Պեպտիդների և սպիտակուցների տարանջատման խառը ռեժիմի ստացիոնար փուլերի պատրաստում բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրմամբ

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար: Բրաուզերի տարբերակը, որը դուք օգտագործում եք, սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ին: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Սիլիցիումի ծակոտկեն մասնիկները պատրաստվել են սոլ-գել մեթոդով՝ որոշ փոփոխություններով՝ մակրոծակոտկեն մասնիկներ ստանալու համար: Այս մասնիկները ածանցավորվել են շրջելի հավելումների մասնատման շղթայի փոխանցման (RAFT) պոլիմերացման միջոցով՝ N-ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատով (PMI) և ստիրոլով՝ N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) և ստիրոլից՝ N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate-ով (PMI) պատրաստելու համար: պակաս պողպատե սյուներ (100 × 1,8 մմ id) փաթեթավորվել են ցեխային փաթեթավորմամբ: Գնահատված է PMP սյունակի առանձնացումը մի պեպտիդային խառնուրդից, որը բաղկացած է հինգ պեպտիդներից (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Argin) և մարդկային դիագրաֆիկական դիագրաֆիկ գործունակությունը: ալբումին (HAS): Օպտիմալ զտման պայմաններում պեպտիդային խառնուրդի տեսական թիթեղների քանակը հասնում է մինչև 280,000 թիթեղ/մ²: Համեմատելով մշակված սյունակի տարանջատման կատարումը առևտրային Ascentis Express RP-Amide սյունակի հետ, նկատվեց, որ PMP սյունակի տարանջատման գործունակությունը գերազանցում է առևտրային սյունակի անջատման արդյունավետությունը և separ լուծաչափի արդյունավետությունը:
Վերջին տարիներին կենսադեղագործական արդյունաբերությունը դարձել է ընդլայնվող համաշխարհային շուկա՝ շուկայական մասնաբաժնի զգալի աճով: Կենսադեղագործական արդյունաբերության պայթյունավտանգ աճով1,2,3, պեպտիդների և սպիտակուցների վերլուծությունը շատ ցանկալի է: Բացի թիրախային պեպտիդից, մի քանի կեղտեր են ստեղծվում պեպտիդների սինթեզի և վերլուծության ընթացքում պահանջվող մաքրագրման համար: Մարմնի հեղուկներում, հյուսվածքներում և բջիջներում սպիտակուցները չափազանց բարդ խնդիր են՝ մեկ նմուշում պոտենցիալ հայտնաբերվող տեսակների մեծ քանակի պատճառով: Թեև զանգվածային սպեկտրոմետրիան արդյունավետ գործիք է պեպտիդների և սպիտակուցների հաջորդականության համար, եթե այդպիսի նմուշները մեկ անցումով ներարկվեն զանգվածային սպեկտրոմետր, ապա բաժանումը իդեալական չի լինի: անալիտները, որոնք մտնում են զանգվածային սպեկտրոմետր տվյալ ժամանակում4,5,6: Բացի այդ, հեղուկ ֆազային տարանջատման ժամանակ անալիտները կարող են կենտրոնանալ նեղ շրջաններում՝ դրանով իսկ կենտրոնացնելով այդ անալիտները և բարելավելով MS հայտնաբերման զգայունությունը: Հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (LC) զգալիորեն առաջադիմել է վերջին տասնամյակի ընթացքում և դարձել է վերլուծության հանրաճանաչ տեխնիկա70,9, պրոտեում:
Հակադարձ փուլով հեղուկ քրոմատոգրաֆիան (RP-LC) լայնորեն օգտագործվում է պեպտիդային խառնուրդների մաքրման և տարանջատման համար՝ օգտագործելով օկտադեցիլ-մոդիֆիկացված սիլիցիում (ODS) որպես անշարժ փուլ11,12,13: Այնուամենայնիվ, RP ստացիոնար փուլերը չեն ապահովում դրանց, պեպտիդների, հատուկ կառուցվածքի և սպիտակուցների բարդ կառուցվածքի բավարար տարանջատում5: նախագծված ստացիոնար փուլերը պահանջվում են բևեռային և ոչ բևեռային մասերով պեպտիդների և սպիտակուցների վերլուծության համար՝ այս անալիտների հետ փոխազդելու և պահպանելու համար: և սպիտակուցների տարանջատումները17,18,19,20,21: Խառը ռեժիմի ստացիոնար փուլերը (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, բևեռային ինտերկալացիա/RPLC) հարմար են պեպտիդների և սպիտակուցների տարանջատման համար՝ պայմանավորված ինչպես բևեռային, այնպես էլ ոչ բևեռային խմբերի առկայությամբ22,23,24,25,25,26,27, բևեռային բևեռային բևեռային բևեռային, 26,27, բևեռային բևեռային խմբերի առկայությամբ: lar խմբերը ցույց են տալիս լավ տարանջատման ուժ և յուրահատուկ ընտրողականություն բևեռային և ոչ բևեռային անալիտների համար, քանի որ տարանջատումը կախված է անալիտի և ստացիոնար փուլի փոխազդեցությունից:Մուլտիմոդալ փոխազդեցություններ 29, 30, 31, 32. Վերջերս Zhang et al.30-ը պատրաստեց դոդեցիլով ավարտված պոլիամինային ստացիոնար փուլ և հաջողությամբ առանձնացրեց ածխաջրածինները, հակադեպրեսանտները, ֆլավոնոիդները, նուկլեոզիդները, էստրոգենները և մի շարք այլ անալիտներ: Բևեռային ինտերկալատորն ունի և՛ բևեռային, և՛ ոչ բևեռային խմբեր, ուստի այն կարող է օգտագործվել պեպտիդների և սպիտակուցների առանձնացման համար, որոնք ունեն և՛ հիդրոֆոբ, և՛ հիդրոֆոբիկ սյունակներ: ed C18 սյունակներ) առևտրային առումով հասանելի են Ascentis Express RP-Amide սյունակներ ապրանքային անվանումով, սակայն այս սյունակները օգտագործվում են միայն ամին 33-ի վերլուծության համար:
Ընթացիկ ուսումնասիրության մեջ պատրաստվել և գնահատվել է բևեռային ներկառուցված ստացիոնար փուլ (N-ֆենիլմալեյմիդով ներկառուցված պոլիստիրոլ)՝ HSA-ի պեպտիդների և տրիպսինի մարսողությունների տարանջատման համար: G), TMOS, ջրի քացախաթթուն ճշգրտվել է մեծ ծակոտիներով սիլիցիումի մասնիկներ պատրաստելու համար: Երկրորդ, նոր լիգանդ՝ ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլ վինիլիզոցիանատը, սինթեզվել և օգտագործվել է սիլիցիումի մասնիկները ածանցավորելու համար՝ բևեռային ներկառուցված ստացիոնար փուլ պատրաստելու համար: Փաթեթավորման սխեման: Սյունակի փաթեթավորմանը օժանդակվում է մեխանիկական թրթռում` ապահովելու համար սյունակի ներսում համասեռ շերտի ձևավորումը: Գնահատեք հինգ պեպտիդներից բաղկացած պեպտիդային խառնուրդների փաթեթավորված սյունակի բաժանումը.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) և մարդու շիճուկի ալբումինի տրիպսինի մարսողությունը (HAS): HSA-ի պեպտիդային խառնուրդը և տրիպսինի մարսումը նկատվել են, որ առանձնանում են լավ լուծաչափով և PMPA-ի արդյունավետությամբ: Սյունակ: Ե՛վ պեպտիդները, և՛ սպիտակուցները լավ լուծված և արդյունավետ են PMP սյունակի վրա, որն ավելի արդյունավետ էր, քան Ascentis Express RP-Amide սյունակը:
PEG (պոլիէթիլեն գլիկոլ), միզանյութ, քացախաթթու, տրիմեթօքսի օրթոսիլիկատ (TMOS), տրիմեթիլ քլորոսիլան (TMCS), տրիպսին, մարդու շիճուկի ալբումին (HSA), ամոնիումի քլորիդ, միզանյութ, հեքսան մեթիլդիսիլազան (HMDS), մետակրիլոլիլ-սթիլօքսիդիլ-քլորիդ (4, MCs) BPO), HPLC աստիճանի ացետոնիտրիլ (ACN), մեթանոլ, 2-պրոպանոլ և ացետոն՝ գնված Sigma-Aldrich-ից (Սենթ Լուիս, ԱՄՆ, ԱՄՆ):
Միզանյութի (8 գ), պոլիէթիլեն գլիկոլի (8 գ) և 8 մլ 0,01 N քացախաթթվի խառնուրդը 10 րոպե շարունակ խառնվել է, այնուհետև դրան ավելացվել է 24 մլ TMOS սառույցի պայմաններում: Ռեակցիայի խառնուրդը 6 ժամ տաքացրել են 40°C-ում, այնուհետև 120°C-ում պողպատն անջատվել է 8 ժամ: չորացվել է 70°C-ում 12 ժամ: Չորացրած փափուկ զանգվածը հարթ աղացել է ջեռոցում և կալցինացվել 550°C-ում 12 ժամ: Պատրաստվել և բնութագրվել է երեք խմբաքանակ՝ մասնիկների չափի, ծակոտիների չափի և մակերեսի վերարտադրելիությունը ուսումնասիրելու համար:
Սիլիցիումի մասնիկների մակերեսային ձևափոխմամբ՝ նախասինթեզված լիգանդի ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատով (PCMP), որին հաջորդում է ստիրոլով ճառագայթային պոլիմերացումը, պատրաստվել է բևեռային խումբ պարունակող միացություն:Ստացիոնար փուլ ագրեգատների և պոլիստիրոլի շղթաների համար: Պատրաստման գործընթացը նկարագրված է ստորև:
N-ֆենիլմալեյիմիդը (200 մգ) և մեթիլ վինիլիզոցիանատը (100 մգ) լուծարվել են չոր տոլուոլի մեջ, և 0,1 մլ 2,2'-ազոիզոբուտիրոնիտրիլ (AIBN) ավելացվել է ռեակցիայի կոլբայի մեջ, որպեսզի պատրաստվի ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլ վինիլային իզոցիանատ, ֆիլտրացված է PM30 ժամում և PMpoly-ով ֆիլտրացվել է 6°C-ով: չորացրած ջեռոցում 40°C ջերմաստիճանում 3 ժամ։
Չոր սիլիցիումի մասնիկները (2 գ) ցրվել են չոր տոլուոլի մեջ (100 մլ), խառնել և 500 մլ կլոր հատակով կոլբայի մեջ 10 րոպե լուծվել: PMCP (10 մգ) լուծարվել է տոլուոլի մեջ և կաթիլ-կաթիլով ավելացնել ռեակցիայի կոլբին կաթիլային ձագարի միջոցով: Խառնուրդը լվանում է 100°C-ով և 80°C-ում հետադարձ հոսքով չորանում է: 60°C 3 ժամով: Այնուհետև PMCP-ով կապված սիլիցիումի մասնիկները (100 գ) լուծարեցին տոլուոլի մեջ (200 մլ) և ավելացրին 4-հիդրօքսի-ՏԵՄՊՈ (2 մլ) 100 մկլ դիբուտիլթին դիլաուրատ որպես կատալիզատոր: Խառնուրդը ֆիլտրվեց 50°C-ում 8 ժամ, 50°C-ում: .
Ստիրոլը (1 մլ), բենզոիլ պերօքսիդ BPO (0,5 մլ) և TEMPO-PMCP-ով կցված սիլիցիումի մասնիկները (1,5 գ) ցրվել են տոլուոլի մեջ և մաքրվել ազոտով: Ստիրոլի պոլիմերացումն իրականացվել է 100°C ջերմաստիճանում 12 ժամ: Ստացված ռեակցիան ամբողջությամբ լվացվել է 6°C ջերմաստիճանում: ինձ ցույց է տրված Նկար 1-ում:
Նմուշները գազազերծվել են 393 K ջերմաստիճանում 1 ժամվա ընթացքում, որպեսզի ստացվի 10-3 Torr-ից պակաս մնացորդային ճնշում: P/P0 = 0,99 հարաբերական ճնշման տակ ներծծված N2-ի քանակը օգտագործվել է ծակոտիների ընդհանուր ծավալը որոշելու համար: Մերկ և լիգանով կապակցված սիլիցիումի մասնիկների մորֆոլոգիան (Սիլիկատային բարձր մասնիկներն ուսումնասիրվել են սիլիցիումի էլեկտրոնիկայի բարձր էլեկտրոնիկայի միջոցով): Չորացված նմուշները (սիլիցիումի մերկ և լիգանդով կապակցված սիլիցիումի մասնիկներ) տեղադրվեցին ալյումինե սյունակի վրա՝ օգտագործելով սոսինձ ածխածնային ժապավենը: Նմուշների վրա ոսկի դրվեց՝ օգտագործելով Q150T ցողող ծածկույթ, իսկ նմուշների վրա դրվեց 5 նմ Au շերտ: խոզապուխտ, MA, ԱՄՆ) Flash EA1112 տարրական անալիզատորն օգտագործվել է տարրական վերլուծության համար: Մասնիկների չափի բաշխումը ստանալու համար օգտագործվել է Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 մասնիկների չափի անալիզատոր: Սիլիցիումի մերկ մասնիկները և լիգանդի հետ կապված սիլիկատային մասնիկները (յուրաքանչյուրը 5 մգ) ցրվել են mL, 5 մգ, ցրվել են 5 մգ-ով րոպե, և տեղադրվել Mastersizer-ի օպտիկական նստարանին: Ջերմոգրաչափական վերլուծությունը կատարվել է րոպեում 5 °C արագությամբ 30-ից 800 °C ջերմաստիճանի միջակայքում:
Ապակեպատ չժանգոտվող պողպատից նեղ փոսով սյուները (100 × 1,8 մմ id) փաթեթավորվել են ցեխի փաթեթավորման մեթոդով, կիրառելով նույն ընթացակարգը, որը կիրառվել է թիվ թիվ 1 հոդվածում։31. Չժանգոտվող պողպատից մի սյուն (ապակե ծածկով, 100 × 1,8 մմ id) ելքային կցամասով, որը պարունակում է 1 մկմ ֆրիտ, միացված է ցեխի փաթեթավորողին (Alltech Deerfield, IL, ԱՄՆ): Պատրաստեք անշարժ փուլային քսուք՝ կասեցնելով 150 մգ.մ.մ. օգտագործվում է որպես ցեխի լուծիչ, ինչպես նաև շարժիչ լուծիչ: Լրացրեք սյունակը հաջորդաբար՝ կիրառելով 100 MP ճնշում 10 րոպեի ընթացքում, 80 MP՝ 15 րոպե, և 60 MP՝ 30 րոպե: Փաթեթավորման ընթացքում մեխանիկական թրթռումը կիրառվել է երկու GC սյունակներով (Alltech, Deviceslue) միատեսակ թափահարիչներով: փաթեթավորեք և դանդաղ արձակեք ճնշումը՝ սյունակի ներսում որևէ վնաս չպատճառելու համար: Անջատեք սյունը ցեխի փաթեթավորման միավորից և միացրեք մեկ այլ կցամաս մուտքի և LC համակարգին՝ դրա աշխատանքը ստուգելու համար:
LC պոմպ (10AD Shimadzu, Ճապոնիա), ներարկիչ (Valco (ԱՄՆ) C14 W.05) 50 nL ներարկման օղակով, թաղանթային գազազերծիչով (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS մազանոթ պատուհանով կառուցվել է հատուկ μLC սարքի դետեկտոր (UV-2075) և միացնելով միկրոկոլով-2075-ի լրացուցիչ էֆեկտը: սյունակի ժապավենի ընդլայնում: Փաթեթավորումից հետո մազանոթները (50 մկմ id 365 և ռեդուկտորական միացման մազանոթներ (50 մկմ) տեղադրվեցին ռեդուկտորական միավորի 1/16 դյույմ ելքի մոտ: Տվյալների հավաքագրումը և քրոմատոգրաֆիկ մշակումը կատարվել են Multichro 2000-ի միջոցով: Մոնիտորինգը վերլուծվել է 254V-ի ներծծող ծրագրային ապահովման միջոցով: inPro8 (Նորթհեմփթոն, MA):
Ալբումին մարդկային շիճուկից, լիոֆիլացված փոշի, ≥ 96% (ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ) 3 մգ խառնված տրիպսինի (1,5 մգ), 4,0 մ միզանյութի (1 մլ) և 0,2 մ ամոնիումի բիկարբոնատի (1 մլ) հետ։ Լուծույթը խառնել են 10 րոպե և պահել 6 լ ջրի մեջ 1 բալիս 3 ժամում։ 0.1% TFA: Զտել լուծույթը և պահել 4 °C-ից ցածր ջերմաստիճանում:
Պեպտիդային խառնուրդների և HSA տրիփսինի մարսումների տարանջատումը գնահատվել է առանձին PMP սյունակներում: Ստուգեք HSA-ի պեպտիդային խառնուրդի և տրիփսինի մարսողության տարանջատումը PMP սյունակով և արդյունքները համեմատեք Ascentis Express RP-Amide սյունակի հետ: Տեսական ափսեի համարը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.
Սիլիցիումի մերկ մասնիկների և լիգանդի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկների SEM պատկերները ներկայացված են ՆԿ.Սիլիցիումի մերկ մասնիկների SEM պատկերները (A, B) ցույց են տալիս, որ, ի տարբերություն մեր նախորդ ուսումնասիրությունների, այս մասնիկները գնդաձև են, որոնցում մասնիկները երկարաձգված են կամ ունեն անկանոն սիմետրիա: Լիգանդի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկների (C, D) մակերեսն ավելի հարթ է, քան մերկ սիլիցիումի մասնիկների մակերեսը մասնիկներ.
Մերկ սիլիցիումի մասնիկների (A, B) և լիգանդի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկների (C, D) սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի պատկերներ։
Սիլիցիումի մերկ մասնիկների և լիգանդի կապակցված սիլիցիումի մասնիկների մասնիկների չափերի բաշխումը ներկայացված է Նկար 3(Ա): Ծավալի վրա հիմնված մասնիկների չափի բաշխման կորերը ցույց են տվել, որ սիլիցիումի մասնիկների չափը մեծացել է քիմիական փոփոխությունից հետո (նկ. 3Ա): (0,5), PMP-ը 3,36 մկմ է՝ համեմատած մեր նախորդ հետազոտության հետ՝ ad(0,5) արժեքով 3,05 մկմ (պոլիստիրոլով կապված սիլիցիումի մասնիկներ)34: Այս խմբաքանակն ուներ մասնիկների չափի ավելի նեղ բաշխվածություն՝ համեմատած մեր նախորդ հետազոտության հետ՝ պայմանավորված PEG-ի, միզանյութի, MP-ի, պոլիսաթթվի, պոլիսիլաթթվի, TMOS-ի չափով և ավելի մեծ ռեակցիայի չափսերով: ne-կապակցված սիլիցիումի մասնիկների փուլը, որը մենք նախկինում ուսումնասիրել ենք: Սա նշանակում է, որ սիլիցիումի մասնիկների մակերևույթի ֆունկցիոնալացումը ստիրոլով միայն պոլիստիրոլի շերտ (0,97 մկմ) նստեցրեց սիլիցիումի մակերեսին, մինչդեռ PMP փուլում շերտի հաստությունը 1,38 մկմ էր:
Մասնիկների չափի բաշխումը (A) և ծակոտիների չափի բաշխումը (B) մերկ սիլիցիումի մասնիկների և լիգանդի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկների:
Ընթացիկ հետազոտության սիլիցիումի մասնիկների ծակոտիի չափը, ծակոտի ծավալը և մակերեսը տրված են Աղյուսակ 1-ում (B): Սիլիցիումի մերկ մասնիկների և լիգանդի հետ կապված սիլիցիումի մասնիկների PSD պրոֆիլները ներկայացված են Նկար 3(B): Արդյունքները համեմատելի են մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ: ցույց է տալիս, որ ծակոտիների չափը նվազում է 69-ով քիմիական ձևափոխումից հետո, ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 1(B)-ում, իսկ կորի փոփոխությունը ցույց է տրված Նկար 3(B)-ում: Նմանապես, սիլիցիումի մասնիկների ծակոտիների ծավալը նվազել է 0,67-ից մինչև 0,58 սմ3/գ քիմիական փոփոխությունից հետո: ուսումնասիրություն (124 մ2/գ): Ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 1(B)-ում, սիլիցիումի մասնիկների մակերեսը (մ2/գ) նույնպես նվազել է 116 մ2/գ-ից մինչև 105 մ2/գ քիմիական ձևափոխումից հետո:
Ստացիոնար փուլի տարրական վերլուծության արդյունքները ներկայացված են Աղյուսակ 2-ում: Ընթացիկ անշարժ փուլի ածխածնի բեռնվածությունը 6,35% է, ինչը ավելի ցածր է, քան մեր նախորդ ուսումնասիրության ածխածնի բեռնումը (պոլիստիրոլի կապակցված սիլիցիումի մասնիկներ, համապատասխանաբար 7,93%35 և 10,21%, համապատասխանաբար) 42: Օգտագործվել են որոշ բևեռային լիգանդներ, ինչպիսիք են ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատը (PCMP) և 4-հիդրօքսի-ՏԵՄՊՕ-ն: Ընթացիկ ստացիոնար փուլի ազոտի զանգվածային տոկոսը կազմում է 2,21%, նախորդ հետազոտություններում համապատասխանաբար 0,1735 և 0,85% ազոտի կշռի համեմատ: Նմանապես, արտադրանքի (4) և (5) ածխածնի բեռնվածությունը համապատասխանաբար կազմել է 2,7% և 2,9%, մինչդեռ վերջնական արտադրանքի (6) ածխածնի բեռնվածությունը եղել է 6,35%, ինչպես ցույց է տրված Աղյուսակ 2-ում: Քաշի կորուստը ստուգվել է PMP ստացիոնար փուլով, իսկ TGA կորը ցույց է տրված Նկար 4-ում: 35%), քանի որ լիգանդները պարունակում են ոչ միայն C, այլ նաև N, O և H:
Ֆենիլմալեյմիդ-մեթիլվինիլիզոցիանատ լիգանն ընտրվել է սիլիցիումի մասնիկների մակերեսային ձևափոխման համար, քանի որ այն ունի բևեռային ֆենիլմալեյիմիդային խմբեր և վինիլիզոցիանատ խմբեր: Քանի որ ֆենիլմալեյմիդի մասը չունի վիրտուալ լիցք նորմալ pH-ում: Ստացիոնար փուլի բևեռականությունը կարող է վերահսկվել ստիրոլի օպտիմալ քանակով և ազատ ռադիկալների պոլիմերացման արձագանքման ժամանակով: Ռեակցիայի վերջին քայլը (ազատ ռադիկալների պոլիմերացում) կարևոր է և կարող է փոխել ստացիոնար փուլի բևեռականությունը: ne և արձագանքման ժամանակը մեծացրել է ստացիոնար փուլի ածխածնի բեռնվածությունը և հակառակը: Ստիրոլի տարբեր կոնցենտրացիաներով պատրաստված SP-ները ունեն տարբեր ածխածնի բեռնվածություն: Կրկին, բեռնեք այս կայուն փուլերը չժանգոտվող պողպատից սյուների մեջ և ստուգեք դրանց քրոմատոգրաֆիկ կատարումը (ընտրողականություն, լուծաչափություն, N արժեք և այլն):
Հինգ պեպտիդային խառնուրդներ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) նույնպես գնահատվել են PMP սյունակի միջոցով՝ օգտագործելով շարժական փուլ;60/40 (v/v) ացետոնիտրիլ/ջուր (0,1% TFA) 80 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ: Օպտիմալ զտման պայմաններում տեսական ափսեի համարը (N) մեկ սյունակում (100 × 1,8 մմ id) կազմում է 20,000 ± 100 (200,3 ՄՊ/մ² սյունակի համար՝ 200,000 ± 100, իսկ 200,000 մ² սյունակ): քրոմատոգրամները ցույց են տրված Նկար 5Ա-ում: Արագ վերլուծություն PMP սյունակի վրա բարձր հոսքի արագությամբ (700 մկլ/րոպե), հինգ պեպտիդներ ողողվել են մեկ րոպեի ընթացքում, N արժեքները շատ լավ էին, 13,500 ± 330 մեկ սյունակում (100 × 1,8 մմ նույնական id), համապատասխանում է 000 hre 135 սյունակի չափսերին: (100 × 1,8 մմ id) փաթեթավորվել են երեք տարբեր խմբաքանակով PMP ստացիոնար փուլով՝ վերարտադրելիությունը ստուգելու համար: Յուրաքանչյուր սյունակի համար անալիտի կոնցենտրացիան գրանցվել է՝ օգտագործելով օպտիմալ լուծողական պայմանները և տեսական թիթեղների քանակը N և պահպանման ժամանակը յուրաքանչյուր սյունակի վրա նույն փորձնական խառնուրդն առանձնացնելու համար: Աղյուսակ 3-ում:
Պեպտիդային խառնուրդի տարանջատում PMP սյունակում (B) և Ascentis Express RP-Amide սյունակում (A);շարժական փուլ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP սյունակի չափսերը (100 × 1.8 մմ id);վերլուծական Միացությունների արտանետման կարգը՝ 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) և 5 (լեյցին) թթու էնկեֆալին):
PMP սյունակը (100 × 1,8 մմ id) գնահատվել է մարդու շիճուկի ալբումինի տրիպտիկ մարսողությունների տարանջատման համար բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայում: Նկար 6-ի քրոմատոգրամը ցույց է տալիս, որ նմուշը լավ տարանջատված է և լուծաչափը շատ լավն է: Ինչպես ցույց է տրված քրոմատոգրամում (Նկար 6), HSA-ի մարսողությունը բաժանվել է 17 գագաթների, որոնք համապատասխանում են 17 պեպտիդներին: Յուրաքանչյուր գագաթնակետի տարանջատման արդյունավետությունը հաշվարկվել է HSA մարսողության մեջ, և արժեքները տրված են Աղյուսակ 5-ում:
HSA-ի տրիպտիկ մարսողությունը (100 × 1,8 մմ id) առանձնացվել է PMP սյունակի վրա;հոսքի արագություն (100 µL/min), շարժական փուլ 60/40 ացետոնիտրիլ/ջուր 0,1% TFA-ով:
որտեղ L-ը սյունակի երկարությունն է, η-ը շարժական փուլի մածուցիկությունն է, ΔP-ն սյունակի հետադարձ ճնշումն է, իսկ u-ը շարժական փուլի գծային արագությունն է: PMP սյունակի թափանցելիությունը 2,5 × 10-14 մ2 է, հոսքի արագությունը՝ 25 մկլ/րոպե, և 60/40 վ/վ։ նման էր մեր նախորդ ուսումնասիրության Ref.34-ին: Մակերեսային ծակոտկեն մասնիկներով լցված սյունակի թափանցելիությունը հետևյալն է. մ մասնիկներ 43. Հետևաբար, PMP փուլի թափանցելիությունը նման է 5 մկմ միջուկային պատյան մասնիկների թափանցելիությանը:
որտեղ Wx-ը քլորոֆորմով լցված սյունակի կշիռն է, Wy-ը մեթանոլով լցված սյունակի կշիռն է, իսկ ρ՝ լուծիչի խտությունը։ C18-Urea 31 սյունակները, որոնք մենք նախկինում ուսումնասիրել էինք, համապատասխանաբար 0,63 և 0,55 էին: Սա նշանակում է, որ միզանյութերի առկայությունը նվազեցնում է ստացիոնար փուլի թափանցելիությունը: մասնիկներ, քանի որ C18 տիպի ստացիոնար փուլերում C18 լիգանները կցվում են սիլիցիումի մասնիկներին որպես գծային շղթաներ, մինչդեռ պոլիստիրոլի տիպի անշարժ փուլերում դրա շուրջ ձևավորվում է համեմատաբար հաստ պոլիմերային շերտ: Տիպիկ փորձի ժամանակ սյունակի ծակոտկենությունը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.
Նկար 7A,B ցույց է տալիս PMP սյունակը (100 × 1.8 մմ id) և Ascentis Express RP-Amide սյունակը (100 × 1.8 մմ id)՝ օգտագործելով նույն լուծողական պայմանները (այսինքն՝ 60/40 ACN/H2O և 0.1% TFA):) van Deemter հողամասի։Ընտրված պեպտիդային խառնուրդներ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) պատրաստվել են 20 µL/-ում երկու սյունակների նվազագույն հոսքի արագությունը 800 µL/min է: Նվազագույն HETP-ի արժեքները PL-ի համար էքսպրես 8-ն է: RP-Amide սյունակը համապատասխանաբար եղել է 2,6 մկմ և 3,9 մկմ: HETP արժեքները ցույց են տալիս, որ PMP սյունակի տարանջատման արդյունավետությունը (100 × 1,8 մմ id) շատ ավելի լավ է, քան առևտրային հասանելի Ascentis Express RP-Amide սյունակը (100 × 1,8 մմ տրամաչափի աճող սյունակում): էական չէ՝ համեմատած մեր նախորդ ուսումնասիրության հետ: PMP սյունակի (100 × 1,8 մմ id) ավելի բարձր տարանջատման արդյունավետությունը Ascentis Express RP-Amide սյունակի համեմատ հիմնված է ընթացիկ աշխատանքում օգտագործվող մասնիկների ձևի, չափի և բարդ սյունակների փաթեթավորման ընթացակարգերի բարելավման վրա34:
(A) van Deemter գծապատկեր (HETP-ն ընդդեմ շարժական փուլի գծային արագության), որը ստացվել է PMP սյունակի միջոցով (100 × 1,8 մմ id) 60/40 ACN/H2O-ում 0,1% TFA-ով: ACN/H2O 0,1% TFA-ով:
Բևեռային ներկառուցված պոլիստիրոլի ստացիոնար փուլը պատրաստվել և գնահատվել է մարդու շիճուկի ալբումինի (HAS) սինթետիկ պեպտիդային խառնուրդների և տրիպսինի մարսումների առանձնացման համար բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատագրության մեջ: Պեպտիդային խառնուրդների համար PMP սյունակների քրոմատոգրաֆիկ կատարումը գերազանց է տարանջատման արդյունավետության և լուծաչափի առումով: սիլիցիումի մասնիկների, ստացիոնար փուլի վերահսկվող սինթեզը և բարդ սյունակների փաթեթավորումը: Ի լրումն բարձր տարանջատման արդյունավետության, սյունակի ցածր ճնշումը բարձր հոսքի արագությամբ այս կայուն փուլի ևս մեկ առավելություն է: PMP սյունակները լավ վերարտադրելիություն են ցուցաբերում և կարող են օգտագործվել պեպտիդային խառնուրդների վերլուծության և տրիպսինի մարսման համար՝ բնական սյունակային միացություններից մինչև սյունակային ակտիվ սպիտակուցներ օգտագործելու համար: բույսերի և սնկերի էքստրակտները հեղուկ քրոմատագրության մեջ: Ապագայում PMP սյունակները նույնպես կգնահատվեն սպիտակուցների և մոնոկլոնալ հակամարմինների տարանջատման համար:
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Մաս I. Սյունակի բնութագրման արձանագրության մշակում:J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019 թ.):
Gomez, B. et al. Բարելավված ակտիվ պեպտիդներ, որոնք նախատեսված են վարակիչ հիվանդությունների բուժման համար: Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018):
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009).2009.
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ընդլայնված հեղուկ քրոմատագրություն-զանգվածային սպեկտրոմետրիան հնարավորություն է տալիս ներառել լայնորեն նպատակաուղղված մետաբոլոմիկա և proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019):
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC-ի դերը դեղերի մշակման գործում:J.Sep. Sci.30 (8), 1183-1190 (2007):
Wu, N. & Clausen, AM Գերբարձր ճնշման հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի հիմնարար և գործնական ասպեկտները արագ բաժանումների համար: Ջ.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007):
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ուլտրաբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի կիրառումը դեղերի մշակման մեջ: Ջ.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006 թ.):
Gu, H. et al.Monolithic macroporous hydrogels, պատրաստված նավթի-ջրի բարձր ներքին փուլային էմուլսիաներից էնտերովիրուսների արդյունավետ մաքրման համար:Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020):
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Հեղուկ քրոմատագրության դերը պրոտեոմիկայի մեջ: Ջ.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004):
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Թերապևտիկ պեպտիդների և սպիտակուցների հակադարձ փուլային հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի տարանջատումների առաջացող միտումներ. տեսություն և կիրառություն: Ջ.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012):
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Պեպտիդների երկչափ տարանջատում RP-RP-HPLC համակարգի միջոցով՝ օգտագործելով տարբեր pH արժեքներ առաջին և երկրորդ տարանջատման չափսերում:J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005):
Feletti, S. et al. Հետազոտվել են C18 sub-2 մկմ լրիվ և մակերեսային ծակոտկեն մասնիկներով լցված բարձր արդյունավետության քրոմատոգրաֆիկ սյուների զանգվածային փոխանցման բնութագրերը և կինետիկ կատարումը:Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020):
Piovesana, S. et al. Վերջին միտումները և վերլուծական մարտահրավերները բույսերի կենսաակտիվ պեպտիդների մեկուսացման, նույնականացման և վավերացման գործում.
Mueller, JB et al. Կյանքի թագավորության պրոտեոմիկ լանդշաֆտը: Բնություն 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020 թ.):
DeLuca, C. et al. Թերապևտիկ պեպտիդների ներքևի վերամշակում նախապատրաստական ​​հեղուկ քրոմատագրմամբ: Molecule (Բազել, Շվեյցարիա) 26(15), 4688 (2021):
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography and its application to biopolymers.J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands խառը ռեժիմի սպիտակուցային քրոմատագրման համար. սկզբունք, բնութագրում և ձևավորում: Ջ.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).


Հրապարակման ժամանակը՝ հունիս-05-2022