Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Հեղուկ բիոպսիան (ՀԲ) հասկացություն է, որը արագորեն ժողովրդականություն է ձեռք բերում կենսաբժշկական ոլորտում: Հայեցակարգը հիմնականում հիմնված է շրջանառվող արտաբջջային ԴՆԹ-ի (ccfDNA) բեկորների հայտնաբերման վրա, որոնք հիմնականում արտազատվում են որպես փոքր բեկորներ բջջային մահից հետո տարբեր հյուսվածքներում: Այս բեկորների մի փոքր մասը ծագում է օտար (օտար) հյուսվածքներից կամ օրգանիզմներից: Ընթացիկ աշխատանքում մենք այս հասկացությունը կիրառել ենք միդիաների վրա, որոնք պահապան տեսակներ են, որոնք հայտնի են իրենց ծովային ջրի բարձր ֆիլտրման ունակությամբ: Մենք օգտագործում ենք միդիաների ունակությունը՝ գործել որպես բնական ֆիլտրեր՝ տարբեր աղբյուրներից շրջակա միջավայրի ԴՆԹ բեկորներ որսալու համար՝ ծովային ափամերձ էկոհամակարգերի կենսաբազմազանության մասին տեղեկատվություն տրամադրելու համար: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ միդիաների հեմոլիմֆը պարունակում է ԴՆԹ բեկորներ, որոնք մեծապես տարբերվում են չափսերով՝ 1-ից մինչև 5 կբ: Հրթիռային հաջորդականացումը ցույց տվեց, որ ԴՆԹ բեկորների մեծ մասը օտար մանրէային ծագում ունի: Դրանց մեջ մենք գտանք բակտերիաների, արխեաների և վիրուսների ԴՆԹ բեկորներ, այդ թվում՝ վիրուսներ, որոնք հայտնի են ափամերձ ծովային էկոհամակարգերում սովորաբար հանդիպող տարբեր տերերի վարակելու համար: Ամփոփելով՝ մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ միդիաների նկատմամբ կիրառված LB հասկացությունը ներկայացնում է ծովային ափամերձ էկոհամակարգերի մանրէային բազմազանության վերաբերյալ գիտելիքների հարուստ, բայց դեռևս չուսումնասիրված աղբյուր։
Կլիմայի փոփոխության (ԿՓ) ազդեցությունը ծովային էկոհամակարգերի կենսաբազմազանության վրա արագ զարգացող հետազոտության ոլորտ է: Գլոբալ տաքացումը ոչ միայն առաջացնում է կարևոր ֆիզիոլոգիական սթրեսներ, այլև ընդլայնում է ծովային օրգանիզմների ջերմային կայունության էվոլյուցիոն սահմանները՝ ազդելով մի շարք տեսակների բնակավայրի վրա, մղելով նրանց փնտրել ավելի բարենպաստ պայմաններ [1, 2]: Բացի մետազոանների կենսաբազմազանությանը ազդելուց, ԿՓ-ն խախտում է տեր-մանրէային փոխազդեցությունների նուրբ հավասարակշռությունը: Այս մանրէային դիսբակտերիոզը լուրջ սպառնալիք է ներկայացնում ծովային էկոհամակարգերի համար, քանի որ այն ծովային օրգանիզմներին ավելի զգայուն է դարձնում վարակիչ հարուցիչների նկատմամբ [3, 4]: Կարծիք կա, որ ԿՓ-ն կարևոր դեր է խաղում զանգվածային մահերի մեջ, ինչը լուրջ խնդիր է համաշխարհային ծովային էկոհամակարգերի կառավարման համար [5, 6]: Սա կարևոր հարց է՝ հաշվի առնելով բազմաթիվ ծովային տեսակների տնտեսական, էկոլոգիական և սննդային ազդեցությունը: Սա հատկապես ճիշտ է բևեռային շրջաններում ապրող երկփեղկանիների համար, որտեղ ԿՓ-ի ազդեցությունն ավելի անմիջական և ծանր է [6, 7]: Փաստորեն, երկփեղկանիները, ինչպիսիք են Mytilus spp.-ն, լայնորեն օգտագործվում են ԿՓ-ի ծովային էկոհամակարգերի վրա ազդեցությունը վերահսկելու համար: Զարմանալի չէ, որ նրանց առողջությունը վերահսկելու համար մշակվել է համեմատաբար մեծ թվով բիոմարկերներ, որոնք հաճախ օգտագործվում են երկաստիճան մոտեցմամբ, որը ներառում է ֆունկցիոնալ բիոմարկերներ, որոնք հիմնված են ֆերմենտային ակտիվության կամ բջջային գործառույթների վրա, ինչպիսիք են բջիջների կենսունակությունը և ֆագոցիտային ակտիվությունը [8]: Այս մեթոդները ներառում են նաև ծովի ջրի մեծ քանակությամբ կլանումից հետո փափուկ հյուսվածքներում կուտակվող ճնշման որոշակի ցուցիչների կոնցենտրացիայի չափումը: Այնուամենայնիվ, երկփեղկանի մկների բարձր զտման հզորությունը և կիսաբաց շրջանառության համակարգը հնարավորություն են տալիս մշակել նոր հեմոլիմֆային բիոմարկերներ՝ օգտագործելով հեղուկ բիոպսիայի (LB) հայեցակարգը, որը հիվանդների կառավարման պարզ և նվազագույն ինվազիվ մոտեցում է: Արյան նմուշներ [9, 10]: Չնայած մարդու LB-ում կարելի է գտնել շրջանառվող մոլեկուլների մի քանի տեսակներ, այս հայեցակարգը հիմնականում հիմնված է պլազմայում շրջանառվող արտաբջջային ԴՆԹ-ի (ccfDNA) բեկորների ԴՆԹ-ի հաջորդականության վերլուծության վրա: Փաստորեն, մարդու պլազմայում շրջանառվող ԴՆԹ-ի առկայությունը հայտնի է 20-րդ դարի կեսերից [11], բայց միայն վերջին տարիներին է, որ բարձր արդյունավետությամբ հաջորդականության մեթոդների ի հայտ գալը հանգեցրել է ccfDNA-ի վրա հիմնված կլինիկական ախտորոշման: Այս շրջանառվող ԴՆԹ բեկորների առկայությունը մասամբ պայմանավորված է բջջային մահից հետո գենոմային ԴՆԹ-ի (միջուկային և միտոքոնդրիալ) պասիվ արտազատմամբ։ Առողջ անհատների մոտ ccfDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), սակայն կարող է 5-10 անգամ աճել տարբեր պաթոլոգիաներով տառապող կամ սթրեսի ենթարկված հիվանդների մոտ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասվածքի։ Առողջ անհատների մոտ ccfDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), սակայն կարող է 5-10 անգամ աճել տարբեր պաթոլոգիաներով տառապող կամ սթրեսի ենթարկված հիվանդների մոտ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասվածքի։ У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но може да повышаться в 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводяврщенйнык. Առողջ մարդկանց մոտ cccDNA-ի կոնցենտրացիան սովորաբար ցածր է (<10 նգ/մլ), սակայն այն կարող է աճել 5-10 անգամ տարբեր պաթոլոգիաներով կամ հյուսվածքների վնասվածքի հանգեցնող սթրեսի տակ գտնվող հիվանդների մոտ։在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致的在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 նգ/մլ） 但 在 各 种 病理 或中 可 增加 5-10 倍 从而 组织。。。损伤Կենտրոնացում ccfDNA обычно ниские (<10 нг/мл) у здоровых людей, но կարող է быть увеличены в 5-10 раз во пациентов со различными патологиями или սթրեսսոմ, ինչ կարող է ազդել այս հիվանդության հետ: ccfDNA-ի կոնցենտրացիաները առողջ անհատների մոտ սովորաբար ցածր են (<10 նգ/մլ), սակայն տարբեր պաթոլոգիաներով կամ սթրեսով հիվանդների մոտ կարող են աճել 5-10 անգամ, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասման։CcfDNA բեկորների չափը լայնորեն տատանվում է, բայց սովորաբար տատանվում է 150-ից մինչև 200 զույգ հիմքի սահմաններում: [12] Ինքնաստեղծված ccfDNA-ի, այսինքն՝ նորմալ կամ տրանսֆորմացված հյուրընկալող բջիջներից ccfDNA-ի վերլուծությունը կարող է օգտագործվել միջուկային և/կամ միտոքոնդրիալ գենոմում առկա գենետիկական և էպիգենետիկ փոփոխությունները հայտնաբերելու համար, այդպիսով օգնելով բժիշկներին ընտրել մոլեկուլային-նպատակային հատուկ թերապիաներ [13]: Այնուամենայնիվ, ccfDNA-ն կարող է ստացվել օտարերկրյա աղբյուրներից, ինչպիսիք են հղիության ընթացքում պտղի բջիջներից ccfDNA-ն կամ փոխպատվաստված օրգաններից [14,15,16,17]: ccfDNA-ն նաև կարևոր տեղեկատվության աղբյուր է վարակիչ նյութի (օտար) նուկլեինաթթուների առկայությունը հայտնաբերելու համար, ինչը թույլ է տալիս ոչ ինվազիվ հայտնաբերել արյան կուլտուրաներով չբացահայտված տարածված վարակները՝ խուսափելով վարակված հյուսվածքի ինվազիվ բիոպսիայից [18]: Վերջին ուսումնասիրությունները իսկապես ցույց են տվել, որ մարդու արյունը պարունակում է տեղեկատվության հարուստ աղբյուր, որը կարող է օգտագործվել վիրուսային և բակտերիալ հարուցիչները նույնականացնելու համար, և որ մարդու պլազմայում հայտնաբերված ccfDNA-ի մոտ 1%-ը օտարերկրյա ծագում ունի [19]: Այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ օրգանիզմի շրջանառվող միկրոբիոմի կենսաբազմազանությունը կարելի է գնահատել ccfDNA վերլուծության միջոցով: Սակայն, մինչև վերջերս, այս հասկացությունն օգտագործվում էր բացառապես մարդկանց և, ավելի փոքր չափով, այլ ողնաշարավորների մոտ [20, 21]:
Այս աշխատանքում մենք օգտագործում ենք LB պոտենցիալը՝ Aulacomya atra-ի ccfDNA-ն վերլուծելու համար, որը հարավային տեսակ է, որը սովորաբար հանդիպում է ենթաանտարկտիկական Կերգուելեն կղզիներում, կղզիների խումբ, որը գտնվում է մեծ սարահարթի գագաթին և ձևավորվել է 35 միլիոն տարի առաջ։ Հրաբխային ժայթքում։ Օգտագործելով in vitro փորձարարական համակարգ, մենք պարզեցինք, որ ծովային ջրում գտնվող ԴՆԹ-ի բեկորները արագորեն կլանվում են միդիաների կողմից և մտնում հեմոլիմֆային խցիկ։ Շոկային հաջորդականացումը ցույց է տվել, որ միդիաների հեմոլիմֆային ccfDNA-ն պարունակում է սեփական և ոչ սեփական ծագման ԴՆԹ բեկորներ, այդ թվում՝ սիմբիոտիկ մանրէներ և ԴՆԹ բեկորներ սառը հրաբխային ծովային ափամերձ էկոհամակարգերին բնորոշ բիոմներից։ Հեմոլիմֆային ccfDNA-ն նաև պարունակում է վիրուսային հաջորդականություններ, որոնք ստացվել են տարբեր տերերի տիրույթ ունեցող վիրուսներից։ Մենք նաև գտել ենք բազմաբջիջ կենդանիների ԴՆԹ բեկորներ, ինչպիսիք են ոսկրային ձկները, ծովային անեմոնները, ջրիմուռները և միջատները։ Եզրափակելով՝ մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ LB հայեցակարգը կարող է հաջողությամբ կիրառվել ծովային անողնաշարավորների վրա՝ ծովային էկոհամակարգերում հարուստ գենոմային ռեպերտուար ստեղծելու համար։
Մեծահասակ (55-70 մմ երկարությամբ) Mytilus platensis (M. platensis) և Aulacomya atra (A. atra) միդիաները հավաքվել են Պորտ-օ-Ֆրանսի (049°21.235 S, 070°13.490 E .) միջմակընթացային ժայռոտ ափերից։ Կերգելեն կղզիներ 2018 թվականի դեկտեմբերին։ Այլ մեծահասակ կապույտ միդիաներ (Mytilus spp.) ձեռք են բերվել առևտրային մատակարարից (PEI Mussel King Inc., Փրինս Էդվարդ կղզի, Կանադա) և տեղադրվել են ջերմաստիճանի կարգավորվող (4°C) օդափոխվող բաքի մեջ, որը պարունակում էր 10-20 լիտր 32‰ արհեստական ​​աղաջուր (արհեստական ​​ծովի աղ Reef Crystal, Instant Ocean, Վիրջինիա, ԱՄՆ)։ Յուրաքանչյուր փորձի համար չափվել են առանձին խեցիների երկարությունը և քաշը։
Այս ծրագրի անվճար բաց մուտքի արձանագրությունը հասանելի է առցանց (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1): Հակիրճ ասած, LB հեմոլիմֆը հավաքվել է առևանգող մկաններից, ինչպես նկարագրված է [22]: Հեմոլիմֆը մաքրվել է ցենտրիֆուգացման միջոցով 1200×g-ում 3 րոպե, վերին շերտը սառեցվել է (-20°C) մինչև օգտագործումը: cfDNA-ի մեկուսացման և մաքրման համար նմուշները (1.5-2.0 մլ) հալեցվել և մշակվել են NucleoSnap cfDNA հավաքածուի (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: ccfDNA-ն պահվել է -80°C ջերմաստիճանում մինչև հետագա վերլուծությունը: Որոշ փորձարկումներում ccfDNA-ն մեկուսացվել և մաքրվել է QIAamp DNA Investigator Kit-ի (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada) միջոցով: Մաքրված ԴՆԹ-ն քանակականացվել է PicoGreen ստանդարտ թեստի միջոցով: Մեկուսացված ccfDNA-ի բեկորների բաշխումը վերլուծվել է մազանոթային էլեկտրոֆորեզով՝ օգտագործելով Agilent 2100 կենսաանալիզատոր (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)՝ օգտագործելով High Sensitivity DNA Kit: Փորձարկումը կատարվել է ccfDNA-ի 1 մկլ նմուշի միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների:
Հեմոլիմֆի ccfDNA բեկորների հաջորդականության որոշման համար Génome Québec-ը (Մոնրեալ, Քվեբեկ, Կանադա) պատրաստել է որսորդական հրացանների գրադարաններ՝ օգտագործելով Illumina MiSeq PE75 հավաքածուի Illumina DNA Mix հավաքածուն: Օգտագործվել է ստանդարտ ադապտեր (BioO): Հում տվյալների ֆայլերը հասանելի են NCBI Sequence Read Archive-ից (SRR8924808 և SRR8924809): Հիմնական ընթերցման որակը գնահատվել է FastQC-ի միջոցով [23]: Ադապտերի կտրման և վատ որակի ընթերցումների համար օգտագործվել է Trimmomatic [24]: Զույգ ծայրերով որսորդական հրացանների ընթերցումները FLASH-ով միավորվել են ավելի երկար մեկ ընթերցումների՝ 20 զույգ հիմքի նվազագույն համընկնմամբ՝ անհամապատասխանություններից խուսափելու համար [25]: Միավորված ընթերցումները մեկնաբանվել են BLASTN-ով՝ օգտագործելով երկփեղկանի NCBI տաքսոնոմիայի տվյալների բազան (e արժեքը < 1e−3 և 90% համանմանություն), իսկ ցածր բարդության հաջորդականությունների քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]: Միավորված ընթերցումները մեկնաբանվել են BLASTN-ով՝ օգտագործելով երկփեղկանի NCBI տաքսոնոմիայի տվյալների բազան (e արժեքը < 1e−3 և 90% համանմանություն), իսկ ցածր բարդության հաջորդականությունների քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]: Объединенные чтения были антированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчатых моллюсков NCBI (նշանակություն e < 1e-3 и 90% нискомология), а маский. было выполнено с использованием DUST [26]: Միավորված ընթերցումները մեկնաբանվել են BLASTN-ով՝ օգտագործելով NCBI երկփեղկանի տաքսոնոմիայի տվյալների բազան (e արժեքը < 1e-3 և 90% համանմանություն), իսկ ցածր բարդության հաջորդականության քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]:使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数STN 注释合并的读数进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 用 用 佨释 合并 读敹进行 复杂度 序列 的。。。。掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были антированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двустворчатых моллюсков NCBI (նշանակություն և <1e-3 և 90% մատնանշված ճանաչողականություն), было выполнено с использованием DUST [26]: Միավորված ընթերցումները մեկնաբանվել են BLASTN-ով՝ օգտագործելով NCBI երկփեղկանի տաքսոնոմիկ տվյալների բազան (e արժեքը <1e-3 և 90% համանմանություն), իսկ ցածր բարդության հաջորդականության քողարկումը կատարվել է DUST-ի միջոցով [26]:Ընթերցումները բաժանվեցին երկու խմբի՝ երկփեղկանի հաջորդականություններին վերաբերող (այստեղ կոչվում են ինքնաընթերցումներ) և անկապ (ոչ ինքնաընթերցումներ): Երկու խմբերը առանձին-առանձին հավաքվեցին MEGAHIT-ի միջոցով՝ կոնտիգներ ստեղծելու համար [27]: Միևնույն ժամանակ, այլմոլորակային միկրոբիոմի ընթերցումների տաքսոնոմիկ բաշխումը դասակարգվեց Kraken2-ի միջոցով [28] և գրաֆիկորեն ներկայացվեց Galaxy-ի վրա Krona շրջանաձև դիագրամով [29, 30]: Մեր նախնական փորձերի արդյունքում օպտիմալ kmers-ը որոշվեց kmers-59-ը: Այնուհետև ինքնուրույն կոնտիգները նույնականացվեցին BLASTN-ի (երկփեղկանի NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% համանմանություն) հետ համապատասխանեցման միջոցով՝ վերջնական ծանոթագրության համար։ Այնուհետև ինքնուրույն կոնտիգները նույնականացվեցին BLASTN-ի (երկփեղկանի NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% համանմանություն) հետ համապատասխանեցման միջոցով՝ վերջնական ծանոթագրության համար։ Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (հիմնական տվյալների հիման վրա ստեղծված NCBI, նշանակության e <1e-10 եւ գոմոլոգիա 60%) համար окончательной. Այնուհետև ինքնակոնտիգները նույնականացվեցին՝ վերջնական ծանոթագրության համար BLASTN-ի (NCBI երկփեղկանի տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% համանմանություն) հետ համեմատելով։然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% BLASTN-ի տվյալների համաձայն NCBI-ի ստեղծած մոլլյուսկով, նշանակությունը e <1e-10 եւ %6: Ինքնամփոփները այնուհետև նույնականացվեցին վերջնական ծանոթագրության համար՝ BLASTN-ի հետ համապատասխանեցնելով (NCBI երկփեղկանի տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% համանմանություն): Զուգահեռաբար, ոչ սեփական խմբի կոնտիգները նշագրվել են BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% համանմանություն): Զուգահեռաբար, ոչ սեփական խմբի կոնտիգները նշագրվել են BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեք < 1e−10 և 60% համանմանություն): Parallelьno чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (հիմնական տվյալների nt NCBI, նշանակության e <1e-10 եւ гломология 60%): Զուգահեռաբար, օտար խմբային կոնտիգները նշագրվել են BLASTN-ով (NT NCBI տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% համանմանություն):平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Parallelьno contigi, не относящиеся к собственной խմբпе, были аннотированы с помощью BLASTN (բազա տվյալների nt NCBI, նշանակություն e <1e-10 եւ գոմոլոգիա 60%): Զուգահեռաբար, ոչ սեփական խմբի կոնտիգները նշագրվել են BLASTN-ով (nt NCBI տվյալների բազա, e արժեքը <1e-10 և 60% համանմանություն): BLASTX-ը նաև իրականացվել է ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq սպիտակուցային NCBI տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e−10 և 60% համանմանություն): BLASTX-ը նաև իրականացվել է ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq սպիտակուցային NCBI տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e−10 և 60% համանմանություն): BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr եւ RefSeq NCBI (նշանակություն e <1e-10 եւ омология 60%)։ BLASTX-ը կատարվել է նաև ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq NCBI սպիտակուցային տվյալների բազաները (e արժեքը < 1e-10 և 60% համանմանություն):还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ィ怼怼性性ﺐ 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值ィ怼怼性性ﺐ 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr եւ RefSeq NCBI (նշանակություն e <1e-10 եւ омология 60%): BLASTX-ը կատարվել է նաև ոչ ինքնուրույն կոնտիգների վրա՝ օգտագործելով nr և RefSeq NCBI սպիտակուցային տվյալների բազաները (e արժեքը <1e-10 և 60% համանմանություն):Ոչ ինքնակոնտիգների BLASTN և BLASTX խմբերը ներկայացնում են վերջնական կոնտիգները (տե՛ս լրացուցիչ ֆայլը):
ՊՇՌ-ի համար օգտագործված պրայմերները ներկայացված են S1 աղյուսակում: ccfDNA թիրախային գեների ուժեղացման համար օգտագործվել է Taq ԴՆԹ պոլիմերազ (Bio Basic Canada, Markham, ON): Օգտագործվել են հետևյալ ռեակցիայի պայմանները՝ դենատուրացիա 95°C-ում 3 րոպե, 95°C-ում 1 րոպե, թրծման ջերմաստիճանի կարգավորում 1 րոպե, երկարացում 72°C-ում 1 րոպե, 35 ցիկլ և վերջապես 72°C 10 րոպեի ընթացքում: ՊՇՌ արգասիքները բաժանվել են էլեկտրոֆորեզի միջոցով ագարոզային գելերում (1.5%), որոնք պարունակում էին SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) 95 Վ լարման տակ:
Միդիաները (Mytilus spp.) 24 ժամ ակլիմատիզացվել են 500 մլ թթվածնացված ծովային ջրում (32 PSU) 4°C ջերմաստիճանում: Մարդու գալեկտին-7 կԴՆԹ հաջորդականությունը կոդավորող ներդիր պարունակող պլազմիդային ԴՆԹ-ն (NCBI մուտքագրման համարը՝ L07769) ավելացվել է սրվակի մեջ՝ 190 մկգ/մկլ վերջնական կոնցենտրացիայով: Նույն պայմաններում առանց ԴՆԹ ավելացնելու ինկուբացված միդիաները եղել են վերահսկիչ: Երրորդ վերահսկիչ բաքը պարունակում էր առանց միդիաների ԴՆԹ: Ծովային ջրում ԴՆԹ-ի որակը վերահսկելու համար, նշված ժամին յուրաքանչյուր բաքից վերցվել են ծովային ջրի նմուշներ (20 մկլ, երեք անգամ): Պլազմիդային ԴՆԹ-ի հետագծելիության համար LB միդիաները հավաքվել են նշված ժամերին և վերլուծվել են qPCR և ddPCR մեթոդներով: Ծովային ջրի աղի բարձր պարունակության պատճառով, բոլոր ՊՇՌ փորձարկումներից առաջ ալիքվոտները նոսրացվել են ՊՇՌ որակի ջրում (1:10):
Թվային կաթիլային ՊՇՌ-ն (ddPCR) իրականացվել է BioRad QX200 արձանագրության միջոցով (Միսիսսաուգա, Օնտարիո, Կանադա): Օպտիմալ ջերմաստիճանը որոշելու համար օգտագործվել է ջերմաստիճանի պրոֆիլը (աղյուսակ S1): Կաթիլները ստեղծվել են QX200 կաթիլների գեներատորի միջոցով (BioRad): ddPCR-ն իրականացվել է հետևյալ կերպ՝ 95°C՝ 5 րոպե, 95°C-ի 50 ցիկլ՝ 30 վայրկյան և տրված թրծման ջերմաստիճան՝ 1 րոպե և 72°C՝ 30 վայրկյան, 4°C՝ 5 րոպե և 90°C՝ 5 րոպեի ընթացքում: Կաթիլների և դրական ռեակցիաների քանակը (պատճենների քանակը/µլ) չափվել է QX200 կաթիլների ընթերցիչ սարքի միջոցով (BioRad): 10,000-ից պակաս կաթիլներով նմուշները մերժվել են: Դրսևորումների վերահսկում չի իրականացվել ամեն անգամ, երբ ddPCR է իրականացվել:
qPCR-ը կատարվել է Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Սիդնեյ, Ավստրալիա) և LGALS7-ի համար նախատեսված պրայմերների միջոցով: Բոլոր քանակական ՊՇՌ-ները կատարվել են 20 մկլ-ում՝ օգտագործելով QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN): qPCR-ը սկսվել է 15 րոպեանոց ինկուբացիայով 95°C ջերմաստիճանում, որին հաջորդել են 40 ցիկլեր 95°C ջերմաստիճանում՝ 10 վայրկյան և 60°C ջերմաստիճանում՝ 60 վայրկյան՝ մեկ տվյալների հավաքագրմամբ: Հալման կորերը ստեղծվել են հաջորդական չափումների միջոցով՝ qPCR-ի ավարտին՝ 95°C ջերմաստիճանում՝ 5 վայրկյան, 65°C ջերմաստիճանում՝ 60 վայրկյան և 97°C ջերմաստիճանում՝ qPCR-ի ավարտին: Յուրաքանչյուր qPCR կատարվել է եռակի, բացառությամբ վերահսկիչ նմուշների:
Քանի որ միդիաները հայտնի են իրենց բարձր ֆիլտրացիայի արագությամբ, մենք նախ ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք դրանք կարող են ֆիլտրել և պահպանել ծովային ջրում առկա ԴՆԹ բեկորները: Մեզ նաև հետաքրքրում էր, թե արդյոք այդ բեկորները կուտակվում են նրանց կիսաբաց լիմֆատիկ համակարգում: Մենք փորձարարականորեն լուծեցինք այս խնդիրը՝ հետևելով կապույտ միդիաների ակվարիումներին ավելացված լուծելի ԴՆԹ բեկորների ճակատագրին: ԴՆԹ բեկորների հետևումը հեշտացնելու համար մենք օգտագործեցինք օտար (ոչ թե ինքնուրույն) պլազմիդային ԴՆԹ, որը պարունակում էր մարդու գալեկտին-7 գեն: ddPCR-ը հետևում է պլազմիդային ԴՆԹ բեկորներին ծովային ջրում և միդիաներում: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ եթե ծովային ջրում ԴՆԹ բեկորների քանակը ժամանակի ընթացքում (մինչև 7 օր) մնում էր համեմատաբար անփոփոխ միդիաների բացակայության դեպքում, ապա միդիաների առկայության դեպքում այս մակարդակը գրեթե ամբողջությամբ անհետանում էր 8 ժամվա ընթացքում (Նկար 1ա,բ): Արտաքին ԴՆԹ-ի բեկորները հեշտությամբ հայտնաբերվում էին ներփականային հեղուկում և հեմոլիմֆայում 15 րոպեի ընթացքում (Նկար 1գ): Այս բեկորները կարող էին հայտնաբերվել ազդեցությունից հետո մինչև 4 ժամ: ԴՆԹ բեկորների նկատմամբ այս ֆիլտրացման ակտիվությունը համեմատելի է մանրէների և ջրիմուռների ֆիլտրացման ակտիվության հետ [31]: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ միդիաները կարող են զտել և կուտակել օտար ԴՆԹ իրենց հեղուկ խցիկներում։
Պլազմիդային ԴՆԹ-ի հարաբերական կոնցենտրացիաները ծովային ջրում՝ միդիաների առկայության (A) կամ բացակայության (B) դեպքում, չափված ddPCR-ով: A-ում արդյունքները արտահայտվում են տոկոսներով, որտեղ վանդակների սահմանները ներկայացնում են 75-րդ և 25-րդ պերսենտիլները: Հարմարեցված լոգարիթմական կորը ցույց է տրված կարմիրով, իսկ մոխրագույնով ստվերավորված տարածքը ներկայացնում է 95% վստահության միջակայքը: B-ում կարմիր գիծը ներկայացնում է միջինը, իսկ կապույտ գիծը՝ կոնցենտրացիայի 95% վստահության միջակայքը: C Պլազմիդային ԴՆԹ-ի կուտակում միդիաների հեմոլիմֆում և փականային հեղուկում պլազմիդային ԴՆԹ-ի ավելացումից հետո տարբեր ժամանակներում: Արդյունքները ներկայացված են որպես հայտնաբերված բացարձակ պատճեններ/մլ (±SE):
Հաջորդը, մենք ուսումնասիրեցինք ccfDNA-ի ծագումը Կերգուելեն կղզիների միդիաների շերտերից հավաքված միդիաներում, որոնք կղզիների խումբ են՝ սահմանափակ մարդածին ազդեցությամբ: Այս նպատակով միդիաների հեմոլիմֆներից cccDNA-ն մեկուսացվել և մաքրվել է մարդու cccDNA-ն մաքրելու համար սովորաբար օգտագործվող մեթոդներով [32, 33]: Մենք պարզեցինք, որ միդիաներում հեմոլիմֆի ccfDNA-ի միջին կոնցենտրացիաները ցածր միկրոգրամներ են մեկ մլ հեմոլիմֆի համար (տե՛ս աղյուսակ S2, Լրացուցիչ տեղեկատվություն): Կոնցենտրացիաների այս միջակայքը շատ ավելի մեծ է, քան առողջ մարդկանց մոտ (ցածր նանոգրամներ մեկ միլիլիտրում), բայց հազվադեպ դեպքերում, քաղցկեղով հիվանդների մոտ ccfDNA-ի մակարդակը կարող է հասնել մի քանի միկրոգրամ մեկ միլիլիտրում [34, 35]: Հեմոլիմֆի ccfDNA-ի չափերի բաշխման վերլուծությունը ցույց տվեց, որ այս բեկորները մեծապես տարբերվում են չափսերով՝ տատանվելով 1000 հիմքից մինչև 1000 հիմք, մինչև 5000 հիմք (Նկար 2): Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել նաև սիլիցիումի վրա հիմնված QIAamp Investigator Kit-ի միջոցով, որը դատաբժշկական գիտության մեջ լայնորեն օգտագործվող մեթոդ է՝ ցածր կոնցենտրացիայի ԴՆԹ նմուշներից, այդ թվում՝ ccfDNA-ից, գենոմային ԴՆԹ-ն արագորեն մեկուսացնելու և մաքրելու համար [36]:
Միդիաների հեմոլիմֆի ներկայացուցչական ccfDNA էլեկտրոֆորեգրամ։ Արդյունահանված է NucleoSnap Plasma Kit-ով (վերևում) և QIAamp DNA Investigator Kit-ով։ B Ջութակի գրաֆիկ, որը ցույց է տալիս հեմոլիմֆի ccfDNA կոնցենտրացիաների (±SE) բաշխումը միդիաներում։ Սև և կարմիր գծերը համապատասխանաբար ներկայացնում են միջնարժեքը, առաջին և երրորդ քվարտիլները։
Մարդկանց և պրիմատների մոտ ccfDNA-ի մոտավորապես 1%-ը ունի օտար աղբյուր [21, 37]: Հաշվի առնելով երկփեղկանի կենդանիների կիսաբաց շրջանառության համակարգը, մանրէներով հարուստ ծովային ջուրը և միդիաների ccfDNA-ի չափերի բաշխումը, մենք ենթադրեցինք, որ միդիաների հեմոլիմֆ ccfDNA-ն կարող է պարունակել մանրէային ԴՆԹ-ի հարուստ և բազմազան պաշար: Այս վարկածը ստուգելու համար մենք հաջորդականացրեցինք հեմոլիմֆ ccfDNA-ն Կերգուելեն կղզիներից հավաքված Aulacomya atra նմուշներից, ինչը տվեց ավելի քան 10 միլիոն ընթերցում, որոնցից 97.6%-ը հաջողությամբ անցավ որակի ստուգումը: Այնուհետև ցուցմունքները դասակարգվեցին ըստ սեփական և ոչ սեփական աղբյուրների՝ օգտագործելով BLASTN և NCBI երկփեղկանի կենդանիների տվյալների բազաները (Նկար S1, Լրացուցիչ տեղեկատվություն):
Մարդկանց մոտ արյան մեջ կարող է արտազատվել ինչպես միջուկային, այնպես էլ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն [38]: Այնուամենայնիվ, ներկայիս ուսումնասիրության մեջ հնարավոր չէր մանրամասն նկարագրել միդիաների միջուկային գենոմային ԴՆԹ-ն, քանի որ A. atra-ի գենոմը չի հաջորդականացվել կամ նկարագրվել: Այնուամենայնիվ, մենք կարողացանք նույնականացնել մեր սեփական ծագման ccfDNA-ի մի շարք բեկորներ՝ օգտագործելով երկփեղկանի գրադարանը (Նկ. S2, Լրացուցիչ տեղեկատվություն): Մենք նաև հաստատեցինք մեր սեփական ծագման ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը՝ հաջորդականացված A. atra գեների ուղղորդված ՊՇՌ ամպլիֆիկացիայի միջոցով (Նկ. 3): Նմանապես, հաշվի առնելով, որ A. atra-ի միտոքոնդրիալ գենոմը հասանելի է հանրային տվյալների բազաներում, կարելի է գտնել ապացույցներ միտոքոնդրիալ ccfDNA բեկորների առկայության մասին A. atra-ի հեմոլիմֆում: Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը հաստատվել է ՊՇՌ ամպլիֆիկացիայի միջոցով (Նկ. 3):
ՊՇՌ-ով ուժեղացված A. atra-ի (կարմիր կետեր – պահեստային համար՝ SRX5705969) և M. platensis-ի (կապույտ կետեր – պահեստային համար՝ SRX5705968) հեմոլիմֆում առկա էին տարբեր միտոքոնդրիալ գեներ: Նկարը վերցված է Breton et al., 2011 B-ից: A. atra-ի հեմոլիմֆի վերին շերտի ուժեղացում: Պահված է FTA թղթի վրա: Օգտագործեք 3 մմ դակիչ՝ ՊՇՌ խառնուրդը պարունակող ՊՇՌ խողովակի մեջ ուղղակիորեն ավելացնելու համար:
Հաշվի առնելով ծովային ջրում առատ մանրէային պարունակությունը, մենք սկզբում կենտրոնացանք հեմոլիմֆում մանրէային ԴՆԹ հաջորդականությունների բնութագրման վրա: Դրա համար մենք օգտագործում ենք երկու տարբեր ռազմավարություն: Առաջին ռազմավարությունում օգտագործվել է Kraken2-ը՝ ալգորիթմի վրա հիմնված հաջորդականությունների դասակարգման ծրագիր, որը կարող է նույնականացնել մանրէային հաջորդականությունները BLAST-ի և այլ գործիքների հետ համեմատելի ճշգրտությամբ [28]: Որոշվել է, որ ավելի քան 6719 ընթերցում ունեն բակտերիալ ծագում, մինչդեռ 124-ը և 64-ը համապատասխանաբար արխեաներից և վիրուսներից են (Նկար 4): Առավել առատ բակտերիալ ԴՆԹ բեկորները Firmicutes-ն էին (46%), Proteobacteria-ն (27%) և Bacteroidetes-ը (17%) (Նկար 4ա): Այս բաշխումը համապատասխանում է ծովային կապույտ միդիաների միկրոբիոմի նախորդ ուսումնասիրություններին [39, 40]: Gammaproteobacteria-ն Proteobacteria-ի հիմնական դասն էր (44%), այդ թվում՝ շատ Vibrionales-ներ (Նկար 4բ): ddPCR մեթոդը հաստատել է Vibrio ԴՆԹ բեկորների առկայությունը A. atra հեմոլիմֆի ccfԴՆԹ-ում (Նկար 4գ) [41]: CcfDNA-ի բակտերիալ ծագման մասին ավելի շատ տեղեկություններ ստանալու համար կիրառվել է լրացուցիչ մոտեցում (Նկ. S2, Լրացուցիչ տեղեկատվություն): Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքվել են որպես զույգ-ծայրերի ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես սեփական (երկփականներ) կամ ոչ սեփական ծագման՝ օգտագործելով BLASTN-ը, 1e−3 e արժեքը և >90% համանմանությամբ սահմանային արժեքը։ Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքվել են որպես զույգ-ծայրերի ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես սեփական (երկփականներ) կամ ոչ սեփական ծագման՝ օգտագործելով BLASTN-ը, 1e−3 e արժեքը և >90% համանմանությամբ սահմանային արժեքը։ В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) կամ чужие по происхольждени. 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքագրվել են որպես զույգերով ավարտվող ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես բնիկ (երկփական) կամ ոչ օրիգինալ՝ օգտագործելով BLASTN-ը և 1e-3 e արժեքը և >90% համանմանությամբ սահմանային արժեքը։在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皌e >90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使1-e3 bla值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。… В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственные (двустворые моллюски) կամ несобственные по происхольждени. 1e-3 и порога гомологии> 90%. Այս դեպքում, համընկնող ընթերցումները հավաքագրվել են որպես զույգերով ավարտվող ընթերցումներ և դասակարգվել են որպես սեփական (երկփականներ) կամ ոչ օրիգինալ՝ օգտագործելով e BLASTN և 1e-3 արժեքները և >90% հոմոլոգիայի շեմը։Քանի որ A. atra գենոմը դեռևս հաջորդականացված չէ, մենք օգտագործել ենք MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) ասեմբլերի de novo ասեմբլերի ռազմավարությունը: Ընդհանուր առմամբ 147,188 կոնտիգ է նույնականացվել որպես ծագման կախյալ (երկփեղկանի): Այս կոնտիգները այնուհետև պայթեցվել են 1e-10 e-արժեքներով՝ օգտագործելով BLASTN և BLASTX: Այս ռազմավարությունը թույլ տվեց մեզ նույնականացնել A. atra ccfDNA-ում առկա 482 ոչ երկփեղկանի բեկորներ: Այս ԴՆԹ բեկորների կեսից ավելին (57%) ստացվել է մանրէներից, հիմնականում խռիկային սիմբիոնտներից, այդ թվում՝ սուլֆոտրոֆ սիմբիոնտներից, և խռիկային սիմբիոնտ Solemya velum-ից (Նկար 5):
Հարաբերական առատությունը տիպի մակարդակում։ B Երկու հիմնական տիպերի (Firmicutes և Proteobacteria) մանրէային բազմազանություն։ ddPCR-ի ներկայացուցչական ուժեղացում։ C Vibrio spp. A. 16S rRNA գենի (կապույտ) հատվածներ երեք ատրա հեմոլիմֆներում։
Վերլուծվել է ընդհանուր առմամբ 482 հավաքված կոնտիգ։ Մետագենոմիկ կոնտիգների ծանոթագրությունների (պրոկարիոտներ և էուկարիոտներ) տաքսոնոմիկ բաշխման ընդհանուր պրոֆիլը։ B BLASTN-ի և BLASTX-ի միջոցով նույնականացված բակտերիալ ԴՆԹ բեկորների մանրամասն բաշխումը։
Kraken2 վերլուծությունը նաև ցույց տվեց, որ միդիաների ccfDNA-ն պարունակում է արխեական ԴՆԹ-ի բեկորներ, այդ թվում՝ Euryarchaeota-ի (65%), Crenarchaeota-ի (24%) և Thaurmarcheota-ի (11%) ԴՆԹ-ի բեկորներ (Նկար 6ա): Euryarchaeota-ից և Crenarchaeota-ից ստացված ԴՆԹ-ի բեկորների առկայությունը, որոնք նախկինում հայտնաբերվել էին կալիֆոռնիական միդիաների մանրէային համայնքում, չպետք է զարմացնի [42]: Չնայած Euryarchaeota-ն հաճախ կապված է ծայրահեղ պայմանների հետ, այժմ ճանաչվում է, որ և՛ Euryarchaeota-ն, և՛ Crenarcheota-ն ծովային կրիոգեն միջավայրում ամենատարածված պրոկարիոտներից են [43, 44]: Միդիաներում մեթանոգեն միկրոօրգանիզմների առկայությունը զարմանալի չէ, հաշվի առնելով Կերգուելենի սարահարթի հատակային արտահոսքերից մեթանի լայնածավալ արտահոսքերի վերջին հաղորդագրությունները [45] և Կերգուելեն կղզիների ափերի մոտ դիտարկված մանրէային մեթանի հնարավոր արտադրությունը [46]:
Այնուհետև մեր ուշադրությունը կենտրոնացավ ԴՆԹ վիրուսներից ստացված տվյալների վրա: Մեր ունեցած տեղեկություններով, սա միդիաների վիրուսի պարունակության առաջին ոչ նպատակային ուսումնասիրությունն է: Ինչպես և սպասվում էր, մենք հայտնաբերեցինք բակտերիոֆագերի (Caudovirales) ԴՆԹ բեկորներ (Նկար 6բ): Այնուամենայնիվ, ամենատարածված վիրուսային ԴՆԹ-ն գալիս է նուկլեոցիտովիրուսային տիպից, որը հայտնի է նաև որպես միջուկային ցիտոպլազմային մեծ ԴՆԹ վիրուս (NCLDV), որն ունի ցանկացած վիրուսի ամենամեծ գենոմը: Այս տիպում ԴՆԹ հաջորդականությունների մեծ մասը պատկանում է Mimimidoviridae (58%) և Poxviridae (21%) ընտանիքներին, որոնց բնական տերերը ներառում են ողնաշարավորներ և հոդվածոտանիներ, մինչդեռ այս ԴՆԹ հաջորդականությունների փոքր մասը պատկանում է հայտնի վիրուսաբանական ջրիմուռներին: Վարակում է ծովային էուկարիոտ ջրիմուռները: Հաջորդականությունները ստացվել են նաև Pandora վիրուսից, որը հայտնի վիրուսային սեռերի մեջ ամենամեծ գենոմի չափ ունեցող հսկա վիրուսն է: Հետաքրքիր է, որ հեմոլիմֆի ccfDNA հաջորդականության որոշմամբ որոշված ​​​​վիրուսով վարակված տերերի շրջանակը համեմատաբար մեծ էր (Նկար S3, Լրացուցիչ տեղեկատվություն): Այն ներառում է վիրուսներ, որոնք վարակում են միջատներին, ինչպիսիք են Baculoviridae-ն և Iridoviridae-ն, ինչպես նաև վիրուսներ, որոնք վարակում են ամեոբաներին, ջրիմուռներին և ողնաշարավորներին: Մենք նաև հայտնաբերել ենք Pithovirus sibericum գենոմին համապատասխանող հաջորդականություններ: Պիտովիրուսները (հայտնի են նաև որպես «զոմբի վիրուսներ») առաջին անգամ մեկուսացվել են Սիբիրի 30,000 տարեկան հավերժական սառցադաշտից [47]: Այսպիսով, մեր արդյունքները համապատասխանում են նախորդ զեկույցներին, որոնք ցույց են տալիս, որ այս վիրուսների ոչ բոլոր ժամանակակից տեսակներն են ոչնչացել [48], և որ այս վիրուսները կարող են առկա լինել հեռավոր ենթաարկտիկական ծովային էկոհամակարգերում:
Վերջապես, մենք փորձարկեցինք՝ պարզելու համար, թե արդյոք կարող ենք գտնել այլ բազմաբջիջ կենդանիների ԴՆԹ բեկորներ: BLASTN-ի և BLASTX-ի միջոցով nt, nr և RefSeq գրադարանների (գենոմային և սպիտակուցային) միջոցով հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 482 օտար կոնտիգ: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ բազմաբջիջ կենդանիների ccfDNA-ի օտար բեկորների մեջ գերակշռում է ոսկրային ոսկորների ԴՆԹ-ն (Նկար 5): Հայտնաբերվել են նաև միջատների և այլ տեսակների ԴՆԹ բեկորներ: ԴՆԹ բեկորների համեմատաբար մեծ մասը չի հայտնաբերվել, հնարավոր է՝ գենոմային տվյալների բազաներում ծովային տեսակների մեծ թվի թերներկայացվածության պատճառով՝ համեմատած ցամաքային տեսակների հետ [49]:
Այս աշխատանքում մենք LB հայեցակարգը կիրառում ենք միդիաների վրա՝ պնդելով, որ հեմոլիմֆի ccfDNA ներարկման հաջորդականացումը կարող է պատկերացում տալ ծովային ափամերձ էկոհամակարգերի կազմի մասին: Մասնավորապես, մենք պարզեցինք, որ 1) միդիաների հեմոլիմֆը պարունակում է համեմատաբար մեծ (~1-5 կբ) շրջանառվող ԴՆԹ բեկորների համեմատաբար բարձր կոնցենտրացիաներ (միկրոգրամային մակարդակներ). 2) այս ԴՆԹ բեկորները և՛ անկախ են, և՛ ոչ անկախ. 3) Այս ԴՆԹ բեկորների օտար աղբյուրների շարքում մենք հայտնաբերել ենք բակտերիալ, արխեական և վիրուսային ԴՆԹ, ինչպես նաև այլ բազմաբջիջ կենդանիների ԴՆԹ. 4) Այս օտար ccfDNA բեկորների կուտակումը հեմոլիմֆում տեղի է ունենում արագ և նպաստում է միդիաների ներքին ֆիլտրման ակտիվությանը: Եզրափակելով՝ մեր ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ LB հայեցակարգը, որը մինչ այժմ կիրառվել է հիմնականում կենսաբժշկության ոլորտում, կոդավորում է գիտելիքների հարուստ, բայց չուսումնասիրված աղբյուր, որը կարող է օգտագործվել պահապան տեսակների և նրանց միջավայրի միջև փոխազդեցությունն ավելի լավ հասկանալու համար:
Պրիմատներից բացի, ccfDNA-ի մեկուսացման դեպքեր են գրանցվել կաթնասունների մոտ, այդ թվում՝ մկների, շների, կատուների և ձիերի մոտ [50, 51, 52]: Այնուամենայնիվ, մեր իմացության չափով, մեր ուսումնասիրությունը առաջինն է, որը հաղորդում է ccfDNA-ի հայտնաբերման և հաջորդականության որոշման մասին բաց շրջանառության համակարգ ունեցող ծովային տեսակների մոտ: Միդիաների այս անատոմիական առանձնահատկությունը և ֆիլտրման ունակությունը կարող են, գոնե մասամբ, բացատրել շրջանառվող ԴՆԹ բեկորների տարբեր չափերի բնութագրերը՝ համեմատած այլ տեսակների հետ: Մարդկանց մոտ արյան մեջ շրջանառվող ԴՆԹ բեկորների մեծ մասը փոքր բեկորներ են, որոնց չափերը տատանվում են 150-ից մինչև 200 զույգ հիմքի վրա՝ առավելագույնը 167 զույգ հիմքի վրա [34, 53]: ԴՆԹ բեկորների փոքր, բայց նշանակալի մասը 300-ից մինչև 500 զույգ հիմքի վրա է, և մոտ 5%-ը ավելի երկար են, քան 900 զույգ հիմքի վրա [54]: Այս չափերի բաշխման պատճառն այն է, որ պլազմայում ccfDNA-ի հիմնական աղբյուրը առաջանում է բջջային մահվան հետևանքով՝ կամ բջջային մահվան, կամ առողջ անհատների մոտ շրջանառվող արյունաստեղծ բջիջների նեկրոզի, կամ քաղցկեղով հիվանդների մոտ ուռուցքային բջիջների ապոպտոզի պատճառով (հայտնի է որպես շրջանառվող ուռուցքային ԴՆԹ): Միդիաներում մեր կողմից հայտնաբերված հեմոլիֆ ccfDNA-ի չափերի բաշխումը տատանվում էր 1000-ից մինչև 5000 զույգ հիմքի սահմաններում, ինչը ենթադրում է, որ միդիաների ccfDNA-ն ունի այլ ծագում: Սա տրամաբանական վարկած է, քանի որ միդիաներն ունեն կիսաբաց անոթային համակարգ և ապրում են ծովային ջրային միջավայրերում, որոնք պարունակում են մանրէային գենոմային ԴՆԹ-ի բարձր կոնցենտրացիաներ: Փաստորեն, էկզոգեն ԴՆԹ-ի օգտագործմամբ մեր լաբորատոր փորձարկումները ցույց են տվել, որ միդիաները կուտակում են ԴՆԹ-ի բեկորներ ծովային ջրում, առնվազն մի քանի ժամ անց դրանք քայքայվում են բջջային կլանումից հետո և/կամ արտազատվում և/կամ պահվում են տարբեր կազմակերպություններում: Հաշվի առնելով բջիջների (թե՛ պրոկարիոտ, թե՛ էուկարիոտ) հազվադեպությունը, փականային խցիկների օգտագործումը կնվազեցնի ինչպես սեփական աղբյուրներից, այնպես էլ օտար աղբյուրներից ստացված ccfDNA-ի քանակը: Հաշվի առնելով երկփեղկանի բնածին իմունիտետի կարևորությունը և շրջանառվող ֆագոցիտների մեծ քանակը, մենք լրացուցիչ ենթադրեցինք, որ նույնիսկ օտար ccfDNA-ն հարստացված է շրջանառվող ֆագոցիտներով, որոնք կուտակում են օտար ԴՆԹ միկրոօրգանիզմների և/կամ բջջային մնացորդների կլանման ժամանակ: Ամփոփելով՝ մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ երկփեղկանի հեմոլիմֆի ccfDNA-ն մոլեկուլային տեղեկատվության եզակի պահոց է և ամրապնդում է դրանց կարգավիճակը որպես պահապան տեսակ:
Մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ մանրէներից ստացված հեմոլիմֆի ccfDNA բեկորների հաջորդականացումը և վերլուծությունը կարող են հիմնական տեղեկություններ տրամադրել տեր բակտերիալ ֆլորայի և շրջակա ծովային էկոհամակարգում առկա մանրէների մասին: Կրակոցային հաջորդականացման տեխնիկաները բացահայտել են A. atra կոմենսալ բակտերիաների խռիկների հաջորդականություններ, որոնք բաց կթողնվեին, եթե օգտագործվեին 16S rRNA-ի նույնականացման ավանդական մեթոդները, մասամբ՝ հղումային գրադարանի կողմնակալության պատճառով: Փաստորեն, Կերգելենի նույն միդիաների շերտում M. platensis-ից հավաքված LB տվյալների մեր օգտագործումը ցույց տվեց, որ խռիկների հետ կապված բակտերիալ սիմբիոնտների կազմը նույնն էր երկու միդիաների տեսակների համար (Նկ. S4, Լրացուցիչ տեղեկատվություն): Երկու գենետիկորեն տարբեր միդիաների այս նմանությունը կարող է արտացոլել Կերգելենի սառը, ծծմբային և հրաբխային հանքավայրերում բակտերիալ համայնքների կազմը [55, 56, 57, 58]: Ծծումբը նվազեցնող միկրոօրգանիզմների ավելի բարձր մակարդակները լավ նկարագրվել են կենսատուրբացված ափամերձ տարածքներից, ինչպիսին է Պորտ-օ-Ֆրանսի ափը, միդիաներ հավաքելիս [59]: Մեկ այլ հնարավորություն է այն, որ կոմենսալ միդիաների բուսական աշխարհը կարող է ազդվել հորիզոնական փոխանցման միջոցով [60, 61]: Անհրաժեշտ են լրացուցիչ հետազոտություններ՝ ծովային միջավայրի, ծովի հատակի մակերեսի և միդիաների սիմբիոտիկ բակտերիաների կազմի միջև փոխհարաբերությունը որոշելու համար: Այս ուսումնասիրությունները ներկայումս շարունակվում են:
Հեմոլիմֆային ccfDNA-ի երկարությունը և կոնցենտրացիան, դրա մաքրման հեշտությունը և բարձր որակը, որը թույլ է տալիս արագ հաջորդականացում, ծովային ափամերձ էկոհամակարգերում կենսաբազմազանությունը գնահատելու համար միդիաների ccfDNA-ի օգտագործման բազմաթիվ առավելություններից մի քանիսն են: Այս մոտեցումը հատկապես արդյունավետ է տվյալ էկոհամակարգում վիրուսային համայնքների (վիրոմների) բնութագրման համար [62, 63]: Ի տարբերություն մանրէների, արխեաների և էուկարիոտների, վիրուսային գենոմները չեն պարունակում ֆիլոգենետիկորեն պահպանված գեներ, ինչպիսիք են 16S հաջորդականությունները: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ինդիկատոր տեսակների, ինչպիսիք են միդիաները, հեղուկ բիոպսիաները կարող են օգտագործվել ccfDNA վիրուսի համեմատաբար մեծ թվով բեկորներ հայտնաբերելու համար, որոնք հայտնի են ափամերձ ծովային էկոհամակարգերում սովորաբար բնակվող տերերին վարակելու համար: Սա ներառում է վիրուսներ, որոնք հայտնի են նախակենդանիներ, հոդվածոտանիներ, միջատներ, բույսեր և բակտերիալ վիրուսներ (օրինակ՝ բակտերիոֆագեր) վարակելու համար: Նմանատիպ բաշխում հայտնաբերվել է, երբ մենք ուսումնասիրել ենք Կերգուելենի նույն միդիաների շերտում հավաքված կապույտ միդիաների (M. platensis) հեմոլիմֆային ccfDNA վիրոմը (աղյուսակ S2, լրացուցիչ տեղեկատվություն): ccfDNA-ի հրացանային հաջորդականացումը իսկապես նոր մոտեցում է, որը թափ է հավաքում մարդկանց կամ այլ տեսակների վիրուսային ուսումնասիրության մեջ [21, 37, 64]: Այս մոտեցումը հատկապես օգտակար է երկշղթա ԴՆԹ վիրուսների ուսումնասիրության համար, քանի որ բոլոր երկշղթա ԴՆԹ վիրուսների մեջ ոչ մի գեն չի պահպանվում, ինչը ներկայացնում է Բալթիմորի վիրուսների ամենաբազմազան և լայն դասը [65]: Չնայած այս վիրուսների մեծ մասը մնում է չդասակարգված և կարող է ներառել վիրուսներ վիրուսային աշխարհի բոլորովին անհայտ մասից [66], մենք պարզեցինք, որ A. atra և M. platensis միդիաների վիրոմներն ու տերերի տիրույթները նմանապես ընկնում են երկու տեսակների միջև (տե՛ս նկար S3, լրացուցիչ տեղեկատվություն): Այս նմանությունը զարմանալի չէ, քանի որ այն կարող է արտացոլել շրջակա միջավայրում առկա ԴՆԹ-ի կլանման ընտրողականության բացակայությունը: Ներկայումս անհրաժեշտ են մաքրված ՌՆԹ-ի օգտագործմամբ ապագա ուսումնասիրություններ՝ ՌՆԹ վիրուսայինը բնութագրելու համար:
Մեր ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործել ենք շատ խիստ խողովակաշար, որը վերցված է Կովարսկու և գործընկերների [37] աշխատանքից, որոնք օգտագործել են համատեղ կարդացումների և կոնտիգների երկփուլ ջնջում բնիկ ccfDNA-ի հավաքումից առաջ և հետո, ինչը հանգեցրել է չքարտեզագրված կարդացումների մեծ համամասնության: Հետևաբար, մենք չենք կարող բացառել, որ այս չքարտեզագրված կարդացումներից մի քանիսը կարող են դեռևս ունենալ իրենց սեփական ծագումը, հիմնականում այն ​​պատճառով, որ մենք չունենք այս միդիա տեսակի համար հղման գենոմ: Մենք նաև օգտագործել ենք այս խողովակաշարը, քանի որ մտահոգված էինք սեփական և ոչ սեփական կարդացումների միջև եղած քիմերաներով և Illumina MiSeq PE75-ի կողմից ստեղծված կարդացումների երկարություններով: Չքարտեզագրված կարդացումների մեծամասնության մեկ այլ պատճառն այն է, որ ծովային մանրէների մեծ մասը, հատկապես հեռավոր տարածքներում, ինչպիսին է Կերգուելենը, չեն մեկնաբանվել: Մենք օգտագործել ենք Illumina MiSeq PE75-ը՝ ենթադրելով, որ ccfDNA բեկորների երկարությունները նման են մարդու ccfDNA-ին: Հետագա ուսումնասիրությունների համար, հաշվի առնելով մեր արդյունքները, որոնք ցույց են տալիս, որ հեմոլիմֆի ccfDNA-ն ունի ավելի երկար կարդացման ժամանակ, քան մարդկանց և/կամ կաթնասունների մոտ, մենք խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել հաջորդականության հարթակ, որն ավելի հարմար է ccfDNA-ի ավելի երկար բեկորների համար: Այս պրակտիկան շատ ավելի հեշտ կդարձնի ավելի խորը վերլուծության համար ավելի շատ ցուցումների նույնականացումը: Ներկայումս անհասանելի A. atra միջուկային գենոմի ամբողջական հաջորդականության ստացումը նաև մեծապես կնպաստի ccfDNA-ի տարբերակմանը սեփական և ոչ սեփական աղբյուրներից: Հաշվի առնելով, որ մեր հետազոտությունը կենտրոնացել է հեղուկ բիոպսիայի հայեցակարգը միդիաների վրա կիրառելու հնարավորության վրա, մենք հույս ունենք, որ քանի որ այս հայեցակարգը կօգտագործվի ապագա հետազոտություններում, կմշակվեն նոր գործիքներ և խողովակաշարեր՝ միդիաների մանրէային բազմազանությունն ուսումնասիրելու այս մեթոդի ներուժը մեծացնելու համար: Ծովային էկոհամակարգ:
Որպես ոչ ինվազիվ կլինիկական բիոմարկեր, մարդու պլազմայում ccfDNA-ի բարձր մակարդակը կապված է տարբեր հիվանդությունների, հյուսվածքների վնասվածքի և սթրեսային պայմանների հետ [67,68,69]: Այս աճը կապված է հյուսվածքների վնասվածքից հետո սեփական ծագման ԴՆԹ բեկորների արտազատման հետ: Մենք այս խնդիրը լուծել ենք սուր ջերմային սթրեսի միջոցով, որի դեպքում միդիաները կարճ ժամանակով ենթարկվել են 30°C ջերմաստիճանի: Մենք այս վերլուծությունը կատարել ենք երեք տարբեր տեսակի միդիաների վրա երեք անկախ փորձերի ընթացքում: Այնուամենայնիվ, մենք սուր ջերմային սթրեսից հետո ccfDNA մակարդակի որևէ փոփոխություն չենք հայտնաբերել (տե՛ս նկար S5, լրացուցիչ տեղեկատվություն): Այս հայտնագործությունը կարող է մասամբ բացատրել այն փաստը, որ միդիաներն ունեն կիսաբաց շրջանառության համակարգ և կուտակում են մեծ քանակությամբ օտար ԴՆԹ՝ իրենց բարձր ֆիլտրացիոն ակտիվության շնորհիվ: Մյուս կողմից, միդիաները, ինչպես շատ անողնաշարավորներ, կարող են ավելի դիմացկուն լինել սթրեսից առաջացած հյուսվածքային վնասվածքի նկատմամբ, դրանով իսկ սահմանափակելով ccfDNA-ի արտազատումը իրենց հեմոլիմֆում [70, 71]:
Մինչ օրս ջրային էկոհամակարգերում կենսաբազմազանության ԴՆԹ վերլուծությունը հիմնականում կենտրոնացած է եղել շրջակա միջավայրի ԴՆԹ-ի (eDNA) մետաբարկոդավորման վրա: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդը սովորաբար սահմանափակվում է կենսաբազմազանության վերլուծության մեջ, երբ օգտագործվում են պրայմերներ: «Shotgun» հաջորդականության կիրառումը շրջանցում է ՊՇՌ-ի սահմանափակումները և պրայմերների հավաքածուների կողմնակալ ընտրությունը: Այսպիսով, որոշ առումով, մեր մեթոդն ավելի մոտ է վերջերս օգտագործված բարձր արտադրողականության eDNA «Shotgun» հաջորդականության մեթոդին, որը կարող է ուղղակիորեն հաջորդականացնել մասնատված ԴՆԹ-ն և վերլուծել գրեթե բոլոր օրգանիզմները [72, 73]: Այնուամենայնիվ, կան մի շարք հիմնարար խնդիրներ, որոնք տարբերակում են LB-ն ստանդարտ eDNA մեթոդներից: Իհարկե, eDNA-ի և LB-ի միջև հիմնական տարբերությունը բնական ֆիլտրի տերերի օգտագործումն է: Հաղորդվել է ծովային տեսակների, ինչպիսիք են սպունգերը և երկփեղկանիները (Dresseina spp.), օգտագործումը որպես eDNA-ի ուսումնասիրության բնական ֆիլտր [74, 75]: Այնուամենայնիվ, Դրեյսենայի ուսումնասիրության մեջ օգտագործվել են հյուսվածքային բիոպսիաներ, որոնցից ԴՆԹ-ն արդյունահանվել է: LB-ից ccfDNA-ի վերլուծությունը չի պահանջում հյուսվածքային բիոպսիա, մասնագիտացված և երբեմն թանկարժեք սարքավորումներ և լոգիստիկա, որոնք կապված են eDNA-ի կամ հյուսվածքային բիոպսիայի հետ: Փաստորեն, մենք վերջերս հաղորդել ենք, որ LB-ից ccfDNA-ն կարող է պահպանվել և վերլուծվել FTA աջակցությամբ՝ առանց սառը շղթա պահպանելու, ինչը մեծ մարտահրավեր է հեռավոր շրջաններում հետազոտությունների համար [76]: Հեղուկ բիոպսիաներից ccfDNA-ի արդյունահանումը նույնպես պարզ է և ապահովում է բարձրորակ ԴՆԹ՝ որսորդական հաջորդականության և ՊՇՌ վերլուծության համար: Սա մեծ առավելություն է՝ հաշվի առնելով eDNA վերլուծության հետ կապված որոշ տեխնիկական սահմանափակումներ [77]: Նմուշառման մեթոդի պարզությունն ու ցածր արժեքը հատկապես հարմար են նաև երկարաժամկետ մոնիթորինգի ծրագրերի համար: Բացի բարձր ֆիլտրացման ունակությունից, երկփեղկանի մկանուտների մեկ այլ հայտնի առանձնահատկությունը նրանց լորձի քիմիական մուկոպոլիսախարիդային կազմն է, որը նպաստում է վիրուսների կլանմանը [78, 79]: Սա երկփեղկանի մկանուտներին դարձնում է իդեալական բնական ֆիլտր՝ կենսաբազմազանությունը և կլիմայի փոփոխության ազդեցությունը տվյալ ջրային էկոհամակարգում բնութագրելու համար: Չնայած տիրոջից ստացված ԴՆԹ բեկորների առկայությունը կարող է դիտվել որպես մեթոդի սահմանափակում՝ համեմատած eDNA-ի հետ, նման բնիկ ccfDNA ունենալու հետ կապված արժեքը՝ համեմատած eDNA-ի հետ, միաժամանակ հասկանալի է առողջապահական ուսումնասիրությունների համար հասանելի տեղեկատվության հսկայական քանակի համար: փոխհատուցել տիրոջը: Սա ներառում է տիրոջ գենոմում ինտեգրված վիրուսային հաջորդականությունների առկայությունը: Սա հատկապես կարևոր է միդիաների համար՝ հաշվի առնելով երկփեղկանի մկների մոտ հորիզոնական փոխանցվող լեյկեմիկ ռետրովիրուսների առկայությունը [80, 81]: LB-ի մեկ այլ առավելություն eDNA-ի նկատմամբ այն է, որ այն օգտագործում է հեմոլիմֆում շրջանառվող արյան բջիջների ֆագոցիտային ակտիվությունը, որը կլանում է միկրոօրգանիզմները (և նրանց գենոմները): Ֆագոցիտոզը երկփեղկանի մկների արյան բջիջների հիմնական գործառույթն է [82]: Վերջապես, մեթոդը օգտագործում է միդիաների բարձր ֆիլտրման ունակությունը (միջինում 1.5 լ/ժ ծովային ջուր) և երկօրյա շրջանառությունը, որոնք մեծացնում են ծովային ջրի տարբեր շերտերի խառնումը՝ թույլ տալով որսալ հետերոլոգ eDNA-ն: [83, 84]: Այսպիսով, միդիաների ccfDNA վերլուծությունը հետաքրքիր միջոց է՝ հաշվի առնելով միդիաների սննդային, տնտեսական և շրջակա միջավայրի վրա ազդեցությունը: Նման մարդկանցից հավաքված LB-ի վերլուծությանը, այս մեթոդը նաև հնարավորություն է տալիս չափել տիրոջ ԴՆԹ-ի գենետիկական և էպիգենետիկ փոփոխությունները էկզոգեն նյութերի ազդեցության տակ: Օրինակ, կարելի է նախատեսել երրորդ սերնդի հաջորդականության տեխնոլոգիաներ՝ բնիկ ccfDNA-ում գենոմի լայնածավալ մեթիլացման վերլուծություն կատարելու համար՝ օգտագործելով նանոփոսերի հաջորդականացում: Այս գործընթացը պետք է հեշտացվի այն փաստով, որ միդիաների ccfDNA բեկորների երկարությունը իդեալականորեն համատեղելի է երկար ընթերցման հաջորդականության հարթակների հետ, որոնք թույլ են տալիս գենոմի լայնածավալ ԴՆԹ մեթիլացման վերլուծություն կատարել մեկ հաջորդականության վազքից՝ առանց քիմիական փոխակերպումների անհրաժեշտության:85,86] Սա հետաքրքիր հնարավորություն է, քանի որ ցույց է տրվել, որ ԴՆԹ մեթիլացման օրինաչափությունները արտացոլում են շրջակա միջավայրի սթրեսի նկատմամբ արձագանքը և պահպանվում են բազմաթիվ սերունդների ընթացքում: Հետևաբար, այն կարող է արժեքավոր պատկերացում տալ կլիմայի փոփոխության կամ աղտոտիչների ազդեցությանը ենթարկվելուց հետո արձագանքը կարգավորող հիմքում ընկած մեխանիզմների մասին [87]: Այնուամենայնիվ, LB-ի օգտագործումը զուրկ չէ սահմանափակումներից: Անհրաժեշտ չէ ասել, որ սա պահանջում է էկոհամակարգում ինդիկատոր տեսակների առկայություն: Ինչպես նշվեց վերևում, տվյալ էկոհամակարգի կենսաբազմազանությունը գնահատելու համար LB-ի օգտագործումը պահանջում է նաև խիստ կենսաինֆորմատիկայի խողովակաշար, որը հաշվի է առնում աղբյուրից ԴՆԹ բեկորների առկայությունը: Մեկ այլ լուրջ խնդիր է ծովային տեսակների համար հղման գենոմների առկայությունը: Հույս կա, որ այնպիսի նախաձեռնություններ, ինչպիսիք են «Ծովային կաթնասունների գենոմների նախագիծը» և վերջերս ստեղծված Fish10k նախագիծը [88], կնպաստեն նման վերլուծությունների իրականացմանը ապագայում: LB հայեցակարգի կիրառումը ծովային ֆիլտրերով սնվող օրգանիզմների վրա նույնպես համատեղելի է հաջորդականության տեխնոլոգիայի վերջին նվաճումների հետ, ինչը այն դարձնում է հարմար բազմաօմ բիոմարկերների մշակման համար՝ շրջակա միջավայրի սթրեսին ի պատասխան ծովային բնակավայրերի առողջության մասին կարևոր տեղեկատվություն տրամադրելու համար:
Գենոմի հաջորդականության տվյալները պահվել են NCBI Sequence Read Archive-ում՝ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808, Bioprojects SRR8924808 անվանակարգի ներքո։
Բրայերլի Ա.Ս., Քինգսֆորդ Մ.Ջ. Կլիմայի փոփոխության ազդեցությունը ծովային կյանքի և էկոհամակարգերի վրա: Cole Biology. 2009; 19: P602–P614:
Գիսսի Ե, Մանեա Ե, Մազարիս ԱԴ, Ֆրաշետի Ս, Ալպանիդու Վ, Բևիլակուա Ս և այլք։ Դիտարկենք կլիմայի փոփոխության և այլ տեղական սթրեսորների համակցված ազդեցությունը ծովային միջավայրի վրա։ Ընդհանուր գիտական ​​միջավայր։ 2021;755:142564։
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ) մարտի 1-ի գիտ. 2020; 7:48.
Սերոնտ Լ, Նիկաստրո ԿՌ, Զարդի ԳԻ, Գոբերվիլ Ե. Կրկնվող ջերմային սթրեսի պայմաններում ջերմության նկատմամբ դիմադրողականության նվազումը բացատրում է կապույտ միդիաների բարձր ամառային մահացությունը: Գիտական ​​զեկույց 2019; 9:17498:
Ֆեյ ՍԲ, Սիեպիելսկի Ա.Մ., Նուսլե Ս., Սերվանտես-Յոշիդա Կ., Հվան Ջ.Լ., Հուբեր Է.Ռ. և այլք։ Կենդանիների մահացության հաճախականության, պատճառների և ծավալի վերջին փոփոխությունները։ ԱՄՆ Գիտությունների ազգային ակադեմիայի նյութեր։ 2015;112:1083-8։
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Բազմաթիվ ոչ հատուկ պաթոգեններ կարող են առաջացնել Pinna nobilis-ի զանգվածային մահացություն: Կյանք. 2020; 10:238.
Բրեդլի Մ., Քաութս Ս.Ջ., Ջենկինս Ե., Օ'Հարա Թ.Մ. Կլիմայի փոփոխության հնարավոր ազդեցությունը Արկտիկայի զոոնոտիկ հիվանդությունների վրա: Միջազգային բժշկական հանդես Circumpolar health. 2005; 64:468–77:
Բեյեր Ջ., Գրին ՆՎ, Բրուքս Ս., Ալան ԻՋ., Ռուուս Ա., Գոմես Թ. և այլք։ Կապույտ միդիաները (Mytilus edulis spp.) որպես ազդանշանային օրգանիզմներ ափամերձ աղտոտվածության մոնիթորինգում. ակնարկ։ Mar Environ Res 2017; 130:338-65։
Սիրավենյա Գ., Մարսոնի Ս., Սիենա Ս., Բարդելի Ա. Հեղուկ բիոպսիայի ինտեգրումը քաղցկեղի բուժման մեջ: Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48:
Վան Ջ.Ս.Մ., Մասի Ս., Գարսիա-Կորբաչո Ջ., Մուլիեր Ֆ., Բրենտոն Ջ.Դ., Կալդաս Ս. և այլք։ Հեղուկ բիոպսիայի հասունացում. Թույլ է տալիս ուռուցքի ԴՆԹ-ին շրջանառվել։ Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38։
Մանդել Պ., Մետաիս Պ. Նուկլեինաթթուներ մարդու պլազմայում: Soc Biol դուստր ձեռնարկությունների նիստերի արձանագրություններ: 1948; 142:241-3:
Բրոնկհորստ Ա.Ջ., Ունգերեր Վ., Հոլդենրիդեր Ս. Բջջային ազատ ԴՆԹ-ի նոր դերը որպես մոլեկուլային մարկեր քաղցկեղի բուժման համար: Բիոմոլային վերլուծության քանակականացում: 2019;17:100087:
Իգնատիադիս Մ., Սլեջ Գ.Վ., Ջեֆրի Ս.Ս. Հեղուկ բիոպսիան մտնում է կլինիկա. ներդրման խնդիրներ և ապագա մարտահրավերներ: Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312:
Լո ՅՄ, Կորբետտա Ն., Չեմբերլեյն Պ.Ֆ., Ռայ Վ., Սարջենթ Ի.Լ., Ռեդման Ս.Վ. և ուրիշներ։ Պտղի ԴՆԹ-ն առկա է մայրական պլազմայում և շիճուկում։ Lancet. 1997; 350:485-7։
Մուֆարեյ Մ.Ն., Վոնգ Ռ.Ջ., Շոու Գ.Մ., Սթիվենսոն Դ.Կ., Քվեյք Ս.Ռ. Հղիության ընթացքի և դրա բարդությունների ուսումնասիրություն՝ օգտագործելով հղիության ընթացքում կանանց արյան մեջ շրջանառվող արտաբջջային ՌՆԹ-ն: Dopediatrics. 2020;8:605219:
Օլերիխ Մ., Շերվուդ Կ., Քեաուն Պ., Շյուց Ե., Բեք Ջ., Ստեգբաուեր Ջ. և այլք: Հեղուկ բիոպսիա. դոնորական բջիջներից զերծ ԴՆԹ-ն օգտագործվում է երիկամային տրանսպլանտի ալոգեն վնասվածքները հայտնաբերելու համար: Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603:
Խուան Ֆ.Կ., Լո Յ.Մ. Նորարարություններ նախածննդյան ախտորոշման մեջ. մայրական պլազմայի գենոմի հաջորդականացում: Աննա Մ.Դ. 2016;67:419-32:
Գու Վ, Դենգ Շ, Լի Մ, Սուկու ՅԴ, Արևալո Ս, Սթրայք Դ և այլք։ Վարակված մարմնական հեղուկների նոր սերնդի մետագենոմիկ հաջորդականության միջոցով պաթոգենների արագ հայտնաբերում։ Nat Medicine. 2021;27:115-24։