LC համակարգի որոշ խնդիրների լուծման թեմաներ երբեք չեն հնանում, քանի որ LC պրակտիկայում կան խնդիրներ, նույնիսկ այն դեպքում, երբ գործիքների տեխնոլոգիան ժամանակի ընթացքում կատարելագործվում է: LC համակարգում կան բազմաթիվ եղանակներ, որոնցով կարող են խնդիրներ առաջանալ և հանգեցնել գագաթնակետի վատ ձևի: Երբ առաջանում են գագաթնակետի ձևի հետ կապված խնդիրներ, այդ արդյունքների հնարավոր պատճառների կարճ ցանկը օգնում է պարզեցնել մեր խնդիրների լուծման փորձը:
Հաճելի էր գրել այս «LC խնդիրների լուծում» սյունակը և ամեն ամիս մտածել թեմաների մասին, քանի որ որոշ թեմաներ երբեք նորաձևությունից դուրս չեն գալիս։ Մինչդեռ քրոմատոգրաֆիայի հետազոտության ոլորտում որոշ թեմաներ կամ գաղափարներ հնանում են, քանի որ դրանք փոխարինվում են ավելի նոր և ավելի լավ գաղափարներով, խնդիրների լուծման ոլորտում՝ 1983 թվականից ի վեր, երբ առաջին անգամ հայտնվեց այս ամսագրում (այն ժամանակ LC ամսագիրը), քանի որ որոշ թեմաներ դեռևս արդիական են (1): Վերջին մի քանի տարիների ընթացքում ես LC խնդիրների լուծման մի քանի բաժիններ կենտրոնացրել եմ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի (LC) վրա ազդող ժամանակակից միտումների վրա (օրինակ՝ ճնշման ազդեցության մեր ըմբռնման համեմատությունը պահպանման վրա [2] Նոր առաջընթացներ): LC արդյունքների մեր մեկնաբանությունը և ժամանակակից LC գործիքներով խնդիրների լուծման եղանակները: Այս ամսվա համար ես շարունակում եմ իմ շարքը (3), որը սկսվել է 2021 թվականի դեկտեմբերին և կենտրոնացած էր LC խնդիրների լուծման որոշ «կյանքի և մահվան» թեմաների վրա. տարրեր, որոնք հիանալի են ցանկացած խնդիրների լուծման համար, կարևոր են՝ անկախ մեր օգտագործած համակարգի տարիքից: Այս շարքի հիմնական թեման խիստ արդիական է LCGC-ի հայտնի «LC խնդիրների լուծման ուղեցույցի» համար: (4) դիագրամը կախված է բազմաթիվ լաբորատորիաներում: Այս շարքի երրորդ մասի համար ես որոշեցի կենտրոնանալ գագաթի ձևի կամ գագաթի բնութագրերի հետ կապված հարցերի վրա: Անհավանական է, բայց պատի դիագրամը թվարկում է գագաթի վատ ձևի 44 տարբեր հնարավոր պատճառներ: Մենք չենք կարող մանրամասնորեն քննարկել այս բոլոր խնդիրները մեկ հոդվածում, ուստի այս թեմայի վերաբերյալ այս առաջին մասում ես կկենտրոնանամ դրանցից մի քանիսի վրա, որոնք ես ամենից հաճախ եմ հանդիպում: Հուսով եմ, որ LC-ի երիտասարդ և տարեց օգտատերերը կգտնեն որոշ օգտակար խորհուրդներ և հիշեցումներ այս կարևոր թեմայի վերաբերյալ:
Ես ավելի ու ավելի հաճախ եմ պատասխանում խնդիրների լուծման հարցերին՝ ասելով. «ամեն ինչ հնարավոր է»։ Այս պատասխանը կարող է հեշտ թվալ, երբ դիտարկում ենք դժվար մեկնաբանվող դիտարկումներ, բայց ես այն հաճախ տեղին եմ համարում։ Վատ գագաթնակետի ձևի բազմաթիվ հնարավոր պատճառների պատճառով կարևոր է բաց միտք ունենալ, երբ դիտարկում ենք, թե ինչ կարող է լինել խնդիրը, և կարողանալ առաջնահերթություն տալ հնարավոր պատճառներին՝ մեր խնդիրների լուծման ջանքերը սկսելու համար՝ կենտրոնանալով ամենատարածված հնարավորությունների վրա, այս կետը շատ կարևոր է։
Ցանկացած խնդրի լուծման վարժության հիմնական քայլը, որը, իմ կարծիքով, թերագնահատված է, այն է, որ պետք է ճանաչել, որ կա մի խնդիր, որը պետք է լուծվի։ Խնդրի առկայությունը ճանաչելը հաճախ նշանակում է ճանաչել, որ գործիքի հետ պատահածը տարբերվում է մեր սպասումներից, որոնք ձևավորվում են տեսության, փորձարարական գիտելիքների և փորձի միջոցով (5): Այստեղ նշված «գագաթնակետի ձևը» իրականում վերաբերում է ոչ միայն գագաթնակետի ձևին (սիմետրիկ, ասիմետրիկ, հարթ, փափուկ, առաջատար եզր, պոչավոր և այլն), այլև լայնությանը: Գագաթնակետի իրական ձևի վերաբերյալ մեր սպասումները պարզ են: (6) տեսությունը լավ է հաստատում դասագրքի այն սպասումը, որ քրոմատոգրաֆիկ գագաթները պետք է լինեն սիմետրիկ և համապատասխանեն գաուսյան բաշխման ձևին, ինչպես ցույց է տրված նկար 1ա-ում: Գագաթնակետի լայնություններից մենք ակնկալում ենք ավելի բարդ հարց, և մենք կքննարկենք այս թեման ապագա հոդվածում: Նկար 1-ում ներկայացված մյուս գագաթնակետի ձևերը ցույց են տալիս որոշ այլ հնարավորություններ, որոնք կարող են դիտարկվել, այլ կերպ ասած՝ որոշ եղանակներ, որոնցով կարող են սխալ ընթանալ: Այս մասի մնացած մասում մենք ժամանակ կհատկացնենք այս ձևերի տեսակներին հանգեցնող իրավիճակների որոշ կոնկրետ օրինակների քննարկմանը:
Երբեմն գագաթները ընդհանրապես չեն նկատվում քրոմատոգրամում, որտեղ դրանք պետք է էլուացվեն: Վերոնշյալ պատի գրաֆիկը ցույց է տալիս, որ գագաթի բացակայությունը (ենթադրելով, որ նմուշը իրականում պարունակում է թիրախային անալիտ այնպիսի կոնցենտրացիայով, որը պետք է դետեկտորի արձագանքը բավարար դարձնի այն աղմուկից վերև տեսնելու համար) սովորաբար կապված է սարքի որոշ խնդրի կամ շարժական փուլի սխալ պայմանների հետ (եթե ընդհանրապես նկատվում են): Այս կատեգորիայի հնարավոր խնդիրների և լուծումների կարճ ցանկը կարելի է գտնել աղյուսակ I-ում:
Ինչպես նշվեց վերևում, այն հարցը, թե որքանով պետք է հանդուրժել գագաթնակետի լայնացումը՝ ուշադրություն դարձնելուց և այն շտկելու փորձ անելուց առաջ, բարդ թեմա է, որը ես կքննարկեմ ապագա հոդվածում։ Իմ փորձը ցույց է տալիս, որ գագաթնակետի զգալի լայնացումը հաճախ ուղեկցվում է գագաթնակետի ձևի զգալի փոփոխությամբ, և գագաթնակետի պոչային փոփոխությունները ավելի տարածված են, քան նախագագաթնակետայինը կամ բաժանումը։ Այնուամենայնիվ, անվանապես սիմետրիկ գագաթները նույնպես լայնանում են, ինչը կարող է պայմանավորված լինել մի քանի տարբեր պատճառներով.
Այս խնդիրներից յուրաքանչյուրը մանրամասն քննարկվել է «LC խնդիրների լուծում» ամսագրի նախորդ համարներում, և այս թեմաներով հետաքրքրված ընթերցողները կարող են դիմել նախորդ հոդվածներին՝ այս խնդիրների արմատական ​​պատճառների և հնարավոր լուծումների վերաբերյալ տեղեկություններ ստանալու համար: Ավելի մանրամասն տեղեկություններ:
Գագաթնակետային պոչը, գագաթնակետային ճակատը և ճեղքումը կարող են առաջանալ քիմիական կամ ֆիզիկական երևույթներից, և այս խնդիրների հնարավոր լուծումների ցանկը մեծապես տարբերվում է՝ կախված նրանից, թե մենք գործ ունենք քիմիական, թե ֆիզիկական խնդրի հետ։ Հաճախ քրոմատոգրամի տարբեր գագաթները համեմատելով՝ կարող եք կարևոր ակնարկներ գտնել այն մասին, թե որն է մեղավորը։ Եթե քրոմատոգրամի բոլոր գագաթները նմանատիպ ձևեր ունեն, ապա պատճառը, ամենայն հավանականությամբ, ֆիզիկական չէ։ Եթե ազդվում է միայն մեկ կամ մի քանի գագաթ, բայց մնացածը նորմալ տեսք ունեն, ապա պատճառը, ամենայն հավանականությամբ, քիմիական է։
Գագաթնակետային պոչերի քիմիական պատճառները չափազանց բարդ են այստեղ համառոտ քննարկելու համար: Հետաքրքրված ընթերցողին խորհուրդ է տրվում դիմել «LC Troubleshooting» ամսագրի վերջին համարին՝ ավելի խորը քննարկման համար (10): Այնուամենայնիվ, հեշտ փորձելու բան է ներարկված անալիտի զանգվածը նվազեցնելը և տեսնելը, թե արդյոք գագաթնակետի ձևը բարելավվում է: Եթե այո, ապա սա լավ ակնարկ է, որ խնդիրը «զանգվածի գերբեռնվածությունն» է: Այս դեպքում մեթոդը պետք է սահմանափակվի անալիտի փոքր զանգվածների ներարկմամբ, կամ քրոմատոգրաֆիկ պայմանները պետք է փոխվեն այնպես, որ գագաթնակետի լավ ձևեր ստացվեն նույնիսկ ներարկված ավելի մեծ զանգվածներով:
Գագաթնակետային պոչերի առաջացման բազմաթիվ հնարավոր ֆիզիկական պատճառներ կան։ Հնարավորությունների մանրամասն քննարկմամբ հետաքրքրված ընթերցողներին խորհուրդ է տրվում դիմել «LC Troubleshooting» ամսագրի մեկ այլ վերջերս թողարկված համարին (11): Գագաթնակետային պոչերի առաջացման ամենատարածված ֆիզիկական պատճառներից մեկը ներարկիչի և դետեկտորի միջև գտնվող կետում վատ կապն է (12): Ծայրահեղ օրինակ է ցույց տրված նկար 1դ-ում, որը ստացվել է իմ լաբորատորիայում մի քանի շաբաթ առաջ: Այս դեպքում մենք կառուցել ենք նոր ներարկման փականով համակարգ, որը նախկինում չէինք օգտագործել, և տեղադրել ենք փոքր ծավալի ներարկման օղակ՝ չժանգոտվող պողպատե մազանոթի վրա ձուլված ֆարուլով: Սկզբնական խնդիրների լուծման որոշ փորձարկումներից հետո մենք հասկացանք, որ ներարկման փականի ստատորի անցքի խորությունը շատ ավելի խորն էր, քան մենք սովոր էինք, ինչը հանգեցնում էր անցքի ներքևի մասում մեծ մեռյալ ծավալի առաջացմանը: Այս խնդիրը հեշտությամբ լուծվում է՝ ներարկման օղակը փոխարինելով մեկ այլ խողովակով, մենք կարող ենք ֆարուլը կարգավորել համապատասխան դիրքի՝ անցքի ներքևի մասում մեռյալ ծավալը վերացնելու համար:
Նկար 1ե-ում ցույց տրված գագաթների ճակատները կարող են նաև առաջանալ ֆիզիկական կամ քիմիական խնդիրներից։ Առաջատար եզրի տարածված ֆիզիկական պատճառն այն է, որ սյան մասնիկների շերտը լավ չի փաթեթավորված, կամ որ մասնիկները ժամանակի ընթացքում վերակազմակերպվել են։ Ինչպես այս ֆիզիկական երևույթի պատճառով առաջացած գագաթների պոչերի դեպքում, սա շտկելու լավագույն միջոցը սյունը փոխարինելն ու շարունակելն է։ Հիմնականում, քիմիական ծագում ունեցող առաջատար եզրերի գագաթների ձևերը հաճախ առաջանում են այն բանից, ինչը մենք անվանում ենք «ոչ գծային» պահպանման պայմաններ։ Իդեալական (գծային) պայմաններում ստացիոնար փուլի կողմից պահպանված անալիտի քանակը (հետևաբար՝ պահպանման գործակիցը) գծայինորեն կապված է սյան մեջ անալիտի կոնցենտրացիայի հետ։ Քրոմատոգրաֆիկորեն սա նշանակում է, որ սյան մեջ ներարկված անալիտի զանգվածի մեծացմանը զուգընթաց գագաթը դառնում է ավելի բարձր, բայց ոչ ավելի լայն։ Այս կապը խզվում է, երբ պահպանման վարքագիծը ոչ գծային է, և գագաթները ոչ միայն ավելի բարձր են դառնում, այլև ավելի լայն, քանի որ ավելի շատ զանգված է ներարկվում։ Բացի այդ, ոչ գծային ձևերը որոշում են քրոմատոգրաֆիկ գագաթների ձևը, ինչը հանգեցնում է առաջատար կամ հետևի եզրերի։ Ինչպես զանգվածի գերբեռնվածության դեպքում, որը առաջացնում է գագաթների պոչերի (10), ոչ գծային պահպանման պատճառով առաջացած գագաթնակետային առաջխաղացումը կարող է ախտորոշվել նաև ներարկված անալիտի զանգվածը նվազեցնելով։ Եթե գագաթնակետի ձևը բարելավվում է, մեթոդը պետք է փոփոխվի՝ չգերազանցելու առաջնային եզր առաջացնող ներարկման որակը, կամ քրոմատոգրաֆիկ պայմանները պետք է փոխվեն՝ այս վարքագիծը նվազագույնի հասցնելու համար։
Երբեմն մենք դիտարկում ենք մի բան, որը թվում է «բաժանված» գագաթ, ինչպես ցույց է տրված նկար 1f-ում: Այս խնդիրը լուծելու առաջին քայլը որոշելն է, թե արդյոք գագաթի ձևը պայմանավորված է մասնակի համատեղ էլյուցիայով (այսինքն՝ երկու տարբեր, բայց սերտորեն էլյուացված միացությունների առկայությամբ): Եթե իրականում կան երկու տարբեր անալիտներ, որոնք էլյուացվում են միմյանց մոտ, ապա խոսքը դրանց լուծաչափը բարելավելու մասին է (օրինակ՝ ընտրողականությունը, պահպանումը կամ թիթեղների քանակը մեծացնելով), և ակնհայտ «բաժանված» գագաթները կապված են ֆիզիկականի հետ: Արդյունավետությունը կապ չունի սյան հետ: Հաճախ այս որոշման ամենակարևոր հուշումն այն է, թե արդյոք քրոմատոգրամի բոլոր գագաթները ցուցաբերում են բաժանված ձևեր, թե՞ միայն մեկը, թե երկուսը: Եթե դա ընդամենը մեկ կամ երկու է, դա հավանաբար համատեղ էլյուցիայի խնդիր է. եթե բոլոր գագաթները բաժանված են, դա հավանաբար ֆիզիկական խնդիր է, որը, ամենայն հավանականությամբ, կապված է սյան հետ:
Սյունակի ֆիզիկական հատկությունների հետ կապված ճեղքված գագաթները սովորաբար պայմանավորված են մուտքի կամ ելքի մասնակի խցանված ֆրիտներով կամ սյունակում մասնիկների վերակազմակերպմամբ, ինչը թույլ է տալիս շարժական փուլին սյունակի ալիքի ձևավորման որոշակի հատվածներում շարժական փուլից ավելի արագ հոսել, իսկ այլ հատվածներում՝ (11): Մասամբ խցանված ֆրիտը երբեմն կարող է մաքրվել սյունակով հոսքը հակադարձելով. սակայն, իմ փորձից ելնելով, սա սովորաբար կարճաժամկետ լուծում է, այլ ոչ թե երկարաժամկետ: Սա հաճախ մահացու է ժամանակակից սյուների դեպքում, եթե մասնիկները վերամիավորվում են սյունակի ներսում: Այս պահին լավագույնն է փոխարինել սյունը և շարունակել:
Նկար 1g-ում գագաթնակետը, որը նույնպես վերջերս վերցված է իմ սեփական լաբորատորիայում, սովորաբար ցույց է տալիս, որ ազդանշանն այնքան բարձր է, որ հասել է արձագանքի միջակայքի ամենաբարձր սահմանին։ Օպտիկական կլանման դետեկտորների համար (այս դեպքում՝ UV-vis), երբ անալիտի կոնցենտրացիան շատ բարձր է, անալիտը կլանում է դետեկտորի հոսքային խցիկով անցնող լույսի մեծ մասը, թողնելով շատ քիչ լույս, որը կարող է հայտնաբերվել։ Այս պայմաններում լուսադետեկտորից եկող էլեկտրական ազդանշանը մեծապես ազդվում է աղմուկի տարբեր աղբյուրներից, ինչպիսիք են թափառող լույսը և «մութ հոսանքը», ինչը ազդանշանը դարձնում է շատ «մշուշոտ» տեսքով և անկախ անալիտի կոնցենտրացիայից։ Երբ դա տեղի է ունենում, խնդիրը հաճախ կարելի է հեշտությամբ լուծել՝ նվազեցնելով անալիտի ներարկման ծավալը՝ նվազեցնելով ներարկման ծավալը, նոսրացնելով նմուշը կամ երկուսն էլ։
Քրոմատոգրաֆիայի դպրոցում մենք օգտագործում ենք դետեկտորի ազդանշանը (այսինքն՝ քրոմատոգրամի y-առանցքը) որպես նմուշում անալիտի կոնցենտրացիայի ցուցիչ։ Այսպիսով, տարօրինակ է թվում քրոմատոգրամը տեսնել զրոյից ցածր ազդանշանով, քանի որ պարզ մեկնաբանությունն այն է, որ սա ցույց է տալիս անալիտի բացասական կոնցենտրացիա, ինչը, իհարկե, ֆիզիկապես հնարավոր չէ։ Իմ փորձից ելնելով՝ բացասական գագաթները ամենից հաճախ դիտվում են օպտիկական կլանման դետեկտորներ (օրինակ՝ UV-Visual) օգտագործելիս։
Այս դեպքում բացասական գագաթնակետը պարզապես նշանակում է, որ սյունակից դուրս եկող մոլեկուլները կլանում են ավելի քիչ լույս, քան շարժական փուլը գագաթնակետից անմիջապես առաջ և հետո։ Սա կարող է տեղի ունենալ, օրինակ, երբ օգտագործվում են համեմատաբար ցածր հայտնաբերման ալիքի երկարություններ (<230 նմ) ​​և շարժական փուլի հավելանյութեր, որոնք կլանում են լույսի մեծ մասը այդ ալիքի երկարություններում։ Նման հավելանյութերը կարող են լինել շարժական փուլի լուծիչի բաղադրիչներ, ինչպիսիք են մեթանոլը կամ բուֆերային բաղադրիչներ, ինչպիսիք են ացետատը կամ ֆորմատը։ Իրականում կարելի է օգտագործել բացասական գագաթնակետեր՝ տրամաչափման կոր պատրաստելու և ճշգրիտ քանակական տեղեկատվություն ստանալու համար, ուստի դրանցից խուսափելու հիմնարար պատճառ չկա (այս մեթոդը երբեմն անվանում են «անուղղակի ուլտրամանուշակագույն հայտնաբերում») (13): Այնուամենայնիվ, եթե մենք իսկապես ցանկանում ենք ընդհանրապես խուսափել բացասական գագաթնակետերից, կլանման հայտնաբերման դեպքում լավագույն լուծումը տարբեր հայտնաբերման ալիքի երկարություն օգտագործելն է, որպեսզի անալիտը կլանի ավելի շատ, քան շարժական փուլը, կամ փոխել շարժական փուլի կազմը, որպեսզի դրանք կլանում են ավելի քիչ լույս, քան անալիտները։
Բացասական գագաթներ կարող են առաջանալ նաև բեկման ցուցիչի (RI) հայտնաբերման դեպքում, երբ նմուշում անալիտից բացի այլ բաղադրիչների, օրինակ՝ լուծիչի մատրիցի, բեկման ցուցիչը տարբերվում է շարժական փուլի բեկման ցուցիչից: Սա տեղի է ունենում նաև ուլտրամանուշակագույն-տեսանելի հայտնաբերման դեպքում, սակայն այս էֆեկտը հակված է թուլանալու RI հայտնաբերման համեմատ: Երկու դեպքում էլ բացասական գագաթները կարելի է նվազագույնի հասցնել՝ նմուշի մատրիցի կազմը շարժական փուլի կազմին ավելի մոտիկից համապատասխանեցնելով:
Երրորդ մասում, որը նվիրված էր LC խնդիրների լուծման հիմնական թեմային, ես քննարկեցի այն իրավիճակները, երբ դիտարկվող գագաթնակետի ձևը տարբերվում է սպասվող կամ նորմալ գագաթնակետի ձևից: Նման խնդիրների արդյունավետ լուծումը սկսվում է սպասվող գագաթնակետի ձևերի իմացությունից (հիմնված տեսության կամ առկա մեթոդների հետ նախկին փորձի վրա), ուստի այդ սպասումներից շեղումները ակնհայտ են: Գագաթնակետի ձևի խնդիրները ունեն բազմաթիվ տարբեր հնարավոր պատճառներ (չափազանց լայն, պոչային, առաջատար եզր և այլն): Այս մասում ես մանրամասն քննարկում եմ այն ​​պատճառներից մի քանիսը, որոնք ես ամենից հաճախ տեսնում եմ: Այս մանրամասները իմանալը լավ հիմք է խնդիրների լուծումը սկսելու համար, բայց չի արտացոլում բոլոր հնարավորությունները: Պատճառների և լուծումների ավելի մանրամասն ցանկով հետաքրքրված ընթերցողները կարող են դիմել LCGC «LC խնդիրների լուծման ուղեցույց» պատի աղյուսակին:
(4) LCGC «LC խնդիրների լուծման ուղեցույց» պատի աղյուսակ։ https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021)։
(6) Ա. Ֆելինգեր, Տվյալների վերլուծություն և ազդանշանների մշակում քրոմատոգրաֆիայում (Էլսևիեր, Նյու Յորք, Նյու Յորք, 1998), էջ 43-96։
(8) Վահաբ Մ.Ֆ., Դասգուպտա Պ.Կ., Կադջո Ա.Ֆ. և Արմսթրոնգ Դ.Վ., Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.