Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Դուք օգտագործում եք սահմանափակ CSS աջակցությամբ դիտարկիչի տարբերակ: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Բացի այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Միաժամանակ ցուցադրում է երեք սլայդից բաղկացած կարուսել: Օգտագործեք «Նախորդ» և «Հաջորդ» կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդով անցնելու համար, կամ օգտագործեք վերջում գտնվող սահող կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդով անցնելու համար:
Ինքնակազմակերպվող նյարդային օրգանոիդները խոստումնալից in vitro հարթակ են ներկայացնում մարդու զարգացման և հիվանդությունների մոդելավորման համար: Այնուամենայնիվ, օրգանոիդները զուրկ են in vivo գոյություն ունեցող կապից, ինչը սահմանափակում է հասունացումը և կանխում վարքագիծը վերահսկող այլ շղթաների հետ ինտեգրումը: Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ նորածին մերկ առնետների սոմատոզենսորային կեղևում փոխպատվաստված մարդու ցողունային բջիջներից ստացված կեղևային օրգանոիդները զարգացնում են հասուն բջջային տեսակներ, որոնք ինտեգրվում են զգայական և մոտիվացիոն շղթաների մեջ: ՄՌՏ-ն ցույց տվեց փոխպատվաստումից հետո օրգանոիդների աճ մի քանի ցողունային բջջային գծերում և կենդանիների մոտ, մինչդեռ մեկ միջուկի վերլուծությունը ցույց տվեց կորտիկոգենեզի առաջընթաց և ակտիվությունից կախված տրանսկրիպցիոն ծրագրի ի հայտ գալը: Իրոք, փոխպատվաստված կեղևային նեյրոնները ցուցաբերում են ավելի բարդ ձևաբանական, սինապտիկ և ներքին թաղանթային հատկություններ, քան իրենց in vitro համարժեքները, ինչը թույլ է տալիս հայտնաբերել նեյրոնային արատներ Թիմոթիի համախտանիշով հիվանդների մոտ: Անատոմիական և ֆունկցիոնալ հետևումը ցույց է տվել, որ փոխպատվաստված օրգանոիդները ստանում են թալամոկորտիկալ և կեղևոկորտիկորտիկալ ազդակներ, և նյարդային ակտիվության in vivo ձայնագրությունները ենթադրում են, որ այդ ազդակները կարող են առաջացնել զգայական արձագանքներ մարդու բջիջներում: Վերջապես, կեղևային օրգանոիդները տարածում են աքսոններ առնետի ուղեղի ամբողջ երկայնքով, և դրանց օպտոգենետիկ ակտիվացումը հանգեցնում է պարգևատրման որոնման վարքագծի: Այսպիսով, փոխպատվաստված մարդու կեղևի նեյրոնները հասունանում են և մասնակցում են տիրոջ վարքագիծը վերահսկող շղթաներին: Մենք ակնկալում ենք, որ այս մոտեցումը կնպաստի հիվանդից ստացված բջիջներում շղթայական մակարդակի ֆենոտիպերի հայտնաբերմանը, որոնք այլ միջոցներով հնարավոր չէ հայտնաբերել:
Զարգացող մարդու ուղեղը ուշագրավ ինքնակազմակերպվող գործընթաց է, որի ընթացքում բջիջները բազմանում, դիֆերենցվում, միգրացվում և միանում են՝ ձևավորելով ֆունկցիոնալ նեյրոնային շղթաներ, որոնք հետագայում կատարելագործվում են զգայական փորձի միջոցով: Մարդու ուղեղի զարգացումը հասկանալու հիմնական խնդիրը, հատկապես հիվանդության համատեքստում, ուղեղի հյուսվածքին հասանելիության բացակայությունն է: Ինքնակազմակերպվող օրգանոիդները, այդ թվում՝ մարդու կեղևի օրգանոիդները (hCO3, որը հայտնի է նաև որպես մարդու կեղևի գունդ), կարող են առաջացնել 2,3,4,5,6: Այնուամենայնիվ, մի շարք սահմանափակումներ սահմանափակում են դրանց ավելի լայն կիրառումը նյարդային շղթաների զարգացման և գործունեության հասկացման համար: Մասնավորապես, պարզ չէ, թե արդյոք hCO3-ի հասունացումը սահմանափակվում է in vivo առկա որոշակի միկրոմիջավայրի և զգայական ազդակների բացակայությամբ: Բացի այդ, քանի որ hCO3-ները չեն ինտեգրվում վարքային արդյունքներ ստեղծող շղթաների մեջ, դրանց օգտակարությունը գենետիկորեն բարդ և վարքային նյարդահոգեբուժական խանգարումների մոդելավորման մեջ ներկայումս սահմանափակ է:
hCO-ի փոխպատվաստումը ամբողջական կենդանի ուղեղի մեջ կարող է հաղթահարել այս սահմանափակումները: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ կրծողների կեղևում փոխպատվաստված մարդու նեյրոնները կարող են գոյատևել, պրոյեկտվել և շփվել կրծողների բջիջների հետ7,8,9,10,11,12: Այնուամենայնիվ, այս փորձերը սովորաբար կատարվում են չափահաս կենդանիների վրա, ինչը կարող է սահմանափակել սինապսային և աքսոնալ ինտեգրացիան: Այստեղ մենք նկարագրում ենք փոխպատվաստման մի մոդել, որի դեպքում մենք hiPS բջիջներից ստացված 3D hCO-ն փոխպատվաստել ենք իմունային անբավարարություն ունեցող առնետների առաջնային սոմատոզենսորային կեղև (S1)՝ պլաստիկ զարգացման վաղ փուլում: Փոխպատվաստված hCO (t-hCO) նեյրոնները ենթարկվում են զգալի հասունացման, ստանում են թալամոկորտիկալ և կեղև-կեղևային ազդակներ, որոնք առաջացնում են զգայական արձագանքներ, և տարածում են աքսոնալ պրոյեկցիաները առնետի ուղեղի մեջ՝ պարգևատրման որոնման վարքագիծը խթանելու համար: t-hCO-ի երկարատև հասունացումը բացահայտել է նեյրոնային արատներ Թիմոթիի համախտանիշով (TS) հիվանդների մոտ, որը ծանր գենետիկ խանգարում է, որն առաջանում է լարման նկատմամբ զգայուն L-տիպի CaV1.2 կալցիումական ալիքի մուտացիաների պատճառով (կոդավորված CACNA1C-ի կողմից):
Մարդու կեղևային նեյրոնները in vivo շղթաներում ուսումնասիրելու համար մենք ստերեոտակտիկորեն փոխպատվաստել ենք անփոփոխ 3D hCO3-ը վաղ հետծննդյան աթիմիկ առնետների S1 մեջ (հետծննդյան 3-7 օրեր) (Նկար 1ա և Նկար 1ա-գ-ի ընդլայնված տվյալները): Այս պահին թալամոկորտիկալ և կեղևոկորտիկալ աքսոնալ ելուստները դեռևս չեն ավարտել իրենց S1 ներվերացումը (հղում 13): Այսպիսով, այս մոտեցումը նախատեսված է t-hCO3 ինտեգրացիան մաքսիմալացնելու համար՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով էնդոգեն շղթաների վրա ազդեցությունը: Կենդանի կենդանիների մոտ t-hCO3-ի տեղակայումը պատկերացնելու համար մենք կատարել ենք առնետների T2-կշռված ՄՌՏ ուղեղի վերակառուցումներ փոխպատվաստումից 2-3 ամիս անց (Նկար 1բ և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1դ): t-hCO2-ը հեշտությամբ դիտարկվեցին, և t-hCO2-ի ծավալային չափումները նման էին ֆիքսված կտորներից հաշվարկվածներին (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 1դ,ե; P > 0.05): t-hCO2-ը հեշտությամբ դիտարկվեցին, և t-hCO2-ի ծավալային չափումները նման էին ֆիքսված կտորներից հաշվարկվածներին (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 1դ,ե; P > 0.05): t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05): t-hCO3-ը հեշտությամբ դիտարկվեց, և t-hCO3 ծավալային չափումները նման էին ֆիքսված հատվածների համար հաշվարկվածներին (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 1դ, ե; P > 0.05):很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05＼很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05): t-hCO3-ը հեշտությամբ դիտարկվեց, և t-hCO3 ծավալային չափումները նման էին ֆիքսված հատվածների համար հաշվարկվածներին (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 1դ, ե; P > 0.05):Մենք որոշեցինք t-hCO-ն փոխպատվաստված կենդանիների 81%-ի մոտ փոխպատվաստումից մոտավորապես 2 ամիս անց (n = 72 կենդանի; hCO-ն 10 hiPS բջջային գծերից; hiPS բջջային գծերը՝ լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում): Դրանցից 87%-ը գտնվում էր ուղեղային կեղևում (Նկար 1գ): Նույն փոխպատվաստված առնետի մոտ մի քանի ժամանակային կետերում հաջորդական ՄՌՏ սկանավորումներ կատարելով՝ մենք հայտնաբերեցինք t-hCO-ի ծավալի ինը անգամ աճ 3 ամսվա ընթացքում (Նկար 1դ և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1զ): Փոխպատվաստված կենդանիները փոխպատվաստումից 12 ամիս անց ունեցել են բարձր գոյատևման մակարդակ (74%) (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1գ և Լրացուցիչ աղյուսակ 2), և չեն հայտնաբերվել ակնհայտ շարժիչային կամ հիշողության խանգարումներ, գլիոզ կամ էլեկտրաէնցեֆալոգրաֆիա (ԷԷԳ): Տվյալները՝ Նկար 1գ և լրացուցիչ աղյուսակ 2): 1ժ–ր և 3ե):
ա, Փորձարարական դիզայնի սխեմատիկ պատկերը։ hiPS բջիջներից ստացված hCO2-ն փոխպատվաստվել է նորածին մերկ առնետների S1 մեջ դիֆերենցիացիայի 30-60 օրերին։ բ, T2-կշռված պսակաձև և հորիզոնական ՄՌՏ պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս t-hCO2-ն S1-ում փոխպատվաստումից 2 ամիս անց։ Սանդղակի գիծ, ​​2 մմ։ գ, Յուրաքանչյուր hiPS բջջային գծի համար ներկայացված է փոխպատվաստման հաջողության մակարդակի քանակական որոշումը (n = 108, սանդղակների մեջ թվերը ցույց են տալիս t-hCO2-ի քանակը hIPS բջջային գծում) և կեղևային կամ ենթակեղևային տեղակայումը (n = 88)։ դ, պսակաձև զարկերակի ՄՌՏ պատկերը (ձախից, սանդղակի գիծ, ​​3 մմ) և համապատասխան եռաչափ ծավալային վերակառուցումը (սանդղակի գիծ, ​​3 մմ), որը ցույց է տալիս t-hCO2-ի աճը 3 ամսվա ընթացքում։ ե, t-hCO2 օրինաչափությունների վերանայում առնետի գլխուղեղի կեղևում։ Սանդղակի գիծ, ​​1 մմ։ f, t-hCO-ի ներկայացուցչական իմունոցիտոքիմիական պատկերներ, որոնք ներկայացված են վերևի ձախից աջ (դիֆերենցիացիայի ընթացքում). PPP1R17 (4 ամսական), NeuN (8 ամսական), SOX9 և GFAP (8 ամսական), PDGFRα; (8 ամսական), MAP2 (8 ամսական) և IBA1 (8 ամսական): Մասշտաբի գիծ՝ 20 մկմ: HNA-ի համատեղ արտահայտումը ցույց է տալիս մարդու ծագման բջիջները: g, snRNA-seq: Բոլոր բարձրորակ t-hCO կորիզների միասնական բազմաձևության և պրոյեկցիայի (UMAP) չափայնության նվազեցման պատկերացում Սյորատի ինտեգրումից հետո (n=3 t-hCO նմուշներ, n=2 hiPS բջջային գծեր): Աստրոցիտներ, աստրոցիտների գծի բջիջներ; cycle prog, շրջանառվող նախորդներ; GluN DL, խորը գլուտամատերգիկ նեյրոններ; GluN DL/SP, խորը և ենթաշերտային գլուտամատերգիկ նեյրոններ; GluN UL, վերին շերտի գլուտամատերգիկ նեյրոններ; օլիգոդենդրոցիտներ, օլիգոդենդրոցիտներ; OPC, օլիգոդենդրոցիտների նախորդ բջիջներ; RELN, րիլին նեյրոններ։ հ, Գենային Օնտոլոգիայի (GO) տերմինային հարստացման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում գեների արժեքը զգալիորեն բարձրացել է (ճշգրտված P < 0.05, ծալքի փոփոխություն > 2, արտահայտված է կորիզների առնվազն 10%-ում)՝ համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ։ հ, Գենային Օնտոլոգիայի (GO) տերմինային հարստացման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում գեների արժեքը զգալիորեն բարձրացել է (ճշգրտված P < 0.05, ծալքի փոփոխություն > 2, արտահայտված է կորիզների առնվազն 10%-ում)՝ համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ։ h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% яные ярый почетной активнацией) с глутаматергическими нейронами hCO. h, Գենային Օնտոլոգիայի (GO) տերմինային հարստացման վերլուծություն t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում նշանակալի ակտիվացում (ճշգրտված P<0.05, ծալքի փոփոխություն >2, արտահայտություն առնվազն 10% կորիզներում) ունեցող գեների համար՝ համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ։ h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（莃P 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集圯语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上萃 （5 弃 p变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скоректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнениями. Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում գեները զգալիորեն բարձրացված էին (ճշգրտված P < 0.05, ծալքի փոփոխություն > 2, արտահայտված կորիզների առնվազն 10%-ում)՝ համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ։ Հարստացման տերմինի օնտոլոգիական (GO) վերլուծություն։Կետավոր գիծը ցույց է տալիս 0.05 aq արժեքը։ i, GluN բջջային տեսակների UMAP պատկերումը t-hCO-ում, օգտագործելով պիտակի փոխանցումը 22 snRNA-seq չափահաս շարժիչային կեղևի հղման տվյալների հավաքածուից։ CT՝ կորտիկոթալամիկ բջիջներ, ET՝ արտաուղեղային բջիջներ, IT՝ ներքին տելենցեֆալիկ բջիջներ, NP՝ մոտ պրոյեկցիա։
Այնուհետև մենք գնահատեցինք t-hCO-ի ցիտոարխիտեկտուրան և ընդհանուր բջջային կազմը: Առնետի էնդոթելային բջիջների հակամարմիններով ներկումը բացահայտեց t-hCO-ով անոթավորում, մինչդեռ IBA1 ներկումը բացահայտեց առնետի միկրոգլիայի առկայությունը ամբողջ պատվաստանյութում (Նկար 1f և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 3c,d): Իմունային ներկումը բացահայտեց մարդու միջուկային հակածինի (HNA) դրական բջիջներ, որոնք համատեղ արտահայտում էին PPP1R17 (կեղևային նախորդներ), NeuN (նեյրոններ), SOX9 և GFAP (գլիայից ստացված բջիջներ) կամ PDGFRα (օլիգոդենդրոցիտների նախորդներ) (Նկար 1f): T-hCO-ի բջջային կազմը մեկ բջջային լուծաչափով ուսումնասիրելու համար մենք կատարեցինք միամիջուկային RNA հաջորդականացում (snRNA-seq) մոտավորապես 8 ամսվա դիֆերենցիացումից հետո: Առնետի կորիզների զանգվածային ֆիլտրացիան և հեռացումը տվեցին 21,500 բարձրորակ մարդու մոնոնուկլեար քարտեզներ (Նկար 1g և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 4a,b): Բջջային տիպի բնորոշ մարկերների արտահայտման օրինաչափությունները բացահայտել են կեղևային բջիջների հիմնական դասերի կլաստերներ, ներառյալ խորը և մակերեսային գլուտամատերգիկ նեյրոնները, շրջանառվող նախորդները, օլիգոդենդրոցիտները և աստրոցիտների տոհմը (Նկար 1գ, ընդլայնված տվյալներ, Նկար 4գ և Լրացուցիչ աղյուսակ 3): SATB2-ի և CTIP2-ի իմունային ներկումը ցույց է տվել, որ կեղևային ենթատիպերի առկայությանը չնայած, t-hCO-ն չի ցուցաբերել հստակ անատոմիական շերտավորում (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 3ա): Փուլին համապատասխանող snRNA-seq hCO-ն առաջացրել է լայնորեն նմանատիպ բջջային դասեր, մի քանի բացառություններով, ներառյալ օլիգոդենդրոցիտների բացակայությունը և GABAergic նեյրոնների առկայությունը, ինչը կարող է արտացոլել կողմնային նախորդ բջիջների համար նախկինում հաղորդված in vitro բարենպաստ պայմանները15 (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 4ֆ-ի և Լրացուցիչ աղյուսակ 4): Գեների դիֆերենցիալ էքսպրեսիայի վերլուծությունը բացահայտեց գլուտամատերգիկ նեյրոնների զգալի տարբերություններ t-hCO-ի և hCO-ի միջև (Լրացուցիչ աղյուսակ 5), ներառյալ նեյրոնային հասունացման հետ կապված գեների հավաքածուների ակտիվացումը, ինչպիսիք են սինապտիկ ազդանշանային փոխանցումը, դենդրիտային տեղայնացումը և լարման-կախյալ ալիքային ակտիվությունը (Նկար 1h և Լրացուցիչ աղյուսակ 5): Աղյուսակ 6): Համապատասխանաբար, կեղևային գլուտամատերգիկ t-hCO նեյրոնները ցուցաբերեցին արագացված տրանսկրիպցիոն հասունացում:
Պարզաբանելու համար, թե արդյոք t-hCO-ի այս տրանսկրիպցիոն փոփոխությունները կապված են hCO-ի in vitro և t-hCO-ի in vivo միջև ձևաբանական տարբերությունների հետ, մենք վերակառուցեցինք փուլին համապատասխան բիոցիտինով լցված hCO-ն և hCO-ն սուր հատվածներում՝ 7-8 ամիս դիֆերենցիացիայից հետո: hCO նեյրոններ (Նկար 2ա): t-hCO նեյրոնները զգալիորեն ավելի մեծ էին, ունեին սոմայի տրամագիծը 1.5 անգամ մեծ, դենդրիտների քանակը կրկնակի ավելի էր և դենդրիտների ընդհանուր երկարությունը ընդհանուր առմամբ վեց անգամ ավելի մեծ էր in vitro hCO-ի համեմատ (Նկար 2բ): Բացի այդ, մենք նկատեցինք դենդրիտային փշերի զգալիորեն ավելի բարձր խտություն t-hCO նեյրոններում, քան hCO նեյրոններում (Նկար 2գ): Սա ենթադրում է, որ t-hCO նեյրոնները ենթարկվում են դենդրիտների լայնածավալ երկարացման և ճյուղավորման, որը, զուգորդված բջիջների շարունակական բազմացման հետ, կարող է նպաստել t-hCO-ի ինտենսիվ աճին փոխպատվաստումից հետո (Նկար 1դ և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 1զ): Սա մեզ դրդեց ուսումնասիրել էլեկտրաֆիզիոլոգիական հատկությունները: Թաղանթի տարողունակությունը ութ անգամ ավելի բարձր էր (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 8դ), հանգստի վիճակում գտնվող թաղանթային պոտենցիալն ավելի հիպերպոլարիզացված էր (մոտավորապես 20 մՎ), և հոսանքի ներարկումը t-hCO նեյրոններում առաջացրել է ավելի բարձր առավելագույն գրգռման արագություն, քան hCO նեյրոններում: in vitro (Նկ. 2դ), ե), ինչը համապատասխանում է t-hCO-ի ավելի մեծ և ավելի բարդ ձևաբանական առանձնահատկություններին: Բացի այդ, ինքնաբուխ գրգռիչ հետսինապսային հոսանքի իրադարձությունների (EPSC) հաճախականությունը զգալիորեն ավելի բարձր էր t-hCO նեյրոններում (Նկ. 2զ), ինչը ենթադրում է, որ t-hCO նեյրոններում դիտարկվող դենդրիտային փշերի խտության աճը կապված էր ֆունկցիոնալ գրգռվածության հետ: Սեռական սինապս: Մենք հաստատեցինք hCO նեյրոնների անհասուն բնույթը in vitro՝ գրանցելով նշված գլուտամատերգիկ նեյրոնները (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 6ա-գ):
ա, բիոցիտինով լցված hCO և t-hCO նեյրոնների եռաչափ վերակառուցում 8 ամսվա դիֆերենցիացումից հետո։ բ, Մորֆոլոգիական առանձնահատկությունների քանակականացում (n = 8 hCO3 նեյրոններ, n = 6 t-hCO3 նեյրոններ; **P = 0.0084, *P = 0.0179 և ***P < 0.0001): բ, Մորֆոլոգիական առանձնահատկությունների քանակականացում (n = 8 hCO3 նեյրոններ, n = 6 t-hCO3 նեյրոններ; **P = 0.0084, *P = 0.0179 և ***P < 0.0001): б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001): բ, ձևաբանական առանձնահատկությունների քանակականացում (n=8 hCO3 նեյրոններ, n=6 t-hCO3 նեյրոններ; **P=0.0084, *P=0.0179 և ***P<0.0001): b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001): b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001): б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001): բ, ձևաբանական առանձնահատկությունների քանակականացում (n=8 hCO3 նեյրոններ, n=6 t-hCO3 նեյրոններ; **P=0.0084, *P=0.0179 և ***P<0.0001):գ, hCO և t-hCO դենդրիտային ճյուղերի եռաչափ վերակառուցում 8 ամսվա դիֆերենցիացումից հետո: Կարմիր աստղանիշները ցույց են տալիս ենթադրյալ դենդրիտային փշերը: Դենդրիտային փշերի խտության քանակականացում (n = 8 hCO նեյրոններ, n = 6 t-hCO նեյրոններ; **P = 0.0092): դ, Հանգստի թաղանթային պոտենցիալի քանակական որոշում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): դ, Հանգստի թաղանթային պոտենցիալի քանակական որոշում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001): դ, հանգստի թաղանթային պոտենցիալի քանակականացում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001): դ, հանգստի թաղանթային պոտենցիալի քանակականացում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): ե, hCO և t-hCO3-ում գործողության պոտենցիալի կրկնվող ակտիվացում, որն առաջանում է հոսանքի ներարկումների ավելացման հետևանքով, և առավելագույն ակտիվացման հաճախականության քանակականացում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): ե, hCO և t-hCO3-ում գործողության պոտենցիալի կրկնվող ակտիվացում, որն առաջանում է հոսանքի ներարկումների ավելացման հետևանքով, և առավելագույն ակտիվացման հաճախականության քանակականացում (n = 25 hCO3 նեյրոններ, n = 16 t-hCO3 նեյրոններ; ***P < 0.0001): e, նորից է возбудения потенциала действия в hCO եւ t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO). ե, hCO և t-hCO-ում գործողության պոտենցիալի վերագործարկումը՝ պայմանավորված հոսանքի աճով և առավելագույն ակտիվացման արագության քանակականացմամբ (n = 25 hCO նեյրոններ, n = 16 t-hCO նեյրոններ; *** P < 0.0001): e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）։ E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001）: e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO; n n = 1. <00001): ե, hCO և t-hCO գործողության պոտենցիալների կրկնվող ակտիվացում՝ առաջացած հոսանքի մատակարարման ավելացմամբ և առավելագույն ակտիվացման արագության քանակականացում (n = 25 hCO նեյրոններ, n = 16 t-hCO նեյրոններ; *** P < 0.0001): f, hCO և t-hCO նեյրոններում ինքնաբուխ EPSC-ներ (sEPSC) դիֆերենցիացիայի 8 ամսվա ընթացքում և սինապտիկ իրադարձությունների հաճախականության քանակականացում (n = 25 hCO նեյրոններ, n = 17 t-hCO նեյրոններ; ***P < 0.0001): f, hCO և t-hCO նեյրոններում ինքնաբուխ EPSC-ները (sEPSC) դիֆերենցիացիայի 8 ամսվա ընթացքում և սինապտիկ իրադարձությունների հաճախականության քանակականացում (n = 25 hCO նեյրոններ, n = 17 t-hCO նեյրոններ; ***P < 0.0001): f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO և t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 նոր hCO, n = 17 PCO;0;0 t. f, hCO և t-hCO նեյրոններում ինքնաբուխ EPSC-ները (sEPSC) 8 ամսվա դիֆերենցիացիայի և սինապտիկ իրադարձությունների հաճախականության քանակականացման արդյունքում (n=25 hCO նեյրոններ, n=17 t-hCO նեյրոններ; ***P<0.0001): f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs.神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001）: f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs)，以及突触事件及突触事件及率缄频5 CO.神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001）: f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO և t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 նեյրոնով hCO, n = 17 PCO;0 t***): f, hCO և t-hCO նեյրոններում ինքնաբուխ EPSC-ները (sEPSC) 8 ամսվա դիֆերենցիացիայի և սինապտիկ իրադարձությունների հաճախականության քանակականացման արդյունքում (n = 25 hCO նեյրոններ, n = 17 t-hCO նեյրոններ; *** P<0.0001):bf-ի համար, 1208-2 տողում hCO-ն և t-hCO-ն վերցվել են զուգահեռաբար պահպանվող նույն դիֆերենցման խմբաքանակից։ g, Գեների հարստացման վերլուծություն (միակողմանի Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ)՝ t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում զգալիորեն բարձրացված (ճշգրտված P < 0.05, ծալքի փոփոխություն > 2, արտահայտված կորիզների առնվազն 10%-ում) գեների համար, համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ՝ in vivo մկների ուսումնասիրությունից16 և in vitro նեյրոններից17 մարդու համար հատուկ LRG-ների գեների հավաքածուներով։ g, Գեների հարստացման վերլուծություն (միակողմանի Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ)՝ t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում զգալիորեն բարձրացված (ճշգրտված P < 0.05, ծալքի փոփոխություն > 2, արտահայտված կորիզների առնվազն 10%-ում) գեների համար, համեմատած hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հետ՝ in vivo մկների ուսումնասիրությունից16 և in vitro նեյրոններից17 մարդու համար հատուկ LRG-ների գեների հավաքածուներով։ g, անալիզ обогащения набора генов (одосторонний точный критерий Фишера) генови со значительной активацией (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по мень10% глудерский мереги) нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов како раннего (ERG), так и позднего (LRG) գենով, зависящих от активности, идентифицированных в. исследовании на мышах in vivo16, и specifiческих для человека LRG из нейронов in vitro17: գ, t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում նշանակալի ակտիվացում ունեցող գեների գեների հարստացման (միակողմանի Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ) վերլուծություն (ճշգրտված P<0.05, ծալքի փոփոխություն >2, արտահայտում կորիզների առնվազն 10%-ում)՝ համեմատած in vivo մկների16 և in vitro նեյրոններից մարդու համար հատուկ LRG-ների17 մոտ հայտնաբերված վաղ և ուշ (ERG) ակտիվությունից կախված գեների hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների հավաքածուների հետ։ g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类牧LRG g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 刞胃 伏<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （ ձկնորս体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16.神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG։ g, глутаматергические нейроны t-hCO մեծապես ակտիվորեն ակտիվանում է hCO-ի հետ գլյուտամատերգիկական նեյրոնային hCO-ի հետ (скоректированный P<0,05, кратность изменения> 2, ոչ միայն 10% անալիզի վրա) точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17, специфичные для человека. g-ով, t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնները զգալիորեն բարձրացված էին hCO գլուտամատերգիկ նեյրոնների համեմատ (ճշգրտված P<0.05, ծալքի փոփոխություն >2, առնվազն 10%): Վաղ արձագանքի (ERG) և ուշ արձագանքի գեների հարստացման վերլուծություն (միակողմանի Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ) արձագանքի ակտիվությունից կախված գեներ (LRG), որոնք հայտնաբերվել են in vivo մկների16 և in vitro նեյրոնների17 մոտ: Մարդու հատուկ LRG-ներ:Կետավոր գիծը ցույց է տալիս Բոնֆերոնիի կողմից շտկված 0.05 P արժեքը։ h, GluN գենի արտահայտությունը (յուրաքանչյուր գենի կեղծ փաթեթավորումը և մասշտաբավորումը) զգալիորեն բարձրացել է LRG գեների snRNA-seq կրկնօրինակներում t-hCO գլուտամատերգիկ նեյրոններում։ i, իմունային ներկումը ցույց է տալիս SCG2 արտահայտությունը t-hCO (վերին) և hCO (ստորին) նեյրոններում։ Սպիտակ նետերը ցույց են տալիս SCG2+ բջիջները։ Մասշտաբի գիծը՝ 25 մկմ։ Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում։
Հիմնվելով ex vivo շերտերում t-hCO-ի ակտիվության աճի վրա, snRNA-seq-ը բացահայտեց գեների տրանսկրիպտների ակտիվությունից կախված աճ t-hCO-ում՝ համեմատած hCO-ի հետ in vitro: Գլուտամատերգիկ t-hCO նեյրոնները արտահայտեցին ուշ արձագանքի ակտիվությունը կարգավորող գեների ավելի բարձր մակարդակներ (Նկար 2g,h), որոնք հայտնաբերվել էին մկների և մարդու նեյրոնների վրա նախորդ ուսումնասիրություններում16,17: Օրինակ, BDNF18-ը, SCG2-ը և OSTN-ը՝ պրիմատների հատուկ ակտիվությունը կարգավորող գենը, ցույց տվեցին t-hCO նեյրոններում արտահայտման աճ՝ համեմատած hCO նեյրոնների հետ (Նկար 2g-i): Այսպիսով, t-hCO նեյրոնները ցուցաբերեցին հասունացման բարելավված բնութագրեր՝ համեմատած hCO նեյրոնների հետ՝ տրանսկրիպցիոն, ձևաբանական և ֆունկցիոնալ վերլուծությունների միջոցով:
Մարդու ուղեղի զարգացման հետ t-hCO հասունացման կապը հետագա գնահատելու համար մենք կատարեցինք պտղի և չափահասի կեղևի բջջային տեսակների տրանսկրիպտոմիկ համեմատություններ19,20 և չափահասի21,22, ինչպես նաև զարգացման ընթացքում կեղևի գեների արտահայտման վերաբերյալ լայնածավալ տվյալներ23 (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 5): Նախորդ աշխատանքների համեմատ24, hCO-ի և t-hCO տրանսկրիպտոմների հասունացման ընդհանուր վիճակը 7-8 ամսվա դիֆերենցման ժամանակ ընդհանուր առմամբ համապատասխանում է in vivo զարգացման ժամանակին և առավելագույնս համարժեք է պտղի կյանքի ուշ շրջանին (Ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 5ա): Հատկանշական է, որ մենք նկատեցինք t-hCO-ում տրանսկրիպտոմների հասունության աճ՝ համեմատած տարիքին համապատասխանող hCO-ի հետ, ինչպես նաև տրանսկրիպտոմների ակտիվացում՝ կապված սինապտոգենեզի, աստղագենեզի և միելինացման հետ (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 5բ-դ): Բջջային մակարդակում մենք հայտնաբերեցինք t-hCO-ում ավելի բարակ կեղևի ենթատիպի ապացույցներ, որտեղ գլուտամատերգիկ նեյրոնների կլաստերները համընկնում էին չափահասի L2/3, L5 և L6 նեյրոնների ենթատիպերի հետ (Նկար 1i): Ի հակադրություն, գլուտամատերգիկ t-hCO նեյրոնների և պտղի կեղևային նեյրոնների միջև կլաստերային համընկնումը ավելի սահմանափակ էր հղիության կեսին (ընդլայնված տվյալներ, նկար 5e-j): Որոշելու համար, թե արդյոք t-hCO նեյրոնները ֆունկցիոնալ առումով նման են մարդու հետծննդյան նեոկորտիկալ նեյրոններին, մենք կատարեցինք մարդու L2/3 բուրգային նեյրոնների էլեկտրաֆիզիոլոգիական ձայնագրություններ և անատոմիական վերակառուցումներ մարդու հետծննդյան կեղևի սուր հատվածներում (ընդլայնված տվյալներ, նկար 7ա): L2/3 բուրգային նեյրոնների էլեկտրաֆիզիոլոգիական հատկությունները նման էին t-hCO բուրգային նեյրոնների հատկություններին (ընդլայնված տվյալներ, նկար 7ե): Մորֆոլոգիապես, հետծննդյան մարդկային նմուշներից վերցված L2/3 նեյրոնները ավելի նման էին t-hCO-ին, քան hCO-ին, չնայած L2/3 բջիջները ավելի երկար էին, ընդհանուր առմամբ ավելի շատ ճյուղեր ունեին և ունեին ավելի բարձր ողնաշարի խտություն (Նկար 3g և ընդլայնված տվյալներ, նկար 7b-): G):
ա, վերահսկիչ և TS hiPS բջջային գծերի կողմից արտադրված hCO-ի փոխպատվաստում նորածին առնետների մեջ։ բ, բիոցիտինով լցված t-hCO նեյրոնների եռաչափ վերակառուցում 8 ամսվա դիֆերենցիացումից հետո։ գ, դենդրիտների միջին երկարության քանակականացում (n = 19 վերահսկիչ նեյրոններ, n = 21 TS նեյրոններ; **P = 0.0041): դ, 8 ամսվա դիֆերենցիացիայից հետո վերահսկիչ և TS t-hCO3 դենդրիտային ճյուղերի եռաչափ վերակառուցում և դենդրիտային ողնաշարի խտության քանակական որոշում (n = 16 վերահսկիչ նեյրոններ, n = 21 TS նեյրոններ, ***P < 0.0001): դ, 8 ամսվա դիֆերենցիացիայից հետո վերահսկիչ և TS t-hCO3 դենդրիտային ճյուղերի եռաչափ վերակառուցում և դենդրիտային ողնաշարի խտության քանակական որոշում (n = 16 վերահսկիչ նեյրոններ, n = 21 TS նեյրոններ, ***P < 0.0001): d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, 201). դ, վերահսկիչ և t-hCO TS դենդրիտային ճյուղերի եռաչափ վերակառուցում 8 ամսվա դիֆերենցիացիայի և դենդրիտային ողնաշարի խտության քանակականացման արդյունքում (n=16 վերահսկիչ նեյրոններ, n=21 TS նեյրոններ, ***P<0.0001): d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =1，1个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）։ d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 重建神经 元, n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. դ, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 20,0TS): դ, վերահսկիչ դենդրիտային ճյուղերի և TS t-hCO3-ի եռաչափ վերակառուցում 8 ամսվա դիֆերենցիացիայի և դենդրիտային ողնաշարի խտության քանակականացման արդյունքում (n=16 վերահսկիչ նեյրոններ, n=21 TS նեյրոններ, ***P<0.0001):Կարմիր աստղանիշները ցույց են տալիս ենթադրյալ դենդրիտային փշերը։ ե, ինքնաբուխ EPSC-ներ վերահսկիչ և TS t-hCO նեյրոններում 8 ամսվա դիֆերենցիացումից հետո։ զ, կուտակային հաճախականության գրաֆիկ և սինապտիկ իրադարձությունների հաճախականության և ամպլիտուդի քանակականացում (n=32 վերահսկիչ նեյրոններ, n=26 TS նեյրոններ; **P=0.0076 և P=0.8102)։ գ, TS և վերահսկիչ նեյրոնների Շոլի վերլուծություն hCO-ում և t-hCO-ում։ Կետագծերը ցույց են տալիս մարդու L2/3 հետծննդյան բուրգաձև նեյրոնները համեմատության համար (n = 24 վերահսկիչ t-hCO նեյրոններ, n = 21 TS t-hCO նեյրոններ, n = 8 վերահսկիչ hCO նեյրոններ և n = 7 TS hCO նեյրոններ)։ Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում։
t-hCO-ի՝ մարդու կեղևի նեյրոնների ձևաբանական և ֆունկցիոնալ առանձնահատկությունները բարձր մակարդակով կրկնօրինակելու ունակությունը մեզ դրդեց ուսումնասիրել, թե արդյոք t-hCO-ն կարող է օգտագործվել հիվանդության ֆենոտիպերը հայտնաբերելու համար: Մենք կենտրոնացանք TS-ի վրա, որը CaV1.2 կոդավորող գենի ֆունկցիայի ձեռքբերման մուտացիաների հետևանքով առաջացած ծանր նյարդաբանական խանգարում է, որը նեյրոններում սկսում է ակտիվությունից կախված գեների տրանսկրիպցիա: Մենք hCO ստացանք TS-ով երեք հիվանդներից, որոնք կրում էին ամենատարածված փոխարինումը (p.G406R) և երեք վերահսկիչ խմբից (Նկար 3ա): Փոխպատվաստումից հետո մենք պարզեցինք, որ դենդրիտների ձևաբանությունը փոխվել էր TS նեյրոններում՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 3բ և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 8ա,բ), առաջնային դենդրիտների քանակի կրկնակի աճով և դենդրիտների երկարության միջին և ընդհանուր նվազմամբ (Նկ. 3գ և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 8գ): Սա կապված էր փշերի խտության աճի և TS-ում ինքնաբուխ EPSC-ների հաճախականության աճի հետ՝ համեմատած վերահսկիչ նեյրոնների հետ (Նկ. 3դ-զ և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 8գ): Հետագա վերլուծությունը բացահայտեց t-hCO3 TS-ում աննորմալ դենդրիտային ճյուղավորման օրինաչափություններ՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, բայց ոչ in vitro TS hCO3-ում՝ դիֆերենցիացիայի նմանատիպ փուլում (Նկ. 3g): Սա համապատասխանում է TS-ում ակտիվությունից կախված դենդրիտային կծկման վերաբերյալ մեր նախորդ զեկույցներին և ընդգծում է այս փոխպատվաստման հարթակի կարողությունը in vivo հիվանդության ֆենոտիպերը հայտնաբերելու համար:
Այնուհետև մենք հարցրեցինք, թե որքանով են t-hCO բջիջները ֆունկցիոնալ առումով ինտեգրված առնետի S1-ի մեջ: Կրծողների մոտ S1-ը ստանում է ուժեղ սինապսային ազդակներ նույն կողմի փորոքային բազալ և հետին թալամուսային կորիզներից, ինչպես նաև նույն կողմի շարժիչ և երկրորդային սոմատոզենսորային կեղևներից, և հակակողային S1-ից (Նկար 4ա): Նյարդայնացման օրինաչափությունը վերականգնելու համար մենք վարակեցինք hCO-ն կատաղության վիրուս-dG-GFP/AAV-G-ով և 3 օր անց hCO-ն փոխպատվաստեցինք S1 առնետի մեջ: Փոխպատվաստումից 7-14 օր անց մենք դիտարկեցինք GFP-ի խիտ արտահայտություն նույն կողմի S1-ի և որովայնի բազալ գանգլիաների նեյրոններում (Նկար 4բ, գ): Բացի այդ, թալամուսային մարկեր նետրին G1-ի հակամարմիններով ներկումը բացահայտեց թալամուսային վերջավորությունների առկայությունը t-hCO-ում (Նկար 4դ, ե): Գնահատելու համար, թե արդյոք այս աֆերենտ ելուստները կարող են առաջացնել սինապսային արձագանքներ t-hCO բջիջներում, մենք կատարեցինք մարդու բջիջների ամբողջական բջիջների գրանցումներ թալամոկորտիկալ շերտի սուր հատվածներում: Առնետի S1-ի, ներքին պարկուճի, սպիտակ նյութի, t-hCO-ի մոտ գտնվող մանրաթելերի էլեկտրական խթանում կամ օպսին արտահայտող թալամիկ ծայրերի օպտոգենետիկ ակտիվացում t-hCO-ով ինդուկցված կարճատև լատենտության EPSC-ներում AMPA ընկալիչի անտագոնիստ NBQX-ին ենթարկված t-hCO նեյրոններում: (Նկար 4f, g և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 9a–g): Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ t-hCO-ն անատոմիապես ինտեգրված է առնետի ուղեղում և կարող է ակտիվացվել առնետի տիրոջ հյուսվածքի կողմից:
ա, Կատաղության հետևման փորձի սխեմատիկ դիագրամ։ բ, GFP և մարդու համար սպեցիֆիկ STEM121 արտահայտությունը t-hCO-ի և առնետի գլխուղեղի կեղևի միջև (վերին վահանակ)։ Նաև ներկայացված է GFP արտահայտությունը առնետի նույն կողմի փորոքային բազալ կորիզում (VB) (ներքևի ձախ անկյունում) և նույն կողմի S1-ում (ներքևի աջ անկյունում)։ Չափսերի գիծը՝ 50 մկմ։ Կարմիր քառակուսիները ներկայացնում են ուղեղի այն հատվածները, որտեղ արվել են պատկերները։ գ, GFP արտահայտող բջիջների քանակական որոշումը (n = 4 առնետ)։ դ, ե — Netrin G1+ թալամիկական ծայրերը t-hCO-ում։ դ-ն ցույց է տալիս պսակի հատվածը, որը պարունակում է t-hCO և VB կորիզներ։ Չափսերի գիծը՝ 2 մմ։ ե-ն ցույց է տալիս Netrin G1-ի և STEM121 արտահայտությունը t-hCO (ձախ) և VB (աջ) նեյրոններում։ Չափսերի գիծը՝ 50 մկմ։ Նարնջագույն կետավոր գիծը ցույց է տալիս t-hCO սահմանը։ f, g, t-hCO նեյրոնների ընթացիկ հետքերը S1 առնետի (f) կամ ներքին պարկուճի (g) էլեկտրական խթանումից հետո, (մանուշակագույն) կամ առանց (սև) NBQX-ի (ձախ): EPSC ամպլիտուդները NBQX-ով և առանց դրա (n = 6 S1 նեյրոններ, *P = 0.0119; և n = 6 ներքին պարկուճի նեյրոններ, **P = 0.0022) (կենտրոն): t-hCO նեյրոնների տոկոսը, որոնք ցույց են տալիս EPSC առնետի S1 (f) կամ ներքին պարկուճի (g) (աջ) էլեկտրական խթանման ի պատասխան: aCSF, արհեստական ​​ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկ: h, 2P պատկերման փորձի սխեմատիկ դիագրամ (ձախ): GCaMP6s-ի էքսպրեսիան t-hCO-ում (մեջտեղում): Սանդղակի գիծ, ​​100 մկմ: GCaMP6s-ի ֆլուորեսցենցիայի ժամանակի ընդհատում (աջ): i, ինքնաբուխ ակտիվության ֆլուորեսցենցիայի Z-միավոր: j, բեղերի խթանման սխեմատիկ պատկեր: k, z-գնահատված 2P ֆլուորեսցենցիայի հետագծեր մեկ փորձարկման մեջ, համընկած բեղիկների շեղման հետ զրոյական ժամանակում (ընդհատ գիծ) օրինակելի բջիջներում: l, բոլոր բջիջների պոպուլյացիայի միջինացված z-գնահատականի արձագանքները, համընկած բեղիկների շեղման հետ զրոյական ժամանակում (ընդհատ գիծ) (կարմիր) կամ պատահականորեն ստեղծված ժամանակային դրոշմանիշներ (մոխրագույն): m. Փորձի սխեմատիկ դիագրամ օպտիկական նշագրման վրա: n, t-hCO3 օրինակելի բջջից ստացված հում լարման կորեր կապույտ լազերային խթանման կամ բեղիկների շեղման ժամանակ: Կարմիր նետերը ցույց են տալիս լույսի (վերևում) կամ բեղիկների շեղման (ներքևում) առաջացած առաջին ցատկերը: Մոխրագույն ստվերումը ցույց է տալիս բեղիկների շեղման ժամանակահատվածները: o, լույսի գագաթնակետային ալիքաձևերը և բեղիկների շեղման արձագանքները: p, մեկ փորձի ցատկերը, համընկած օրինակի բջիջների բեղիկների շեղման հետ: 0-ն ցույց է տալիս բեղիկների շեղումը (ընդհատ գիծ): q, բոլոր լուսազգայուն բջիջների համար պոպուլյացիայի միջինացված z-գնահատականի կրակման արագությունը, համընկած բեղիկների շեղման հետ զրոյական ժամանակում (ընդհատ գիծ) (կարմիր) կամ պատահականորեն ստեղծված ժամանակային դրոշմանիշներ (մոխրագույն): r, լուսազգայուն միավորների համամասնությունը, որը զգալիորեն մոդուլացված է բեղերի շեղմամբ (n = 3 առնետ) (ձախ): Z-գնահատման գագաթնակետային լատենտություն (n = 3 առնետ; n = 5 (բաց կանաչ), n = 4 (մուգ կանաչ) և n = 4 (երկնագույն) բեղերի շեղման մոդուլյացիայի միավորներ մեկ առնետի համար) (աջ): Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում:
Այնուհետև մենք հարցրեցինք, թե արդյոք t-hCO-ն կարող է ակտիվացվել զգայական խթաններով in vivo: Մենք S1 առնետների մեջ փոխպատվաստեցինք գենետիկորեն կոդավորված կալցիումի ինդիկատորներ GCaMP6 արտահայտող hCO: 150 օր անց մենք կատարեցինք մանրաթելային ֆոտոմետրիա կամ երկֆոտոնային կալցիումի պատկերացում (Նկար 4h և ընդլայնված տվյալներ, Նկար 10a): Մենք պարզեցինք, որ t-hCO բջիջները ցուցաբերում էին սինխրոն ռիթմիկ ակտիվություն (Նկար 4i, ընդլայնված տվյալներ, Նկար 10b և լրացուցիչ տեսանյութ 1): T-hCO-ի գագաթնակետային ակտիվությունը բնութագրելու համար մենք կատարեցինք արտաբջջային էլեկտրաֆիզիոլոգիական գրանցումներ անզգայացված փոխպատվաստված առնետների մոտ (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 10c-f): Մենք ստերեոտաքսիկ կոորդինատներ ենք ստացել ՄՌՏ պատկերներից. այսպիսով, այս գրանցված միավորները ներկայացնում են ենթադրյալ մարդու նեյրոններ, չնայած էլեկտրաֆիզիոլոգիան միայն թույլ չի տալիս որոշել ծագման տեսակը: Մենք դիտարկեցինք ակտիվության սինխրոն պայթյուններ (ընդլայնված տվյալներ, Նկար 10d): Պայթյունները տևել են մոտ 460 մվրկ և միմյանցից բաժանված են մոտ 2 վայրկյան լռության ժամանակահատվածներով (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10դ, ե): Առանձին միավորները միջինում արձակել են մոտ երեք կրակոց մեկ պայթյունի համար, ինչը կազմում է մեկ պայթյունի համար գրանցված միավորների մոտավորապես 73%-ը: Առանձին միավորների ակտիվությունները խիստ փոխկապակցված էին, և այդ փոխկապակցվածությունները ավելի բարձր էին, քան նույն պայմաններում գրանցված չպատվաստված կենդանիների մոտ նույնականացված միավորների ակտիվությունները (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10զ): Մարդուց ստացված նույնականացված նեյրոնների սպիկ արձագանքները ավելի լավ բնութագրելու համար մենք լույսի նշագրման փորձեր ենք անցկացրել անզգայացված առնետների վրա, որոնց փոխպատվաստվել էր լույսի նկատմամբ զգայուն կատիոնային ալիք՝ ռոդոպսին 2-ը (hChR2), որի միջոցով t-hCO նեյրոնները կարճատև լատենտությամբ (10 մվրկ-ից պակաս) ճանաչում են իրականացնում կապույտ լույսի խթաններին ի պատասխան (Նկ. 4մ–օ): t-hCO նեյրոնները ցուցաբերեցին ինքնաբուխ ակտիվության պոռթկումներ՝ կալցիումի պատկերման ժամանակ դիտվող հաճախականություններին նման հաճախականություններով, ինչպես նաև t-hCO-ում լույսի նշագրման բացակայության դեպքում կատարված էլեկտրաֆիզիոլոգիական գրանցումներով (ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10c-g): In vitro գրանցված hCO-ի համապատասխան փուլերում ինքնաբուխ ակտիվություն չի նկատվել: Գնահատելու համար, թե արդյոք t-hCO-ն կարող է ակտիվանալ զգայական խթաններով, մենք կարճ ժամանակով շեղեցինք առնետի բեղիկները t-hCO-ից (Նկ. 4j,m և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10h,k): Նախորդ ուսումնասիրությունների համաձայն8,10, t-hCO բջիջների ենթաբազմությունը ցույց տվեց ակտիվության աճ՝ բեղիկների շեղմանն ի պատասխան, ինչը չնկատվեց, երբ տվյալները համեմատվեցին պատահական ժամանակային դրոշմանիշների հետ (Նկ. 4k–q և ընդլայնված տվյալներ, Նկ. 10h–q): Իրոք, օպտո-նշագրված առանձին միավորների մոտ 54%-ը ցույց տվեց զգալիորեն աճող գրգռման արագություն բեղիկների խթանումից հետո՝ գագաթնակետին հասնելով մոտ 650 մվրկ-ում (Նկ. 4r): Ամփոփելով՝ այս տվյալները ենթադրում են, որ t-hCO3-ն ստանում է համապատասխան ֆունկցիոնալ ազդակներ և կարող է ակտիվանալ շրջակա միջավայրի խթանների ազդեցությամբ։
Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք t-hCO-ն կարող է ակտիվացնել շղթաները առնետների մոտ՝ վարքագիծը վերահսկելու համար: Մենք նախ ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք t-hCO նեյրոնների աքսոնները պրոյեկտվում են առնետի շրջակա հյուսվածքների մեջ: Մենք վարակեցինք hCO-ն EYFP-ի (hChR2-EYFP) հետ միաձուլված hChR2 կոդավորող լենտիվիրուսով: 110 օր անց մենք դիտարկեցինք EYFP-ի արտահայտությունը նույնակողմ կեղևային շրջաններում, ներառյալ լսողական, շարժիչ և սոմատոզենսոր կեղևները, ինչպես նաև ենթակեղևային շրջաններում, ներառյալ ստրիատումը, հիպոկամպը և թալամուսը (Նկար 5ա): Գնահատելու համար, թե արդյոք այս էֆերենտ պրոյեկցիաները կարող են առաջացնել սինապսային արձագանքներ առնետի բջիջներում, մենք օպտիկապես ակտիվացրեցինք hChR2-EYFP արտահայտող t-hCO բջիջները՝ գրանցելով առնետի գլխուղեղի կեղևի բջիջները սուր ուղեղի հատվածներում: Կապույտ լույսով t-hCO աքսոնների ակտիվացումը առնետի բուրգաձև կեղևի նեյրոններում առաջացրեց կարճատև լատենտության EPSC-ներ, որոնք արգելափակվեցին NBQX-ով (Նկար 5բ-գ): Բացի այդ, այս արձագանքները կարող էին արգելափակվել տետրոդոտոքսինով (TTX) և վերականգնվել 4-ամինոպիրիդինով (4-AP), ինչը ենթադրում է, որ դրանք առաջացել են մոնոսինապսային կապերով (Նկար 5ե):
ա, Աքսոնի հետևման սխեմատիկ դիագրամ (ձախից): t-hCO EYFP էքսպրեսիա (աջ): Սանդղակի գիծ, ​​100 մկմ: A1, լսողական կեղև, ACC, առաջային գանգուրային կեղև, d. ստրիատում, մեջքային ստրիատում, HPC, հիպոկամպ; Դիաֆրագմա, կողմնային միջնապատ, mPFC, միջային նախաճակատային կեղև, պիրուս, պիրաձև կեղև, v. ստրիատում, որովայնային ստրիատում, VPM, թալամուսի վենտրոպոստոմեդիալ կորիզ, VTA, որովայնային տեգմենտալ շրջան: Կարմիր քառակուսիները ներկայացնում են ուղեղի այն հատվածները, որտեղ արվել են պատկերները: բ, Խթանման փորձի սխեմատիկ դիագրամ: գ, դ, Կապույտ լույսով ինդուկցված լուսահոսքի (վերևում) և լարման (ներքևում) արձագանքի օրինակներ մարդու (գ) EYFP+ t-hCO կամ առնետի (դ) EYFP- բջիջներում: e, f, առնետի նեյրոնների ներկայիս հետքերը t-hCO աքսոնների կապույտ լույսով խթանումից հետո TTX-ով և 4-AR-ով (կանաչ), TTX-ով (մոխրագույն) կամ aCSF-ով (սև) (e), (մանուշակագույն) կամ առանց (սև) ) ) NBQX-ով (e): g, կապույտ լույսով ինդուկցված արձագանքների լատենտությունը առնետի բջիջներում (n = 16 բջիջ); հորիզոնական սյուները ցույց են տալիս միջին լատենտությունը (7.13 մվ) (ձախից): Լույսով հրահրած EPSC-ների ամպլիտուդը, որը գրանցվել է NBQX-ով կամ առանց դրա (n = 7 բջիջ; ***P < 0.0001) (միջին): Լույսով հրահրած EPSC-ների ամպլիտուդը, որը գրանցվել է NBQX-ով կամ առանց դրա (n = 7 բջիջ; ***P < 0.0001) (միջին): Amplituda вызванных светом EPSC, գրանցված է կամ առանց NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Լույսով ինդուկցված EPSC-ների ամպլիտուդը՝ գրանցված NBQX-ով կամ առանց դրա (n = 7 բջիջ; ***P < 0.0001) (կենտրոնում):使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中） Amplituda вызванных светом EPSC, գրանցված է կամ առանց NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Լույսով ինդուկցված EPSC-ների ամպլիտուդը՝ գրանցված NBQX-ով կամ առանց դրա (n = 7 բջիջ; ***P < 0.0001) (կենտրոնում):Կապույտ լույսին արձագանքող EPSC-ներ ցուցադրող առնետային բջիջների տոկոսը (աջ): h, Վարքային առաջադրանքի սխեմատիկ դիագրամ: d0, 0-րդ օր: i. Օրինակելի կենդանիների աշխատանքը մարզման 1-ին (ձախ) կամ 15-րդ (աջ) օրը: 1-ին օրը (ձախ) կամ 15-րդ օրը (աջ կենտրոն) կատարված լիզումների միջին քանակը (n = 150 կապույտ լույսի փորձարկում, n = 150 կարմիր լույսի փորձարկում; ***P < 0.0001): 1-ին օրը (ձախ) կամ 15-րդ օրը (աջ կենտրոն) կատարված լիզումների միջին քանակը (n = 150 կապույտ լույսի փորձարկում, n = 150 կարմիր լույսի փորձարկում; ***P < 0.0001): Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) կամ день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,000). 1-ին օրը (ձախ) կամ 15-րդ օրը (աջ կենտրոն) կատարված լիզումների միջին քանակը (n = 150 կապույտ լույսի փորձարկում, n = 150 կարմիր լույսի փորձարկում; ***P < 0.0001):第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，150n =次红光试验；***P <0,0001）։第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，150n =次红光试验；***P <0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) կամ день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,000). 1-ին օրը (ձախ) կամ 15-րդ օրը (աջ կենտրոն) կատարված լիզումների միջին քանակը (n = 150 կապույտ լույսի փորձարկում, n = 150 կարմիր լույսի փորձարկում; ***P < 0.0001):Կարմիր և կապույտ լույսի փորձարկումների կուտակային լիզումները 1-ին օրը (ձախ կողմում) կամ 15-րդ օրը (աջ): NS, նշանակալի չէ: j,k, hChR2-EYFP (j) արտահայտող t-hCO3 կամ վերահսկիչ ֆլուորոֆոր (k) փոխպատվաստված բոլոր կենդանիների վարքային բնութագրերը 1-ին կամ 15-րդ օրը (hChR2-EYFP: n = 9 առնետ, ** P = 0.0049; վերահսկիչ՝ n = 9, P = 0.1497): l, նախընտրելիության գնահատման էվոլյուցիա (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկիչ; **P < 0.001, ***P < 0.0001): l, նախընտրելիության գնահատման էվոլյուցիա (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկիչ; **P < 0.001, ***P < 0.0001): l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկողьных; **P <0,001, ***P <0,0001): l, նախընտրության գնահատման էվոլյուցիա (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկիչ խումբ; **P < 0.001, ***P < 0.0001): l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001,***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001,***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկող; **P <0,001, ***P <0,0001): l, նախընտրության միավորների էվոլյուցիա (n = 9 hChR2, n = 9 վերահսկիչ խումբ; **P < 0.001, ***P < 0.0001):m, FOS էքսպրեսիա S1-ում t-hCO-ի օպտոգենետիկ ակտիվացմանը ի պատասխան։ Ներկայացված են FOS արտահայտման պատկերները (ձախից) և քանակականացման պատկերները (n = 3 մեկ խմբի համար; *P < 0.05, **P < 0.01 և ***P < 0.001) (աջից): Ներկայացված են FOS արտահայտման պատկերները (ձախից) և քանակականացման պատկերները (n = 3 մեկ խմբի համար; *P < 0.05, **P < 0.01 և ***P < 0.001) (աջից): Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного որոշակիություն (n = 3 խմբի մեջ; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа): FOS արտահայտման պատկերները (ձախից) և քանակականացման պատկերները (n = 3 մեկ խմբի համար; *P<0.05, **P<0.01 և ***P<0.001) ներկայացված են (աջից):显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного որոշակիություն (n = 3 խմբի մեջ; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа): FOS արտահայտման պատկերները (ձախից) և քանակականացման պատկերները (n = 3 մեկ խմբի համար; *P<0.05, **P<0.01 և ***P<0.001) ներկայացված են (աջից):Սանդղակի սյունակ, 100 մկմ: Տվյալները արտահայտվում են որպես BLA-ի, բազոլատերալ նշիկների, MDT-ի, դորսոմեդիալ թալամիկ կորիզի, PAG-ի, պերիակեդուկտալ մոխրագույնի միջին ± ստանդարտ սխալ:
Վերջապես, մենք հարցրեցինք, թե արդյոք t-hCO3-ն կարող է մոդուլացնել առնետների վարքագիծը: Սա ստուգելու համար մենք hChR2-EYFP արտահայտող hCO3-ն փոխպատվաստեցինք S1-ի մեջ, և 90 օր անց մենք օպտիկական մանրաթելեր տեղադրեցինք t-hCO3-ի մեջ լույսի մատակարարման համար: Այնուհետև մենք մարզեցինք առնետներին փոփոխված օպերանտային պայմանավորման պարադիգմայով (Նկար 5h): Մենք կենդանիներին տեղադրեցինք վարքային թեստի խցիկում և պատահականորեն կիրառեցինք 5 վայրկյան տևողությամբ կապույտ (473 նմ) և կարմիր (635 նմ) լազերային խթաններ: Կենդանիները ստացան ջրային պարգև, եթե լիզում էին կապույտ լույսի խթանման ժամանակ, բայց չէին լիզում կարմիր լույսի խթանման ժամանակ: Մարզման առաջին օրը կենդանիները տարբերություն չցուցաբերեցին լիզելու հարցում կապույտ կամ կարմիր լույսով խթանման ժամանակ: Այնուամենայնիվ, 15-րդ օրը hChR2-EYFP արտահայտող hCO3 փոխպատվաստված կենդանիները ավելի ակտիվ լիզում ցուցաբերեցին կապույտ լույսով խթանման ժամանակ՝ համեմատած կարմիր լույսի խթանման հետ: Լիզելու վարքագծի այս փոփոխությունները չեն նկատվել վերահսկիչ կենդանիների մոտ, որոնց փոխպատվաստվել էր վերահսկիչ ֆլուորոֆոր արտահայտող hCO2 (սովորելու հաջողության մակարդակ՝ hChR2 89%, EYFP 0%, նկար 5i-1 և լրացուցիչ տեսանյութ 2): Այս տվյալները ենթադրում են, որ t-hCO2 բջիջները կարող են ակտիվացնել առնետի նեյրոնները՝ խրախուսելու պարգևատրման փնտրտուքի վարքագիծը խթանելու համար: Պարզելու համար, թե որ առնետի t-hCO2 նեյրոնային շղթաները կարող են ներգրավված լինել այս վարքային փոփոխությունների մեջ, մենք օպտոգենետիկորեն ակտիվացրել ենք t-hCO2-ն մարզված կենդանիների մոտ և 90 րոպե անց հավաքել ենք հյուսվածքներ: Իմունահյուսվածքաքիմիան բացահայտել է ակտիվությունից կախված FOS սպիտակուցի արտահայտությունը մոտիվացված վարքագծին մասնակցող ուղեղի մի քանի շրջաններում, ներառյալ միջային նախաճակատային կեղևը, միջային թալամուսը և պերիակեդուկտալ մոխրագույն նյութը, որը արտահայտվել է կամ չխթանված վերահսկիչ կենդանիների մոտ, կամ կենդանիների մոտ: բրինձ. 5մ): Ամփոփելով՝ այս տվյալները ենթադրում են, որ t-hCO2-ն կարող է մոդուլացնել առնետի նեյրոնային ակտիվությունը՝ վարքագիծը խթանելու համար:
Նեյրոնային օրգանոիդները խոստումնալից համակարգ են մարդու զարգացումը և հիվանդությունները in vitro ուսումնասիրելու համար, սակայն դրանք սահմանափակված են in vivo գոյություն ունեցող շղթաների միջև կապերի բացակայությամբ: Մենք մշակել ենք նորարարական հարթակ, որի միջոցով hCO2-ն փոխպատվաստել ենք իմունային անբավարարությամբ վաղ հետծննդյան առնետների S1 բջիջների մեջ՝ in vivo ուսումնասիրելու մարդու բջիջների զարգացումը և գործառույթը: Մենք ցույց ենք տվել, որ t-hCO2-ն զարգացնում է հասուն բջիջների տեսակներ, որոնք չեն դիտարկվել in vitro28, և որ t-hCO2-ն անատոմիապես և ֆունկցիոնալորեն ինտեգրված է կրծողների ուղեղում: t-hCO2-ի ինտեգրումը կրծողների նյարդային շղթաներում թույլ տվեց մեզ կապ հաստատել մարդու բջջային ակտիվության և ուսումնասիրված կենդանիների վարքագծի միջև՝ ցույց տալով, որ t-hCO2 նեյրոնները կարող են մոդուլացնել առնետների նեյրոնային ակտիվությունը՝ վարքային արձագանքները խթանելու համար:
Մեր նկարագրած հարթակը մի քանի առավելություն ունի մարդկային բջիջները կրծողների ուղեղ փոխպատվաստելու վերաբերյալ նախորդ հետազոտությունների համեմատ: Նախ, մենք hCO3 փոխպատվաստեցինք վաղ հետծննդյան առնետների զարգացող կեղևի մեջ, ինչը կարող է նպաստել անատոմիական և ֆունկցիոնալ ինտեգրմանը: Երկրորդ, t-hCO3 ՄՌՏ մոնիթորինգը թույլ տվեց մեզ ուսումնասիրել պատվաստի դիրքը և աճը կենդանի կենդանիների մոտ, ինչը թույլ տվեց մեզ անցկացնել երկարաժամկետ բազմակի կենդանիների վրա ուսումնասիրություններ և հաստատել մի քանի hiPS բջջային գծերի հուսալիությունը: Վերջապես, մենք փոխպատվաստեցինք ամբողջական օրգանոիդներ, այլ ոչ թե մեկուսացված մեկ բջջային սուսպենզիաներ, որոնք պակաս քայքայիչ են մարդու բջիջների համար և կարող են նպաստել մարդու կեղևի նեյրոնների ինտեգրմանը և առաջացմանը առնետների ուղեղում:
Մենք ընդունում ենք, որ այս հարթակի առաջընթացին չնայած, ժամանակային, տարածական և միջտեսակային սահմանափակումները խոչընդոտում են մարդու նյարդային շղթաների բարձր ճշգրտությամբ ձևավորմանը, նույնիսկ զարգացման վաղ փուլում փոխպատվաստումից հետո: Օրինակ, պարզ չէ, թե արդյոք t-hCO-ում դիտարկվող ինքնաբուխ ակտիվությունը ներկայացնում է զարգացման ֆենոտիպ, որը նման է կեղևի զարգացման ընթացքում դիտարկվող ռիթմիկ ակտիվությանը, թե՞ դա պայմանավորված է t-hCO-ում առկա ճնշող բջջային տեսակների բացակայությամբ: Նմանապես, պարզ չէ, թե որքանով է t-hCO-ում շերտավորման բացակայությունը ազդում շղթայական կապի վրա30: Ապագա աշխատանքները կկենտրոնանան այլ բջջային տեսակների, ինչպիսիք են մարդու միկրոգլիան, մարդու էնդոթելային բջիջները և ԳԱԲԱերգիկ միջնեյրոնների տարբեր համամասնությունները, ինտեգրման վրա, ինչպես ցույց է տրված in vitro assembly 6-ի միջոցով, ինչպես նաև հասկանալու վրա, թե ինչպես կարող են նյարդային ինտեգրացիան և մշակումը տեղի ունենալ փոփոխված t-hCO-ի տրանսկրիպցիոն, սինապտիկ և վարքային մակարդակներում հիվանդներից ստացված բջիջներում:
Ընդհանուր առմամբ, այս in vivo հարթակը ներկայացնում է հզոր ռեսուրս, որը կարող է լրացնել in vitro մարդու ուղեղի զարգացումը և հիվանդությունների հետազոտությունը: Մենք կանխատեսում ենք, որ այս հարթակը թույլ կտա մեզ հայտնաբերել նոր շղթայական մակարդակի ֆենոտիպեր հիվանդներից ստացված բջիջներում, որոնք այլապես դժվարհասանելի են, և փորձարկել նոր թերապևտիկ ռազմավարություններ:
Մենք HiPS բջիջներից ստացանք hCO2.5, ինչպես նկարագրվել է նախկինում: Սնուցող շերտերի վրա կուլտիվացված hiPS բջիջներից hCO արտադրությունը սկսելու համար, hiPS բջիջների ամբողջական գաղութները հեռացվեցին կուլտուրայի ամաններից՝ օգտագործելով դիսպազ (0.35 մգ/մլ) և տեղափոխվեցին գերցածր կպչունակությամբ պլաստիկ կուլտուրաների մեջ, որոնք պարունակում էին hiPS բջջային կուլտուրայի միջավայրով ամաններ: (Corning)-ը լրացվեց երկու SMAD ինհիբիտորներով՝ դորսոմորֆին (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) և SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) և ROCK ինհիբիտոր Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem): Առաջին 5 օրվա ընթացքում hiPS բջջային միջավայրը փոխվում էր ամեն օր և ավելացվում էին դորսոմորֆին և SB-431542: Վեցերորդ օրը սուսպենզիայի մեջ նյարդային գնդաձևերը տեղափոխվեցին նեյրոբազալ-A (10888, Life Technologies), վիտամին A-ից զուրկ B-27 հավելում (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), պենիցիլին և ստրեպտոմիցին (1:100, Life Technologies) պարունակող նյարդային միջավայր և մինչև 24-րդ օրը լրացվեցին էպիդերմալ աճի գործոնով (EGF; 20 նգ մլ−1; R&D Systems) և ֆիբրոբլաստների աճի գործոն 2-ով (FGF2; 20 նգ մլ−1; R&D Systems): 25-րդ օրվանից մինչև 42-րդ օրը միջավայրը լրացվեց ուղեղից ստացված նեյրոտրոֆիկ գործոնով (BDNF; 20 նգ մլ−1, Peprotech) և նեյրոտրոֆին 3-ով (NT3; 20 նգ մլ−1; Peprotech)՝ միջավայրի փոփոխություններով ամեն երկրորդ օրը: Վեցերորդ օրը սուսպենզիայի մեջ նյարդային գնդաձևերը տեղափոխվեցին նեյրոբազալ-A (10888, Life Technologies), վիտամին A-ից զուրկ B-27 հավելում (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), պենիցիլին և ստրեպտոմիցին (1:100, Life Technologies) պարունակող նյարդային միջավայր և մինչև 24-րդ օրը լրացվեցին էպիդերմալ աճի գործոնով (EGF; 20 նգ մլ−1; R&D Systems) և ֆիբրոբլաստների աճի գործոն 2-ով (FGF2; 20 նգ մլ−1; R&D Systems): 25-րդ օրվանից մինչև 42-րդ օրը միջավայրը լրացվեց ուղեղից ստացված նեյրոտրոֆիկ գործոնով (BDNF; 20 նգ մլ−1, Peprotech) և նեյրոտրոֆին 3-ով (NT3; 20 նգ մլ−1; Peprotech)՝ միջավայրի փոփոխություններով ամեն երկրորդ օրը:Վեցերորդ օրը սուսպենզիա գտնվելիս նյարդային գնդաձևերը տեղափոխվեցին նյարդային միջավայր, որը պարունակում էր Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 հավելում՝ առանց վիտամին A-ի (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) և պենիցիլին։и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) до 24-. և ստրեպտոմիցին (1:100, Life Technologies) և լրացվել է էպիդերմալ աճի գործոնով (EGF; 20 նգ/մլ; R&D Systems) և ֆիբրոբլաստների աճի գործոն 2-ով (FGF2; 20 նգ/մլ; R&D Systems) մինչև 24-րդ օրը։25-ից 42-րդ օրերի ընթացքում միջավայրում ավելացվել են ուղեղից ստացված նեյրոտրոֆիկ գործոն (BDNF; 20 նգ մլ-1, Peprotech) և նեյրոտրոֆին 3 (NT3; 20 նգ մլ-1, Peprotech)՝ միջավայրը փոխելով օրը մեկ։在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7生补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和1:Life 0 Տեխնոլոգիաներ）并辅以表皮生长因子（EGF；20 նգ ml-1; R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 獻 画 画 主b-27 补充剂 (12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 10 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 (((20 նգ մլ-1) R&D համակարգեր) На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициный տեխնոլոգիաներ стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; 6-րդ օրը նեյրոսֆերաների կախույթները փոխարինվեցին նեյրոբազալ-A (10888, Life Technologies), B-27 հավելանյութ առանց A վիտամինի (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), պենիցիլին-չեզոքացված ստրեպտոմիցին (1:100, Life Technologies), որը լրացված էր էպիդերմալ աճի գործոնով (EGF; 20 նգ մլ-1; R&D Systems) և ֆիբրոբլաստների աճի գործոն 2-ով (FGF2; 20 նգ մլ-1) 1։ R&D Systems) մինչև 24 օր: Հետազոտությունների և զարգացման համակարգեր) մինչև 24-րդ օրը։25-ից 42-րդ օրերի ընթացքում ուղեղից ստացված նեյրոտրոֆիկ գործոնը (BDNF; 20 նգ մլ-1, Peprotech) և նեյրոտրոֆիկ գործոն 3-ը (NT3; 20 նգ մլ-1, Peprotech) ավելացվել են կուլտուրայի միջավայրում օրը մեկ անգամ։ Միջավայրը փոխել են մեկ անգամ։Սկսած 43-րդ օրվանից, hCO2-ն պահպանվել է չհավելված նեյրոբազալ-A միջավայրում (NM; 1088022, Thermo Fisher)՝ միջավայրը փոխելով յուրաքանչյուր 4-6 օրը մեկ: Առանց սնուցման պայմաններում կուլտիվացված hiPS բջիջներից hCO2 ստանալու համար, hiPS բջիջները ինկուբացվել են Accutase-ի (AT-104, Innovate Cell Technologies) հետ 37°C ջերմաստիճանում 7 րոպե, դիսոցացվել են առանձին բջիջների և տեղադրվել AggreWell 800 թիթեղների (34815, STEMCELL Technologies) վրա՝ 3 × 106 առանձին բջիջների խտությամբ Essential 8 միջավայրում, որը լրացված է ROCK ինհիբիտոր Y-27632-ով (10 μM; S1049, Selleckchem): 24 ժամ անց, անցքերի մեջ գտնվող միջավայրը պիպետով տեղափոխվեց Essential 6 միջավայր (A1516401, Life Technologies) պարունակող միջավայրի մեջ, որը լրացված էր դորզոմորֆինով (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) և SB-431542 (10 μM; 1614), Tocrida: 2-ից 6-րդ օրերը Essential 6 միջավայրը ամեն օր փոխարինվեց դորզոմորֆինով և SB-431542 հավելումով: Վեցերորդ օրվանից սկսած, նեյրոսֆերաների կախույթները տեղափոխվեցին նեյրոբազալ միջավայր և պահպանվեցին վերը նկարագրված եղանակով:
Կենդանիների հետ կապված բոլոր ընթացակարգերը կատարվել են Սթենֆորդի համալսարանի լաբորատոր կենդանիների խնամքի վարչական կոմիտեի (APLAC) կողմից հաստատված կենդանիների խնամքի ուղեցույցներին համապատասխան: Հղի էվտիմիկ RNU (rnu/+) առնետները գնվել են (Charles River Laboratories) կամ տեղավորվել են: Կենդանիները պահվել են 12-ժամյա լույս-մութ ցիկլով՝ սնունդով և ջրով ad libitum: Երեքից յոթ օրական մերկ (FOXN1–/–) առնետի ձագերը նույնականացվել են անհասուն բեղերի աճով՝ նախքան մորթելը: Ձագերը (արու և էգ) անզգայացվել են 2-3% իզոֆլուրանով և տեղադրվել ստերեոտաքսիկ շրջանակի վրա: Կատարվել է գանգի տրեպանացիա՝ S1-ից մոտավորապես 2-3 մմ տրամագծով՝ պահպանելով կարծր մաշկի ամբողջականությունը: Այնուհետև կռանիոտոմիայից անմիջապես դուրս օգտագործվել է 30-G ասեղ (մոտավորապես 0.3 մմ)՝ կարծր մաշկը ծակելու համար: Այնուհետև HCO3-ն քսել բարակ 3×3 սմ պարաֆիլմի վրա և հեռացնել ավելորդ միջավայրը: Համիլթոնի ներարկիչը, որը միացված է 23 G, 45° ասեղին, զգուշորեն քաշեք hCO3-ը ասեղի ամենադիստալ ծայրը։ Այնուհետև ներարկիչը տեղադրեք ներարկիչի պոմպի վրա, որը միացված է ստերեոտաքսիկ սարքին։ Այնուհետև ասեղի ծայրը դրեք կարծր մկանի վրա նախապես պատրաստված 0.3 մմ լայնությամբ ծակող անցքի վրա (z = 0 մմ) և նեղացրեք ներարկիչը 1-2 մմ (z = մոտավորապես –1.5 մմ) մինչև ասեղը հայտնվի կարծր մկանի A միջև։ Արդյունքում կձևավորվի խիտ կնիք։ Այնուհետև բարձրացրեք ներարկիչը դեպի կեղևի մակերեսի կենտրոնը z = -0.5 մմ արագությամբ և ներարկեք hCO3-ը րոպեում 1-2 մկլ արագությամբ։ hCO3 ներարկումն ավարտելուց հետո ասեղը հետ է քաշվում րոպեում 0.2-0.5 մմ արագությամբ, մաշկը կարվում է, և լակոտը անմիջապես տեղադրվում է տաք տաքացնող բարձիկի վրա մինչև լիակատար ապաքինումը։ Որոշ կենդանիների փոխպատվաստումը կատարվել է երկկողմանի։
Կենդանիների հետ կապված բոլոր միջամտությունները կատարվել են Սթենֆորդի համալսարանի APLAC-ի կողմից հաստատված կենդանիների խնամքի ուղեցույցներին համապատասխան: Առնետները (փոխպատվաստումից ավելի քան 60 օր անց) ենթարկվել են 5% իզոֆլուրանային անզգայացման և անզգայացվել են 1-3% իզոֆլուրանով պատկերման ընթացքում: Վիզուալիզացիայի համար օգտագործվել է 7 Տեսլա հզորությամբ ակտիվորեն պաշտպանված հորիզոնական հորատանցքային սկաներ Bruker (Bruker Corp.)՝ International Electric Company (IECO) գրադիենտային շարժիչով, 120 մմ ներքին տրամագծով (600 մՏ/մ, 1000 Տ/մ/վ) պաշտպանված գրադիենտային ներդիր՝ AVANCE.III-ի, ութալիքային բազմակծիկային ՌՀ և բազմամիջուկային հնարավորությունների և ուղեկցող Paravision 6.0.1 հարթակի միջոցով: Գրանցումը կատարվել է 86 մմ ներքին տրամագծով ակտիվորեն անջատված ծավալային ՌՀ կծիկի և միայն ընդունման համար նախատեսված չորսալիքային կրիո-սառեցված ՌՀ կծիկի միջոցով: Առանցքային 2D Turbo-RARE (կրկնության ժամանակ = 2500 մվ, արձագանքի ժամանակ = 33 մվ, 2 միջին)՝ 16 շերտի նկարահանումներով, 0.6–0.8 մմ շերտի հաստությամբ, որը պարունակում է 256 × 256 նմուշ: Ազդանշանները ստացվել են 2 սմ ներքին տրամագծով քառակուսային ընդունիչ-ընդունիչ-ծավալային Ռ/Ռ կծիկով (Rapid MR International, LLC): Վերջապես, օգտագործվել են ներկառուցված Imaris (BitPlane) մակերևույթի գնահատման ֆունկցիաները՝ 3D ռենդերինգի և ծավալի վերլուծության համար: Հաջողակ փոխպատվաստումը սահմանվել է որպես այն, որի դեպքում փոխպատվաստված կիսագնդում ձևավորվել են անընդհատ T2-կշռված ՄՌՏ ազդանշանի տարածքներ: Տրանսպլանտի մերժումը սահմանվել է որպես այն տրանսպլանտը, որը փոխպատվաստված կիսագնդում չի առաջացրել անընդհատ T2-կշռված ՄՌՏ ազդանշանի տարածքներ: Ենթակեղևային t-hCO2-ն բացառվել է հետագա վերլուծությունից:
Երկֆոտոնային կալցիումի պատկերման համար hCO3-ում GCaMP6s-ը կայուն արտահայտելու համար, hiPS բջիջները վարակվել են pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro-ով, որին հաջորդել է հակաբիոտիկների ընտրությունը: Հակիրճ ասած, բջիջները դիսոցացվել են EDTA-ի միջոցով և կախույթի են ենթարկվել 1 մլ Essential 8 միջավայրում՝ մոտավորապես 300,000 բջիջների խտությամբ՝ պոլիբրենի (5 մկգ/մլ) և 15 մկլ վիրուսի առկայությամբ: Այնուհետև բջիջները ինկուբացվել են կախույթի մեջ 60 րոպե և ցանվել են 50,000 բջիջների խտությամբ մեկ փոսում: Միաձուլումից հետո բջիջները մշակվել են 5-10 մկգ մլ-1 պուրոմիցինով 5-10 օրվա ընթացքում կամ մինչև կայուն գաղութների հայտնվելը: Սուր hCO վարակը կատարվել է նախկինում նկարագրվածի պես5՝ որոշ փոփոխություններով: Հակիրճ ասած, 30-45-րդ օրը hCO3-ը տեղափոխել 1.5 մլ Eppendorf միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ, որոնք պարունակում են 100 մկլ նյարդային միջավայր: Այնուհետև մոտավորապես 90 մկլ միջավայր է հանվում, խողովակին ավելացվում է 3-6 մկլ բարձր տիտրով լենտիվիրուս (0.5 x 108-ից մինչև 1.2 x 109), և hCO3-ն տեղափոխվում է ինկուբատոր 30 րոպեով: Այնուհետև յուրաքանչյուր խողովակին ավելացվում է 90-100 մկլ միջավայր և խողովակները վերադարձվում են ինկուբատոր մեկ գիշերվա ընթացքում: Հաջորդ օրը hCO3-ն տեղափոխվում է թարմ նյարդային միջավայրի մեջ՝ ցածր կպչունության թիթեղներով: 7 օր անց hCO3-ն տեղափոխվում է 24 փոսիկով ապակե հատակով թիթեղների մեջ՝ վարակի որակը վիզուալիզացնելու և գնահատելու համար: pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE և pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE-ն ստեղծվել են VectorBuilder-ի կողմից: Լենտիվիրուսն օգտագործվում է փորձերի մեծ մասում, քանի որ այն ինտեգրված է տիրոջ գենոմի մեջ՝ թույլ տալով ռեպորտեր գենի արտահայտում վարակված բջջային գծերում: Կատաղության հետազոտության համար 30-45-րդ օրերին hCO-ն համատեղ վարակվել է rabies-ΔG-eGFP-ով և AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA-ով (պլազմիդ #67528, Addgene), մանրակրկիտ լվացվել է 3 օր, փոխպատվաստվել է առնետների մեջ S1-ում և պահպանվել in vivo պայմաններում 7-14 օր։
Իմունոցիտոքիմիական հետազոտության համար կենդանիները անզգայացվել են և տրանսկարդիալ պերֆուզիայի ենթարկվել PBS-ով, որին հաջորդել է 4% պարաֆորմալդեհիդ (PFA PBS-ում; Electron Microscopy Sciences): Ուղեղները ֆիքսվել են 4% PFA-ում 2 ժամ կամ ամբողջ գիշեր 4°C ջերմաստիճանում, կրիոկոնսերվացվել են 30% սախարոզայի մեջ PBS-ում 48-72 ժամ և ներդրվել 1:1, 30% սախարոզայի մեջ՝ OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) և պսակաձև կտրվածքներ են կատարվել 30 մկմ հաստությամբ՝ օգտագործելով կրիոստատ (Leica): Հաստ կտրվածքների իմունահյուսվածքաքիմիական հետազոտության համար կենդանիները պերֆուզիայի ենթարկվել են PBS-ով, և ուղեղը դիսեկցիայի ենթարկվել և պսակաձև կտրվածք է կատարվել 300-400 մկմ հաստությամբ՝ օգտագործելով վիբրատոմ (Leica), և կտրվածքները ֆիքսվել են 4% PFA-ով 30 րոպե: Այնուհետև կրիոսեկցիաները կամ հաստ հատվածները լվացվեցին PBS-ով, բլոկավորվեցին 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում (10% նորմալ ավանակի շիճուկ (NDS) և 0.3% Triton X-100՝ նոսրացված PBS-ով) և բլոկավորվեցին բլոկավորող լուծույթով 4°C ջերմաստիճանում: – Ինկուբացիա Կրիոսեկցիաները ինկուբացվեցին գիշերը, իսկ հաստ հատվածները՝ ինկուբացվեցին 5 օր: Օգտագործված հիմնական հակամարմիններն էին՝ հակա-NeuN (մուկ, 1:500; ab104224, abcam), հակա-CTIP2 (առնետ, 1:300; ab18465, abcam), հակա-GFAP (նապաստակ, 1:1,000; Z0334, Dako), հակա-GFP (հավ, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), հակա-HNA (մուկ, 1:200; ab191181, abcam), հակա-NeuN (նապաստակ, 1:500; ABN78, Millipore), հակա-PDGFRA (նապաստակ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), հակա-PPP1R17 (նապաստակ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), հակա-RECA-1 (մուկ, 1:50; ab9774, abcam), հակա-SCG2 (նապաստակ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), հակա-SOX9 (այծ, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (այծ, 1:100; AF1166, R&D Systems), հակա-STEM121 (մուկ, 1:200; Y40410, Takara Bio), հակա-SATB2 (մուկ, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (նապաստակ, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (այծ, 1:100; ab5076, abcam): Օգտագործված հիմնական հակամարմիններն էին՝ հակա-NeuN (մուկ, 1:500; ab104224, abcam), հակա-CTIP2 (առնետ, 1:300; ab18465, abcam), հակա-GFAP (նապաստակ, 1:1,000; Z0334, Dako), հակա-GFP (հավ, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), հակա-HNA (մուկ, 1:200; ab191181, abcam), հակա-NeuN (նապաստակ, 1:500; ABN78, Millipore), հակա-PDGFRA (նապաստակ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), հակա-PPP1R17 (նապաստակ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), հակա-RECA-1 (մուկ, 1:50; ab9774, abcam), հակա-SCG2 (նապաստակ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), հակա-SOX9 (այծ, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (այծ, 1:100; AF1166, R&D Systems), հակա-STEM121 (մուկ, 1:200; Y40410, Takara Bio), հակա-SATB2 (մուկ, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (նապաստակ, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (այծ, 1:100; ab5076, abcam): Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), հակա-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), հակա-GFAP (1:010, 1:03, 1:03), -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), հակա-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), հակա-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), հակա-PDGFRA (кролик, 1:3: հակա-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), հակա-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), հակա-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-tech), SO-AP 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:0; հակա-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (կոզա, 1:100; աբ5076, абкам): Օգտագործված հիմնական հակամարմիններն էին՝ հակա-NeuN (մուկ, 1:500; ab104224, abcam), հակա-CTIP2 (առնետ, 1:300; ab18465, abcam), հակա-GFAP (նապաստակ, 1:1000; Z0334, Dako), հակա-GFP (հավ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), հակա-HNA (մուկ, 1:200; ab191181, abcam), հակա-NeuN (նապաստակ, 1:500; ABN78, Millipore), հակա-PDGFRA (նապաստակ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), հակա-PPP1R17 (նապաստակ, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), հակա-RECA-1 (մուկ, 1:50; ab9774, abcam), հակա-SCG2 (նապաստակ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), հակա-SOX9 (այծ, 1:500; AF3075, R&D Systems), նեթրին G1a (այծ, 1:100; AF1166, R&D Systems), հակա-STEM121 (մուկ, 1:200; Y40410, Takara Bio), հակա-SATB2 (մուկ, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (նապաստակ, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (այծ, 1:100; ab5076, abkam):使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00, ab18465, abcam,, 抗GFAP, 兔, 1:1,000, Z0334, Dako,, 抗-GF P (鸡, 1: 1,000, GTX13970, GeneTex), 抗HNA, 小鼠, 1: 200, ab1911 81, abcam,, 抗NeuN, 兔, 1:500, ABN78, Millipore, 抗PDGFRA, 兔, 1:200；sc-338，Սանտա Կրուզ），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Ատլաս抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100, 20357-1-AP, Proteintech, SOX9, 山羊, 1: 500, AF3075, R&D համակարգեր, Netrin G1a（山羊（山羊，山羊，山羊，山羊，，山羊，6，1: Համակարգեր, STEM121, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300, ab18465, abcam,, 抗GFAP, 兔, 1:1,000, Z0334, Dako, 抗-GFP (鸡), 1:1,000, GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠), 1:200, ab 191181, abcam,, 抗NeuN, 兔, 1:500, ABN78, Millipore, 弔, 抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Ատլաս抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100,20357-1-AP,Proteintech,, SOX9,山羊, 1:500, AF3075, R&D համակարգեր, Netrin G1a,山羊, 1:110,6D, 1:100 Համակարգեր) 1:20, ;Y40410, Takara Bio), հակա-SATB2 (մուկ, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (նապաստակ, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (այծ, 1:100; ab5076, abcam):Օգտագործված հիմնական հակամարմիններն էին՝ հակա-NeuN (մուկ, 1:500; ab104224, abcam), հակա-CTIP2 (առնետ, 1:300; ab18465, abcam), հակա-GFAP (նապաստակ, 1:1000; Z0334, Dako): , հակա-GFP (հավ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), հակա-HNA (մուկ, 1:200; ab191181, abcam), հակա-NeuN (ճագար, 1:500; ABN78, Millipore), հակա-PDGFRA (ճագար, 1:200; sc-338, Santa Cruz), հակա-PPP1R17 (ճագար, 1:200; HPA047819, Atlas հակամարմին), հակա-RECA-1 (մուկ, 1:50; ab9774, abcam), հակա-SCG2 (ճագար), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), հակա-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), հակա -STEM121 (мышь, 1:2010,TakSo, 1:2010, Yara); (мышь, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (коза, 1:100; ab5076, абкам): 20357-1-AP, Proteintech), հակա-SOX9 (այծ, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (այծ, 1:100; AF1166, R&D Systems), հակա-STEM121 (մուկ, 1:200; Y40410, Takara Bio), հակա-SATB2 (մուկ, 1:50; ab51502, abcam), հակա-GAD65/67 (նապաստակ, 1:400; ABN904, Millipore) և հակա-IBA1 (այծ, 1:100; ab5076, abkam):Այնուհետև կտրվածքները լվացվեցին PBS-ով և ինկուբացվեցին երկրորդային հակամարմնի հետ 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում (սառեցված կտրվածքներ) կամ ամբողջ գիշեր 4°C ջերմաստիճանում (հաստ կտրվածքներ): Օգտագործվեց Alexa Fluor երկրորդային հակամարմինը (Life Technologies), որը նոսրացվեց 1:1000 հարաբերակցությամբ բլոկավորման լուծույթում: PBS-ով լվանալուց հետո կորիզները վիզուալիզացվեցին Hoechst 33258 (Life Technologies) սարքով: Վերջապես, սլայդները տեղադրվեցին մանրադիտակի վրա՝ ծածկոցներով (Fisher Scientific)՝ օգտագործելով Aquamount (Polysciences) սարք և վերլուծվեցին Keyence ֆլուորեսցենտային մանրադիտակով (BZ-X վերլուծիչ) կամ Leica TCS SP8 կոնֆոկալ մանրադիտակով (Las-X)՝ պատկերի վրա: Պատկերները մշակվեցին ImageJ ծրագրի միջոցով (Ֆիջի): t-hCO-ում և առնետի կեղևում մարդու նեյրոնների համամասնությունը քանակականացնելու համար, t-hCO-ի կենտրոնում, առնետի կեղևի եզրին կամ դրա մոտ, արվեցին 387.5 մկմ լայնությամբ ուղղանկյուն պատկերներ: Տրանսպլանտատի սահմանները որոշվել են հյուսվածքների թափանցիկության, HNA+ կորիզների և/կամ հյուսվածքների աուտոֆլուորեսցենցիայի առկայության փոփոխությունները գնահատելով: Յուրաքանչյուր պատկերում NeuN+ և HNA+ բջիջների ընդհանուր թիվը բաժանվել է նույն տարածքում գտնվող NeuN+ բջիջների ընդհանուր թվի վրա: Որպեսզի հաշվվեն միայն պատկերի հարթության մեջ կորիզներ ունեցող բջիջները, հաշվարկի մեջ ներառվել են միայն Hoechst+ բջիջները: Վիճակագրական սխալը նվազեցնելու համար միջինացվել է առնվազն 1 մմ հեռավորության վրա գտնվող երկու պատկեր:
Նմուշի հավաքագրումից մեկ շաբաթ առաջ hCO3 փոխպատվաստված կենդանիներին (մոտավորապես 8 ամիս դիֆերենցիացիայի փուլում) տեղադրեք մութ սենյակում՝ կտրելով բեղիկները՝ զգայական խթանումը նվազագույնի հասցնելու համար: Կորիզների մեկուսացումը կատարվել է նախկինում նկարագրվածի պես՝ որոշ փոփոխություններով: Հակիրճ ասած, t-hCO3-ն և hCO3-ն ոչնչացվել են լվացող-մեխանիկական բջջային լիզիսի և 2 մլ ապակե հյուսվածքի մանրացնողի (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) միջոցով: Այնուհետև հում կորիզները զտվել են 40 մկմ ֆիլտրի միջոցով և ցենտրիֆուգացվել են 320 գ-ի վրա 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ սախարոզի խտության գրադիենտ կատարելուց առաջ: Ցենտրիֆուգացման փուլից հետո (320 գ 20 րոպե 4°C ջերմաստիճանում) նմուշները վերստին սուսպենդացվել են 0.04% BSA/PBS-ում՝ ավելացնելով 0.2 միավոր մկլ-1 RNase ինհիբիտոր (40 մկլ-1, AM2682, Ambion) և անցկացվել են 40 մկմ հոսքային ֆիլտրի միջով: Այնուհետև դիսոցացված միջուկները վերստին սուսպենդացվեցին 0.02% BSA պարունակող PBS-ում և բեռնվեցին Chromium Single Cell 3' չիպի վրա (մոտավորապես 8000 բջիջ վերականգնում մեկ գծում): snRNA-seq գրադարանները պատրաստվել են Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ով։ snRNA-seq գրադարանները պատրաստվել են Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ով։ Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics): snRNA-seq գրադարանները պատրաստվել են Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) օգտագործելով։ snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteku snRNA-seq готовили со употреба Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics): snRNA-seq գրադարանը պատրաստվել է Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) օգտագործմամբ։Տարբեր նմուշներից գրադարանները միավորվել և հաջորդականացվել են Admera Health-ի կողմից NovaSeq S4 (Illumina) սարքի վրա։
Յուրաքանչյուր ենթադրյալ միջուկային շտրիխկոդի գեների արտահայտման մակարդակները քանակականացվել են 10x Genomics CellRanger վերլուծության ծրագրային փաթեթի (տարբերակ 6.1.2) միջոցով: Մասնավորապես, ընթերցումները համեմատվել են մարդու (GRCh38, Ensemble, տարբերակ 98) և առնետի (Rnor_6.0, Ensemble, տարբերակ 100) հղման գենոմների համադրության հետ, որոնք ստեղծվել են mkref հրամանով և count-ի միջոցով՝ –include-introns=TRUE հրամանի միջոցով՝ ինտրոնային շրջաններին քարտեզագրված ներառման ընթերցումները քանակականացնելու համար: t-hCO3 նմուշների համար մարդու կորիզները նույնականացվել են պահպանողական պահանջի հիման վրա, որ քարտեզագրված ընթերցումների առնվազն 95%-ը համապատասխանում է մարդու գենոմին: Հետագա բոլոր վերլուծությունները կատարվել են CellRanger-ից ստացված ֆիլտրացված շտրիխկոդի զանգվածի վրա՝ օգտագործելով R փաթեթը (տարբերակ 4.1.2) Seurat (տարբերակ 4.1.1)32:
Որպեսզի հետագա վերլուծության մեջ ներառվեն միայն բարձրորակ կորիզներ, յուրաքանչյուր նմուշի համար իրականացվել է իտերատիվ ֆիլտրման գործընթաց: Նախ, նույնականացվում և հեռացվում են ցածր որակի կորիզները, որոնցում հայտնաբերվել են 1000-ից պակաս եզակի գեներ և ընդհանուր միտոքոնդրիաների ավելի քան 20%-ը: Հետագայում, գեների թվի հում մատրիցը նորմալացվել է կանոնավորված բացասական բինոմիալ ռեգրեսիայի միջոցով՝ օգտագործելով sctransform(vst.flavor=”v2″) ֆունկցիան, որը նաև նույնականացրել է 3000 ամենափոփոխական գեները՝ օգտագործելով լռելյայն պարամետրերը: Չափերի կրճատումը կատարվել է վերին փոփոխական գեների վրա՝ օգտագործելով Գլխավոր բաղադրիչների վերլուծություն (PCA)՝ լռելյայն պարամետրերով՝ օգտագործելով 30 տվյալների հավաքածուի չափ (dims = 30-ը ընտրվել է ծնկի տեղամասերի տեսողական զննման հիման վրա և օգտագործվել է բոլոր նմուշների և համույթային վերլուծությունների համար): Այնուհետև մենք իրականացրեցինք իտերատիվ կլաստերացման մի քանի փուլեր (լուծաչափ = 1)՝ գեները դասակարգելու համար՝ հիմնվելով աննորմալ ցածր գեների քանակի (միջնարժեքը 10-րդ պերսենտիլից ցածր), աննորմալ բարձր միտոքոնդրիալ գեների քանակի (միջնարժեքը 95-րդ պերսենտիլից բարձր) հիման վրա՝ ցածր որակի ենթադրյալ բջիջները նույնականացնելու և հեռացնելու համար: Կլաստերներ և/կամ կասկածելի երկվորյակների մեծ համամասնություն, որոնք նույնականացվել են DoubletFinder33 փաթեթի միջոցով (միջին DoubletFinder միավորը 95-րդ պերսենտիլից բարձր): t-hCO3 նմուշները (n=3) և hCO3 նմուշները (n=3) առանձին ինտեգրվել են՝ օգտագործելով IntegrateData ֆունկցիան վերը նշվածի հետ: պարամետրեր։ Այնուհետև ինտեգրված տվյալների բազմության որակական ֆիլտրման մեկ այլ փուլ իրականացվեց վերևում նկարագրվածի պես։
Ցածր որակի միջուկները հեռացնելուց հետո, ինտեգրված տվյալների բազմությունը խմբավորվել է (լուծաչափ = 0.5) և ներդրվել UMAP34 վիզուալիզացիայի նպատակներով: Յուրաքանչյուր կլաստերի մարկերային գեները որոշվել են FindMarkers ֆունկցիայի միջոցով՝ նորմալացված գեների արտահայտման տվյալներից հաշվարկված լռելյայն պարամետրերով: Մենք նույնականացնում և դասակարգում ենք հիմնական բջջային դասերը՝ համատեղելով պտղի և չափահասի կեղևի հղման տվյալների բազմությունները մարկերային գեների արտահայտման 19,20,21,35 և ծանոթագրությունների հետ: Մասնավորապես, շրջանառվող նախորդները նույնականացվել են MKI67 և TOP2A արտահայտությամբ: Նախածին կլաստերները սահմանվել են միտոտիկ տրանսկրիպտների բացակայությամբ, ուշ մետաֆազային պտղի կեղևում նկարագրված բազմապոտենցիալ նախածին կլաստերների հետ բարձր համընկնմամբ, ինչպես նաև EGFR և OLIG1 արտահայտությամբ: Մենք օգտագործում ենք «աստրոցիտ» տերմինը՝ աստրոցիտների դիֆերենցման մի քանի վիճակներ ընդգրկելու համար՝ ուշ ճառագայթային գլիայից մինչև աստրոցիտների հասունացում: Աստրոցիտների կլաստերները արտահայտում են SLC1A3 և AQP4 բարձր մակարդակներ և ցույց է տրվել, որ դրանք քարտեզագրվում են պտղի ճառագայթային գլիայի և/կամ չափահաս աստրոցիտների ենթատիպերի հետ: OPC-ները արտահայտում են PDGFRA և SOX10, մինչդեռ օլիգոդենդրոցիտները արտահայտում են միելինացման մարկերներ (MOG և MYRF): Գլուտամատերգիկ նեյրոնները նույնականացվել են նեյրոնային տրանսկրիպտների (SYT1 և SNAP25) առկայությամբ, GABAergic մարկերների բացակայությամբ (GAD2) և NEUROD6, SLC17A7, BCL11B կամ SATB2 արտահայտությամբ: GluN նեյրոնները հետագայում բաժանվել են վերին (SATB2 արտահայտում և BCL11B-ի կորուստ) և խորը (BCL11B արտահայտում) ենթադասերի: Ենթադրյալ ենթաթիթեղային (SP) նեյրոնները, խորը GluN մարկերներից բացի, արտահայտում են նաև հայտնի SP18 մարկերներ, ինչպիսիք են ST18-ը և SORCS1-ը: Խորոիդային հյուսակի նման բջիջները նույնականացվել են TTR արտահայտությամբ, իսկ ուղեղանման բջիջները արտահայտել են ֆիբրոբլաստների հետ կապված գեներ և քարտեզագրել են հղման տվյալների հավաքածուի անոթային/անոթային բջիջները:
t-hCO և hCO ենթադասերի միջև գեների արտահայտման դիֆերենցիալ վերլուծությունը կատարվել է Libra R փաթեթի միջոցով իրականացված նմուշներում վերարտադրված նոր մշակված կեղծ-խմբաքանակային մեթոդի միջոցով (տարբերակ 1.0.0): Մասնավորապես, խմբերի համար իրականացվել են edgeR լոգարիթմական հավանականության թեստեր (տարբերակ 3.36.0, փաթեթ R)՝ յուրաքանչյուր նմուշի կրկնօրինակման համար տվյալ բջջային դասի բջիջներում գեների քանակը գումարելով: Ջերմային քարտեզի վիզուալիզացիայի համար նորմալացված միլիոնի (CPM) արժեքները հաշվարկվել են edgeR-ի միջոցով (cpm() ֆունկցիա) և մասշտաբավորվել (միջին = 0, ստանդարտ շեղում = 1 ստանալու համար): Կատարվել է զգալիորեն բարձրացված t-hCO GluN գեների գենային օնտոլոգիայի (GO) հարստացման վերլուծություն (Բենջամինի-Հոխբերգի կողմից շտկված P արժեքը 0.05-ից պակաս է, արտահայտված t-hCO GluN բջիջների առնվազն 10%-ում և փոփոխության առնվազն 2 անգամ աճ): Կատարվել է ToppGene Suite-ի միջոցով (https://toppgene.cchmc.org/)37: Մենք օգտագործում ենք ToppFun հավելվածը՝ լռելյայն պարամետրերով և ներկայացնում ենք Բենջամինի-Հոխբերգի կողմից շտկված P-արժեքները, որոնք հաշվարկվել են GO-ի կողմից մեկնաբանված հիպերերկրաչափական թեստերից։
Մեր snRNA-seq կլաստերները համապատասխանեցնելու համար առաջնային միաբջջային RNA-seq-ի կամ չափահաս snRNA-seq19,20,21,22-ի հղումային ուսումնասիրություններից վերցված մեկնաբանված բջջային կլաստերների հետ, մենք կիրառեցինք զույգային տվյալների ինտեգրման մոտեցումը: Մենք օգտագործեցինք Seurat-ի SCTransform (v2) նորմալացման աշխատանքային հոսքը՝ տվյալների հավաքածուների միջև կլաստերների համընկնումները ինտեգրելու և համեմատելու համար (օգտագործելով վերևում նշված նույն պարամետրերը): Հաշվողական արդյունավետության համար անհատական ​​տվյալների հավաքածուները պատահականորեն ենթաբաժնվեցին մինչև 500 բջիջ կամ միջուկ յուրաքանչյուր սկզբնական կլաստերի մեջ: Օգտագործելով նախկինում նկարագրված նմանատիպ մոտեցումը, կլաստերի համընկնումը սահմանվեց որպես յուրաքանչյուր համակցված կլաստերում բջիջների կամ միջուկների այն համամասնությունը, որոնք համընկնում էին հղումային կլաստերի պիտակի հետ: GluN-ները հետագա դասակարգելու համար մենք օգտագործեցինք Seurat-ի TransferData աշխատանքային հոսքը GluN ենթաբազմության տվյալների համար՝ մեր GluN բջիջներին հղումային տվյալների հավաքածուի պիտակներ վերագրելու համար:
t-hCO և hCO նմուշների գլոբալ տրանսկրիպտոմի հասունացման կարգավիճակը գնահատելու համար մենք համեմատեցինք մեր կեղծ-բազմաբաղադրիչ նմուշները BrainSpan/psychENCODE23-ի հետ, որը բաղկացած է մարդու ուղեղի զարգացումը ընդգրկող մեծ ՌՆԹ հաջորդականությունից: Մենք կատարեցինք PCA կեղևային նմուշներից վերցված համակցված նախշ-նորմալացված գեների արտահայտման մատրիցի վրա՝ բեղմնավորումից 10 շաբաթ անց և ավելի ուշ՝ 5567 գեներում (մեր տվյալների հետ միասին), որոնք նախկինում նույնականացվել էին որպես ակտիվ BrainSpan կեղևային նմուշներում (սահմանվում է որպես զարգացման տատանման ավելի քան 50%-ը՝ բացատրված տարիքով՝ օգտագործելով խորանարդային մոդել)38: Բացի այդ, մենք ստացանք նեյրոզարգացման հիմնական տրանսկրիպտոմային ստորագրությունների հետ կապված գեներ՝ օգտագործելով ոչ բացասական մատրիցային ֆակտորիզացիա, ինչպես նկարագրվել է նախկինում: Ոչ բացասական մատրիցային ֆակտորիզացիայի ընթացակարգով հաշվարկված նմուշների կշիռները ներկայացված են Նկար 5բ-ում՝ Ժուի և այլոց կողմից նկարագրված հինգ ստորագրություններից յուրաքանչյուրի համար ընդլայնված տվյալներով38: Կրկին, ակտիվությունից կախված տրանսկրիպցիոն մարկերները ստացվել են նախկինում հրապարակված ուսումնասիրություններից: Մասնավորապես, ERG-ն և LRG-ն զգալիորեն բարձրացված էին գլուտամատերգիկ նեյրոններում, որոնք նույնականացվել էին մկան տեսողական կեղևի snRNA-seq հավաքածուով, տեսողական խթանումից հետո (Հրվատին և այլք, 16): Մարդու կողմից հարստացված LRG-ները ստացվել են KCl-ակտիվացված մարդու պտղի ուղեղի կուլտուրաներից և հավաքվել խթանումից 6 ժամ անց, և ֆիլտրացված գեները զգալիորեն բարձրացված էին մարդկանց մոտ, բայց ոչ կրծողների մոտ (Լրացուցիչ աղյուսակ 4): Այս գեների հավաքածուների միջոցով գեների հարստացման վերլուծությունը կատարվել է միակողմանի Ֆիշերի ճշգրիտ թեստի միջոցով:
Առնետներին անզգայացրեք իզոֆլուրանով, հեռացրեք ուղեղը և տեղադրեք սառը (մոտավորապես 4°C) թթվածնով հարստացված (95% O2 և 5% CO2) սախարոզի լուծույթում՝ 234 մՄ սախարոզ, 11 մՄ գլյուկոզ, 26 մՄ NaHCO3, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ NaH2PO4, 10 մՄ MgSO4 և 0.5 մՄ CaCl2 (մոտ 310 մՕսմ) պարունակող հատվածների համար: Առնետների ուղեղի պսակաձև հատվածները (300–400 մկմ), որոնք պարունակում են t-hCO3, պատրաստվել են Leica VT1200 վիբրատոմի միջոցով, ինչպես նկարագրվել է նախկինում39: Այնուհետև կտրվածքները տեղափոխվել են կտրման խցիկ՝ սենյակային ջերմաստիճանում անընդհատ թթվածնավորմամբ, որը պարունակում էր aCSF, որը պատրաստված էր հետևյալ նյութերից՝ 10 մՄ գլյուկոզ, 26 մՄ NaHCO3, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ NaHPO4, 1 մՄ MgSO4, 2 մՄ CaCl2 և 126 մՄ NaCl (298 մՕսմ)՝ գրանցումից առնվազն 45 րոպե առաջ։ Կտրվածքները գրանցվել են ընկղմված խցիկում, որտեղ դրանք անընդհատ պերֆուզիայի են ենթարկվել aCSF-ով (95% O2 և 5% CO2 սրվակ)։ Բոլոր տվյալները գրանցվել են սենյակային ջերմաստիճանում։ t-hCO նեյրոնները վերջնականապես փակվել են բորոսիլիկատային ապակե պիպետով, որը լցված էր 127 մՄ կալիումի գլյուկոնատ, 8 մՄ NaCl, 4 մՄ մագնեզիում ATP, 0.3 մՄ նատրիումի GTP, 10 մՄ HEPES և 0.6 մՄ EGTA պարունակող լուծույթով, pH 7.2, ներքին լուծույթը կարգավորվել է KOH-ով (290 մՕսմ)։ Վերականգնման համար գրանցման լուծույթին ավելացվել է բիոցիտին (0.2%):
Տվյալները ստացվել են MultiClamp 700B ուժեղացուցիչի (Molecular Devices) և Digidata 1550B թվայնացնողի (Molecular Devices) միջոցով, ցածր հաճախականությունների ֆիլտրացվել են 2 կՀց հաճախականությամբ, թվայնացվել են 20 կՀց հաճախականությամբ և վերլուծվել են Clampfit-ի (Molecular Devices), Origin-ի (OriginPro, 2021b, OriginLab) և MATLAB-ի հատուկ ֆունկցիաների (Mathworks) միջոցով։ Միացման պոտենցիալը հաշվարկվել է JPCalc-ի միջոցով, և մուտքագրումները ճշգրտվել են -14 մՎ հաշվարկված արժեքին։ IV գործողությունը բաղկացած է հոսանքի քայլերի շարքից՝ 10-25 պԱ քայլերով՝ -250-ից մինչև 750 պԱ։
Թալամուսը, սպիտակ նյութը և S1 աֆերենտները էլեկտրականորեն խթանվել են թալամոկորտիկալ կտրվածքներում՝ hCO նեյրոնների patch-clamp գրանցման ժամանակ, ինչպես նկարագրվել է նախկինում: Հակիրճ ասած, ուղեղը տեղադրվել է 10° անկյան տակ թեքված 3D տպագրության սեղանի վրա, և ուղեղի առջևի մասը կտրվել է 35° անկյան տակ: Այնուհետև ուղեղը սոսնձվել է կտրված մակերեսին և բաժանվել՝ պահպանելով թալամոկորտիկալ դուրս ցցված աքսոնները: Երկբևեռ վոլֆրամե էլեկտրոդներ (0.5 ՄՕմ) տեղադրվել են երկրորդ միկրոմանիպուլյատորի վրա և ռազմավարականորեն տեղադրվել են՝ յուրաքանչյուր բջջի չորս շրջանները (ներքին պարկուճ, սպիտակ նյութ, S1 և hCO3) խթանելու համար: Գրանցել սինապսային արձագանքները 300 µA փուլային խթանումից հետո՝ 0.03–0.1 Հց հաճախականությամբ:
hChR2 արտահայտող hCO2 նեյրոնները ակտիվացել են 480 նմ-ում, և LED (Prizmatix)-ի կողմից առաջացած լուսային իմպուլսները կիրառվել են ×40 օբյեկտիվի (0.9 NA; Olympus) միջով՝ բջիջների մոտ hChR2-ի արտահայտությունը գրանցելու համար: Լուսավորված դաշտի տրամագիծը մոտավորապես 0.5 մմ է, իսկ ընդհանուր հզորությունը՝ 10-20 մՎտ: Իմպուլսի լայնությունը սահմանվել է 10 մվ, որը համապատասխանում է վարքային ուսուցման փորձի ընթացքում տրված իմպուլսին: Օգտագործվել են տարբեր խթանման հաճախականություններ՝ 1-ից մինչև 20 Հց, բայց քանակական որոշման համար օգտագործվել է շարքի միայն առաջին իմպուլսը: Շարքերի միջև ընկած ժամանակահատվածները սովորաբար ավելի երկար են, քան 30 վայրկյան՝ սինապտիկ արգելակող կամ հեշտացնող ուղիների վրա ազդեցությունը նվազագույնի հասցնելու համար: Ստուգելու համար, թե արդյոք hChR2 արձագանքը մոնոսինապտիկ է, մենք լոգարանին կիրառել ենք TTX (1 μM) մինչև EPSC ռեակցիայի անհետացումը, ապա կիրառել ենք 4-ամինոպիրիդին (4-AP; 100 μM): Սովորաբար, պատասխանը վերադարձվում է մի քանի րոպեի ընթացքում՝ LED-ի միացման և EPSC-ի առաջացման միջև մի փոքր ավելի երկար ուշացմամբ: NBQX (10 μM) մեթոդը օգտագործվել է AMPA ընկալիչների կողմից արձագանքի առաջացման ստուգման համար:
Սուր hCO հատվածներ են ստեղծվել նախկինում նկարագրվածի պես։ Հակիրճ ասած, hCO հատվածները ներդրվել են 4% ագարոզի մեջ և տեղափոխվել 126 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ NaH2PO4, 1 մՄ MgSO4, 2 մՄ CaCl2, 26 մՄ NaHCO3 և 10 մՄ d-(+)-գլյուկոզ պարունակող բջիջների մեջ։ Կտրվածքները կտրվել են 200-300 մկմ չափսերով սենյակային ջերմաստիճանում՝ օգտագործելով Leica VT1200 վիբրատոր և պահվել են ASF-ում սենյակային ջերմաստիճանում։ Այնուհետև, hCO հատվածների վրա կատարվել է ամբողջական բջիջների patch-camp գրանցում՝ ուղիղ SliceScope մանրադիտակի (Scientifica) ներքո։ Կտրվածքները պերֆուզվել են aCSF-ով (95% O2 և 5% CO2), և բջջային ազդանշանները գրանցվել են սենյակային ջերմաստիճանում։ hCO նեյրոնները կիրառվել են բորոսիլիկատային ապակե պիպետի միջոցով, որը լցված է 127 մՄ կալիումի գլյուկոնատ, 8 մՄ NaCl, 4 մՄ մագնեզիում ATP, 0.3 մՄ նատրիումի GTP, 10 մՄ HEPES և 0.6 մՄ EGTA պարունակող լուծույթով, ներքին pH 7, 2, կարգավորված KOH-ով (օսմոլյարություն 290): Վերականգնման նպատակով ներքին լուծույթին ավելացրեք 0.2% բիոցիտին:
Տվյալները ստացվել են Clampex-ի (Clampex 11.1, Molecular Devices) կողմից՝ օգտագործելով MultiClamp 700B ուժեղացուցիչ (Molecular Devices) և Digidata 1550B թվայնացուցիչ (Molecular Devices), ցածր հաճախականությունների ֆիլտրացվել են 2 կՀց հաճախականությամբ, թվայնացվել են 20 կՀց հաճախականությամբ և վերլուծվել են Clampfit-ի (տարբերակ 10.6) վերլուծության համար (մոլեկուլային սարքեր) և MATLAB-ի հատուկ ֆունկցիաների (MATLAB 2019b, Mathworks) միջոցով: Միացման պոտենցիալը հաշվարկվել է JPCalc-ի միջոցով, և մուտքագրումները հարմարեցվել են -14 մՎ հաշվարկված միացման պոտենցիալին: IV գործողությունը բաղկացած է հոսանքի քայլերի շարքից՝ 5-10 պԱ քայլերով՝ -50-ից մինչև 250 պԱ:
Սեղմված նեյրոնների ձևաբանական վերականգնման համար ներքին լուծույթին ավելացվել է 0.2% բիոցիտին (Sigma-Aldrich): Բջիջները նախապատրաստվում են առնվազն 15 րոպե՝ կտրելուց հետո: Այնուհետև պիպետը դանդաղորեն ներծծվում է 1-2 րոպե, մինչև գրանցված թաղանթը լիովին կնքվի: Հատվածի ֆիզիոլոգիական ընթացակարգին հետևելով՝ հատումները ֆիքսվել են գիշերը 4°C ջերմաստիճանում 4% PFA-ում, լվացվել PBS X3-ով և նոսրացվել 1:1000 հարաբերակցությամբ ստրեպտավիդին-կոնյուգացված DyLight 549-ով կամ DyLight 405-ով (Vector Labs): Բիոցիտինով (2%; Sigma-Aldrich) լցված բջիջները պիտակավորվել են պատչային սեղմակով գրանցման ժամանակ սենյակային ջերմաստիճանում 2 ժամ: Այնուհետև հատումները տեղադրվել են մանրադիտակի սլայդների վրա՝ օգտագործելով Aquamount (Thermo Scientific) սարքը, և հաջորդ օրը տեսողականացվել են Leica TCS SP8 կոնֆոկալ մանրադիտակի վրա՝ օգտագործելով յուղային ընկղմման օբյեկտիվ՝ թվային ապերտուրայով ×40 1.3, մեծացմամբ ×0.9–1.0, xy: Նմուշառման հաճախականությունը մոտավորապես 7 պիքսել է մեկ միկրոնում: Z-շերտերը ստացվել են հաջորդաբար՝ 1 մկմ ինտերվալներով, և z-շերտերի խճանկարներ և Leica-ի վրա հիմնված ավտոմատ կարում է իրականացվել՝ յուրաքանչյուր նեյրոնի ամբողջ դենդրիտային ծառը ծածկելու համար: Այնուհետև նեյրոնները հետևվել են կիսաձեռքով՝ neuTube 40 ինտերֆեյսի միջոցով, և ստեղծվել են SWC ֆայլեր: Այնուհետև ֆայլերը վերբեռնվել են SimpleNeuriteTracer41 Fiji հավելված (ImageJ, տարբերակ 2.1.0; NIH):
Մարդու կեղևային հյուսվածքը ստացվել է տեղեկացված համաձայնությամբ՝ համաձայն Սթենֆորդի համալսարանի ինստիտուցիոնալ վերանայման խորհրդի կողմից հաստատված արձանագրության: Մարդկային հետծննդյան հյուսվածքի երկու նմուշ (3 և 18 տարեկան) ստացվել են ճակատային կեղևի (միջին ճակատային գիրուս) հատման միջոցով՝ որպես ռեֆրակտորային էպիլեպսիայի վիրահատության մաս: Հեռացումից հետո հյուսվածքը հավաքվել է սառցե NMDG-aCSF-ի մեջ, որը պարունակում է. 92 մՄ NMDG, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ NaH2PO4, 30 մՄ NaHCO3, 20 մՄ HEPES, 25 մՄ գլյուկոզ, 2 մՄ թիոմիզանյութ, 5 մՄ նատրիումի ասկորբատ, 3 մՄ նատրիումի պիրուվատ, 0.5 մՄ CaCl2 4H2O և 10 մՄ MgSO4 7H2O: Տիտրվել է մինչև pH 7.3-7.4՝ խտացված աղաթթվով: Հյուսվածքները լաբորատորիա են տեղափոխվել 30 րոպեի ընթացքում, և պսակային հատումները վերցվել են վերը նկարագրված ընթացակարգի համաձայն:
Բոլոր կենդանիների հետ կապված միջամտությունները կատարվել են Սթենֆորդի համալսարանի APLAC-ի կողմից հաստատված կենդանիների խնամքի ուղեցույցներին համապատասխան: Առնետները (փոխպատվաստումից ավելի քան 140 օր անց) վիրահատության ընթացքում ենթարկվել են 5% իզոֆլուրանային անզգայացման և անզգայացվել են 1-3% իզոֆլուրանով: Կենդանիները տեղադրվել են ստերեոտաքսիկ շրջանակի (Kopf) մեջ և ենթամաշկային ներարկվել է երկարատև արտազատմամբ բուպրենորֆին (SR): Գանգը բացվել է, մաքրվել և տեղադրվել են 3-5 ոսկրային պտուտակներ: t-hCO3-ը թիրախավորելու համար մենք ՄՌՏ պատկերներից ստացել ենք ստերեոտաքսիկ կոորդինատներ: Հետաքրքրության տեղում բացվել է փորվածքի անցք, և մանրաթելերը (400 մկմ տրամագծով, NA 0.48, դորիկ) իջեցվել են hCO3 մակերեսից 100 մկմ ներքև և ամրացվել են գանգին ուլտրամանուշակագույն ճառագայթմամբ կարծրացվող ատամնաբուժական ցեմենտով (Relyx):
Ֆոտոմետրիկ մանրաթելային գրանցումները կատարվել են նախկինում նկարագրված եղանակով42: Ինքնաբուխ ակտիվությունը գրանցելու համար առնետները տեղադրվել են մաքուր վանդակում, և 400 մկմ տրամագծով օպտիկամանրաթելային կաբել (Doric), որը միացված է օպտիկամանրաթելային ֆոտոմետրիկ տվյալների հավաքագրման համակարգին, միացվել է իմպլանտացված օպտիկամանրաթելային մալուխին: Շարժողական ակտիվության 10 րոպեանոց գրանցման ընթացքում կենդանիները ազատորեն կարող էին ուսումնասիրել վանդակը: Արձակված ակտիվությունը գրանցելու համար առնետները (փոխպատվաստումից ավելի քան 140 օր անց) անզգայացվել են 5% իզոֆլուրանով՝ ինդուկցիայի համար և 1-3% իզոֆլուրանով՝ պահպանման համար: Կենդանուն տեղադրել են ստերեոտաքսիկ շրջանակի մեջ (Kopf), և t-hCO3-ի հակառակ կողմի բեղիկները կտրվել են մոտ 2 սմ-ով և անցկացվել պիեզոէլեկտրական ակտիվատորին (PI) միացված ցանցի միջով: 400 մկմ օպտիկամանրաթելային կաբել (Doric) միացվել է իմպլանտացված մանրաթելին և տվյալների հավաքագրման համակարգին: t-hCO3-ի հակառակ կողմում գտնվող բեղիկները այնուհետև շեղվել են 50 անգամ (2 մմ 20 Հց հաճախականությամբ, 2 վայրկյան յուրաքանչյուր ներկայացման համար) պատահական ժամանակներում պիեզոէլեկտրական շարժիչով՝ 20 րոպեանոց գրանցման ժամանակահատվածում: Օգտագործեք Arduino MATLAB աջակցության փաթեթը՝ շեղման ժամանակը կարգավորելու համար՝ օգտագործելով MATLAB-ի հատուկ կոդը: Իրադարձությունները համաժամեցվում են տվյալների ձեռքբերման ծրագրի հետ՝ օգտագործելով տրանզիստոր-տրանզիստորային տրամաբանության (TTL) իմպուլսներ:
Առնետները (փոխպատվաստումից ավելի քան 140 օր անց) ենթարկվել են 5% իզոֆլուրանային անզգայացման և վիրահատության ընթացքում անզգայացվել են 1-3% իզոֆլուրանով։ Կենդանիները տեղադրվել են ստերեոտաքսիկ շրջանակի մեջ (Kopf) և ենթամաշկային ներարկվել են բուպրենորֆին SR և դեքսամետազոն։ Գանգը բացվել է, մաքրվել և տեղադրվել են 3-5 ոսկրային պտուտակներ։ t-hCO3-ը թիրախավորելու համար մենք ՄՌՏ պատկերներից ստացել ենք ստերեոտաքսիկ կոորդինատներ։ Բարձր արագությամբ հորատիչով անմիջապես փոխպատվաստված hCO3-ի վրայով կատարվել է շրջանաձև կռանիոտոմիա (մոտավորապես 1 սմ տրամագծով)։ Երբ ոսկորը հնարավորինս բարակ է, բայց ամբողջ ոսկորը փորելուց առաջ, օգտագործել աքցան՝ մնացած ամբողջական կոնքի սկավառակը հեռացնելու համար՝ հիմքում ընկած t-hCO3-ն հայտնաբերելու համար։ Կրանիոտոմիան լցվել է ստերիլ ֆիզիոլոգիական լուծույթով, իսկ գանգին ամրացվել են ծածկող շերտ և հատուկ գլխիկ՝ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթմամբ մշակված ատամնաբուժական ցեմենտով (Relyx):
Երկու ֆոտոնով պատկերումը կատարվել է Bruker բազմաֆոտոնային մանրադիտակի միջոցով՝ Nikon LWD (×16, 0.8 NA) օբյեկտիվով: GCaMP6 պատկերումը կատարվել է 920 նմ-ում՝ 1.4x մեկ z-հարթության մեծացմամբ և 8x միջինում՝ 7.5 կադր/վրկ արագությամբ: Առնետները ինդուկցվել են 5% իզոֆլուրանային անզգայացմամբ և պահպանվել են 1-3% իզոֆլուրանով: Առնետները տեղադրվել են հատուկ պատրաստված գլխի ամրակի մեջ և տեղադրվել ոսպնյակի տակ: Ստացվել է շարժիչ ակտիվության 3 րոպեանոց ֆոնային ձայնագրություն: 20 րոպե ձայնագրության ընթացքում picospricer-ի միջոցով t-hCO3-ի դիմաց գտնվող բեղիկավոր բարձիկին պատահականորեն տրվել է 50 փչում (յուրաքանչյուր ներկայացումը՝ 100 մվ երկարությամբ): Օգտագործեք Arduino MATLAB աջակցության փաթեթը՝ պոռթկման ժամանակը կարգավորելու համար՝ հատուկ MATLAB կոդով: Համաժամեցրեք իրադարձությունները տվյալների ձեռքբերման ծրագրաշարի (PrairieView 5.5) հետ՝ օգտագործելով TTL իմպուլսներ: Վերլուծության համար պատկերները շտկվել են xy շարժման համար՝ օգտագործելով աֆինային ուղղում Ֆիջիում մեկնարկած MoCo ծրագրում: Առանձին բջիջներից ֆլուորեսցենտային հետքերի արդյունահանում CNMF-E43-ի միջոցով: Ֆլուորեսցենցիան արդյունահանվել է հետաքրքրության յուրաքանչյուր շրջանի համար, վերածվել dF/F կորերի, ապա վերածվել z-միավորների:
Առնետները (փոխպատվաստումից ավելի քան 140 օր անց) վիրահատության ընթացքում ինդուկցիայի են ենթարկվել 5% իզոֆլուրանային անզգայացմամբ և անզգայացվել են 1-3% իզոֆլուրանով։ Կենդանիները տեղադրվել են ստերեոտաքսիկ շրջանակի մեջ (Kopf) և ենթամաշկային ներարկվել են բուպրենորֆին SR և դեքսամետազոն։ t-hCO-ի հակառակ կողմի բեղիկները կտրվել են մոտ 2 սմ երկարությամբ և անցկացվել են պիեզոէլեկտրական ակտիվատորին միացված ցանցի միջով։ Գանգը բացվել և մաքրվել է։ Գանգին ամրացվել է չժանգոտվող պողպատից պատրաստված հղկող պտուտակ։ t-hCO-ն թիրախավորելու համար մենք ՄՌՏ պատկերներից ստացել ենք ստերեոտաքսիկ կոորդինատներ։ Կատարել շրջանաձև կռանիոտոմիա (մոտավորապես 1 սմ տրամագծով) բարձր արագության հորատիչով՝ t-hCO-ից անմիջապես վերև։ Երբ ոսկորը հնարավորինս բարակ է, բայց ամբողջ ոսկորը փորելուց առաջ, օգտագործել աքցան՝ մնացած անվնաս կոնքի սկավառակը հեռացնելու համար՝ հիմքում ընկած t-hCO-ն բացահայտելու համար։ Առանձին բջիջները գրանցվել են 32-ալիքային կամ 64-ալիքային բարձր խտության սիլիցիումային զոնդերի (Cambridge Neurotech) միջոցով, որոնք հողակցված են հողակցված պտուտակներին և նախապես ուժեղացվել են RHD ուժեղացուցիչներով (Intan): Մանիպուլյատորի միջոցով էլեկտրոդները իջեցվել են թիրախային տեղամաս՝ գանգի տոմիայի միջոցով, որը լցված է ստերիլ ֆիզիոլոգիական լուծույթով: Տվյալների հավաքագրումը կատարվել է 30 կՀց հաճախականությամբ՝ օգտագործելով Open Ephys տվյալների հավաքագրման համակարգը: Ձայնագրումը շարունակվել է միայն այն ժամանակ, երբ մենք հայտնաբերել ենք բարձր կոռելյացված ռիթմիկ ինքնաբուխ ակտիվություն ավելի քան 10 ալիքներում, ինչը ենթադրում է, որ էլեկտրոդները գտնվում են պատվաստանյութի մեջ (հիմնված երկֆոտոնային կալցիումի պատկերման տվյալների վրա): Ստացվել է շարժիչ ակտիվության 10 րոպեանոց ֆոնային ձայնագրություն: t-hCO3-ի հակառակ կողմում գտնվող բեղիկները այնուհետև շեղվել են 50 անգամ (2 մմ 20 Հց հաճախականությամբ, 2 վայրկյան մեկ ներկայացման համար) պատահական ժամանակներում՝ պիեզոէլեկտրական շարժիչով 20 րոպեանոց ձայնագրման ժամանակահատվածում: Օգտագործելով MATLAB աջակցության փաթեթը Arduino-ի համար (MATLAB 2019b), վերահսկել շեղման ժամանակը հատուկ MATLAB կոդով: Օգտագործեք TTL իմպուլսներ՝ իրադարձությունները տվյալների հավաքագրման ծրագրաշարի հետ համաժամեցնելու համար։
Օպտիկական նշագրման փորձերի համար 200 մկմ օպտիկական միացման լար (Doric), որը միացված էր 473 նմ լազերին (Omicron), միացված էր կռանիոտոմիայի վրա տեղադրված 200 մկմ օպտիկական մանրաթելին: Դրանից անմիջապես առաջ կարգավորեք ցատկի հզորությունը մինչև 20 մՎտ: Մանիպուլյատորի միջոցով իջեցրեք էլեկտրոդները թիրախային տեղամաս՝ կռանիոտոմիայի միջոցով, որը լցված է ստերիլ ֆիզիոլոգիական լուծույթով: Ձայնագրման սկզբում արձակվել են 473 նմ լույսի տասը իմպուլսներ (հաճախականություն՝ 2 Հց, իմպուլսի տևողություն՝ 10 մվ): Լուսազգայուն բջիջները սահմանվել են որպես բջիջներ, որոնք փորձարկումների 70% կամ ավելիում ցույց են տվել սպիկ արձագանք լույսի 10 մվ-ի սահմաններում: