է 24,8 րոպե, որը նման է վայրի տիպի ֆագին, և 38,5 րոպե CSF-ում:Յուրաքանչյուր կենդանուց արյան և ողնուղեղային հեղուկի ֆագի նմուշները ենթարկվել են HTS-ի և բոլոր հայտնաբերված պեպտիդները վերլուծվել են կարճ եռապեպտիդային մոտիվների առկայության համար:Տրիպեպտիդային մոտիվներն ընտրվել են, քանի որ դրանք նվազագույն հիմք են ապահովում կառուցվածքի ձևավորման և պեպտիդ-սպիտակուց փոխազդեցության համար14,15:Մենք լավ հարաբերակցություն գտանք մոտիվների բաշխման մեջ ներարկված ֆագերի գրադարանի և երկու կենդանիների արյունից արդյունահանված կլոնների միջև (նկ. 1e):Տվյալները ցույց են տալիս, որ գրադարանի կազմը արյան խցիկում միայն փոքր-ինչ հարստացված է:Ամինաթթուների հաճախականությունները և կոնսենսուսային հաջորդականությունները հետագայում վերլուծվել են յուրաքանչյուր դիրքում՝ օգտագործելով Weblogo16 ծրագրաշարի հարմարեցումը:Հետաքրքիր է, որ մենք հայտնաբերեցինք արյան գլիցինի մնացորդների ուժեղ հարստացում (նկ. 1գ):Երբ արյունը համեմատվել է CSF-ից ընտրված կլոնների հետ, նկատվել է մոտիվների ուժեղ ընտրություն և որոշ ապընտրվածություն (նկ. 1f), և որոշ ամինաթթուներ նախընտրելիորեն առկա են եղել 12 անդամի նախապես որոշված ​​դիրքերում (նկ. 1h):Հատկանշական է, որ առանձին կենդանիները զգալիորեն տարբերվում էին ողնուղեղային հեղուկում, մինչդեռ արյան գլիցինի հարստացումը նկատվում էր երկու կենդանիների մոտ (Լրացուցիչ նկ. 4ա–ժ):Կենդանիների թիվ 1.1 և #1.2 ողնուղեղային հեղուկում հաջորդականության տվյալների խիստ զտումից հետո ստացվել են ընդհանուր առմամբ 964 և 420 եզակի 12-մեր պեպտիդներ (Լրացուցիչ նկ. 1d–e):Մեկուսացված ֆագերի կլոնները ուժեղացվել են և ենթարկվել in vivo ընտրության երկրորդ փուլի:Ընտրության երկրորդ փուլից արդյունահանված ֆագերը ենթարկվել են HTS-ի յուրաքանչյուր կենդանու մոտ, և բոլոր հայտնաբերված պեպտիդները օգտագործվել են որպես մոտիվների ճանաչման ծրագրի մուտքագրում եռապեպտիդային մոտիվների առաջացումը վերլուծելու համար (նկ. 2a, b, ef):Համեմատած ՔՀՖ-ից վերականգնված ֆագի առաջին ցիկլի հետ, մենք նկատեցինք Ա և Բ ճյուղերում ՔՀՀ-ի բազմաթիվ մոտիվների հետագա ընտրություն և ապաընտրում (նկ. 2):Ցանցի նույնականացման ալգորիթմ է կիրառվել՝ որոշելու համար, թե արդյոք դրանք ներկայացնում են հետևողական հաջորդականության տարբեր օրինաչափություններ:Հստակ նմանություն է նկատվել 12-չափ հաջորդականությունների միջև, որոնք վերականգնվել են ՔՀՀ-ի կողմից այլընտրանքային A կլադում (նկ. 2c, d) և կլադի B-ում (նկ. 2g, h):Յուրաքանչյուր ճյուղում համախմբված վերլուծությունը բացահայտեց 12-մեր պեպտիդների ընտրության տարբեր պրոֆիլներ (Լրացուցիչ Նկ. 5c,d) և CSF/արյան տիտր հարաբերակցության աճ ժամանակի ընթացքում համախմբված կլոնների համար ընտրության երկրորդ փուլից հետո՝ համեմատած ընտրության առաջին փուլի հետ (Լրացուցիչ նկար 5e):)
Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի մոտիվների և պեպտիդների հարստացում in vivo ֆունկցիոնալ ֆագերի ցուցադրման երկու հաջորդական փուլերով:
Բոլոր ողնուղեղային հեղուկի բոլոր ֆագերը, որոնք վերականգնվել են յուրաքանչյուր կենդանու առաջին փուլից (#1.1 և #1.2 կենդանիներ) միավորվել են, ուժեղացվել, HT-հերթականացվել և նորից ներարկվել միասին (2 x 1010 ֆագ/կենդանի) 2 SM կլանված առնետ (#1.1 → #):2.1 և 2.2, 1.2 → 2.3 և 2.4):(a,b,e,f) Հարաբերակցական ցրված գծագրեր, որոնք համեմատում են CSF-ից ստացված բոլոր ֆագերի տրիպեպտիդային մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը առաջին և երկրորդ ընտրության փուլերում:Մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը և բաշխումը, որոնք ներկայացնում են բոլոր հնարավոր համընկնող տրիպեպտիդները, որոնք հայտնաբերված են պեպտիդներում երկու կողմնորոշումներով:Ցուցադրված է 1000 ընթերցմամբ հայտնաբերված մոտիվների թիվը։Մոտիվները, որոնք զգալիորեն (p < 0,001) ընտրվել կամ բացառվել են համեմատվող գրադարաններից մեկում, ընդգծված են կարմիր կետերով:(c, d, g, h) CSF-ով հարուստ բոլոր 12 ամինաթթուների երկար հաջորդականությունների հաջորդականության պատկերանշանը` հիմնված in vivo ընտրության 2-րդ և 1-ին փուլերի վրա:Մեկ տառանոց կոդի չափը ցույց է տալիս, թե որքան հաճախ է այդ ամինաթթուն հայտնվում այդ դիրքում:Լոգոտիպը ներկայացնելու համար առանձին կենդանիներից արդյունահանվող CSF հաջորդականությունը համեմատվում է ընտրության երկու փուլերի միջև և ցուցադրվում են երկրորդ փուլի հարստացված հաջորդականությունները.Առավել հարստացված ամինաթթուները տվյալ դիրքում (c, d) կենդանիների թիվ.2.1 և ոչ.2.2 կամ (g, h) կենդանիների թիվ.2.3 և ոչ.2.4-ը ներկայացված են գունավոր:Կանաչ = բևեռային, մանուշակագույն = չեզոք, կապույտ = հիմնական, կարմիր = թթվային և սև = հիդրոֆոբ ամինաթթուներ:
Ընտրության երրորդ փուլից հետո մենք հայտնաբերեցինք 124 եզակի պեպտիդային հաջորդականություն (#3.1 և #3.2) 332 CSF-ով վերականգնված ֆագերի կլոններից, որոնք մեկուսացված էին երկու կենդանիներից (Լրացուցիչ նկար 6ա):LGSVS հաջորդականությունը (18,7%) ունեցել է ամենաբարձր հարաբերական համամասնությունը, որին հաջորդում են վայրի տիպի ներդիրները PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) և SARGSWREIVSLS (2,2%):Վերջին չորրորդ փուլում մենք միավորեցինք երեք առանձին կենդանիներից երկու անկախ ընտրված ճյուղեր (նկ. 1c):CSF-ից վերականգնված 925 հաջորդականացված ֆագային կլոններից չորրորդ փուլում մենք գտանք 64 եզակի պեպտիդային հաջորդականություն (Լրացուցիչ Նկ. 6b), որոնց թվում վայրի տիպի ֆագերի հարաբերական մասնաբաժինը նվազել է մինչև 0.8%:Չորրորդ փուլում ՔՀՀ-ի ամենատարածված կլոններն էին LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) և 3.6%):%)):Ընտրված պեպտիդների երկարության միջակայքը պայմանավորված է նուկլեոտիդային ներդիրներով/ջնջումներով կամ գրադարանային այբբենարաններում վաղաժամ դադարեցման կոդոններով, երբ օգտագործվում են այլասերված կոդոններ NNK գրադարանի նախագծման համար:Վաղաժամ կանգառի կոդոնները առաջացնում են ավելի կարճ պեպտիդներ և ընտրվում են, քանի որ դրանք պարունակում են բարենպաստ aa մոտիվ:Ավելի երկար պեպտիդներ կարող են առաջանալ սինթետիկ գրադարանների պրայմերներում տեղադրումների/ջնջումների արդյունքում:Սա տեղադրում է նախագծված կանգառի կոդոնը շրջանակից դուրս և կարդում է այն մինչև նոր կանգառ կոդոն հայտնվի հոսանքին ներքև:Ընդհանուր առմամբ, մենք հաշվարկել ենք հարստացման գործակիցները բոլոր չորս ընտրական փուլերի համար՝ համեմատելով մուտքային տվյալները նմուշի ելքային տվյալների հետ:Սքրինինգի առաջին փուլի համար մենք օգտագործել ենք վայրի տիպի ֆագի տիտրերը որպես ոչ հատուկ ֆոնային հղում:Հետաքրքիր է, որ CSF-ի առաջին ցիկլում բացասական ֆագերի ընտրությունը շատ ուժեղ էր, բայց ոչ արյան մեջ (նկ. 3ա), ինչը կարող է պայմանավորված լինել պեպտիդային գրադարանի անդամների մեծ մասի պասիվ դիֆուզիայի ցածր հավանականությամբ ՔՀՖ խցիկում կամ հարաբերական ֆագերը հակված են ավելի արդյունավետ կերպով պահվել կամ հեռացվել արյան հոսքից, քան բակտերիոֆագները:Այնուամենայնիվ, պանինգի երկրորդ փուլում CSF-ում ֆագերի ուժեղ ընտրություն նկատվեց երկու կլադներում, ինչը ենթադրում է, որ նախորդ փուլը հարստացել էր ֆագերով, որոնք ցուցադրում էին ՔՀՖ-ի կլանումը խթանող պեպտիդներ (նկ. 3ա):Կրկին, առանց արյան զգալի հարստացման:Նաև երրորդ և չորրորդ փուլերում ֆագերի կլոնները զգալիորեն հարստացել են ՔՀՀ-ով:Համեմատելով յուրաքանչյուր յուրահատուկ պեպտիդային հաջորդականության հարաբերական հաճախականությունը ընտրության վերջին երկու փուլերի միջև՝ մենք պարզեցինք, որ հաջորդականություններն էլ ավելի հարստացան ընտրության չորրորդ փուլում (նկ. 3b):Ընդհանուր 931 եռապեպտիդային մոտիվներ արդյունահանվել են բոլոր 64 եզակի պեպտիդային հաջորդականություններից՝ օգտագործելով երկու պեպտիդային կողմնորոշումները:Չորրորդ փուլի առավել հարստացված մոտիվներն ավելի մանրակրկիտ ուսումնասիրվել են իրենց հարստացման պրոֆիլների համար բոլոր փուլերում՝ համեմատած ներարկված գրադարանի հետ (կտրվածք՝ 10% հարստացում) (Լրացուցիչ Նկար 6c):Ընտրության ընդհանուր օրինաչափությունները ցույց են տվել, որ ուսումնասիրված մոտիվների մեծ մասը հարստացել է ընտրության երկու ճյուղերի բոլոր նախորդ փուլերում:Այնուամենայնիվ, որոշ մոտիվներ (օրինակ՝ SGL, VSG, LGS GSV) հիմնականում եղել են այլընտրանքային A կլադից, մինչդեռ մյուսները (օրինակ՝ FGW, RTN, WGF, NTR) հարստացել են այլընտրանքային B կլայդով:
CSF-ով հարստացված ֆագով ցուցադրվող պեպտիդների և բիոտինիլացված առաջատար պեպտիդների CSF-ի փոխադրման վավերացում՝ կապված streptavidin-ի բեռների հետ:
ա) Հարստացման գործակիցները հաշվարկված են բոլոր չորս փուլերում (R1-R4)՝ հիմնված ներարկված (մուտք = I) ֆագի (PFU) տիտրերի և CSF ֆագերի որոշված ​​տիտրերի վրա (ելք = O):Վերջին երեք ռաունդների (R2-R4) հարստացման գործակիցները հաշվարկվել են՝ համեմատելով նախորդ փուլի և առաջին փուլի (R1) քաշային տվյալների հետ:Բաց ձողերը ողնուղեղային հեղուկ են, ստվերավորված շերտերը՝ պլազմա:(***p<0.001, հիմնված Student's t-test-ի վրա):(բ) Ամենաառատ ֆագային պեպտիդների ցանկը` դասակարգված ըստ նրանց հարաբերական համամասնության բոլոր ֆագերի, որոնք հավաքվել են ՔՀՀ-ում ընտրության 4-րդ փուլից հետո:Ամենատարածված վեց ֆագային կլոնները ընդգծված են գույնով, համարակալված և դրանց հարստացման գործոններով ընտրության (ներդիրների) 3-րդ և 4-րդ փուլերի միջև:(գ, դ) Ֆագերի վեց առավել հարստացված կլոնները, դատարկ ֆագի և ծնողական ֆագի պեպտիդային գրադարանները 4-րդ փուլից վերլուծվել են առանձին-առանձին ՔՀՀ նմուշառման մոդելում:ՔՀՀ-ի և արյան նմուշները հավաքվել են նշված ժամային կետերում:(գ) հավասար քանակությամբ 6 թեկնածու ֆագի կլոններ (2 x 1010 ֆագեր/կենդանիներ), դատարկ ֆագեր (#1779) (2 x 1010 ֆագեր/կենդանիներ) և ֆոնդային ֆագ պեպտիդային գրադարաններ (2 x 1012 ֆագեր/կենդանիներ): Ներարկեք առնվազն 3 սմ-ով կենդանու պոչը, որը կարելի է առանձնացնել մինչև 3 սմ:Ժամանակի ընթացքում ցուցադրված է յուրաքանչյուր ներարկված ֆագի կլոնի և ֆագի պեպտիդային գրադարանի CSF ֆարմակոկինետիկան:(դ) ցույց է տալիս միջին CSF/արյուն հարաբերակցությունը բոլոր վերականգնված ֆագերի/մլ նմուշառման ժամանակի ընթացքում:(ե) Չորս սինթետիկ առաջատար պեպտիդներ և մեկ խառնված կոնտրոլ կապվել են բիոտինի հետ streptavidin-ին իրենց N-վերջնակի միջոցով (տետրամերի ցուցադրում), որին հաջորդում է ներարկումը (պոչի երակ iv, 10 մգ streptavidin/kg):Առնվազն երեք ինտուբացված առնետ (N = 3):)ՔՀՀ-ի նմուշները հավաքվել են նշված ժամանակային կետերում, և streptavidin-ի կոնցենտրացիաները չափվել են CSF anti-streptavidin ELISA-ով (nd = չի հայտնաբերվել):(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, հիմնված ANOVA թեստի վրա):զ) Առավել հարստացված ֆագային պեպտիդային կլոնի #2002 (մանուշակագույն) ամինաթթուների հաջորդականության համեմատությունը ընտրության 4-րդ փուլից ընտրված այլ ֆագային պեպտիդային կլոնների հետ:Նույնական և նմանատիպ ամինաթթուների բեկորները գունավոր կոդավորված են:
Չորրորդ փուլի բոլոր հարստացված ֆագերից (նկ. 3b) ընտրվել են վեց թեկնածու կլոններ՝ ՔՀՀ նմուշառման մոդելում հետագա անհատական ​​վերլուծության համար:Հավասար քանակությամբ վեց թեկնածու ֆագ, դատարկ ֆագ (առանց ներդիր) և պրոֆագ պեպտիդային գրադարաններ ներարկվել են երեք կաննուլացված CM կենդանիների, և ֆարմակոկինետիկան որոշվել է CSF (նկ. 3c) և արյան (Լրացուցիչ նկ. 7) վերլուծություններում:Փորձարկված բոլոր ֆագային կլոնները թիրախավորել են CSF-ի բաժանմունքը 10-1000 անգամ ավելի բարձր մակարդակի վրա, քան դատարկ հսկիչ ֆագի մակարդակը (#1779):Օրինակ, #2020 և #2077 կլոններն ունեին մոտ 1000 անգամ ավելի բարձր CSF տիտր, քան վերահսկիչ ֆագը:Յուրաքանչյուր ընտրված պեպտիդի ֆարմակոկինետիկ պրոֆիլը տարբեր է, բայց բոլորն էլ ունեն CSF-ի տնամերձման բարձր ունակություն:Մենք ժամանակի ընթացքում նկատեցինք մշտական ​​նվազում #1903 և #2011 կլոնների համար, մինչդեռ #2077, #2002 և #2009 կլոնների համար առաջին 10 րոպեների ընթացքում աճը կարող է ցույց տալ ակտիվ փոխադրում, սակայն անհրաժեշտ է ստուգել:#2020, #2002 և #2077 կլոնները կայունացել են բարձր մակարդակներում, մինչդեռ #2009 կլոնի CSF կոնցենտրացիան նախնական աճից հետո դանդաղորեն նվազել է:Այնուհետև մենք համեմատեցինք CSF-ի յուրաքանչյուր թեկնածուի հարաբերական հաճախականությունը նրա արյան կոնցենտրացիայի հետ (նկ. 3d):ՔՀՀ յուրաքանչյուր թեկնածուի միջին տիտրի հարաբերակցությունը նրա արյան տիտրի հետ բոլոր նմուշառման ժամանակներում ցույց է տվել, որ վեց թեկնածուներից երեքը զգալիորեն հարստացել են արյան ՔՀՀ-ով:Հետաքրքիր է, որ #2077 կլոնը ցույց է տվել արյան ավելի բարձր կայունություն (Լրացուցիչ նկար 7):Հաստատելու համար, որ պեպտիդներն իրենք ի վիճակի են ակտիվորեն փոխադրել այլ բեռներ, բացի ֆագային մասնիկներից, ՔՀՀ խցիկ, մենք սինթեզեցինք չորս առաջատար պեպտիդներ, որոնք ածանցյալ էին բիոտինով N-վերնամասում, որտեղ պեպտիդները միանում են ֆագի մասնիկին:Բիոտինիլացված պեպտիդները (թիվ 2002, 2009, 2020 և 2077) միացվել են streptavidin-ի (SA) հետ՝ ստանալով ֆագերի երկրաչափությունը որոշակիորեն նմանող մուլտիմերային ձևեր:Այս ձևաչափը նաև թույլ տվեց մեզ չափել SA-ի ազդեցությունը արյան մեջ և ողնուղեղային հեղուկում՝ որպես բեռնափոխադրող սպիտակուցային պեպտիդներ:Կարևորն այն է, որ ֆագերի տվյալները հաճախ կարող են վերարտադրվել, երբ սինթետիկ պեպտիդները կիրառվել են այս SA-կոնյուգացված ձևաչափով (նկ. 3e):Խառնված պեպտիդներն ունեին ավելի քիչ նախնական ազդեցություն և ավելի արագ CSF մաքրում 48 ժամվա ընթացքում աննկատելի մակարդակներով:Այս պեպտիդ ֆագային կլոնների CSF տարածություն առաքման ուղիների մասին պատկերացում կազմելու համար մենք վերլուծել ենք ֆագային պեպտիդների առանձին հարվածների տեղայնացումը՝ օգտագործելով իմունոհիստոքիմիան (IHC)՝ ուղղակիորեն հայտնաբերելու ֆագի մասնիկները ներերակային ներարկումից 1 ժամ հետո in vivo:Հատկանշական է, որ #2002, #2077 և #2009 կլոնները կարող էին հայտնաբերվել ուղեղի մազանոթներում ուժեղ գունավորմամբ, մինչդեռ հսկիչ ֆագը (#1779) և #2020 կլոնը չհայտնաբերվեցին (Լրացուցիչ նկար 8):Սա ենթադրում է, որ այս պեպտիդները նպաստում են ուղեղի վրա ազդեցությանը հենց հատելով BBB-ը:Այս վարկածը ստուգելու համար անհրաժեշտ է լրացուցիչ մանրամասն վերլուծություն, քանի որ BSCFB երթուղին նույնպես կարող է ներգրավված լինել:Առավել հարստացված կլոնի (#2002) ամինաթթուների հաջորդականությունը համեմատելով այլ ընտրված պեպտիդների հետ, նշվեց, որ դրանցից ոմանք ունեն նմանատիպ ամինաթթուների ընդարձակումներ, ինչը կարող է ցույց տալ նմանատիպ փոխադրման մեխանիզմ (նկ. 3f):
Շնորհիվ իր յուրահատուկ պլազմային պրոֆիլի և CSF-ի ժամանակի ընթացքում զգալի աճի, ֆագի ցուցադրման կլոն #2077 հետագայում ուսումնասիրվեց ավելի երկար 48 ժամվա ընթացքում և կարողացավ վերարտադրել CSF-ի արագ աճը, որը դիտվում էր SA-ի կայուն մակարդակների հետ կապված (նկ. 4ա):Ինչ վերաբերում է հայտնաբերված այլ ֆագային կլոններին, #2077-ը խիստ ներկվել է ուղեղի մազանոթների համար և ցույց է տվել զգալի կոլոկալիզացիա մազանոթային մարկերային լեկտինով, երբ դիտվել է ավելի բարձր լուծաչափով և, հնարավոր է, որոշակի ներկում պարենխիմային տարածությունում (Նկար 4b):Հետաքննելու համար, թե արդյոք պեպտիդով միջնորդավորված դեղաբանական ազդեցությունները կարելի է ձեռք բերել Կենտրոնական նյարդային համակարգի վրա, մենք կատարեցինք փորձ, որտեղ i) #2077 տարանցիկ պեպտիդի և ii) BACE1 արգելակիչ պեպտիդի բիոտինիլացված տարբերակները խառնվեցին SA-ի հետ երկու տարբեր հարաբերակցությամբ:Մի համակցության համար մենք օգտագործեցինք միայն BACE1 պեպտիդային արգելակիչը, իսկ մյուսի համար օգտագործեցինք BACE1 պեպտիդային ինհիբիտորի 1:3 հարաբերակցությունը #2077 պեպտիդին:Երկու նմուշներն էլ ներարկվել են ներերակային և ժամանակի ընթացքում չափվել են բետա-ամիլոիդ պեպտիդ 40-ի (Աբետա40) արյան և ողնուղեղային հեղուկի մակարդակները:Abeta40-ը չափվել է CSF-ում, քանի որ այն արտացոլում է BACE1 արգելակումը ուղեղի պարենխիմայում:Ինչպես և սպասվում էր, երկու համալիրներն էլ զգալիորեն նվազեցրին Abeta40-ի արյան մակարդակը (նկ. 4c, d):Այնուամենայնիվ, միայն նմուշները, որոնք պարունակում են պեպտիդ No.2077-ը և BACE1 պեպտիդի ինհիբիտորը, որը զուգորդվում է SA-ին, առաջացրել է Abeta40-ի զգալի նվազում ողնուղեղային հեղուկում (նկ. 4c):Տվյալները ցույց են տալիս, որ պեպտիդ թիվ.2077-ն ի վիճակի է 60 կԴա SA սպիտակուցը տեղափոխել կենտրոնական նյարդային համակարգի մեջ, ինչպես նաև դեղաբանական ազդեցություն է առաջացնում BACE1 պեպտիդի SA-կոնյուգացված ինհիբիտորներով:
(ա) T7 ֆագի կլոնային ներարկում (2 × 10 ֆագ/կենդանի), որը ցույց է տալիս CSF պեպտիդ #2077 (RLSSVDSDLSGC) և չներարկված հսկիչ ֆագի (#1779) երկարաժամկետ ֆարմակոկինետիկ պրոֆիլները առնվազն երեք CM-ինտուբացված առնետների մոտ:բ) ֆագով ներարկված առնետների (2 × 10 10 ֆագ/կենդանի) ներկայացուցչական կեղևային միկրոանոթների կոնֆոկալ մանրադիտակային պատկեր, որը ցույց է տալիս պեպտիդ #2077-ի և անոթների (լեկտինի) հակագունավորումը:Այս ֆագային կլոնները ներարկվել են 3 առնետների և թույլ են տվել շրջանառել 1 ժամ առաջ պերֆուզիայից առաջ:Ուղեղները կտրվեցին և ներկվեցին պոլիկլոնալ FITC-պիտակավորված հակամարմիններով՝ T7 ֆագային կապսիդի դեմ:Պերֆուզիայից և հետագա ֆիքսացիայից տասը րոպե առաջ DyLight594 պիտակավորված լեկտինը ներարկվել է ներերակային:Լյումինեսցենտային պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս միկրոանոթների լուսային կողմի լեկտինի ներկումը (կարմիր) և ֆագերը (կանաչ) մազանոթների լույսում և ուղեղի պերիվասկուլյար հյուսվածքներում:Սանդղակի սանդղակը համապատասխանում է 10 մկմ:(գ, դ) Biotinylated BACE1 արգելակող պեպտիդը միայնակ կամ բիոտինիլացված տարանցիկ պեպտիդ #2077-ի հետ զուգակցվել է streptavidin-ի հետ, որին հաջորդում է առնվազն երեք CM առնետների ներերակային ներարկում (10 մգ streptavidin/kg):BACE1 պեպտիդային արգելակիչով Aβ40-ի կրճատումը չափվել է Aβ1-40 ELISA-ով արյան (կարմիր) և ողնուղեղային հեղուկում (նարնջագույն) նշված ժամանակային կետերում:Ավելի լավ պարզության համար գրաֆիկի վրա գծված է կետագիծ 100% մասշտաբով:(գ) Արյան մեջ Aβ40-ի (կարմիր եռանկյուններ) և ողնուղեղային հեղուկի (նարնջագույն եռանկյունիներ) տոկոսային նվազեցում առնետների մոտ, որոնք բուժվել են streptavidin-ով կոնյուգացված տարանցիկ պեպտիդով #2077 և BACE1 արգելակող պեպտիդով 3:1 հարաբերակցությամբ:(դ) Արյան Aβ40-ի (կարմիր շրջանակներ) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (նարնջագույն շրջաններ) տոկոսային նվազեցում առնետների, որոնք բուժվել են streptavidin-ով զուգակցված միայն BACE1 արգելակող պեպտիդով:Հսկիչում Aβ-ի կոնցենտրացիան 420 pg/ml էր (ստանդարտ շեղում = 101 pg/ml):
Ֆագերի ցուցադրումը հաջողությամբ կիրառվել է կենսաբժշկական հետազոտությունների մի քանի ոլորտներում17:Այս մեթոդը օգտագործվել է in vivo անոթային բազմազանության ուսումնասիրությունների համար18,19, ինչպես նաև ուղեղի անոթների թիրախային հետազոտությունների համար20,21,22,23,24,25,26:Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք ընդլայնեցինք այս ընտրության մեթոդի կիրառումը ոչ միայն ուղեղային անոթները թիրախավորող պեպտիդների ուղղակի նույնականացման, այլև արյունաուղեղային պատնեշը հատելու ակտիվ տրանսպորտային հատկություններով թեկնածուների հայտնաբերման համար:Այժմ մենք նկարագրում ենք in vivo ընտրության ընթացակարգի զարգացումը CM ինտուբացված առնետների մոտ և ցույց ենք տալիս դրա ներուժը՝ բացահայտելու CSF-ի տնամերձ հատկություններով պեպտիդները:Օգտագործելով T7 ֆագը, որը ցուցադրում է 12-մեր պատահական պեպտիդների գրադարանը, մենք կարողացանք ցույց տալ, որ T7 ֆագը բավականաչափ փոքր է (մոտ 60 նմ տրամագծով)10՝ հարմարվելու արյունաուղեղային արգելքին՝ դրանով իսկ ուղղակիորեն անցնելով արյունաուղեղային արգելքը կամ քորոիդային պլեքսը:Մենք նկատեցինք, որ CSF-ի հավաքագրումը կլանված CM առնետներից լավ վերահսկվող in vivo ֆունկցիոնալ զննման մեթոդ էր, և որ արդյունահանված ֆագը ոչ միայն կապված էր անոթների հետ, այլև գործում էր որպես փոխադրող արյունաուղեղային պատնեշով:Ավելին, միաժամանակ արյուն հավաքելով և կիրառելով HTS CSF-ի և արյունից ստացված ֆագերի վրա՝ մենք հաստատեցինք, որ ՔՀՀ-ի մեր ընտրությունը չի ազդել արյան հարստացման կամ ընտրության փուլերի միջև ընդլայնման հարմարության վրա:Այնուամենայնիվ, արյան բաժանմունքը ընտրության ընթացակարգի մի մասն է, քանի որ ֆագերը, որոնք կարող են հասնել ՔՀՀ բաժանմունք, պետք է գոյատևեն և շրջանառվեն արյան մեջ այնքան երկար, որպեսզի հարստանան ուղեղում:HTS-ի չմշակված տվյալներից հուսալի հաջորդականության մասին տեղեկատվություն հանելու համար մենք ներդրեցինք ֆիլտրեր, որոնք հարմարեցված էին վերլուծության աշխատանքային հոսքում հարթակին հատուկ հաջորդականության սխալներին:Սքրինինգի մեթոդի մեջ ներառելով կինետիկ պարամետրերը, մենք հաստատեցինք վայրի տիպի T7 ֆագերի արագ ֆարմակոկինետիկան (t½ ~ 28 րոպե) արյան մեջ24, 27, 28, ինչպես նաև որոշեցինք նրանց կես կյանքը ողնուղեղային հեղուկում (t½ ~ 26 րոպե) րոպեում):Չնայած արյան և CSF-ի նման ֆարմակոկինետիկ պրոֆիլներին, ֆագի արյան կոնցենտրացիայի միայն 0,001%-ը կարող է հայտնաբերվել ՔՀՖ-ում, ինչը ցույց է տալիս վայրի տիպի T7 ֆագի ցածր շարժունակությունը արյունաուղեղային պատնեշի միջով:Այս աշխատանքն ընդգծում է ընտրության առաջին փուլի կարևորությունը in vivo պանինգի ռազմավարություններ օգտագործելիս, հատկապես ֆագային համակարգերի համար, որոնք արագորեն մաքրվում են շրջանառությունից, քանի որ մի քանի կլոններ կարող են հասնել կենտրոնական նյարդային համակարգի բաժանմունք:Այսպիսով, առաջին փուլում գրադարանների բազմազանության կրճատումը շատ մեծ էր, քանի որ միայն սահմանափակ թվով կլոններ ի վերջո հավաքվեցին այս շատ խիստ CSF մոդելում:Այս in vivo պանինգի ռազմավարությունը ներառում էր ընտրության մի քանի քայլեր, ինչպիսիք են ակտիվ կուտակումը ՔՀՖ խցիկում, կլոնի գոյատևումը արյան խցիկում և T7 ֆագերի կլոնների արագ հեռացումն արյունից առաջին 10 րոպեների ընթացքում (նկ. 1d և լրացուցիչ նկ. 4M):)Այսպիսով, առաջին փուլից հետո CSF-ում հայտնաբերվեցին տարբեր ֆագային կլոններ, թեև նույն նախնական ավազանը օգտագործվում էր առանձին կենդանիների համար:Սա ենթադրում է, որ գրադարանների մեծ թվով անդամներով սկզբնաղբյուր գրադարանների ընտրության բազմաթիվ խիստ քայլերը հանգեցնում են բազմազանության զգալի կրճատմանը:Հետևաբար, պատահական իրադարձությունները կդառնան նախնական ընտրության գործընթացի անբաժանելի մասը՝ մեծապես ազդելով արդյունքի վրա:Հավանական է, որ սկզբնական գրադարանի կլոններից շատերը ունեին CSF հարստացման շատ նման հակվածություն:Այնուամենայնիվ, նույնիսկ նույն փորձարարական պայմաններում ընտրության արդյունքները կարող են տարբերվել սկզբնական լողավազանում յուրաքանչյուր կոնկրետ կլոնի փոքր քանակի պատճառով:
ՔՀՀ-ով հարստացված մոտիվները տարբերվում են արյան մեջ եղած մոտիվներից։Հետաքրքիր է, որ մենք նկատեցինք առաջին տեղաշարժը դեպի գլիցինով հարուստ պեպտիդներ առանձին կենդանիների արյան մեջ:(նկ. 1գ, Լրացուցիչ նկ. 4e, 4f):Գլիկինի պեպտիդներ պարունակող ֆագերը կարող են ավելի կայուն լինել և շրջանառությունից դուրս հանվելու ավելի քիչ հավանականություն:Այնուամենայնիվ, գլիցինով հարուստ այս պեպտիդները չեն հայտնաբերվել ողնուղեղային հեղուկի նմուշներում, ինչը ենթադրում է, որ ընտրված գրադարաններն անցել են ընտրության երկու տարբեր փուլեր՝ մեկը արյան մեջ, իսկ մյուսը թույլ է տվել կուտակվել ողնուղեղային հեղուկում:Ընտրության չորրորդ փուլից առաջացած CSF-ով հարստացված կլոնները լայնորեն փորձարկվել են:Գրեթե բոլոր անհատապես փորձարկված կլոնները հաստատվել են, որ հարստացված են CSF-ով` համեմատած դատարկ հսկիչ ֆագի հետ:Ավելի մանրամասն ուսումնասիրվել է մեկ պեպտիդային հարված (#2077):Այն ցույց տվեց պլազմայի ավելի երկար կիսամյակ՝ համեմատած այլ հիթերի հետ (Նկար 3d և Լրացուցիչ Նկար 7), և հետաքրքիր է, որ այս պեպտիդը պարունակում էր ցիստեինի մնացորդ C-տերմինալում:Վերջերս ցույց է տրվել, որ պեպտիդներին ցիստեինի ավելացումը կարող է բարելավել դրանց ֆարմակոկինետիկ հատկությունները՝ կապվելով ալբումին 29-ին:Սա ներկայումս անհայտ է պեպտիդ #2077-ի համար և պահանջում է հետագա ուսումնասիրություն:Որոշ պեպտիդներ ցույց տվեցին CSF-ի հարստացման վալենտական ​​կախվածություն (տվյալները ցույց չեն տրված), որը կարող է կապված լինել T7 կապսիդի ցուցադրված մակերեսի երկրաչափության հետ:Մեր օգտագործած T7 համակարգը ցույց տվեց յուրաքանչյուր պեպտիդից 5-15 օրինակ յուրաքանչյուր ֆագի մասնիկի համար:IHC-ն իրականացվել է առնետների գլխուղեղի կեղևի մեջ ներերակային ներարկված առաջատար ֆագերի թեկնածու կլոնների վրա (Լրացուցիչ նկար 8):Տվյալները ցույց են տվել, որ առնվազն երեք կլոն (թիվ 2002, թիվ 2009 և թիվ 2077) փոխազդում են BBB-ի հետ:Մնում է պարզել, թե արդյոք այս BBB փոխազդեցությունը հանգեցնում է CSF-ի կուտակմանը, թե այդ կլոնների տեղափոխմանը անմիջապես դեպի BCSFB:Կարևորն այն է, որ մենք ցույց ենք տալիս, որ ընտրված պեպտիդները պահպանում են իրենց CSF փոխադրման կարողությունը, երբ սինթեզվում և կապվում են սպիտակուցի բեռին:N-տերմինալ բիոտինիլացված պեպտիդների միացումը SA-ին էապես կրկնում է արյան և ողնուղեղային հեղուկի համապատասխան ֆագային կլոնների հետ ստացված արդյունքները (նկ. 3e):Վերջապես, մենք ցույց ենք տալիս, որ կապարի #2077 պեպտիդն ի վիճակի է խթանել BACE1-ի բիոտինիլացված պեպտիդային ինհիբիտորի ուղեղի գործողությունը՝ կապված SA-ի հետ՝ առաջացնելով ընդգծված ֆարմակոդինամիկ ազդեցություն CNS-ում՝ զգալիորեն նվազեցնելով Abeta40 մակարդակը ՔՀՀ-ում (նկ. 4):Մենք չկարողացանք տվյալների բազայում նույնականացնել որևէ հոմոլոգ՝ կատարելով պեպտիդային հաջորդականության հոմոլոգիայի որոնում բոլոր հիթերում:Կարևոր է նշել, որ T7 գրադարանի չափը մոտավորապես 109 է, մինչդեռ 12-մերների համար գրադարանի տեսական չափը 4 x 1015 է: Հետևաբար, մենք ընտրեցինք 12-մեր պեպտիդային գրադարանի բազմազանության տարածության միայն մի փոքր մասը, ինչը կարող է նշանակել, որ ավելի օպտիմիզացված պեպտիդները կարող են նույնականացվել այս սանդղակի տարածության վրա:Հիպոթետիկորեն, պատճառներից մեկը, թե ինչու մենք չենք գտել այս պեպտիդների բնական հոմոլոգներ, կարող է լինել էվոլյուցիայի ժամանակ ընտրված ապաընտրությունը՝ կանխելու որոշակի պեպտիդային մոտիվների անվերահսկելի մուտքը ուղեղ:
Միասին մեր արդյունքները հիմք են տալիս ապագա աշխատանքի համար՝ ավելի մանրամասն բացահայտելու և բնութագրելու ուղեղի անոթային պատնեշի տրանսպորտային համակարգերը in vivo-ում:Այս մեթոդի հիմնական կարգավորումը հիմնված է ֆունկցիոնալ ընտրության ռազմավարության վրա, որը ոչ միայն նույնացնում է ուղեղի անոթային կապող հատկություններով կլոնները, այլ նաև ներառում է մի կարևոր քայլ, որտեղ հաջողակ կլոններն ունեն ներքին ակտիվություն՝ կենսաբանական արգելքները in vivo անցնելու դեպի Կենտրոնական նյարդային համակարգի բաժանմունք:այս պեպտիդների փոխադրման մեխանիզմը և ուղեղի տարածաշրջանին հատուկ միկրոանոթներին կապվելու նախապատվությունը պարզաբանելն է:Սա կարող է հանգեցնել BBB-ի և ընկալիչների տեղափոխման նոր ուղիների հայտնաբերմանը:Մենք ակնկալում ենք, որ հայտնաբերված պեպտիդները կարող են ուղղակիորեն կապվել ուղեղի անոթային ընկալիչների կամ շրջանառվող լիգանդների հետ, որոնք տեղափոխվում են BBB կամ BCSFB:Այս աշխատանքում հայտնաբերված CSF տրանսպորտային ակտիվությամբ պեպտիդային վեկտորները հետագայում կուսումնասիրվեն:Ներկայումս մենք ուսումնասիրում ենք այս պեպտիդների ուղեղի առանձնահատկությունը BBB և/կամ BCSFB-ն անցնելու ունակության համար:Այս նոր պեպտիդները չափազանց արժեքավոր գործիքներ կլինեն նոր ընկալիչների կամ ուղիների հայտնաբերման և մակրոմոլեկուլների, օրինակ կենսաբանական նյութերի, ուղեղ հասցնելու նոր բարձր արդյունավետ հարթակների մշակման համար:
Խողովակավորեք մեծ ջրամբարը (CM)՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված մեթոդի փոփոխությունը:Անզգայացված Wistar առնետները (200-350 գ) տեղադրվեցին ստերեոտաքսիկ ապարատի վրա և միջին կտրվածք արվեց սափրված և ասեպտիկ կերպով պատրաստված գլխի վրա՝ գանգը բացահայտելու համար:Հորատեք երկու անցք վերին շերտի տարածքում և ամրացրեք անցքերում ամրացնող պտուտակները:Լրացուցիչ անցք է փորվել կողային օքսիպիտալ գագաթի վրա՝ չժանգոտվող պողպատից կանուլայի ստերեոտակտիկ ուղղորդման համար CM:Կիրառեք ատամնաբուժական ցեմենտ կանուլայի շուրջ և ամրացրեք պտուտակներով:Ֆոտո-բուժումից և ցեմենտի կարծրացումից հետո մաշկի վերքը փակվել է 4/0 սուպրամիդի կարով:Կանուլայի ճիշտ տեղադրումը հաստատվում է ողնուղեղի հեղուկի (CSF) ինքնաբուխ արտահոսքով:Հեռացրեք առնետին ստերեոտաքսիկ ապարատից, ստացեք համապատասխան հետվիրահատական ​​խնամք և ցավի կառավարում և թույլ տվեք նրան վերականգնվել առնվազն մեկ շաբաթ, մինչև ողնուղեղային հեղուկում արյան նշաններ նկատվեն:Wistar առնետները (Crl:WI/Han) ստացվել են Չարլզ գետից (Ֆրանսիա):Բոլոր առնետները պահվել են հատուկ պաթոգենից զերծ պայմաններում:Կենդանիների վրա բոլոր փորձերը հաստատվել են Շվեյցարիայի Բազել քաղաքի անասնաբուժական գրասենյակի կողմից և կատարվել են Կենդանիների թիվ 2474 լիցենզիայի համաձայն (Ուղեղի ակտիվ տրանսպորտի գնահատում թերապևտիկ թեկնածուների մակարդակների չափման միջոցով առնետի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում և ուղեղում):
Մեղմորեն պահեք առնետին ուշագնացության մեջ՝ CM cannula-ը ձեռքին:Հեռացրեք Datura-ն կաննուլայից և հավաքեք 10 մկլ ինքնաբուխ հոսող ողնուղեղային հեղուկ:Քանի որ կաննուլայի անցունակությունը ի վերջո վտանգված էր, այս հետազոտության մեջ ներառվեցին միայն ողնուղեղային հեղուկի մաքուր նմուշներ՝ առանց արյան աղտոտման կամ գունաթափման ապացույցների:Զուգահեռաբար, մոտավորապես 10-20 մկլ արյուն է վերցվել պոչի ծայրի փոքր կտրվածքից հեպարինով խողովակների մեջ (Sigma-Aldrich):ՔՀՀ-ն և արյունը հավաքվել են տարբեր ժամանակային կետերում՝ T7 ֆագի ներերակային ներարկումից հետո:Մոտավորապես 5–10 մկլ հեղուկ է թափվել մինչև CSF յուրաքանչյուր նմուշ հավաքելը, որը համապատասխանում է կաթետերի մեռած ծավալին:
Գրադարանները ստեղծվել են օգտագործելով T7Select 10-3b վեկտորը, ինչպես նկարագրված է T7Select համակարգի ձեռնարկում (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996):Հակիրճ, պատահական 12-մեր ԴՆԹ-ի ներդիրը սինթեզվել է հետևյալ ձևաչափով.
NNK կոդոնն օգտագործվել է ներդիրում կրկնակի կանգառի կոդոններից և ամինաթթուների գերարտահայտումից խուսափելու համար:N-ը յուրաքանչյուր նուկլեոտիդի ձեռքով խառնված համաչափ հարաբերակցությունն է, իսկ K-ն ադենինի և ցիտոզինի նուկլեոտիդների ձեռքով խառնված հավասարամոլային հարաբերակցությունն է։Միաշղթա շրջանները փոխարկվել են կրկնակի շղթայական ԴՆԹ-ի հետագա ինկուբացիայի միջոցով dNTP (Novagen) և Klenow enzyme-ով (New England Biolabs) Klenow բուֆերում (New England Biolabs) 3 ժամ 37°C ջերմաստիճանում:Ռեակցիայից հետո երկշղթա ԴՆԹ-ն վերականգնվել է EtOH տեղումների միջոցով:Ստացված ԴՆԹ-ն մարսվել է EcoRI և HindIII սահմանափակող ֆերմենտներով (երկուսն էլ Roche-ից):Ճեղքված և մաքրված (QIAquick, Qiagen) ներդիրը (T4 ligase, New England Biolabs) այնուհետև միացվել է շրջանակի մեջ նախապես ճեղքված T7 վեկտորի մեջ 10B կապսիդի գենի 348 ամինաթթուից հետո:Կապակցման ռեակցիաները ինկուբացիոն են եղել 16°C ջերմաստիճանում 18 ժամ առաջ in vitro փաթեթավորումից առաջ:Ֆագերի փաթեթավորումը in vitro իրականացվել է T7Select 10-3b կլոնավորման հավաքածուի (Novagen) հետ տրված հրահանգների համաձայն, և փաթեթավորման լուծույթը մեկ անգամ ուժեղացվել է լիզիզի համար՝ օգտագործելով Escherichia coli (BLT5615, Novagen):Լիզատները ցենտրիֆուգվել, տիտրվել և սառեցվել են -80°C-ում` որպես գլիցերինի պահեստային լուծույթ:
Արգանակի կամ ափսեի մեջ ուժեղացված ֆագերի փոփոխական շրջանների ուղղակի ՊՇՌ ամպլիֆիկացում, օգտագործելով 454/Roche-amplicon fusion պրայմերներ:Առջևի միաձուլման այբբենարանը պարունակում է փոփոխական շրջանի (NNK) 12 (հատուկ ձևանմուշին հատուկ), GS FLX Titanium Adapter A-ի և չորս բազայի գրադարանի բանալիների հաջորդականությունը (TCAG) (Լրացուցիչ նկար 1ա) կողքին գտնվող հաջորդականությունները.
Հակադարձ միաձուլման այբբենարանը պարունակում է նաև բիոտին, որը կցված է ուլունքներին և GS FLX Titanium Adapter B-ն, որն անհրաժեշտ է էմուլսիայի PCR-ի ժամանակ կլոնային ուժեղացման համար.
Այնուհետև ամպլիկոնները ենթարկվել են 454/Roche pyrosequencing-ի՝ համաձայն 454 GS-FLX Titanium արձանագրության:Sanger-ի ձեռքով հաջորդականացման համար (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ԴՆԹ անալիզատոր) T7 ֆագի ԴՆԹ-ն ուժեղացվել է PCR-ով և հաջորդականացվել հետևյալ պրայմերների զույգերով.
Առանձին սալիկների ներդիրները ենթարկվել են PCR ուժեղացման՝ օգտագործելով Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ըստ արտադրողի ցուցումների):Կատարեք տաք մեկնարկ (10 րոպե 95 °C-ում) և 35 խթանման ցիկլեր (50 վրկ 95 °C-ում, 1 րոպե 50 °C և 1 րոպե 72 °C-ում):
Ֆագերը գրադարաններից, վայրի տիպի ֆագերը, CSF-ից և արյունից փրկված ֆագը կամ առանձին կլոններ ուժեղացվել են Escherichia coli BL5615-ում տուբերկուլյոզի արգանակում (Sigma Aldrich) կամ 500 սմ2 ափսեներում (Thermo Scientific) 4 ժամ 37°C-ում:Ֆագերը դուրս են բերվել թիթեղներից՝ ողողելով թիթեղները Tris-EDTA բուֆերով (Fluka Analytical) կամ ափսեները ստերիլ պիպետների ծայրերով հավաքելով:Ֆագերը մեկուսացվել են կուլտուրայի սուպերնատենտից կամ էքստրակցիոն բուֆերից պոլիէթիլեն գլիկոլի (PEG 8000) տեղումների մեկ փուլով (Promega) և կրկին կասեցվել Tris-EDTA բուֆերում:
Ուժեղացված ֆագը ենթարկվել է էնդոտոքսինի հեռացման 2-3 փուլերի՝ օգտագործելով էնդոտոքսինի հեռացման ուլունքներ (Miltenyi Biotec)՝ նախքան ներերակային (IV) ներարկումը (500 μl/կենդանի):Առաջին փուլում ներմուծվել են 2×1012 ֆագեր;երկրորդում՝ 2×1010 ֆագեր;երրորդ և չորրորդ սելեկցիոն փուլերում՝ 2×109 ֆագ մեկ կենդանու համար:Ֆագերի պարունակությունը CSF-ում և արյան նմուշներում հավաքված նշված ժամանակային կետերում որոշվել է ափսեի հաշվարկով՝ ըստ արտադրողի ցուցումների (T7Select համակարգի ձեռնարկ):Ֆագերի ընտրությունը կատարվել է մաքրված գրադարանների ներերակային ներարկումով պոչային երակում կամ նախորդ սելեկցիոն փուլից CSF-ից արդյունահանված ֆագի վերաներարկման միջոցով, իսկ հետագա բերքահավաքը կատարվել է 10 րոպե, 30 րոպե, 60 րոպե, 90 րոպե, 120 րոպե, 180 րոպե և 240 CSF նմուշների համապատասխանաբար:Ընդհանուր առմամբ անցկացվել են in vivo պանինգի չորս փուլեր, որոնցում ընտրված երկու ճյուղերը առանձին պահվել և վերլուծվել են ընտրության առաջին երեք փուլերի ընթացքում:Ընտրության առաջին երկու փուլերից ՔՀՖ-ից արդյունահանված բոլոր ֆագային ներդիրները ենթարկվել են 454/Roche pyrosequencing-ի, մինչդեռ ընտրության վերջին երկու փուլերից CSF-ից դուրս բերված բոլոր կլոնները ձեռքով հաջորդականացվել են:Ընտրության առաջին փուլի բոլոր արյան ֆագերը նույնպես ենթարկվել են 454/Roche pyrosequencing-ի:Ֆագային կլոնների ներարկման համար ընտրված ֆագերը ուժեղացվել են E. coli-ում (BL5615) 500 սմ2 թիթեղների վրա 37°C ջերմաստիճանում 4 ժամ:Առանձին ընտրված և ձեռքով հաջորդականացված կլոնները տարածվել են տուբերկուլյոզի միջավայրում:Ֆագի արդյունահանումից, էնդոտոքսինի մաքրումից և հեռացումից հետո (ինչպես նկարագրված է վերևում), 2 × 1010 ֆագ/կենդանի 300 մկլ-ում ներարկվել են ներերակային մեկ պոչի երակ:
Հաջորդականության տվյալների նախնական մշակում և որակական զտում:Raw 454/Roche տվյալները փոխարկվել են երկուական ստանդարտ հոսքային քարտեզի ձևաչափից (sff) Pearson-ի մարդու ընթերցվող ձևաչափի (fasta)՝ վաճառող ծրագրաշարի միջոցով:Նուկլեոտիդային հաջորդականության հետագա մշակումն իրականացվել է սեփական C ծրագրերի և սկրիպտների միջոցով (չհրապարակված ծրագրային փաթեթ), ինչպես նկարագրված է ստորև:Առաջնային տվյալների վերլուծությունը ներառում է խիստ բազմաստիճան զտման ընթացակարգեր:Ընթերցվածները զտելու համար, որոնք չեն պարունակում վավեր 12մեր ներդիր ԴՆԹ-ի հաջորդականություն, ընթերցումները հաջորդաբար հավասարեցվել են մեկնարկային պիտակի (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), կանգառի պիտակի (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) և ֆոնային ներդիրին (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT՝ օգտագործելով գլոբալ փորձարկումը:հավասարեցում, որը թույլ է տալիս մինչև 2 անհամապատասխանություն յուրաքանչյուր հավասարեցման համար31:Հետևաբար, ընթերցումները առանց սկզբի և դադարեցման պիտակների և ֆոնային ներդիրներ պարունակող ընթերցումները, այսինքն՝ անհամապատասխանությունների թույլատրելի թիվը գերազանցող ընթերցումները հեռացվեցին գրադարանից:Ինչ վերաբերում է մնացած ընթերցումներին, ապա N-mer ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, որը տարածվում է սկզբնական նշանից և ավարտվում է մինչև վերջակետը, հեռացվել է սկզբնական ընթերցման հաջորդականությունից և հետագա մշակվել (այսուհետ՝ «ներդիր»):Ներդիրի թարգմանությունից հետո առաջին կանգառ կոդոնից հետո այբբենարանի 5′ վերջում գտնվող հատվածը հանվում է ներդիրից:Բացի այդ, հեռացվել են նաև այբբենարանի 3′ վերջում դեպի թերի կոդոններ տանող նուկլեոտիդները:Միայն ֆոնային հաջորդականություններ պարունակող ներդիրները բացառելու համար «PAG» ամինաթթուների օրինակով սկսվող թարգմանված ներդիրները նույնպես հեռացվեցին:Գրադարանից հանվել են 3 ամինաթթուից պակաս հետթարգմանական երկարություն ունեցող պեպտիդներ:Վերջապես, հեռացրեք ավելորդությունը ներդիրի լողավազանում և որոշեք յուրաքանչյուր եզակի ներդիրի հաճախականությունը:Այս վերլուծության արդյունքները ներառում էին նուկլեոտիդային հաջորդականությունների (ներդիրների) և դրանց (կարդալու) հաճախականությունների ցանկը (Լրացուցիչ նկարներ 1c և 2):
Խմբի N-mer ԴՆԹ-ի ներդիրներն ըստ հաջորդականության նմանության. 454/Roche-ին հատուկ հաջորդականության սխալները (օրինակ՝ հոմոպոլիմերային ընդարձակման հաջորդականության հետ կապված խնդիրները) վերացնելու և ավելի քիչ կարևոր ավելորդությունները վերացնելու համար, նախկինում զտված N-mer ԴՆԹ-ի հաջորդականության ներդիրները (ներդիրները) տեսակավորվում են ըստ նմանության:ներդիրներ (թույլատրվում է մինչև 2 չհամապատասխանող հիմք) օգտագործելով կրկնվող ալգորիթմը, որը սահմանվում է հետևյալ կերպ. ներդիրները դասակարգվում են նախ՝ ըստ իրենց հաճախականության (ամենաբարձրից մինչև ամենացածրը), իսկ եթե դրանք նույնն են՝ ըստ երկարության (ամենաերկարից մինչև ամենակարճ) .Այսպիսով, ամենահաճախ և ամենաերկար ներդիրները սահմանում են առաջին «խումբը»:Խմբի հաճախականությունը սահմանվում է հիմնական հաճախականության վրա:Այնուհետև տեսակավորված ցանկում մնացած յուրաքանչյուր ներդիր փորձվեց ավելացնել խմբին՝ Needleman-Wunsch զույգ հավասարեցմամբ:Եթե ​​հավասարեցման մեջ անհամապատասխանությունների, ներդիրների կամ ջնջումների թիվը չի գերազանցում 2-ի շեմը, խմբին ավելացվում է ներդիր, և խմբի ընդհանուր հաճախականությունը մեծանում է այն չափով, թե որքան հաճախ է ավելացվել ներդիրը:Խմբում ավելացված ներդիրները նշվում են որպես օգտագործված և բացառվում են հետագա մշակումից:Եթե ​​ներդիրի հաջորդականությունը հնարավոր չէ ավելացնել արդեն գոյություն ունեցող խմբին, ներդիրի հաջորդականությունն օգտագործվում է համապատասխան ներդիրների հաճախականությամբ նոր խումբ ստեղծելու համար և նշվում է որպես օգտագործված:Կրկնությունն ավարտվում է, երբ յուրաքանչյուր ներդրման հաջորդականություն կամ օգտագործվել է նոր խումբ ձևավորելու համար, կամ կարող է ներառվել արդեն գոյություն ունեցող խմբում:Ի վերջո, նուկլեոտիդներից բաղկացած խմբավորված ներդիրները ի վերջո թարգմանվում են պեպտիդային հաջորդականությունների (պեպտիդային գրադարանների):Այս վերլուծության արդյունքը ներդիրների և դրանց համապատասխան հաճախականությունների մի շարք է, որոնք կազմում են հաջորդական ընթերցումների քանակը (Լրացուցիչ նկար 2):
Մոտիվների առաջացում. Եզակի պեպտիդների ցանկի հիման վրա ստեղծվել է գրադարան, որը պարունակում է ամինաթթուների բոլոր հնարավոր օրինաչափությունները (aa), ինչպես ցույց է տրված ստորև:3-րդ երկարության յուրաքանչյուր հնարավոր օրինաչափություն արդյունահանվել է պեպտիդից և դրա հակադարձ նախշը ավելացվել է ընդհանուր մոտիվների գրադարանի հետ միասին, որը պարունակում է բոլոր նախշերը (տրիպեպտիդներ):Շատ կրկնվող մոտիվների գրադարանները հաջորդականացվել են և ավելորդությունը հանվել է:Այնուհետև մոտիվների գրադարանի յուրաքանչյուր եռապեպտիդ համար մենք ստուգեցինք գրադարանում դրա առկայությունը՝ օգտագործելով հաշվողական գործիքներ:Այս դեպքում հայտնաբերված մոտիվ տրիպեպտիդ պարունակող պեպտիդի հաճախականությունը ավելացվում և վերագրվում է մոտիվների գրադարանի մոտիվին («մոտիվների թիվը»):Մոտիվների առաջացման արդյունքը երկչափ զանգված է, որը պարունակում է եռապեպտիդների (մոտիվների) բոլոր երևույթները և դրանց համապատասխան արժեքները, որոնք հաջորդական ընթերցումների քանակն են, որոնք հանգեցնում են համապատասխան մոտիվին, երբ ընթերցումները զտվում, խմբավորվում և թարգմանվում են:Չափումներ, ինչպես մանրամասն նկարագրված է վերևում:
Մոտիվների քանակի և համապատասխան ցրման սյուժեների նորմալացում. Յուրաքանչյուր նմուշի մոտիվների քանակը նորմալացվել է օգտագործելով.
որտեղ ni-ը թեմա պարունակող ընթերցումների թիվն է:Այսպիսով, vi-ն ներկայացնում է նմուշում i պարունակող ընթերցումների (կամ պեպտիդների) տոկոսային հաճախականությունը:Մոտիվների չնորմալացված քանակի համար P-արժեքները հաշվարկվել են Ֆիշերի ճշգրիտ թեստի միջոցով:Ինչ վերաբերում է շարժառիթների քանակի հարաբերակցությանը, ապա Սփիրմանի հարաբերակցությունները հաշվարկվել են՝ օգտագործելով մոտիվների նորմալացված թիվը Ռ.
Պեպտիդային գրադարանի յուրաքանչյուր դիրքում ամինաթթուների պարունակությունը պատկերացնելու համար ստեղծվել են վեբ լոգոգրամներ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com):Նախ, ամինաթթուների պարունակությունը 12-մեր պեպտիդի յուրաքանչյուր դիրքում պահվում է 20×12 մատրիցով:Այնուհետև, 1000 պեպտիդների մի շարք, որոնք պարունակում են նույն հարաբերական ամինաթթուների պարունակությունը յուրաքանչյուր դիրքում, ստեղծվում է արագ հաջորդականության ձևաչափով և տրամադրվում է որպես մուտքագրում վեբ-լոգո 3-ին, որը ստեղծում է ամինաթթուների հարաբերական պարունակության գրաֆիկական ներկայացում յուրաքանչյուր դիրքում:տվյալ պեպտիդային գրադարանի համար:Բազմաչափ տվյալների շտեմարանները պատկերացնելու համար ջերմային քարտեզները ստեղծվեցին R-ում ներքին մշակված գործիքի միջոցով (biosHeatmap, դեռևս թողարկված R փաթեթ):Ջերմային քարտեզներում ներկայացված դենդրոգրամները հաշվարկվել են Ուորդի հիերարխիկ կլաստերավորման մեթոդի կիրառմամբ՝ Էվկլիդեսյան հեռավորության մետրիկով:Մոտիվների գնահատման տվյալների վիճակագրական վերլուծության համար չնորմալացված գնահատման համար P արժեքները հաշվարկվել են Ֆիշերի ճշգրիտ թեստի միջոցով:Այլ տվյալների հավաքածուների համար P-արժեքները հաշվարկվել են R-ով` օգտագործելով Student's t-test կամ ANOVA:
Ընտրված ֆագերի կլոնները և առանց ներդիրների ֆագերը ներարկվել են ներերակային պոչի երակի միջոցով (2×1010 ֆագ/կենդանի 300 μl PBS-ում):Պերֆուզիայից և հետագա ֆիքսումից տասը րոպե առաջ նույն կենդանիներին ներերակային ներարկեցին 100 մկլ DyLight594 պիտակավորված լեկտին (Vector Laboratories Inc., DL-1177):Ֆագերի ներարկումից 60 րոպե անց առնետներին ներարկվել է սրտի միջով 50 մլ PBS, որին հաջորդում է 50 մլ 4% PFA/PBS:Ուղեղի նմուշները լրացուցիչ ամրագրվեցին մեկ գիշերվա ընթացքում 4% PFA/PBS-ում և ներծծվեցին 30% սախարոզայի մեջ գիշերը 4°C-ում:Նմուշները սառեցվում են OCT խառնուրդում:Սառեցված նմուշների իմունոհիստոքիմիական անալիզն իրականացվել է սենյակային ջերմաստիճանում 30 մկմ կրիոսեկցիաների վրա, որոնք արգելափակված էին 1% BSA-ով և ինկուբացված պոլիկլոնալ FITC պիտակավորված հակամարմիններով T7 ֆագի դեմ (Novus NB 600-376A) 4 °C-ում:Ինկուբացնել գիշերը:Ի վերջո, հատվածները 3 անգամ լվացվեցին PBS-ով և հետազոտվեցին կոնֆոկալ լազերային մանրադիտակով (Leica TCS SP5):
98% նվազագույն մաքրությամբ բոլոր պեպտիդները սինթեզվել են GenScript USA-ի կողմից, բիոտինիլացվել և լիոֆիլացվել:Բիոտինը կապված է լրացուցիչ եռակի գլիցինի միջակայքի միջոցով N-վերնամասում:Ստուգեք բոլոր պեպտիդները՝ օգտագործելով զանգվածային սպեկտրոմետրիա:
Ստրեպտավիդինը (Sigma S0677) խառնվել է բիոտինիլացված պեպտիդի, բիոտինիլացված BACE1 արգելակող պեպտիդի 5 անգամ հավասարամոլային ավելցուկի կամ կենսատինիլացված BACE1 արգելակող պեպտիդի և BACE1 արգելակող DM5-100% պեպտիդի համակցությամբ (3:1 հարաբերակցությամբ):Ներարկումից առաջ 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում:Ստրեպտավիդին-կոնյուգացված պեպտիդները ներերակային ներարկվել են 10 մգ/կգ դոզանով ուղեղի խոռոչ ունեցող առնետների պոչի երակներից մեկում:
Ստրեպտավիդին-պեպտիդային համալիրների կոնցենտրացիան գնահատվել է ELISA-ով:Nunc Maxisorp միկրոտիտրային թիթեղները (Sigma) ծածկվել են գիշերվա ընթացքում 4°C ջերմաստիճանում 1,5 մկգ/մլ մկան հակաստրեպտավիդին հակամարմինով (Thermo, MA1-20011):արգելափակումից հետո (արգելափակող բուֆեր՝ 140 nM NaCL, 5 մՄ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% ժելատին, 1% BSA) սենյակային ջերմաստիճանում 2 ժամով, լվացեք ափսեը 0,05% Tween-20/PBS (լվացքի պլազմային բուֆեր) 3 վայրկյան, 1 պլազմային բուֆեր ավելացվեց ջրհորի 1 նմուշով և ավելացվեց 1 պլազմային նմուշ: 0,000, CSF 1:115):Այնուհետև թիթեղը ինկուբացվել է գիշերը 4°C ջերմաստիճանում հայտնաբերման հակամարմիններով (1 մկգ/մլ, հակաստրեպտավիդին-HRP, Novus NB120-7239):Լվացքի երեք քայլերից հետո ստրեպտավիդինը հայտնաբերվել է TMB սուբստրատի լուծույթում (Roche) ինկուբացիայի միջոցով մինչև 20 րոպե:1M H2SO4-ով գույնի զարգացումը դադարեցնելուց հետո չափեք ներծծումը 450 նմ-ում:
Ստրեպտավիդին-պեպտիդ-BACE1 ինհիբիտորային համալիրի գործառույթը գնահատվել է Aβ(1-40) ELISA-ով` ըստ արտադրողի արձանագրության (Wako, 294-64701):Հակիրճ, CSF-ի նմուշները նոսրացվել են ստանդարտ լուծիչով (1:23) և ինկուբացվել են գիշերվա ընթացքում 4°C ջերմաստիճանում 96 ջրհորի ափսեներում, որոնք պատված են BNT77 գրավման հակամարմինով:Լվացքի հինգ քայլերից հետո ավելացվել է HRP-ի կոնյուգացված BA27 հակամարմին և ինկուբացվել 2 ժամ 4°C-ում, որին հաջորդել են լվացման հինգ քայլեր:Aβ(1-40) հայտնաբերվել է TMB լուծույթում 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում ինկուբացիայի միջոցով:Այն բանից հետո, երբ գույնի զարգացումը դադարեցվի կանգառի լուծույթով, չափեք ներծծումը 450 նմ-ով:Պլազմայի նմուշները ենթարկվել են պինդ փուլային արդյունահանման՝ Aβ(1–40) ELISA-ից առաջ:Պլազման ավելացվել է 0.2% DEA (Sigma) 96 ջրհորի ափսեներում և ինկուբացվել սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե:SPE թիթեղները (Oasis, 186000679) հաջորդաբար լվանալուց հետո ջրով և 100% մեթանոլով, պլազմայի նմուշները ավելացվել են SPE թիթեղներին և ամբողջ հեղուկը հեռացվել է:Նմուշները լվացվեցին (նախ 5% մեթանոլով, ապա 30% մեթանոլով) և լվացվեցին 2% NH4OH/90% մեթանոլով:Չորացնելուց հետո լուծույթը 55°C-ում 99 րոպե մշտական ​​N2 հոսանքի պայմաններում, նմուշները կրճատվել են ստանդարտ նոսրիչներով և Aβ(1–40) չափվել, ինչպես նկարագրված է վերևում:
Ինչպես մեջբերել այս հոդվածը. Urich, E. et al.Բեռների առաքում ուղեղ՝ օգտագործելով տարանցիկ պեպտիդներ, որոնք հայտնաբերված են in vivo-ում:գիտությունը։5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015):
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB and Moos T. Մակրոմոլեկուլային դեղերի առաքում ուղեղին, նպատակային թերապիայի միջոցով:Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010):
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Պեպտիդային և սպիտակուցային դեղամիջոցների առաքում արյունաուղեղային պատնեշով:Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009 թ.):
Փարդրիջ, Վ.Մ. Արյունաուղեղային պատնեշ. խոչընդոտ ուղեղի դեղերի մշակման գործում:NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005):
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. Թմրամիջոցների բարելավված առաքման և ուղեղի թիրախավորման հեռանկարները քորոիդային պլեքսուս-CSF ճանապարհով:Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005 թ.):
Pardridge, WM Կենսադեղամիջոցների արդիականացում մոլեկուլային տրոյական ձիերով ուղեղի առաքման համար:Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008):
Pardridge, WM ընկալիչների միջնորդավորված պեպտիդային փոխադրում արյունաուղեղային պատնեշով:Endocr Rev. 7, 314–330 (1986):
Niewoehner, J. et al.Բարձրացնել ուղեղի ներթափանցումը և բուժական հակամարմինների արդյունավետությունը՝ օգտագործելով միավալենտ մոլեկուլային մաքոքներ:Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014):
Bien-Lee, N. et al.Տրանսֆերինի ընկալիչի (TfR) փոխադրումը որոշում է ուղեղի կլանումը TfR հակամարմինների մերձեցման տարբերակներից:J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014):