Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Հեղուկ բիոպսիան (LB) հասկացություն է, որն արագորեն տարածված է դառնում կենսաբժշկական ոլորտում:Հայեցակարգը հիմնականում հիմնված է շրջանառվող արտաբջջային ԴՆԹ-ի (ccfDNA) բեկորների հայտնաբերման վրա, որոնք հիմնականում ազատվում են որպես փոքր բեկորներ տարբեր հյուսվածքներում բջիջների մահից հետո:Այս բեկորների մի փոքր մասը ծագում է օտար (օտար) հյուսվածքներից կամ օրգանիզմներից:Ընթացիկ աշխատանքում մենք կիրառել ենք այս հայեցակարգը միդիաների նկատմամբ՝ պահակային տեսակների, որոնք հայտնի են ծովի ջրի ֆիլտրման բարձր հզորությամբ:Մենք օգտագործում ենք միդիաների կարողությունը՝ գործելու որպես բնական զտիչներ՝ տարբեր աղբյուրներից շրջակա միջավայրի ԴՆԹ-ի բեկորները գրավելու համար՝ ծովային ափամերձ էկոհամակարգերի կենսաբազմազանության մասին տեղեկատվություն տրամադրելու համար:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ միդիա հեմոլիմֆը պարունակում է ԴՆԹ-ի բեկորներ, որոնք մեծապես տարբերվում են չափերով՝ 1-ից 5 կբ:Որսորդական հրացանների հաջորդականությունը ցույց է տվել, որ մեծ թվով ԴՆԹ-ի բեկորներ ունեն օտար մանրէաբանական ծագում:Դրանց թվում մենք գտանք ԴՆԹ-ի բեկորներ բակտերիայից, արխեայից և վիրուսներից, ներառյալ վիրուսները, որոնք հայտնի են, որ վարակում են ափամերձ ծովային էկոհամակարգերում հայտնաբերված մի շարք հյուրընկալողներ:Եզրափակելով՝ մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ միդիաների նկատմամբ կիրառվող LB հասկացությունը ներկայացնում է ծովային ափամերձ էկոհամակարգերում մանրէաբանական բազմազանության մասին գիտելիքների հարուստ, բայց դեռ չուսումնասիրված աղբյուր:
Կլիմայի փոփոխության (ԿԿ) ազդեցությունը ծովային էկոհամակարգերի կենսաբազմազանության վրա հետազոտության արագ աճող ոլորտ է:Գլոբալ տաքացումը ոչ միայն առաջացնում է կարևոր ֆիզիոլոգիական սթրեսներ, այլև մղում է ծովային օրգանիզմների ջերմային կայունության էվոլյուցիոն սահմանները՝ ազդելով մի շարք տեսակների կենսամիջավայրի վրա՝ դրդելով նրանց փնտրել ավելի բարենպաստ պայմաններ [1, 2]:Ի լրումն մետազոների կենսաբազմազանության վրա ազդելու, CC-ն խախտում է հյուրընկալող-մանրէաբանական փոխազդեցությունների նուրբ հավասարակշռությունը:Այս մանրէաբանական դիսբակտերիոզը լուրջ վտանգ է ներկայացնում ծովային էկոհամակարգերի համար, քանի որ այն ծովային օրգանիզմներին դարձնում է ավելի զգայուն վարակիչ պաթոգենների նկատմամբ [3, 4]:Ենթադրվում է, որ ՍՍ-ը կարևոր դեր է խաղում զանգվածային մահերի մեջ, ինչը լուրջ խնդիր է համաշխարհային ծովային էկոհամակարգերի կառավարման համար [5, 6]:Սա կարևոր խնդիր է՝ հաշվի առնելով ծովային շատ տեսակների տնտեսական, էկոլոգիական և սննդային ազդեցությունները:Սա հատկապես ճիշտ է բևեռային շրջաններում ապրող երկփեղկավորների համար, որտեղ CK-ի ազդեցությունն ավելի անմիջական և ծանր է [6, 7]:Փաստորեն, երկփեղկավորներ, ինչպիսիք են Mytilus spp.լայնորեն օգտագործվում են ծովային էկոհամակարգերի վրա CC-ի ազդեցության մոնիտորինգի համար:Զարմանալի չէ, որ համեմատաբար մեծ թվով բիոմարկերներ են մշակվել նրանց առողջությունը վերահսկելու համար՝ հաճախ օգտագործելով երկաստիճան մոտեցում, որը ներառում է ֆունկցիոնալ բիոմարկերներ՝ հիմնված ֆերմենտային ակտիվության կամ բջջային ֆունկցիաների վրա, ինչպիսիք են բջիջների կենսունակությունը և ֆագոցիտային ակտիվությունը [8]:Այս մեթոդները ներառում են նաև հատուկ ճնշման ցուցիչների կոնցենտրացիայի չափումը, որոնք կուտակվում են փափուկ հյուսվածքներում ծովի մեծ քանակությամբ ջրի կլանումից հետո:Այնուամենայնիվ, երկփեղկանների ֆիլտրման բարձր հզորությունը և կիսաբաց շրջանառության համակարգը հնարավորություն են տալիս զարգացնել նոր հեմոլիմֆի բիոմարկերներ՝ օգտագործելով հեղուկ բիոպսիայի (LB) հայեցակարգը, որը պարզ և նվազագույն ինվազիվ մոտեցում է հիվանդի կառավարման համար:արյան նմուշներ [9, 10]:Չնայած մարդու LB-ում կարելի է գտնել մի քանի տեսակի շրջանառվող մոլեկուլներ, այս հայեցակարգը հիմնականում հիմնված է պլազմայում շրջանառվող արտաբջջային ԴՆԹ-ի (ccfDNA) բեկորների ԴՆԹ-ի հաջորդականության վերլուծության վրա:Իրականում, մարդու պլազմայում շրջանառվող ԴՆԹ-ի առկայությունը հայտնի է 20-րդ դարի կեսերից [11], բայց միայն վերջին տարիներին է, որ բարձր թողունակության հաջորդականության մեթոդների հայտնվելը հանգեցրել է կլինիկական ախտորոշման՝ հիմնված ccfDNA-ի վրա:Այս շրջանառվող ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը մասամբ պայմանավորված է գենոմային ԴՆԹ-ի (միջուկային և միտոքոնդրիալ) պասիվ արտազատմամբ՝ բջջի մահից հետո: Առողջ անհատների մոտ ccfDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), բայց կարող է աճել 5-10 անգամ տարբեր պաթոլոգիաներով տառապող կամ սթրեսի ենթարկված հիվանդների մոտ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասմանը: Առողջ անհատների մոտ ccfDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), բայց կարող է աճել 5-10 անգամ տարբեր պաթոլոգիաներով տառապող կամ սթրեսի ենթարկված հիվանդների մոտ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասմանը: У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но може да повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводяврщенйнык. Առողջ մարդկանց մոտ cccDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), սակայն այն կարող է աճել 5-10 անգամ տարբեր պաթոլոգիաներով կամ սթրեսային վիճակում գտնվող հիվանդների մոտ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասմանը:在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 նգ/մԼ），但在患有各种病理或承在但在患有各种病理或承可加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 նգ/մլ） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 从而 组织。。。Կենտրոնացում ccfDNA обычно ниские (<10 нг/мл) у здоровых людей, но կարող է быть увеличены в 5-10 раз во пациентов со различными патологиями или սթրեսսոմ, ինչ կարող է ազդել այս հիվանդության հետ: ccfDNA-ի կոնցենտրացիաները սովորաբար ցածր են (<10 նգ/մլ) առողջ անհատների մոտ, սակայն տարբեր պաթոլոգիաներով կամ սթրեսով հիվանդների մոտ կարող են աճել 5-10 անգամ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասմանը:ccfDNA բեկորների չափերը շատ տարբեր են, բայց սովորաբար տատանվում են 150-ից 200 bp:[12]։Ինքնից ստացված ccfDNA-ի, այսինքն՝ ccfDNA-ի վերլուծությունը նորմալ կամ փոխակերպված հյուրընկալող բջիջներից, կարող է օգտագործվել միջուկային և/կամ միտոքոնդրիալ գենոմում առկա գենետիկական և էպիգենետիկ փոփոխությունները հայտնաբերելու համար՝ այդպիսով օգնելով բժիշկներին ընտրել հատուկ մոլեկուլային նպատակային բուժում [13]:Այնուամենայնիվ, ccfDNA-ն կարելի է ձեռք բերել օտարերկրյա աղբյուրներից, ինչպիսին է ccfDNA-ն հղիության ընթացքում պտղի բջիջներից կամ փոխպատվաստված օրգաններից [14,15,16,17]:ccfDNA-ն նաև տեղեկատվության կարևոր աղբյուր է վարակիչ նյութի (օտարերկրյա) նուկլեինաթթուների առկայության հայտնաբերման համար, որը թույլ է տալիս ոչ ինվազիվ հայտնաբերել արյան մշակույթներով չբացահայտված տարածված վարակները՝ խուսափելով վարակված հյուսվածքի ինվազիվ բիոպսիայից [18]:Վերջին ուսումնասիրությունները իսկապես ցույց են տվել, որ մարդու արյունը պարունակում է տեղեկատվության հարուստ աղբյուր, որը կարող է օգտագործվել վիրուսների և բակտերիաների պաթոգենները հայտնաբերելու համար, և որ մարդու պլազմայում հայտնաբերված ccfDNA-ի մոտ 1%-ը օտար ծագում ունի [19]:Այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ օրգանիզմի շրջանառվող միկրոբիոմի կենսաբազմազանությունը կարելի է գնահատել ccfDNA վերլուծության միջոցով:Այնուամենայնիվ, մինչև վերջերս այս հասկացությունն օգտագործվում էր բացառապես մարդկանց և ավելի փոքր չափով, այլ ողնաշարավորների մոտ [20, 21]:
Սույն հոդվածում մենք օգտագործում ենք LB պոտենցիալը Aulacomya atra-ի ccfDNA-ն վերլուծելու համար, որը հարավային տեսակ է, որը սովորաբար հանդիպում է ենթապանտարկտիկական Կերգուլեն կղզիներում, կղզիների խումբ մեծ սարահարթի վերևում, որը ձևավորվել է 35 միլիոն տարի առաջ:հրաբխային ժայթքում.Օգտագործելով in vitro փորձարարական համակարգը, մենք պարզեցինք, որ ծովի ջրում ԴՆԹ-ի բեկորները արագորեն կլանվում են միդիաների կողմից և մտնում են հեմոլիմֆի խցիկ:Որսորդական հրացանների հաջորդականությունը ցույց է տվել, որ միդիա հեմոլիմֆի ccfDNA-ն պարունակում է իր և ոչ սեփական ծագման ԴՆԹ-ի բեկորներ, ներառյալ սիմբիոտիկ բակտերիաներ և ԴՆԹ-ի բեկորներ բիոմներից, որոնք բնորոշ են սառը հրաբխային ծովային ծովային ափամերձ էկոհամակարգերին:Հեմոլիմֆի ccfDNA-ն պարունակում է նաև վիրուսային հաջորդականություններ՝ ստացված տարբեր հյուրընկալող միջակայքեր ունեցող վիրուսներից:Մենք նաև գտանք ԴՆԹ-ի բեկորներ բազմաբջիջ կենդանիներից, ինչպիսիք են ոսկրային ձկները, ծովային անեմոնները, ջրիմուռները և միջատները:Եզրափակելով, մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ LB հայեցակարգը կարող է հաջողությամբ կիրառվել ծովային անողնաշարավորների վրա՝ ծովային էկոհամակարգերում հարուստ գենոմային ռեպերտուար ստեղծելու համար:
Մեծահասակները (55-70 մմ երկարություն) Mytilus platensis (M. platensis) և Aulacomya atra (A. atra) հավաքվել են Պորտ-օ-Ֆրանսի միջմակընթացային ժայռոտ ափերից (049°21.235 S, 070°13.490 E .):Կերգուլեն կղզիները 2018 թվականի դեկտեմբերին: Այլ չափահաս կապույտ միդիաներ (Mytilus spp.) ստացվել են առևտրային մատակարարից (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Կանադա) և տեղադրվել են ջերմաստիճանի վերահսկվող (4°C) գազավորված բաքում, որը պարունակում է 10-20 լ 32‰ արհեստական ​​աղաջր:(արհեստական ​​ծովային աղ Reef Crystal, Instant Ocean, Վիրջինիա, ԱՄՆ):Յուրաքանչյուր փորձի համար չափվել է առանձին պատյանների երկարությունը և քաշը:
Այս ծրագրի համար անվճար բաց մուտքի արձանագրությունը հասանելի է առցանց (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1):Հակիրճ, LB հեմոլիմֆը հավաքվել է առևանգող մկաններից, ինչպես նկարագրված է [22]:Հեմոլիմֆը մաքրվել է ցենտրիֆուգմամբ 1200×g 3 րոպեում, իսկ վերին նյութը սառեցվել է (-20°C) մինչև օգտագործումը:CfDNA-ի մեկուսացման և մաքրման համար նմուշները (1,5-2,0 մլ) հալվել և մշակվել են NucleoSnap cfDNA հավաքածուի միջոցով (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA)՝ ըստ արտադրողի ցուցումների:ccfDNA-ն պահվել է -80°C-ում մինչև հետագա վերլուծությունը:Որոշ փորձերի ժամանակ ccfDNA-ն մեկուսացվել և մաքրվել է՝ օգտագործելով QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Տորոնտո, Օնտարիո, Կանադա):Մաքրված ԴՆԹ-ն քանակականացվել է ստանդարտ PicoGreen վերլուծության միջոցով:Մեկուսացված ccfDNA-ի բեկորների բաշխումը վերլուծվել է մազանոթային էլեկտրաֆորեզով՝ օգտագործելով Agilent 2100 բիոանալիզատոր (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)՝ օգտագործելով Բարձր զգայունության ԴՆԹ հավաքածու:Փորձարկումն իրականացվել է՝ օգտագործելով ccfDNA նմուշի 1 մկլ՝ ըստ արտադրողի ցուցումների:
Հեմոլիմֆի ccfDNA բեկորների հաջորդականացման համար Génome Québec-ը (Մոնրեալ, Քվեբեկ, Կանադա) պատրաստեց որսորդական հրացանների գրադարաններ՝ օգտագործելով Illumina MiSeq PE75 հավաքածուի Illumina DNA Mix հավաքածուն:Օգտագործվել է ստանդարտ ադապտեր (BioO):Հում տվյալների ֆայլերը հասանելի են NCBI Sequence Read Archive-ից (SRR8924808 և SRR8924809):Հիմնական ընթերցման որակը գնահատվել է FastQC-ի միջոցով [23]:Trimmomatic [24]-ն օգտագործվել է ադապտերների կտրման և վատ որակի ընթերցումների համար:Զուգակցված ծայրերով որսորդական հրացանների ընթերցումները FLASH-ը միաձուլվեցին ավելի երկար մեկ ընթերցումների մեջ՝ նվազագույն համընկնումը 20 բ/վ՝ անհամապատասխանություններից խուսափելու համար [25]: Միաձուլված ընթերցումները ծանոթագրվել են BLASTN-ով` օգտագործելով երկփեղկավոր NCBI Taxonomy տվյալների բազան (e արժեքը < 1e−3 և 90% հոմոլոգիա), և ցածր բարդության հաջորդականությունների քողարկումն իրականացվել է DUST-ի միջոցով [26]: Միաձուլված ընթերցումները ծանոթագրվել են BLASTN-ով` օգտագործելով երկփեղկավոր NCBI Taxonomy տվյալների բազան (e արժեքը < 1e−3 և 90% հոմոլոգիա), և ցածր բարդության հաջորդականությունների քողարկումն իրականացվել է DUST-ի միջոցով [26]: Объединенные чтения были антированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (նշանակություն e < 1e-3 եւ 90% բոլորովինկոստիկանություն), а маский. с использованием ՓՈՇԻՆ [26]: Համախմբված ընթերցումները ծանոթագրվել են BLASTN-ով` օգտագործելով NCBI երկփեղկանի տաքսոնոմիայի տվյալների բազան (e արժեքը < 1e-3 և 90% հոմոլոգիա), և ցածր բարդության հաջորդականության քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]:使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并囄读数 注释合并囄读数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 用 用 俨释 合并 读数]复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩 ​​攽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были антированы со помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (նշանակություն է <1e-3 և 90% մատնանշում է NCBI), полнено с использованиеем DUST [26]. Համախմբված ընթերցումները ծանոթագրվել են BLASTN-ով` օգտագործելով NCBI երկփեղկանի տաքսոնոմիկ տվյալների բազան (e արժեքը <1e-3 և 90% հոմոլոգիա), և ցածր բարդության հաջորդականության քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]:Ընթերցվածները բաժանվեցին երկու խմբի՝ կապված երկփեղկանի հաջորդականությունների հետ (այստեղ կոչվում են ինքնաընթերցումներ) և անկապ (ոչ ինքնաընթերցումներ)։Երկու խումբ առանձին-առանձին հավաքվել են՝ օգտագործելով MEGAHIT՝ կոնտիգեր ստեղծելու համար [27]:Միևնույն ժամանակ, այլմոլորակային միկրոբիոմի ընթերցումների տաքսոնոմիական բաշխումը դասակարգվել է Kraken2-ի միջոցով [28] և գրաֆիկորեն ներկայացված է Գալակտիկայի վրա Krona կարկանդակ գծապատկերով [29, 30]:Օպտիմալ կմերը որոշվել է մեր նախնական փորձերից՝ kmers-59: Այնուհետև ինքնորոշվել են BLASTN-ի (երկփեղկ NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա) համապատասխանեցմամբ՝ վերջնական անոտացիայի համար: Այնուհետև ինքնորոշվել են BLASTN-ի (երկփեղկ NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա) համապատասխանեցմամբ՝ վերջնական անոտացիայի համար: Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (հիմնական տվյալների հիման վրա ստեղծված NCBI, նշանակության e <1e-10 եւ գոմոլոգիա 60%) համար окончательной. Այնուհետև բացահայտվել են ինքնակարգավորումները՝ համապատասխանեցնելով BLASTN-ին (NCBI երկփեղկանի տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% հոմոոլոգիա)՝ վերջնական անոտացիայի համար:然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识襫别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN-ի տվյալների համաձայն NCBI-ի համար նախատեսված կոնտիգիները՝ նկատի ունենալով BLASTN-ը (բազա տվյալների NCBI-ի համար նախատեսված մոլլյուսկով, նշանակություն է <1e-10 եւ 6%): Այնուհետև վերջնական ծանոթագրության համար հայտնաբերվեցին ինքնակարգավորվող նշանները՝ համապատասխանեցնելով BLASTN-ին (NCBI երկփեղկանի տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% հոմոլոգիա): Զուգահեռաբար, ոչ ինքնախմբային կոնտիգները ծանոթագրվեցին BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեքը < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա): Զուգահեռաբար, ոչ ինքնախմբային կոնտիգները ծանոթագրվեցին BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեքը < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա): Parallelьno чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (հիմնական տվյալների nt NCBI, նշանակության e <1e-10 եւ гломология 60%): Զուգահեռաբար, օտար խմբերի կոնտիգները ծանոթագրվեցին BLASTN-ով (NT NCBI տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% հոմոոլոգիա):平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Parallelьno contigi, не относящиеся к собственной խմբпе, были аннотированы с помощью BLASTN (բազա տվյալների nt NCBI, նշանակություն e <1e-10 եւ գոմոլոգիա 60%): Զուգահեռաբար, BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% հոմոլոգիա) ծանոթագրվեցին ոչ ինքնախմբային կոնտիգները: BLASTX-ն անցկացվել է նաև ոչ ինքնակառավարման կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq սպիտակուցի NCBI տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա): BLASTX-ն անցկացվել է նաև ոչ ինքնակառավարման կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq սպիտակուցի NCBI տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e−10 և 60% հոմոլոգիա): BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr եւ RefSeq NCBI (նշանակություն e <1e-10 եւ омология 60%)։ BLASTX-ը նաև իրականացվել է ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq NCBI սպիտակուցային տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e-10 և 60% հոմոոլոգիա):还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ィ怼怼性性ﺓ和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ィ怼怼性性ﺓ和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr եւ RefSeq NCBI (նշանակություն e <1e-10 եւ омология 60%): BLASTX-ը նաև իրականացվել է ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq NCBI սպիտակուցային տվյալների բազաները (e արժեքը <1e-10 և 60% հոմոոլոգիա):BLASTN-ի և BLASTX-ի ոչ-ինքնուրույն կոնտիգների լողավազանները ներկայացնում են վերջնական կոնտիգերը (տես Լրացուցիչ ֆայլ):
PCR-ի համար օգտագործվող պրայմերները թվարկված են Աղյուսակ S1-ում:Taq ԴՆԹ պոլիմերազը (Bio Basic Canada, Markham, ON) օգտագործվել է ccfDNA թիրախային գեների ուժեղացման համար:Օգտագործվել են ռեակցիայի հետևյալ պայմանները՝ դենատուրացիա 95°C-ում 3 րոպե, 95°C՝ 1 րոպե, սահմանված եռացման ջերմաստիճանը 1 րոպե, երկարացում 72°C-ում 1 րոպե, 35 ցիկլ և վերջապես 72°C 10 րոպեի ընթացքում։.ՊՇՌ արտադրանքներն առանձնացվել են էլեկտրոֆորեզով ագարոզայի գելերում (1,5%), որոնք պարունակում են SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Կանադա) 95 Վ-ում:
Միդիաները (Mytilus spp.) ընտելացվեցին 500 մլ թթվածինացված ծովի ջրում (32 PSU) 24 ժամ 4°C-ում:Պլազմիդ ԴՆԹ-ն, որը պարունակում է մարդու գալեկտին-7 cDNA-ի հաջորդականությունը կոդավորող ներդիր (NCBI մուտքային համարը L07769) ավելացվել է սրվակի մեջ 190 μg/μl վերջնական կոնցենտրացիայով:Առանց ԴՆԹ-ի ավելացման նույն պայմաններում ինկուբացված միդիաները հսկիչ էին:Երրորդ հսկիչ տանկը պարունակում էր ԴՆԹ առանց միդիաների:Ծովի ջրում ԴՆԹ-ի որակը վերահսկելու համար նշված ժամին յուրաքանչյուր տանկից վերցվել են ծովի ջրի նմուշներ (20 մկլ; երեք կրկնություն):Պլազմիդային ԴՆԹ-ի հետագծելիության համար LB միդիաները հավաքվել են նշված ժամանակներում և վերլուծվել qPCR-ով և ddPCR-ով:Ծովային ջրի բարձր աղի պարունակության պատճառով մասնաբաժինները նոսրացվել են PCR որակի ջրի մեջ (1:10) մինչև բոլոր PCR վերլուծությունները:
Թվային կաթիլային PCR (ddPCR) կատարվել է BioRad QX200 արձանագրության միջոցով (Միսսաուգա, Օնտարիո, Կանադա):Օպտիմալ ջերմաստիճանը որոշելու համար օգտագործեք ջերմաստիճանի պրոֆիլը (Աղյուսակ S1):Կաթիլները ստեղծվել են QX200 կաթիլների գեներատորի միջոցով (BioRad):ddPCR-ն իրականացվել է հետևյալ կերպ՝ 95°C 5 րոպե, 50 ցիկլ 95°C 30 վրկ և տրված եռացման ջերմաստիճան 1 րոպե և 72°C 30 վրկ, 4°C 5 րոպե և 90°C 5 րոպեի ընթացքում:Կաթիլների քանակը և դրական ռեակցիաները (պատճենների քանակը/µl) չափվել են QX200 կաթիլային ընթերցողի միջոցով (BioRad):10000-ից պակաս կաթիլներով նմուշները մերժվել են:Կաղապարի կառավարումը չի իրականացվել ամեն անգամ, երբ ddPCR-ն գործարկվել է:
qPCR-ն իրականացվել է Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Սիդնեյ, Ավստրալիա) և LGALS7 հատուկ պրայմերների միջոցով:Բոլոր քանակական PCR-ները կատարվել են 20 մկլ-ում՝ օգտագործելով QuantiFast SYBR Green PCR փաթեթը (QIAGEN):qPCR-ն սկսվել է 15 րոպե ինկուբացիայից 95°C-ում, որին հաջորդել են 40 ցիկլեր 95°C-ում 10 վայրկյան և 60°C ջերմաստիճանում 60 վայրկյան՝ մեկ տվյալների հավաքագրմամբ:Հալման կորերը ստեղծվել են՝ օգտագործելով հաջորդական չափումներ 95°C ջերմաստիճանում 5 վրկ, 65°C՝ 60 վրկ և 97°C՝ qPCR-ի վերջում:Յուրաքանչյուր qPCR կատարվել է եռակի, բացառությամբ հսկիչ նմուշների:
Քանի որ միդիաները հայտնի են իրենց ֆիլտրման բարձր արագությամբ, մենք նախ ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք նրանք կարող են զտել և պահպանել ծովի ջրում առկա ԴՆԹ-ի բեկորները:Մեզ հետաքրքրում էր նաև, թե արդյոք այդ բեկորները կուտակվում են իրենց կիսաբաց ավշային համակարգում։Մենք լուծեցինք այս հարցը փորձարարական ճանապարհով՝ հետագծելով կապույտ միդիա տանկերին ավելացված լուծվող ԴՆԹ-ի բեկորների ճակատագիրը:ԴՆԹ-ի բեկորների հետագծումը հեշտացնելու համար մենք օգտագործեցինք օտար (ոչ ինքնուրույն) պլազմիդային ԴՆԹ, որը պարունակում է մարդու գալեկտին-7 գենը:ddPCR-ն հայտնաբերում է պլազմիդի ԴՆԹ-ի բեկորները ծովի ջրում և միդիաներում:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ եթե ծովի ջրում ԴՆԹ-ի բեկորների քանակը մնաց համեմատաբար հաստատուն ժամանակի ընթացքում (մինչև 7 օր) միդիաների բացակայության դեպքում, ապա միդիաների առկայության դեպքում այդ մակարդակը գրեթե ամբողջությամբ անհետացավ 8 ժամվա ընթացքում (նկ. 1ա,բ):Էկզոգեն ԴՆԹ-ի բեկորները հեշտությամբ հայտնաբերվեցին 15 րոպեի ընթացքում ներփականային հեղուկում և հեմոլիմֆում (նկ. 1c):Այս բեկորները դեռևս կարող են հայտնաբերվել բացահայտումից մինչև 4 ժամ հետո:Այս զտիչ ակտիվությունը ԴՆԹ-ի բեկորների նկատմամբ համեմատելի է բակտերիաների և ջրիմուռների զտման ակտիվության հետ [31]:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ միդիաները կարող են զտել և կուտակել օտար ԴՆԹ իրենց հեղուկ բաժանմունքներում:
Պլազմիդային ԴՆԹ-ի հարաբերական կոնցենտրացիաները ծովի ջրում միդիաների (A) կամ բացակայության (B) առկայության դեպքում, չափված ddPCR-ով:A-ում արդյունքներն արտահայտվում են տոկոսներով, իսկ վանդակների եզրագծերը ներկայացնում են 75-րդ և 25-րդ տոկոսները:Տեղադրված լոգարիթմական կորը ցուցադրվում է կարմիրով, իսկ մոխրագույնով ստվերված տարածքը ներկայացնում է 95% վստահության միջակայքը:B-ում կարմիր գիծը ներկայացնում է միջինը, իսկ կապույտ գիծը ներկայացնում է կոնցենտրացիայի համար վստահության 95% միջակայքը:C Պլազմիդային ԴՆԹ-ի կուտակում միդիաների հեմոլիմֆում և փականային հեղուկում պլազմիդային ԴՆԹ-ի ավելացումից հետո տարբեր ժամանակներում:Արդյունքները ներկայացված են որպես հայտնաբերված բացարձակ պատճեններ/մլ (±SE):
Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք ccfDNA-ի ծագումը միդիաներում, որոնք հավաքվել էին Կերգուլեն կղզիների միդիաների մահճակալներից, որը կղզիների հեռավոր խումբ է, որն ունի սահմանափակ մարդածին ազդեցություն:Այդ նպատակով միդիաների հեմոլիմֆներից cccDNA-ն մեկուսացվել և մաքրվել է մարդկային cccDNA-ի մաքրման համար սովորաբար օգտագործվող մեթոդներով [32, 33]:Մենք պարզեցինք, որ միդիաներում հեմոլիմֆի ccfDNA-ի միջին կոնցենտրացիաները ցածր միկրոգրամների մեկ մլ հեմոլիմֆի միջակայքում են (տես Աղյուսակ S2, Լրացուցիչ տեղեկություններ):Կոնցենտրացիաների այս միջակայքը շատ ավելի մեծ է, քան առողջ մարդկանց մոտ (ցածր նանոգրամներ մեկ միլիլիտրում), սակայն հազվադեպ դեպքերում, քաղցկեղով հիվանդների մոտ, ccfDNA-ի մակարդակը կարող է հասնել մի քանի միկրոգրամի մեկ միլիլիտրում [34, 35]:Հեմոլիմֆի ccfDNA-ի չափերի բաշխման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ այդ բեկորները մեծապես տարբերվում են չափերով՝ տատանվում են 1000 bp-ից մինչև 1000 bp:մինչև 5000 bp (նկ. 2):Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել՝ օգտագործելով սիլիցիումի վրա հիմնված QIAamp Investigator Kit, մեթոդ, որը սովորաբար օգտագործվում է դատաբժշկական գիտության մեջ՝ արագորեն մեկուսացնելու և մաքրելու գենոմային ԴՆԹ-ն ցածր կոնցենտրացիայի ԴՆԹ նմուշներից, ներառյալ ccfDNA [36]:
Միդիա հեմոլիմֆի ներկայացուցչական ccfDNA էլեկտրոֆորեգրամ:Արդյունահանվել է NucleoSnap Plasma Kit-ով (վերևում) և QIAamp DNA Investigator Kit-ով:B Ջութակի գծապատկեր, որը ցույց է տալիս հեմոլիմֆի ccfDNA կոնցենտրացիաների բաշխումը (±SE) միդիաներում:Սև և կարմիր գծերը ներկայացնում են համապատասխանաբար միջին և առաջին և երրորդ քառորդները:
Մարդկանց և պրիմատների մոտ ccfDNA-ի մոտ 1%-ն ունի օտար աղբյուր [21, 37]:Հաշվի առնելով երկփեղկների կիսաբաց շրջանառության համակարգը, մանրէներով հարուստ ծովային ջուրը և միդիա ccfDNA-ի չափերի բաշխումը, մենք ենթադրեցինք, որ միդիա հեմոլիմֆի ccfDNA-ն կարող է պարունակել մանրէաբանական ԴՆԹ-ի հարուստ և բազմազան լողավազան:Այս վարկածը ստուգելու համար մենք հաջորդականացրել ենք Հեմոլիմֆի ccfDNA-ն Aulacomya atra-ի նմուշներից, որոնք հավաքվել են Կերգուլեն կղզիներից, որոնք տվել են ավելի քան 10 միլիոն ընթերցումներ, որոնց 97,6%-ն անցել է որակի հսկողություն:Ընթերցումները այնուհետև դասակարգվեցին՝ ըստ սեփական և ոչ ինքնակառավարման աղբյուրների՝ օգտագործելով BLASTN և NCBI երկփեղկանի տվյալների բազաները (նկ. S1, Լրացուցիչ տեղեկատվություն):
Մարդկանց մոտ և՛ միջուկային, և՛ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն կարող է արձակվել արյան մեջ [38]:Այնուամենայնիվ, ներկա ուսումնասիրության մեջ հնարավոր չէր մանրամասն նկարագրել միդիաների միջուկային գենոմային ԴՆԹ-ն, հաշվի առնելով, որ A. atra գենոմը հաջորդականացված կամ նկարագրված չէ:Այնուամենայնիվ, մենք կարողացանք բացահայտել մեր սեփական ծագման մի շարք ccfDNA բեկորներ՝ օգտագործելով երկփեղկանի գրադարանը (նկ. S2, Լրացուցիչ տեղեկություններ):Մենք նաև հաստատել ենք մեր իսկ ծագման ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը A. atra գեների ուղղորդված PCR ամպլիֆիկացմամբ, որոնք հաջորդականացվել են (նկ. 3):Նմանապես, հաշվի առնելով, որ A. atra-ի միտոքոնդրիալ գենոմը հասանելի է հանրային տվյալների շտեմարաններում, կարելի է ապացույցներ գտնել A. atra-ի հեմոլիմֆում միտոքոնդրիալ ccfDNA բեկորների առկայության մասին:Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը հաստատվել է ՊՇՌ ամպլիֆիկացմամբ (նկ. 3):
Տարբեր միտոքոնդրիալ գեներ առկա էին A. atra-ի հեմոլիմֆում (կարմիր կետեր – ֆոնդային համարը՝ SRX5705969) և M. platensis (կապույտ կետեր – պահեստային համարը՝ SRX5705968) ուժեղացված PCR-ով:Նկար՝ հարմարեցված Breton et al.-ից, 2011թ. B Հեմոլիմֆի գերնատանտի ուժեղացում A. atra-ից Պահված FTA թղթի վրա:Օգտագործեք 3 մմ դակիչ՝ ուղղակիորեն PCR խողովակին, որը պարունակում է PCR խառնուրդ:
Հաշվի առնելով ծովի ջրում մանրէների առատ պարունակությունը՝ սկզբում մենք կենտրոնացել ենք հեմոլիմֆում մանրէաբանական ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների բնութագրման վրա:Դա անելու համար մենք օգտագործում ենք երկու տարբեր ռազմավարություններ:Առաջին ռազմավարությունը օգտագործել է Kraken2՝ ալգորիթմի վրա հիմնված հաջորդականության դասակարգման ծրագիր, որը կարող է նույնականացնել մանրէաբանական հաջորդականությունները BLAST-ի և այլ գործիքների հետ համեմատելի ճշգրտությամբ [28]:Պարզվել է, որ ավելի քան 6719 ընթերցումներ բակտերիալ ծագում ունեն, մինչդեռ 124-ը և 64-ը համապատասխանաբար արխեաներից և վիրուսներից են (նկ. 4):Բակտերիաների ԴՆԹ-ի ամենաշատ բեկորները եղել են Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) և Bacteroidetes (17%) (նկ. 4ա):Այս բաշխումը համապատասխանում է ծովային կապույտ միդիա միկրոբիոմի նախորդ ուսումնասիրություններին [39, 40]:Գամապրոտեոբակտերիաները պրոտեոբակտերիաների հիմնական դասն էին (44%), ներառյալ բազմաթիվ վիբրիոնալներ (նկ. 4b):ddPCR մեթոդը հաստատեց Vibrio ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը A. atra hemolymph-ի ccfDNA-ում (նկ. 4c) [41]:ccfDNA-ի բակտերիալ ծագման մասին լրացուցիչ տեղեկություններ ստանալու համար ձեռնարկվել է լրացուցիչ մոտեցում (նկ. S2, Լրացուցիչ տեղեկություններ): Այս դեպքում, ընթերցումները, որոնք համընկնում են, հավաքվել են որպես զույգ ծայրային ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես ինքնուրույն (երկփական) կամ ոչ ինքնուրույն ծագման՝ օգտագործելով BLASTN-ը և e արժեքը 1e−3 և ավելի քան 90% հոմոոլոգիա ունեցող կտրվածք: Այս դեպքում, ընթերցումները, որոնք համընկնում են, հավաքվել են որպես զույգ ծայրային ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես ինքնուրույն (երկփական) կամ ոչ ինքնուրույն ծագման՝ օգտագործելով BLASTN-ը և e արժեքը 1e−3 և ավելի քան 90% հոմոոլոգիա ունեցող կտրվածք: В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) կամ чужие по происхольждени. отсечения с гомологией> 90%. Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքվել են որպես զույգ ավարտված ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես բնիկ (երկփական) կամ ոչ օրիգինալ՝ օգտագործելով BLASTN-ը և e արժեքը 1e-3 և կտրվածքը՝ >90% հոմոոլոգիայով:在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和歄怺怺怐皒e 倢%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 使1-e3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。... В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворые моллюски) կամ несобственные по происхольждени. рога омологии> 90%. Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքվել են որպես զույգ ավարտված ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես սեփական (երկփականներ) կամ ոչ օրիգինալ՝ օգտագործելով e BLASTN և 1e-3 արժեքները և հոմոոլոգիայի շեմը >90%:Քանի որ A. atra գենոմը դեռևս հաջորդականացված չէ, մենք օգտագործեցինք MEGAHIT Հաջորդ սերնդի հաջորդականության (NGS) հավաքման դե նոր ռազմավարությունը:Ընդհանուր առմամբ 147,188 կոնտիգ հայտնաբերվել է որպես ծագման կախյալ (երկփեղկիներ):Այնուհետև այս կոնտիգները պայթեցին 1e-10 էլեկտրոնային արժեքներով՝ օգտագործելով BLASTN և BLASTX:Այս ռազմավարությունը թույլ տվեց մեզ բացահայտել 482 ոչ երկփեղկ բեկորներ, որոնք առկա են A. atra ccfDNA-ում:Այս ԴՆԹ-ի բեկորների կեսից ավելին (57%) ստացվել է բակտերիայից, հիմնականում՝ մաղձի սիմբիոններից, այդ թվում՝ սուլֆոտրոֆիկ սիմբիոններից և Solemya velum մաղձի սիմբիոններից (նկ. 5):
Հարաբերական առատություն տիպի մակարդակում:B Երկու հիմնական ֆիլերի (Ֆիրմիկյուտների և Պրոտեոբակտերիաների) մանրէաբանական բազմազանություն:ddPCR C Vibrio spp-ի ներկայացուցչական ուժեղացում:A. 16S rRNA գենի բեկորներ (կապույտ) երեք atra հեմոլիմֆներում:
Ընդհանուր առմամբ վերլուծվել է 482 հավաքված կոնտիգ:Մետագենոմիկ կոնտիգի անոտացիաների (պրոկարիոտներ և էուկարիոտներ) տաքսոնոմիկ բաշխման ընդհանուր բնութագիրը:B ԲԱԿՏԵՐԱՅԻՆ ԴՆԹ-ի բեկորների մանրամասն բաշխումը BLASTN-ի և BLASTX-ի կողմից:
Kraken2 վերլուծությունը ցույց է տվել նաև, որ միդիա ccfDNA-ն պարունակում է արխեային ԴՆԹ-ի բեկորներ, ներառյալ Euryarchaeota-ի (65%), Crenarchaeota-ի (24%) և Thaurmarcheota-ի (11%) ԴՆԹ-ի բեկորներ (նկ. 6ա):Euryarchaeota-ից և Crenarchaeota-ից ստացված ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը, որոնք նախկինում հայտնաբերվել են Կալիֆորնիայի միդիաների մանրէաբանական համայնքում, չպետք է զարմանա [42]:Չնայած Euryarchaeota-ն հաճախ կապված է ծայրահեղ պայմանների հետ, այժմ հայտնի է, որ և Euryarchaeota-ն և Crenarcheota-ն ծովային կրիոգեն միջավայրում ամենատարածված պրոկարիոտներից են [43, 44]:Մեթանոգեն միկրոօրգանիզմների առկայությունը միդիաներում զարմանալի չէ՝ հաշվի առնելով Կերգուլեն սարահարթի ներքևի արտահոսքերից մեթանի լայնածավալ արտահոսքի վերջին հաղորդումները և Կերգուլեն կղզիների ափերի մոտ նկատված մեթանի մանրէաբանական հնարավոր արտադրությունը [46]:
Մեր ուշադրությունն այնուհետև անցավ ԴՆԹ վիրուսների ընթերցումների վրա:Մեր գիտելիքներով սա միդիաների վիրուսի պարունակության առաջին ոչ նպատակային ուսումնասիրությունն է:Ինչպես և սպասվում էր, մենք գտանք բակտերիոֆագների (Caudovirales) ԴՆԹ-ի բեկորներ (նկ. 6b):Այնուամենայնիվ, ամենատարածված վիրուսային ԴՆԹ-ն գալիս է նուկլեոցիտովիրուսների մի շարքից, որը նաև հայտնի է որպես միջուկային ցիտոպլազմային մեծ ԴՆԹ վիրուս (NCLDV), որն ունի ցանկացած վիրուսի ամենամեծ գենոմը:Այս խմբում ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների մեծ մասը պատկանում է Mimimidoviridae (58%) և Poxviridae (21%) ընտանիքներին, որոնց բնական հյուրընկալողներն են ողնաշարավորները և հոդվածոտանիները, մինչդեռ այս ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների մի փոքր մասը պատկանում է հայտնի վիրուսաբանական ջրիմուռներին:Վարակում է ծովային էուկարիոտային ջրիմուռները։Հերթականությունները նաև ստացվել են Պանդորայի վիրուսից՝ հսկա վիրուսից, որն ունի ամենամեծ գենոմի չափը բոլոր հայտնի վիրուսային սեռերից:Հետաքրքիր է, որ վիրուսով վարակված հյուրընկալողների շրջանակը, ինչպես որոշվել է հեմոլիմֆի ccfDNA-ի հաջորդականությամբ, համեմատաբար մեծ էր (Նկար S3, Լրացուցիչ տեղեկություններ):Այն ներառում է վիրուսներ, որոնք վարակում են միջատներին, ինչպիսիք են Baculoviridae-ն և Iridoviridae-ն, ինչպես նաև վիրուսներ, որոնք վարակում են ամեոբային, ջրիմուռներին և ողնաշարավորներին:Մենք նաև գտել ենք Pithovirus sibericum գենոմին համապատասխանող հաջորդականություններ:Պիտովիրուսները (նաև հայտնի են որպես «զոմբի վիրուսներ») առաջին անգամ մեկուսացվել են Սիբիրում 30,000 տարեկան մշտական ​​սառցակալումից [47]:Այսպիսով, մեր արդյունքները համահունչ են նախորդ զեկույցներին, որոնք ցույց են տալիս, որ այս վիրուսների ոչ բոլոր ժամանակակից տեսակներն են անհետացել [48], և որ այդ վիրուսները կարող են առկա լինել հեռավոր ենթաբարկտիկական ծովային էկոհամակարգերում:
Ի վերջո, մենք փորձարկեցինք՝ պարզելու, թե արդյոք կարող ենք գտնել այլ բազմաբջիջ կենդանիների ԴՆԹ-ի բեկորներ:BLASTN-ի և BLASTX-ի կողմից բացահայտվել է 482 օտարերկրյա կոնտիգ՝ nt, nr և RefSeq գրադարաններով (գենոմային և սպիտակուցային):Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ բազմաբջիջ կենդանիների ccfDNA-ի օտար բեկորների մեջ գերակշռում է ոսկրային ոսկորների ԴՆԹ-ն (նկ. 5):Հայտնաբերվել են նաև միջատների և այլ տեսակների ԴՆԹ-ի բեկորներ։ԴՆԹ-ի բեկորների համեմատաբար մեծ մասը չի հայտնաբերվել, հնարավոր է, որ գենոմային տվյալների բազաներում մեծ թվով ծովային տեսակների թերներկայացումն է ցամաքային տեսակների համեմատ [49]:
Սույն հոդվածում մենք կիրառում ենք LB հայեցակարգը միդիաների նկատմամբ՝ պնդելով, որ հեմոլիմֆի ccfDNA կրակոցների հաջորդականությունը կարող է պատկերացում կազմել ծովային ափամերձ էկոհամակարգերի կազմի մասին:Մասնավորապես, մենք պարզեցինք, որ 1) միդիաների հեմոլիմֆը պարունակում է համեմատաբար բարձր կոնցենտրացիաներ (միկրոգրամի մակարդակ) համեմատաբար մեծ (~1-5 կբ) շրջանառվող ԴՆԹ-ի բեկորների.2) ԴՆԹ-ի այս բեկորները և՛ անկախ են, և՛ ոչ անկախ։4) Հեմոլիմֆում այս օտարերկրյա ccfDNA բեկորների կուտակումը տեղի է ունենում արագ և նպաստում է միդիաների ներքին զտման ակտիվությանը:Եզրափակելով, մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ LB հասկացությունը, որը մինչ այժմ կիրառվել է հիմնականում կենսաբժշկության ոլորտում, կոդավորում է հարուստ, բայց չուսումնասիրված գիտելիքների աղբյուր, որը կարող է օգտագործվել ավելի լավ հասկանալու պահապան տեսակների և նրանց շրջակա միջավայրի փոխազդեցությունը:
Բացի պրիմատներից, ccfDNA-ի մեկուսացումը գրանցվել է կաթնասունների, այդ թվում՝ մկների, շների, կատուների և ձիերի մոտ [50, 51, 52]:Այնուամենայնիվ, մեր տեղեկություններով, մեր ուսումնասիրությունն առաջինն է, որը հայտնում է ccfDNA-ի հայտնաբերման և հաջորդականության մասին բաց շրջանառության համակարգով ծովային տեսակների մեջ:Միդիաների այս անատոմիական առանձնահատկությունը և զտելու ունակությունը կարող են, գոնե մասամբ, բացատրել շրջանառվող ԴՆԹ-ի բեկորների տարբեր չափերի բնութագրերը՝ համեմատած այլ տեսակների:Մարդկանց մոտ արյան մեջ շրջանառվող ԴՆԹ բեկորների մեծ մասը փոքր բեկորներ են, որոնց չափերը տատանվում են 150-ից մինչև 200 bp:առավելագույն գագաթնակետով 167 bp [34, 53]:ԴՆԹ-ի բեկորների մի փոքր, բայց զգալի մասը ունի 300-ից 500 bp չափս, իսկ մոտ 5%-ը ավելի երկար է, քան 900 bp:[54]։Այս չափի բաշխման պատճառն այն է, որ ccfDNA-ի հիմնական աղբյուրը պլազմայում առաջանում է բջիջների մահվան հետևանքով կամ բջիջների մահվան կամ առողջ մարդկանց մոտ շրջանառվող արյունաստեղծ բջիջների նեկրոզից կամ քաղցկեղով հիվանդների մոտ ուռուցքային բջիջների ապոպտոզի պատճառով (հայտնի է որպես շրջանառվող ուռուցքային ԴՆԹ):, ctDNA):Հեմոլիմֆի ccfDNA-ի չափերի բաշխումը, որը մենք հայտնաբերեցինք միդիաներում, տատանվում էր 1000-ից մինչև 5000 bp, ինչը ենթադրում է, որ միդիա ccfDNA-ն այլ ծագում ունի:Սա տրամաբանական վարկած է, քանի որ միդիաներն ունեն կիսաբաց անոթային համակարգ և ապրում են ծովային ջրային միջավայրերում, որոնք պարունակում են մանրէաբանական գենոմային ԴՆԹ-ի բարձր կոնցենտրացիաներ:Փաստորեն, էկզոգեն ԴՆԹ-ի օգտագործմամբ մեր լաբորատոր փորձերը ցույց են տվել, որ միդիները ԴՆԹ-ի բեկորները կուտակում են ծովի ջրում, առնվազն մի քանի ժամ հետո դրանք քայքայվում են բջջային կլանումից հետո և/կամ ազատվում և/կամ պահվում տարբեր կազմակերպություններում:Հաշվի առնելով բջիջների հազվադեպությունը (ինչպես պրոկարիոտ, այնպես էլ էուկարիոտ), ներփականային բաժանմունքների օգտագործումը կնվազեցնի ccfDNA-ի քանակությունը սեփական աղբյուրներից, ինչպես նաև օտար աղբյուրներից:Հաշվի առնելով երկփեղկանի բնածին անձեռնմխելիության և շրջանառվող ֆագոցիտների մեծ քանակի կարևորությունը, մենք հետագայում ենթադրեցինք, որ նույնիսկ օտար ccfDNA-ն հարստացված է շրջանառվող ֆագոցիտներով, որոնք օտար ԴՆԹ են կուտակում միկրոօրգանիզմների և/կամ բջջային բեկորների ընդունումից հետո:Միասին մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ երկփեղկանի հեմոլիմֆ ccfDNA-ն մոլեկուլային տեղեկատվության եզակի պահեստ է և ամրացնում է նրանց՝ որպես պահապան տեսակի կարգավիճակը:
Մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ բակտերիայից ստացված հեմոլիմֆի ccfDNA բեկորների հաջորդականությունը և վերլուծությունը կարող են հիմնական տեղեկատվություն տրամադրել հյուրընկալող բակտերիալ ֆլորայի և շրջակա ծովային էկոհամակարգում առկա բակտերիաների մասին:Նկարահանումների հաջորդականության տեխնիկան հայտնաբերել է համընդհանուր բակտերիաների A. atra gill հաջորդականություններ, որոնք բաց կթողնեին, եթե օգտագործվեին 16S rRNA նույնականացման սովորական մեթոդները, մասամբ՝ հղումային գրադարանի կողմնակալության պատճառով:Իրականում, մեր կողմից M. platensis-ից հավաքագրված LB տվյալների օգտագործումը միդիաների նույն շերտում Քերգելենում ցույց տվեց, որ մաղձի հետ կապված բակտերիալ սիմբիոնների կազմը նույնն էր միդիաների երկու տեսակների համար (նկ. S4, Լրացուցիչ տեղեկություններ):Երկու գենետիկորեն տարբեր միդիների այս նմանությունը կարող է արտացոլել բակտերիալ համայնքների կազմը Կերգելենի սառը, ծծմբային և հրաբխային հանքավայրերում [55, 56, 57, 58]:Ծծումբը նվազեցնող միկրոօրգանիզմների ավելի բարձր մակարդակները լավ նկարագրված են, երբ միդիաները հավաքում են կենսատուրբացված ափամերձ տարածքներից [59], ինչպիսին է Պորտ-օ-Ֆրանսի ափերը:Մեկ այլ հավանականություն այն է, որ միդիաների համակցված ֆլորան կարող է ազդվել հորիզոնական փոխանցման հետևանքով [60, 61]:Ավելի շատ հետազոտություններ են անհրաժեշտ՝ ծովային միջավայրի, ծովի հատակի մակերեսի և միդիաների մեջ սիմբիոտիկ բակտերիաների բաղադրության միջև կապը որոշելու համար:Այս ուսումնասիրությունները ներկայումս շարունակվում են:
Հեմոլիմֆի ccfDNA-ի երկարությունը և կոնցենտրացիան, մաքրման հեշտությունը և բարձր որակը, որը թույլ է տալիս որսորդական հրացանի արագ հաջորդականությունը, միդիա ccfDNA-ի օգտագործման բազմաթիվ առավելություններից են ծովային ափամերձ էկոհամակարգերում կենսաբազմազանությունը գնահատելու համար:Այս մոտեցումը հատկապես արդյունավետ է տվյալ էկոհամակարգում վիրուսային համայնքների (վիրոմների) բնութագրման համար [62, 63]:Ի տարբերություն բակտերիաների, արխեաների և էուկարիոտների, վիրուսային գենոմները չեն պարունակում ֆիլոգենետիկորեն պահպանված գեներ, ինչպիսիք են 16S հաջորդականությունը:Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ հեղուկ բիոպսիաները ցուցիչ տեսակներից, ինչպիսիք են միդիները, կարող են օգտագործվել համեմատաբար մեծ թվով ccfDNA վիրուսի բեկորներ հայտնաբերելու համար, որոնք հայտնի են, որ վարակում են տանտերերին, որոնք սովորաբար բնակվում են ափամերձ ծովային էկոհամակարգերում:Սա ներառում է վիրուսներ, որոնք հայտնի են, որ վարակում են նախակենդանիներին, հոդվածոտանիներին, միջատներին, բույսերին և բակտերիալ վիրուսներին (օրինակ՝ բակտերիոֆագներին):Նմանատիպ բաշխում հայտնաբերվեց, երբ մենք ուսումնասիրեցինք կապույտ միդիաների (M. platensis) հեմոլիմֆի ccfDNA վիրուսը, որը հավաքված էր նույն միդիա շերտում Քերգելենում (Աղյուսակ S2, Լրացուցիչ տեղեկություններ):ccfDNA-ի որսորդական հրացանների հաջորդականությունը իսկապես նոր մոտեցում է, որը թափ է հավաքում մարդկանց կամ այլ տեսակների վիրուսների ուսումնասիրության մեջ [21, 37, 64]:Այս մոտեցումը հատկապես օգտակար է երկշղթա ԴՆԹ վիրուսների ուսումնասիրության համար, քանի որ ոչ մի գեն պահպանված չէ բոլոր երկշղթա ԴՆԹ վիրուսների մեջ, որը ներկայացնում է Բալթիմորի վիրուսների ամենատարբեր և լայն դասը [65]:Թեև այս վիրուսներից շատերը մնում են չդասակարգված և կարող են ներառել վիրուսային աշխարհի բոլորովին անհայտ մասի վիրուսներ [66], մենք պարզեցինք, որ A. atra և M. platensis միդիների վիրուսները և հյուրընկալող միջակայքերը ընկնում են երկու տեսակների միջև:նմանապես (տես նկար S3, լրացուցիչ տեղեկություններ):Այս նմանությունը զարմանալի չէ, քանի որ այն կարող է արտացոլել շրջակա միջավայրում առկա ԴՆԹ-ի կլանման ընտրողականության բացակայությունը:ՌՆԹ-ի վիրուսը բնութագրելու համար ներկայումս անհրաժեշտ են մաքրված ՌՆԹ օգտագործող ապագա հետազոտություններ:
Մեր ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործեցինք շատ խիստ խողովակաշար, որը հարմարեցված էր Կովարսկու և գործընկերների աշխատանքից [37], ովքեր օգտագործեցին երկու քայլով ջնջված ընթերցումների և կոնտիգների՝ բնիկ ccfDNA-ի հավաքումից առաջ և հետո, ինչը հանգեցրեց չքարտեզագրված ընթերցումների մեծ քանակին:Հետևաբար, մենք չենք կարող բացառել, որ այս չքարտեզագրված ընթերցումներից մի քանիսը դեռ կարող են ունենալ իրենց սեփական ծագումը, առաջին հերթին այն պատճառով, որ մենք չունենք տեղեկատու գենոմ այս միդիա տեսակի համար:Մենք նաև օգտագործեցինք այս խողովակաշարը, քանի որ մեզ մտահոգում էր կիմերաները՝ ինքնագնահատման և ոչ ինքնուրույն ընթերցումների և ընթերցման երկարությունների մասին, որոնք առաջացել են Illumina MiSeq PE75-ի կողմից:Չբացահայտված ընթերցումների մեծամասնության մեկ այլ պատճառ էլ այն է, որ ծովային մանրէների մեծ մասը, հատկապես հեռավոր շրջաններում, ինչպիսին է Կերգելենը, ծանոթագրված չեն:Մենք օգտագործեցինք Illumina MiSeq PE75-ը՝ ենթադրելով, որ ccfDNA հատվածի երկարությունը նման է մարդու ccfDNA-ին:Հետագա ուսումնասիրությունների համար, հաշվի առնելով մեր արդյունքները, որոնք ցույց են տալիս, որ հեմոլիմֆի ccfDNA-ն ավելի երկար ընթերցումներ ունի, քան մարդիկ և/կամ կաթնասունները, խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել հաջորդականության հարթակ, որն ավելի հարմար է ավելի երկար ccfDNA բեկորների համար:Այս պրակտիկան շատ ավելի հեշտ կդարձնի ավելի խորը վերլուծության համար ավելի շատ ցուցումներ բացահայտելը:Ներկայիս անհասանելի ամբողջական A. atra միջուկային գենոմի հաջորդականությունը նույնպես մեծապես կհեշտացնի ccfDNA-ի տարբերակումը սեփական և ոչ սեփական աղբյուրներից:Հաշվի առնելով, որ մեր հետազոտությունը կենտրոնացել է միդիաների նկատմամբ հեղուկ բիոպսիայի հայեցակարգի կիրառման հնարավորության վրա, մենք հուսով ենք, որ քանի որ այս հայեցակարգը կօգտագործվի ապագա հետազոտություններում, նոր գործիքներ և խողովակաշարեր կմշակվեն՝ մեծացնելու այս մեթոդի ներուժը՝ միդիաների մանրէաբանական բազմազանությունն ուսումնասիրելու համար:ծովային էկոհամակարգ.
Որպես ոչ ինվազիվ կլինիկական բիոմարկեր, մարդու պլազմայում ccfDNA-ի բարձր մակարդակները կապված են տարբեր հիվանդությունների, հյուսվածքների վնասման և սթրեսային պայմանների հետ [67,68,69]:Այս աճը կապված է հյուսվածքների վնասումից հետո սեփական ծագման ԴՆԹ-ի բեկորների ազատման հետ:Մենք լուծեցինք այս խնդիրը՝ օգտագործելով սուր ջերմային սթրես, որի ժամանակ միդիաները կարճ ժամանակով ենթարկվեցին 30 °C ջերմաստիճանի:Մենք այս վերլուծությունը կատարեցինք երեք տարբեր տեսակի միդիաների վրա երեք անկախ փորձերի ընթացքում:Այնուամենայնիվ, մենք սուր ջերմային սթրեսից հետո ccfDNA մակարդակներում որևէ փոփոխություն չգտանք (տես Գծապատկեր S5, լրացուցիչ տեղեկատվություն):Այս հայտնագործությունը գոնե մասամբ կարող է բացատրել այն փաստը, որ միդիաներն ունեն կիսաբաց շրջանառության համակարգ և մեծ քանակությամբ օտար ԴՆԹ են կուտակում իրենց բարձր զտիչ ակտիվության պատճառով:Մյուս կողմից, միդիաները, ինչպես շատ անողնաշարավորներ, կարող են ավելի դիմացկուն լինել սթրեսի հետևանքով առաջացած հյուսվածքների վնասմանը, դրանով իսկ սահմանափակելով ccfDNA-ի արտազատումը իրենց հեմոլիմֆում [70, 71]:
Մինչ օրս ջրային էկոհամակարգերում կենսաբազմազանության ԴՆԹ-ի վերլուծությունը հիմնականում կենտրոնացած է շրջակա միջավայրի ԴՆԹ-ի (eDNA) մետաբարկոդավորման վրա:Այնուամենայնիվ, այս մեթոդը սովորաբար սահմանափակվում է կենսաբազմազանության վերլուծության ժամանակ, երբ օգտագործվում են այբբենարաններ:Որսորդական հրացանների հաջորդականության օգտագործումը շրջանցում է PCR-ի սահմանափակումները և պրայմերների հավաքածուների կողմնակալ ընտրությունը:Այսպիսով, ինչ-որ իմաստով մեր մեթոդն ավելի մոտ է վերջերս օգտագործված բարձր թողունակությամբ eDNA Shotgun-ի հաջորդականացման մեթոդին, որն ի վիճակի է ուղղակիորեն հաջորդականացնել մասնատված ԴՆԹ-ն և վերլուծել գրեթե բոլոր օրգանիզմները [72, 73]:Այնուամենայնիվ, կան մի շարք հիմնարար խնդիրներ, որոնք տարբերում են LB-ն ստանդարտ eDNA մեթոդներից:Իհարկե, eDNA-ի և LB-ի հիմնական տարբերությունը բնական ֆիլտրի հոսթների օգտագործումն է:Զեկուցվել է ծովային տեսակների օգտագործումը, ինչպիսիք են սպունգները և երկփեղկավորները (Dresseina spp.), որպես բնական զտիչ eDNA-ի ուսումնասիրության համար [74, 75]:Այնուամենայնիվ, Dreissena-ի ուսումնասիրությունը օգտագործեց հյուսվածքների բիոպսիա, որից ԴՆԹ-ն արդյունահանվեց:LB-ից ccfDNA-ի վերլուծությունը չի պահանջում հյուսվածքների բիոպսիա, մասնագիտացված և երբեմն թանկարժեք սարքավորումներ և նյութատեխնիկական միջոցներ, որոնք կապված են eDNA-ի կամ հյուսվածքների բիոպսիայի հետ:Իրականում, մենք վերջերս հայտնել ենք, որ ccfDNA-ն LB-ից կարող է պահվել և վերլուծվել FTA-ի աջակցությամբ՝ առանց սառը շղթայի պահպանման, ինչը մեծ մարտահրավեր է հեռավոր տարածքներում հետազոտությունների համար [76]:Հեղուկ բիոպսիաներից ccfDNA-ի արդյունահանումը նույնպես պարզ է և ապահովում է բարձրորակ ԴՆԹ որսորդական հրացանի հաջորդականության և ՊՇՌ վերլուծության համար:Սա մեծ առավելություն է՝ հաշվի առնելով eDNA վերլուծության հետ կապված որոշ տեխնիկական սահմանափակումներ [77]:Նմուշառման մեթոդի պարզությունն ու ցածր արժեքը նույնպես հարմար է երկարաժամկետ մոնիտորինգի ծրագրերի համար:Ի լրումն բարձր զտման կարողության, երկփեղկավորների մեկ այլ հայտնի հատկանիշը նրանց լորձի քիմիական մուկոպոլիսաքարիդային բաղադրությունն է, որը նպաստում է վիրուսների կլանմանը [78, 79]:Սա երկփեղկանները դարձնում է իդեալական բնական զտիչ՝ բնութագրելու կենսաբազմազանությունը և կլիմայի փոփոխության ազդեցությունը տվյալ ջրային էկոհամակարգում:Թեև հյուրընկալողից ստացված ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը կարող է դիտվել որպես մեթոդի սահմանափակում՝ համեմատած eDNA-ի հետ, eDNA-ի համեմատ նման բնիկ ccfDNA ունենալու հետ կապված ծախսերը միևնույն ժամանակ հասկանալի են առողջապահական ուսումնասիրությունների համար մատչելի տեղեկատվության հսկայական քանակի համար:օֆսեթ հյուրընկալող.Սա ներառում է վիրուսային հաջորդականությունների առկայությունը, որոնք ինտեգրված են հյուրընկալողի գենոմում:Սա հատկապես կարևոր է միդիաների համար՝ հաշվի առնելով երկփեղկանների մեջ հորիզոնական փոխանցվող լեյկեմիկ ռետրովիրուսների առկայությունը [80, 81]:LB-ի մեկ այլ առավելություն eDNA-ի նկատմամբ այն է, որ այն օգտագործում է հեմոլիմֆում շրջանառվող արյան բջիջների ֆագոցիտային ակտիվությունը, որը կլանում է միկրոօրգանիզմները (և նրանց գենոմները):Ֆագոցիտոզը երկփեղկանի արյան բջիջների հիմնական գործառույթն է [82]:Ի վերջո, մեթոդն օգտվում է միդիաների ֆիլտրման բարձր հզորությունից (միջինում 1,5 լ/ժ ծովի ջուր) և երկօրյա շրջանառությունից, որոնք մեծացնում են ծովի ջրի տարբեր շերտերի խառնումը, ինչը թույլ է տալիս հետերոլոգ էԴՆԹ-ի գրավումը:[83, 84]։Այսպիսով, միդիաների ccfDNA վերլուծությունը հետաքրքիր միջոց է հաշվի առնելով միդիաների սննդային, տնտեսական և բնապահպանական ազդեցությունները:Մարդկանցից հավաքված LB-ի վերլուծության նման, այս մեթոդը նաև հնարավորություն է տալիս չափել հյուրընկալող ԴՆԹ-ում գենետիկական և էպիգենետիկ փոփոխությունները՝ ի պատասխան էկզոգեն նյութերի:Օրինակ, երրորդ սերնդի հաջորդականացման տեխնոլոգիաները կարող են նախատեսվել՝ գենոմի լայնածավալ մեթիլացման վերլուծություն իրականացնելու համար բնիկ ccfDNA-ում՝ օգտագործելով նանոպորների հաջորդականությունը:Այս գործընթացին պետք է նպաստի այն փաստը, որ միդիա ccfDNA բեկորների երկարությունը իդեալականորեն համատեղելի է երկար ընթերցված հաջորդականության հարթակների հետ, որոնք թույլ են տալիս գենոմի լայնածավալ ԴՆԹ մեթիլացման վերլուծություն մեկ հաջորդականությամբ՝ առանց քիմիական փոխակերպումների անհրաժեշտության:Հետևաբար, այն կարող է արժեքավոր պատկերացում կազմել կլիմայի փոփոխության կամ աղտոտիչների ազդեցությունից հետո արձագանքման հիմքում ընկած մեխանիզմների վերաբերյալ [87]:Այնուամենայնիվ, LB-ի օգտագործումը առանց սահմանափակումների չէ:Ավելորդ է ասել, որ դրա համար անհրաժեշտ է էկոհամակարգում ցուցիչ տեսակների առկայությունը:Ինչպես նշվեց վերևում, LB-ի օգտագործումը տվյալ էկոհամակարգի կենսաբազմազանությունը գնահատելու համար պահանջում է նաև խիստ կենսաինֆորմատիկայի խողովակաշար, որը հաշվի է առնում աղբյուրից ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը:Մեկ այլ կարևոր խնդիր է ծովային տեսակների համար հղումային գենոմների առկայությունը:Հույս կա, որ այնպիսի նախաձեռնություններ, ինչպիսիք են Ծովային կաթնասունների գենոմների նախագիծը և վերջերս ստեղծված Fish10k նախագիծը [88], հետագայում կհեշտացնեն նման վերլուծությունը:LB-ի հայեցակարգի կիրառումը ծովային ֆիլտրով սնվող օրգանիզմների վրա համատեղելի է նաև հաջորդականության տեխնոլոգիայի վերջին առաջընթացների հետ, ինչը հարմար է բազմաօհմ բիոմարկերների մշակման համար՝ կարևոր տեղեկատվություն տրամադրելու ծովային ապրելավայրերի առողջության մասին՝ ի պատասխան շրջակա միջավայրի սթրեսի:
Գենոմի հաջորդականության տվյալները պահվել են NCBI Sequence Read Archive-ում https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 Bioprojects SRR8924808 ներքո:
Brierley AS, Kingsford MJ Կլիմայի փոփոխության ազդեցությունը ծովային կյանքի և էկոհամակարգերի վրա:Քոուլի կենսաբանություն.2009 թ.19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Դիտարկենք կլիմայի փոփոխության և այլ տեղական սթրեսային գործոնների համատեղ ազդեցությունը ծովային միջավայրի վրա:ընդհանուր գիտական ​​միջավայր.2021; 755: 142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.)մարտի 1-ի գիտ.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Կրճատված ջերմային հանդուրժողականությունը կրկնվող ջերմային սթրեսի պայմաններում բացատրում է կապույտ միդիաների բարձր ամառային մահացությունը:Գիտական ​​հաշվետվություն 2019 թ.9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Կենդանիների մահվան հաճախականության, պատճառների և չափի վերջին փոփոխությունները:Proc Natl Acad Sci ԱՄՆ.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Բազմաթիվ ոչ հատուկ պաթոգեններ կարող են առաջացնել Pinna nobilis-ի զանգվածային մահացություն:Կյանք.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Կլիմայի փոփոխության հնարավոր ազդեցությունը Արկտիկայի կենդանաբանական հիվանդությունների վրա.Int J Circumpolar առողջություն.2005 թ.64:468–77։
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Կապույտ միդիաները (Mytilus edulis spp.) որպես ազդանշանային օրգանիզմներ ափամերձ աղտոտվածության մոնիտորինգում. վերանայում.Mar Environ Res 2017;130:338-65։
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Հեղուկ բիոպսիայի ինտեգրումը քաղցկեղի բուժման մեջ:Nat Rev Մաքուր Oncol.2017 թ.14։531–48։
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Հեղուկ բիոպսիայի հասունացում. թույլ է տալիս ուռուցքի ԴՆԹ-ի շրջանառությունը:Nat Rev քաղցկեղ.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Նուկլեինաթթուները մարդու պլազմայում:Soc Biol դուստր ձեռնարկությունների նիստի արձանագրությունը.1948 թ.142։241-3։
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Բջջազուրկ ԴՆԹ-ի նոր դերը որպես քաղցկեղի բուժման մոլեկուլային մարկեր:Կենսամոլային վերլուծության քանակականացում:2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Հեղուկ բիոպսիան մուտք է գործում կլինիկա. իրականացման խնդիրներ և ապագա մարտահրավերներ:Nat Rev Clin Oncol.2021 թ.18:297–312։
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW և այլք:Պտղի ԴՆԹ-ն առկա է մոր պլազմայում և շիճուկում:Լանսետ.1997 թ.350:485-7։
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Հղիության ընթացքի և դրա բարդությունների ուսումնասիրություն՝ օգտագործելով շրջանառվող արտաբջջային ՌՆԹ հղիության ընթացքում կանանց արյան մեջ:Դոպեդիա.2020; 8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Հեղուկ բիոպսիա. դոնորային առանց բջիջների ԴՆԹ-ն օգտագործվում է երիկամի փոխպատվաստման մեջ ալոգեն ախտահարումները հայտնաբերելու համար:Nat Rev Nephrol.2021 թ.17:591–603.
Juan FC, Lo YM Նորարարություններ նախածննդյան ախտորոշման մեջ. մայրական պլազմայի գենոմի հաջորդականություն:Աննա MD.2016; 67: 419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Վարակված մարմնական հեղուկների հաջորդ սերնդի մետագենոմիկ հաջորդականությամբ պաթոգենների արագ հայտնաբերում:Nat Medicine.2021; 27:115-24.