Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Angustifolius lupine-ը (NLL, Lupinus angustifolius L.) լոբազգի բույս ​​է, որն օգտագործվում է սննդամթերքի արտադրության և հողի բարելավման համար: NLL-ի գլոբալ ընդլայնումը որպես մշակաբույս ​​գրավել է բազմաթիվ պաթոգեն սնկերի, այդ թվում՝ լուպինային անտրակնոզին, որը առաջացնում է կործանարար անտրակնոզ հիվանդությունը: NLL-ի բուծման մեջ օգտագործվել են երկու ալելներ՝ Lanr1-ը և AnMan-ը, որոնք ապահովում են դիմադրողականության բարձրացում, սակայն հիմքում ընկած մոլեկուլային մեխանիզմները մնում են անհայտ: Այս ուսումնասիրության մեջ Lanr1 և AnMan մարկերներն օգտագործվել են եվրոպական NLL նմուշների սկրինինգի համար: Վակցինայի փորձարկումը վերահսկվող միջավայրում հաստատել է երկու դիմադրողական դոնորների արդյունավետությունը: Գեների արտահայտման դիֆերենցիալ պրոֆիլավորումը կատարվել է ներկայացուցչական դիմադրողական և զգայուն գծերի վրա: Անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականությունը կապված էր գեների օնտոլոգիայի՝ «GO:0006952 Պաշտպանական արձագանք», «GO:0055114 Ռեդոքս պրոցես» և «GO:0015979 Ֆոտոսինթեզ» տերմինների գերարտահայտման հետ: Բացի այդ, Lanr1(83A:476) գիծը ցույց տվեց տրանսկրիպտոմների զգալի արագ վերածրագրավորում պատվաստումից հետո, մինչդեռ մյուս գծերը ցույց տվեցին այս արձագանքի մոտ 42 ժամով ուշացում: Պաշտպանական արձագանքները կապված են TIR-NBS, CC-NBS-LRR և NBS-LRR գեների հետ, որոնք ներգրավված են պաթոգենեզում 10 սպիտակուցների, լիպիդային փոխանցման սպիտակուցների, էնդոգլուկան-1,3-β-գլյուկոզիդազի, գլիցինով հարուստ բջջային պատի սպիտակուցների և թթվածնի ռեակտիվ ուղուց եկող գեների հետ: 83A:476-ի վաղ արձագանքները, ներառյալ ֆոտոսինթեզի հետ կապված գեների զգույշ ճնշումը, համընկել են սնկային կենսաբանության վեգետատիվ աճի փուլում հաջող պաշտպանության հետ, ինչը ենթադրում է, որ էֆեկտորը ակտիվացնում է անձեռնմխելիությունը: Մանդելուպի ռեակցիան դանդաղում է, ինչպես նաև ընդհանուր հորիզոնական դիմադրությունը:
Նեղտերևավոր լուպինը (NLL, Lupinus angustifolius L.) բարձր սպիտակուցային հացահատիկ է, որը ծագում է արևմտյան Միջերկրածովյան տարածաշրջանից1,2: Այն ներկայումս աճեցվում է որպես սննդային մշակաբույս ​​կենդանիների և մարդկանց համար: Այն նաև համարվում է կանաչ գոմաղբ ցանքաշրջանառության համակարգերում՝ սիմբիոտիկ ազոտ ֆիքսող բակտերիաների կողմից ազոտի ֆիքսացիայի և հողի կառուցվածքի ընդհանուր բարելավման շնորհիվ: NLL-ը վերջին դարում ենթարկվել է արագ ընտելացման գործընթացի և դեռևս գտնվում է բարձր բուծման ճնշման տակ3,4,5,6,7,8,9,10,11,12: NLL-ի լայնորեն տարածված մշակության հետ մեկտեղ, պաթոգեն սնկերի հաջորդականությունը ստեղծել է նոր գյուղատնտեսական խորշեր և առաջացրել նոր բերքը ոչնչացնող հիվանդություններ: Լուպին աճեցնող ֆերմերների և բուծողների համար ամենաուշագրավը անտրակնոզի ի հայտ գալն էր, որն առաջացել էր Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 պաթոգեն սնկով։ Լուպին աճեցնող ֆերմերների և բուծողների համար ամենաուշագրավը անտրակնոզի ի հայտ գալն էր, որն առաջացել էր Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 պաթոգեն սնկով։ Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13: Լուպին աճեցնող ֆերմերների և բուծողների համար ամենանշանակալիցը անտրակնոզի ի հայտ գալն էր, որն առաջացել էր Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 պաթոգեն սնկով։对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱illeum珗(Բոնդար) Նիրենբերգ, Ֆեյլեր և Հագեդորն 13 引起的։对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是猱illeum珗(Բոնդար)՝ մազերով։ 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Լուպին աճեցնող ֆերմերների և բուծողների համար ամենից ակնառուը անտրակնոզի ի հայտ գալն է, որն առաջացել է Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 պաթոգեն սնկով։Հիվանդության մասին առաջին հաղորդագրությունները ստացվել են Բրազիլիայից և Միացյալ Նահանգներից, որոնց բնորոշ ախտանիշները ի հայտ են եկել համապատասխանաբար 1912 և 1929 թվականներին: Սակայն, մոտ 30 տարի անց հարուցիչը անվանվեց Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz: & Սակ., տելեոմորֆ Glomerella cingulata (Սթոունմեն) Սպոլդ։ & Սակ., տելեոմորֆ Glomerella cingulata (Սթոունմեն) Սպոլդ։ & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Սթոունմեն) Սպոլդի տելեոմորֆը։ & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Սթոունմեն) Սփոլդը թիրախային մորֆոլոգիայում։ և Հ. Շրենկ,. և Հ. Շրենկ, .և Հ. Շրենկ։ & H.施伦克,. & H.施伦克,.և Հ. Շլենկ, .20-րդ դարի կեսերին կատարված նախնական հիվանդության ֆենոտիպավորումը ցույց տվեց որոշակի դիմադրողականություն ոչ լյարդային լյուպինի և դեղին լուպինի (L. luteus L.) աճեցումների դեպքում, սակայն բոլոր փորձարկված սպիտակ լուպինի (L. albus L.) աճեցումները խիստ զգայուն էին15,16: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ անտրակնոզի զարգացումը կապված է տեղումների (օդի խոնավության) և ջերմաստիճանի ավելացման հետ (12-28°C սահմաններում), ինչը հանգեցնում է դիմադրողականության խախտման բարձր ջերմաստիճաններում17, 18: Փաստորեն, կոնիդիաների ծլման և հիվանդության սկսման համար անհրաժեշտ ժամանակը 24°C (4 ժամ) ջերմաստիճանում չորս անգամ ավելի կարճ էր, քան 12°C (16 ժամ) ջերմաստիճանում՝ բարձր խոնավության պայմաններում19: Այսպիսով, շարունակվող գլոբալ տաքացումը հանգեցրել է անտրակնոզի տարածմանը: Այնուամենայնիվ, հիվանդությունը դիտվել է Ֆրանսիայում (1982) և Ուկրաինայում (1983)՝ որպես մոտալուտ սպառնալիքի նախանշան, բայց, ակնհայտորեն, անտեսվել է լուպինի արդյունաբերության կողմից այդ ժամանակ20,21: Մի քանի տարի անց այս կործանարար հիվանդությունը տարածվեց ամբողջ աշխարհում և ազդեց նաև լուպին արտադրող խոշոր երկրների վրա, ինչպիսիք են Ավստրալիան, Լեհաստանը և Գերմանիան22,23,24: 1990-ականների կեսերին անտրակնոզի բռնկումից հետո լայնածավալ սկրինինգի արդյունքում NLL19 նմուշներում հայտնաբերվել են մի քանի դիմացկուն դոնորներ: NLL-ի անտրակնոզի նկատմամբ կայունությունը վերահսկվում է երկու առանձին գերիշխող ալելներով, որոնք հայտնաբերվում են տարբեր գերմապլազմայի աղբյուրներում՝ Lanr1՝ Tanjil և Wonga սորտի մեջ և AnMan՝ Mandalay 25, 26 սորտի մեջ: Այս ալելները լրացնում են մոլեկուլային մարկերները, որոնք աջակցում են դիմացկուն գերմապլազմայի ընտրությանը բուծման ծրագրերում25,26,27,28,29,30: Lanr1 ալելը կրող 83A:476 դիմացկուն բուծման գիծը խաչասերվել է զգայուն վայրի P27255 գծի հետ՝ անտրակնոզի դիմադրության համար առանձնացող RIL պոպուլյացիա ստանալու համար, ինչը հնարավորություն է տվել Lanr1 լոկուսը վերագրել NLL-1131, 32, 33 քրոմոսոմին: Կողային դիմադրության լոկուսներից անտրակնոզին կապի քարտեզի մարկերների գենոմային շրջանակով համապատասխանեցմամբ, NLL-ը բացահայտեց բոլոր երեք ալելների տեղակայումը նույն քրոմոսոմի վրա (NLL-11), բայց տարբեր դիրքերում29,34,35: Այնուամենայնիվ, RIL-ների փոքր թվի և մարկերների ու համապատասխան ալելների միջև մեծ գենետիկ հեռավորության պատճառով, դրանց հիմքում ընկած գեների վերաբերյալ հուսալի եզրակացություններ չեն կարող արվել: Մյուս կողմից, լուպինների մոտ հակադարձ գենետիկայի կիրառումը դժվար է դրանց շատ ցածր վերականգնման ներուժի պատճառով, ինչը գենետիկական մանիպուլյացիան դարձնում է դժվար37:
Հոմոզիգոտ վիճակում ցանկալի ալելը կրող ընտելացված գերմապլազմայի զարգացումը, ինչպիսիք են 83A:476 (Lanr1) և Mandelup (AnMan), բացեց դուռը անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականության ուսումնասիրության համար՝ վայրի պոպուլյացիաներում ալելների հակադիր համակցությունների առկայության պայմաններում: Մոլեկուլային մեխանիզմների հնարավորությունները: Համեմատեք որոշակի գենոտիպերի կողմից առաջացած պաշտպանական պատասխանները: Այս ուսումնասիրությունը գնահատել է NLL-ի վաղ տրանսկրիպտոմային պատասխանը C. lupini պատվաստմանը: Նախ, 215 տող պարունակող եվրոպական NLL գերմապլազմայի վահանակը ստուգվել է Lanr1 և AnMan ալելները նշող մոլեկուլային մարկերների միջոցով: Այնուհետև անտրակնոզի ֆենոտիպավորում է իրականացվել 50 NLL գծերի վրա, որոնք նախկինում ընտրվել էին մոլեկուլային մարկերների համար՝ վերահսկվող պայմաններում: Այս փորձերի հիման վրա անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականությամբ և Lanr1/AnMan ալելային կազմով տարբերվող չորս գծեր ընտրվել են դիֆերենցիալ պաշտպանական գեների արտահայտման պրոֆիլավորման համար՝ օգտագործելով երկու լրացուցիչ մոտեցումներ՝ բարձր թողունակությամբ ՌՆԹ հաջորդականացում և իրական ժամանակի ՊՇՌ քանակականացում:
NLL սերմնապլազմայի մի շարքի (N = 215) Lanr1 (Anseq3 և Anseq4) և AnMan (Anseq4) և AnMan (AnManM1) մարկերներով սկրինինգը ցույց տվեց, որ միայն մեկ գիծ (95726, Սալամանկա-b-ի մոտ) ուժեղացնում է բոլոր մարկերների «դիմադրության» ալելը, մինչդեռ ««Զգայուն» ալելների առկայությունը» հայտնաբերեց բոլոր մարկերների համամասնությունը 158 (~73.5%) գծերում: Տասներեք գիծը առաջացրեց Lanr1 մարկերի երկու «դիմացկուն» ալել, իսկ 8 գիծ՝ Lanr1 մարկերի «դիմացկուն» ալելներ: AnMan մարկերի «դիմադրության» ալելը (Լրացուցիչ աղյուսակ S1): Երկու գիծ հետերոզիգոտ էին Anseq3 մարկերի և մեկ հետերոզիգոտ՝ AnManM1 մարկերի համար: 42 գիծ (19.5%) կրում էր Anseq3 և Anseq4 ալելների հակառակ փուլեր, ինչը վկայում է այս երկու լոկուսների միջև ռեկոմբինացիայի բարձր հաճախականության մասին: Անտրակնոզի ֆենոտիպերը վերահսկվող պայմաններում (Լրացուցիչ աղյուսակ S2) ցույց տվեցին փորձարկված գենոտիպերի դիմադրողականության փոփոխականություն, որն արտացոլվեց անտրակնոզի ծանրության մեջ: Միջին միավորների տարբերությունները տատանվում էին 1.8-ից (միջին դիմադրողականություն) մինչև 6.9 (զգայունություն), իսկ բույսերի քաշի տարբերությունները՝ 0.62-ից (զգայունություն) մինչև 4.45 գ (դիմացկունություն): Փորձի երկու կրկնություններում (0.51 հիվանդության ծանրության միավորների համար, P = 0.00017 և 0.61 բույսի քաշի համար, P < 0.0001), ինչպես նաև այս երկու պարամետրերի միջև (-0.59 և -0.77, P < 0.0001) նկատվել է նշանակալի կապ։ Փորձի երկու կրկնություններում դիտարկված արժեքների (0.51 հիվանդության ծանրության միավորների համար, P = 0.00017 և 0.61 բույսի քաշի համար, P < 0.0001), ինչպես նաև այս երկու պարամետրերի միջև (-0.59 և -0.77, P < 0.0001) նշանակալի կապ կար։ Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для Pssze, 0,61 для массже, 0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для Pssze <1,0, 0,00,00,00,00,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000 0,61 dlya P. этими двумя параметрими (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001): Փորձի երկու կրկնությունների ընթացքում դիտարկված արժեքների (0.51 հիվանդության ծանրության միավորների համար, P = 0.00017 և 0.61 բույսի քաշի համար, P < 0.0001), ինչպես նաև այս երկու պարամետրերի (- 0.59 և -0.77, P < 0.0001) միջև նշանակալի կապ է հայտնաբերվել։在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分严0. 0.00017，植物重量为0.61，P <0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，01.在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 度 严重 度分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001 ） 以及 两 个 参数 之鈑（，， 0,59 和– 0,59 和– 0,59 - 0,77, P < 0,0001): Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001, P <0,0001), и -0,0001) 0,77, P <0,0001. Կրկնօրինակում դիտարկված արժեքների (հիվանդության ծանրության միավոր՝ 0.51, P = 0.00017 և բույսի քաշ՝ 0.61, P < 0.0001) և այս երկու պարամետրերի (-0.59 և -0.0001) միջև կար նշանակալի կապ՝ 0.77, P<0.0001: ).Զգայուն բույսերի մոտ դիտվող բնորոշ ախտանիշներից են ցողունի ծռվելը և ոլորվելը, որը նման է «հովվի աղեղի» կառուցվածքի, որին հաջորդում են նարնջագույն/վարդագույն սպորոզոիտներով օվալաձև վնասվածքները (Լրացուցիչ նկ. 1): Lanr1 (83A:476 և Tanjil) և AnMan (Mandelup) գեները կրող ավստրալիական աճեցումները չափավոր դիմացկուն են՝ 0.0331 և 0.0036): Որոշ գծեր, որոնք կրում են նաև «դիմացկուն» Lanr1 և/կամ AnMan ալելներ, ցուցաբերում են հիվանդության ախտանիշներ:
Հետաքրքիր է, որ մի քանի NLL գծեր, որոնք զուրկ էին որևէ «դիմացկուն» մարկերային ալելից, բացահայտեցին անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության բարձր մակարդակ (համեմատելի կամ ավելի բարձր, քան Lanr1 կամ AnMan գենոտիպերի դեպքում), ինչպիսիք են Boregine-ը (P արժեքը < 0.0001 երկու պարամետրերի համար էլ), Bojar-ը (P արժեքը < 0.0001 սքորի համար և 0.001 բույսի քաշի համար) և B-549/79b պոպուլյացիան (P արժեքը < 0.0001 սքորի համար և ոչ նշանակալի քաշի համար): Հետաքրքիր է, որ մի քանի NLL գծեր, որոնք զուրկ էին որևէ «դիմացկուն» մարկերային ալելից, բացահայտեցին անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության բարձր մակարդակ (համեմատելի կամ ավելի բարձր, քան Lanr1 կամ AnMan գենոտիպերի դեպքում), ինչպիսիք են Boregine-ը (P արժեքը < 0.0001 երկու պարամետրերի համար էլ), Bojar-ը (P արժեքը < 0.0001 սքորի համար և 0.001 բույսի քաշի համար) և B-549/79b պոպուլյացիան (P արժեքը < 0.0001 սքորի համար և ոչ նշանակալի քաշի համար): Interesno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного алеля, показали высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для кагенахн), Boregine (նշանակություն P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (նշանակություն P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) և պոպուլյացիաներ B-549/79b (նշանակություն P <0,0001 для): незначимо для массы). Հետաքրքիր է, որ մի քանի NLL գծեր, որոնք զուրկ էին որևէ «դիմացկուն» մարկերային ալելից, ցուցաբերեցին անտրակնոզի նկատմամբ բարձր դիմադրողականություն (համեմատելի կամ ավելի բարձր, քան Lanr1 կամ AnMan գենոտիպերի դեպքում), ինչպիսիք են Boregine-ը (P արժեքը < 0.0001 երկու պարամետրերի համար էլ), Bojar-ը (P արժեքը < 0.0001 գնահատման համար և 0.001 բույսի քաշի համար) և B-549/79b պոպուլյացիան (P արժեքը < 0.0001 գնահատման համար և նշանակալի չէ քաշի համար):有趣的是，一些缺乏任何«抗性»标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重阇为 Հետաքրքիր է, որ որոշ NLL համակարգեր, որոնք չունեն որևէ «հակածին» մարկեր, ցուցաբերում են բարձր հորիզոնական դիմադրություն (համարժեք է Lanr1 կամ AnMan գեներին կամ ավելի բարձր), ինչպիսիք են Boregine-ը (երկու պարամետրերն էլ՝ P < 0.0001), Bojar-ը (P արժեքը < 0.0001, բույսի քաշը՝ 0.001) և B-549/79b շտամը (P արժեքը < 0.0001, քաշը՝ աննշան): Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnM). обоих параметров <0,0001), Bojar (նշանակություն P <0,0001, масса растения 0,001) и ժողովրդականություն B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Հետաքրքիր է, որ որոշ NLL գծեր, որոնք զուրկ էին որևէ «դիմադրության» մարկերային ալելներից, ցուցաբերել են անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության բարձր մակարդակներ (համեմատելի կամ ավելի բարձր, քան Lanr1 կամ AnMan գենոտիպերը), ինչպիսիք են Boregine-ը (երկու պարամետրերի համար էլ P արժեքը <0.0001), Bojar-ը (P-արժեք < 0.0001, բույսի քաշը 0.001) և B-549/79b պոպուլյացիան (P-արժեք < 0.0001, քաշը նշանակալի չէ):Այս երևույթը ենթադրում է դիմադրության նոր գենետիկական աղբյուրի առկայության հնարավորություն, որը բացատրում է մարկերային գենոտիպերի և հիվանդության ֆենոտիպերի միջև դիտարկվող կապի բացակայությունը (P արժեքները՝ ~0.42-ից մինչև ~0.98): Այսպիսով, Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստը ցույց տվեց, որ անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության վերաբերյալ տվյալները մոտավորապես նորմալ էին բաշխված միավորների (P-արժեքներ՝ 0.25 և 0.11) և բույսերի զանգվածի (P-արժեքներ՝ 0.47 և 0.55) համար, ինչը ենթադրում է, որ ես ենթադրում եմ, որ ներգրավված են ավելի շատ ալելներ, քան Lanr1-ը և AnMan-ը:
Անտրակնոզի նկատմամբ կայունության սկրինինգի արդյունքների հիման վրա տրանսկրիպտոմային վերլուծության համար ընտրվել է 4 գիծ՝ 83A:476, Բորեգին, Մանդելուպ և Պոպուլյացիա 22660: Այս գծերը վերստուգվել են սիբիրախտի նկատմամբ կայունության համար՝ ՌՆԹ հաջորդականության միջոցով պատվաստման փորձերի ժամանակ, պայմանով, որ դրանք նույնն են, ինչ նախորդ թեստում: Միավորների արժեքները հետևյալն էին. Բորեգին (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Մանդելուպ (3.82 ± 1.42) և պոպուլյացիա 22660 (6.11 ± 1.29):
Illumina NovaSeq 6000 արձանագրությունը միջինում 40.5 Mread զույգ է ապահովել մեկ նմուշի համար (29.7-ից մինչև 54.4 Mread) (Լրացուցիչ աղյուսակ S3): Հղման հաջորդականության մեջ համահունչության միավորները տատանվում էին 75.5%-ից մինչև 88.6%: Կենսաբանական կրկնօրինակների միջև փորձարարական տարբերակների միջև ընթերցման հաշվարկի տվյալների միջին կորելյացիան տատանվում էր 0.812-ից մինչև 0.997 (միջինը՝ 0.959): Վերլուծված 35,170 գեներից 2917-ը չեն արտահայտվել, իսկ մնացած 4785 գեները արտահայտվել են աննշան մակարդակով (բազային միջին < 5): Վերլուծված 35,170 գեներից 2917-ը չեն արտահայտվել, իսկ մնացած 4785 գեները արտահայտվել են աննշան մակարդակով (բազային միջին < 5): Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5): Վերլուծված 35,170 գեներից 2917-ը չեն ցուցաբերել էքսպրեսիա, իսկ մնացած 4785 գեները էքսպրեսիայի են ենթարկվել աննշան մակարդակով (բազային միջին <5):在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35,170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а ональные 4785 генов имели незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5): Վերլուծված 35,170 գեներից 2917-ը չէին արտահայտվում, իսկ մնացած 4785 գեները աննշան արտահայտում ունեին (բազային միջին <5):Այսպիսով, փորձի ընթացքում արտահայտված համարվող գեների քանակը (բազային միջին ≥ 5) կազմել է 27,468 (78.1%) (Լրացուցիչ աղյուսակ S4):
Առաջին ժամանակային կետից սկսած, բոլոր NLL գծերը արձագանքեցին C. lupini-ի (շտամ Col-08) պատվաստմանը՝ վերածրագրավորելով տրանսկրիպտոմը (աղյուսակ 1), սակայն գծերի միջև նկատվեցին զգալի տարբերություններ: Այսպիսով, 83A:476 դիմադրության գիծը (որը կրում է Lanr1 գենը) ցույց տվեց տրանսկրիպտոմի զգալի վերածրագրավորում առաջին ժամանակային կետում (6 hpi)՝ մեկուսացված վերև և ներքև գեների քանակի 31-69 անգամ աճով՝ համեմատած այս ժամանակային կետում այլ ժամանակային կետերի հետ: Բացի այդ, այս գագաթնակետը կարճատև էր, քանի որ երկրորդ ժամանակային կետում (12 hpi) միայն մի քանի գեների արտահայտությունը մնաց զգալիորեն փոփոխված: Հետաքրքիր է, որ Boregine-ը, որը նույնպես ցույց տվեց դիմադրության բարձր մակարդակ պատվաստման թեստում, փորձի ընթացքում չենթարկվեց նման զանգվածային տրանսկրիպցիոն վերածրագրավորման: Այնուամենայնիվ, տարբերակված արտահայտված գեների քանակը (DEG) նույնն էր Boregine-ի և 83A:476-ի համար 12 HPI-ում: Ե՛վ Մանդելուպը, և՛ 22660 պոպուլյացիան վերջին ժամանակային կետում (48 լ/վ) ցույց տվեցին DEG գագաթնակետեր, ինչը վկայում է պաշտպանական արձագանքների հարաբերական ուշացման մասին։
Քանի որ 83A:476-ը ենթարկվել է զանգվածային տրանսկրիպտոմային վերածրագրավորման՝ ի պատասխան C. lupini-ի 6 HPI-ի՝ համեմատած մյուս բոլոր գծերի հետ, այս ժամանակահատվածում դիտարկված DEG-ների մոտ 91%-ը տոհմային-սպեցիֆիկ էին (Նկար 1): Այնուամենայնիվ, ուսումնասիրության գծերի միջև վաղ արձագանքներում որոշակի համընկնում կար, քանի որ Բորեգինում, Մանդելուպում և 22660 պոպուլյացիայում DEG-ների համապատասխանաբար 68.5%, 50.9% և 52.6% համընկնում էր 83A:476-ում հայտնաբերվածների հետ որոշակի ժամանակահատվածներում: Այնուամենայնիվ, այս DEG-ները կազմում էին 83A:476-ի միջոցով ներկայումս հայտնաբերված բոլոր DEG-ների միայն մի փոքր մասը (0.97–1.70%): Բացի այդ, այս պահին բոլոր գծերից 11 DEG-ներ կոհերենտ էին (Լրացուցիչ աղյուսակներ S4-S6), ներառյալ բույսերի պաշտպանական պատասխանների ընդհանուր բաղադրիչները՝ լիպիդային փոխանցման սպիտակուց (TanjilG_32225), էնդոգլուկան-1,3-β-գլյուկոզիդ ֆերմենտ (TanjilG_23384), երկու սթրեսի ինդուկցվող սպիտակուցներ, ինչպիսիք են SAM22-ը (TanjilG_31528 և TanjilG_31531), հիմնական լատեքսային սպիտակուց (TanjilG_32352) և երկու գլիցինով հարուստ կառուցվածքային բջջային պատի սպիտակուցներ (TanjilG_19701 և TanjilG_19702): Տրանսկրիպտոմային պատասխաններում համեմատաբար բարձր համընկնում կար նաև 83A:476-ի և Boregine-ի միջև՝ 24 HPI-ով (ընդհանուր 16-38% DEG) և Mandelup-ի և Population 22660-ի միջև՝ 48 HPI-ով (ընդհանուր 14-20% DEG):
Վեննի դիագրամ, որը ցույց է տալիս Colletotrichum lupini-ով պատվաստված նեղատերև լուպինային (NLL) գծերում տարբերակված արտահայտված գեների (DEG) քանակը (Col-08 շտամ, ստացված լուպինային դաշտերից Վիերժենիցեում, Լեհաստան, 1999թ.): Վերլուծված NLL գծերն էին՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրում է Lanr1 ալելը), Boregine (դիմացկուն, գենետիկական նախապատմությունը անհայտ է), Mandelup (միջին դիմացկուն, կրում է AnMan ալելը) և պոպուլյացիա 22660 (շատ զգայուն): hpi հապավումը նշանակում է պատվաստումից ժամեր անց: Զրոյական արժեքները հանվել են գրաֆիկը պարզեցնելու համար:
6 hpi-ում գերարտահայտված գեների հավաքածուն վերլուծվել է կանոնիկ R գեների դոմենների առկայության համար (Լրացուցիչ աղյուսակ S7): Այս ուսումնասիրությունը բացահայտել է դասական հիվանդության նկատմամբ դիմադրության գեների տրանսկրիպտոմային ինդուկցիա միայն NBS-LRR դոմեններով 83A:476-ում: Այս հավաքածուն բաղկացած էր մեկ TIR-NBS-LRR գենից (tanjilg_05042), հինգ CC-NBS-LRR գեներից (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 և tanjilg_16162), չորս NBS-LR, Tanjilg_16162, չորս NBS-LRRE (tanjilg_16162), ինչպես նաև չորս NBS-Lrr (tanjilg_16162) և չորս NBS-LRR (TANJILG_16162): Այս բոլոր գեներն ունեն կանոնիկ դոմեններ, որոնք դասավորված են պահպանված հաջորդականություններով: NBS-LRR դոմեյնի գեներից բացի, մի քանի RLL կինազներ ակտիվացել են 6 hpi-ում, մասնավորապես՝ մեկը Բորեգինի մոտ (TanjilG_19877), երկուսը՝ Մանդելուպի մոտ (TanjilG_07141 և TanjilG_19877) և 22660 պոպուլյացիայի մոտ (TanjilG_09014 և TanjilG_10361) և երկուսը՝ 83A 27:476-ում։
C. lupini-ով (Col-08 շտամ) պատվաստման արդյունքում էքսպրեսիայի զգալի փոփոխության ենթարկված գեները ենթարկվել են Գեների Օնտոլոգիայի (GO) հարստացման վերլուծության (Լրացուցիչ աղյուսակ S8): Ամենահաճախ գերագնահատված կենսաբանական պրոցեսի տերմինը «GO:0006952 պաշտպանական արձագանքն» էր, որը հայտնվել է բարձր նշանակալիությամբ (P արժեք < 0.001) 16 (ժամանակ × գիծ) համակցություններից 6-ում (Նկար 2): Ամենահաճախ գերագնահատված կենսաբանական պրոցեսի տերմինը «GO:0006952 պաշտպանական արձագանքն» էր, որը հայտնվել է բարձր նշանակալիությամբ (P արժեք < 0.001) 16 (ժամանակ × գիծ) համակցություններից 6-ում (Նկար 2): Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (времея × линя) կոմբինացիա со высокой (0006952) կոմբինացիա с высокой (0006952) Ամենահաճախ գերագնահատված կենսաբանական պրոցեսի տերմինը «GO:0006952 պաշտպանական արձագանքն» էր, որը հայտնվել է բարձր նշանակալիությամբ (P արժեք < 0.001) 16 (ժամանակ × տոհմ) համակցություններից 6-ում (Նկար 2):最常被过度代表的生物过程术语是«GO:0006952 防御反应»，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Կենսաբանական գործընթացի ամենաներկայացուցչական տերմինը «GO:0006952 պաշտպանական պատասխանն» է, որը հանդիպում է 16 (时间×线) համակցություններից 6-ում՝ բարձր նշանակալիությամբ (P արժեք < 0.001) (图2): Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», который появлялся в 6 из 16 комбинаций (времея × линя) с высокой значимостью (2.00) <0.00 P. Ամենահաճախ գերագնահատված կենսաբանական պրոցեսի տերմինը «GO:0006952 Defense Response»-ն էր, որը բարձր նշանակալիությամբ (P արժեք < 0.001) հայտնվել է 16 համակցություններից 6-ում (ժամանակ × գիծ):Այս տերմինը գերներկայացված էր 83A-ում երկու ժամանակային կետերում՝ 476 և Բորեգին (6 և 24 hpi) և մեկ ժամանակային կետում՝ Մանդելուպում և 22660 պոպուլյացիայում (համապատասխանաբար 12 և 6 hpi): Սա սպասելի արդյունք է, որը ընդգծում է դիմացկուն գծերի հակասնկային արձագանքը: Բացի այդ, 83A:476-ը արձագանքել է C. lupini-ին՝ արագորեն ինդուկցելով օքսիդատիվ պայթյունի հետ կապված գեները, որոնք ներկայացված են «GO:0055114 օքսիդա-վերականգնման գործընթաց» տերմինով, ինչը ցույց է տալիս որոշակի պաշտպանական արձագանք, մինչդեռ Բորեգինը բացահայտել է որոշակի պաշտպանական արձագանքներ, որոնք կապված են «GO» տերմինի հետ: :0006950 Սթրեսային արձագանք»։ 22660 պոպուլյացիան ակտիվացրել է երկրորդային մետաբոլիտներով հորիզոնական դիմադրության արձագանքը, ինչը ընդգծում է «GO:0016104 Տրիտերպենների կենսասինթեզի գործընթաց» և «GO:0006722 Տրիտերպենների նյութափոխանակության գործընթաց» տերմինների չափազանց մեծ քանակը (երկու տերմիններն էլ պատկանում են նույն գեների հավաքածուին), հաշվի առնելով GO տերմինի հարստացման վերլուծության արդյունքները, Մանդելուպի ռեակցիայի կայունությունը Բորեգինի և 22660 պոպուլյացիայի միջև էր։ Բացի այդ, վաղ ռեակցիա 83A:476 (6 hpi) և ուշացած ռեակցիա Մանդելուպի և 22660 պոպուլյացիայի մեջ ներառված է GO:0015979 «ֆոտոսինթեզ» տերմինը և այլ դրանց հետ կապված կենսաբանական գործընթացներ։
Սիբիրախտի լուպինով (Col-08 շտամ, որը ստացվել է Լեհաստանի Վիրժենիցե քաղաքի լուպինի դաշտերից 1999 թվականին) պատվաստված նեղտերև լուպինի (NLL) տրանսկրիպտոմատիկ արձագանքների ընթացքում տարբերակված արտահայտված գեների ծանոթագրություններում ընտրված կենսագործընթացային գեների օնտոլոգիայի տերմինները մեծապես չափազանցված են: Վերլուծված NLL գծերն էին՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ Lanr1 ալելը), Բորեգին (դիմացկուն, անհայտ գենետիկական ծագում), Մանդելուպ (միջին դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ AnMan ալելը) և պոպուլյացիա 22660 (զգայուն):
Քանի որ այս ուսումնասիրության նպատակն էր բացահայտել անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականությանը նպաստող գեները, GO «GO: 0006952 Պաշտպանական պատասխաններ» և «GO: 0055114 Ռեդոքս պրոցեսներ» տերմիններին վերագրվող գեները վերլուծվել են սահմանային արժեքներով, քանի որ սկզբնական միջինները ≥ 30 են՝ առնվազն մեկ տողով։ × ժամանակի կետում log2-ի (փաթաթման փոփոխություն) վիճակագրորեն նշանակալի արժեքները համատեղելով։ Այս չափանիշներին համապատասխանող գեների քանակը GO:0006952-ի համար կազմել է 65, իսկ GO:0055114-ի համար՝ 524։
83A:476-ը բացահայտեց երկու DEG գագաթներ, որոնք նշված էին GO:0006952 տերմինով, առաջինը՝ 6 գեն մեկ դյույմի վրա (64 գեն, վերև և ներքև կարգավորում), իսկ երկրորդը՝ 24 գեն մեկ դյույմի վրա (15 գեն, միայն վերև կարգավորում): Բորեջինը նաև ցույց տվեց, որ GO:0006952-ը գագաթնակետին հասավ նույն ժամանակային կետում, բայց ավելի քիչ DEG-ով (11 և 8) և նախընտրելի ակտիվացմամբ: Մանդելուպը ցույց տվեց GO:0006952-ի երկու գագաթնակետ՝ 12 և 48 HPI-ում, երկուսն էլ կրում էին 12 գեն (առաջինը ակտիվացնող գեներով, իսկ երկրորդը՝ միայն ճնշող գեներով), մինչդեռ 22660 պոպուլյացիան՝ 6 HPI-ով (13 գեն) ուներ աճի գագաթնակետի կարգավորման ավելի մեծ գերակշռություն: Պետք է նշել, որ այս գագաթներում GO:0006952 DEG-ի 96.4%-ը ուներ նույն տեսակի արձագանք (վեր կամ ներքև), ինչը ցույց է տալիս պաշտպանական արձագանքների զգալի համընկնումը՝ չնայած ներգրավված գեների քանակի տարբերություններին: GO:0006952 տերմինին վերաբերող հաջորդականությունների ամենամեծ խումբը կոդավորում է «Սովամահության սթրեսի հետ կապված հաղորդագրության սպիտակուց 22»-ը (SAM22-անման), որը պատկանում է 10-րդ դասի պաթոգենեզի հետ կապված սպիտակուցի (PR-10) սպիտակուցային կլադին և միջուկային սպիտակուցի լատեքսային (MLP-անման) սպիտակուցին (Նկար 3): Երկու խմբերը տարբերվում էին արտահայտման բնույթով և արձագանքի ուղղությամբ: SAM22-անման սպիտակուցներ կոդավորող գեները ցույց տվեցին հաստատուն և նշանակալի ինդուկցիա վաղ ժամանակային կետերում (6 կամ 12 hpi) և ընդհանուր առմամբ անպատասխանատու էին փորձի վերջում (48 hpi), մինչդեռ MLP-անման սպիտակուցները ցույց տվեցին կոորդինացիա 6 hpi-ում (83A:476 և Mandelup 48 hpi-ում), գրեթե բոլոր մյուս տվյալները անպատասխանատու էին: Բացի այդ, SAM22-անման սպիտակուցային գեների արտահայտման պրոֆիլների տարբերությունները հետևեցին անտրակնոզի դիմադրության դիտարկված փոփոխականությանը, քանի որ ավելի դիմացկուն գծերն ունեին ավելի շատ ժամանակային կետեր, որոնք զգալիորեն ինդուկցում էին այդ գեները, քան ավելի զգայուն գեները: Մեկ այլ LlR18A/B-անման PR-10 գեն ցուցաբերեց SAM22-անման սպիտակուցային գենի էքսպրեսիայի շատ նման օրինաչափություն։
Կենսաբանական գործընթացի «GO:0006952 Defense Response» տերմինի հիմնական բաղադրիչները և Lanr1 և AnMan ալելների թեկնածու գեների արտահայտման օրինաչափությունները բացահայտվել են: Log2 սանդղակը ներկայացնում է log2 արժեքները (կրկնակի փոփոխությունը) պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված լուպինի դաշտերից, Վիժենիցա, Լեհաստան, 1999) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերի միջև նույն ժամանակահատվածում: Վերլուծվել են հետևյալ նեղտերև լուպինային գծերը՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ Lanr1 ալելը), Բորեգին (դիմացկուն, գենետիկական նախապատմությունը անհայտ), Մանդելուպ (միջին դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ AnMan ալելը) և Պոպուլյացիա 22660 (զգայուն):
Բացի այդ, գնահատվել են RNA-seq թեկնածու Lanr1 (TanjilG_05042) և AnMan (TanjilG_12861) գեների արտահայտման պրոֆիլները (Նկար 3): TanjilG_05042 գենը 83A:476-ում ցույց է տվել նշանակալի արձագանք (ակտիվացում) միայն առաջին ժամանակային կետում (6 hpi), մինչդեռ TanjilG_12861-ը նշանակալի էր Մանդելուպում միայն երկու ժամանակային կետերում՝ 6 hpi (down regulation) և 24 hpi (6 hpi): With.). կարգավորելի) ).
GO:0055114 «օքսիդա-վերականգնման գործընթաց» տերմինում ամենաշատ գերարտահայտված գեները ցիտոքրոմ P450 սպիտակուցներ և պերօքսիդազ կոդավորող գեներն էին (Նկար 4): 83A:476-ից 6 HPI-ով մեկուսացված նմուշների համար առավելագույն կամ նվազագույն log2 (անգամային փոփոխություն) արժեքները (գեների 86.6%-ի համար) ընդհանուր առմամբ դիտվել են պատվաստված և վերահսկիչ բույսերի միջև, ինչը ընդգծում է այս գենոտիպի բարձր արձագանքը պատվաստվող սեռին: 83A:476-ը ցույց է տվել GO: 0055114 DEG-ի ամենակարևոր ցուցանիշը 6 hpi-ով (503 գեն), մինչդեռ մնացած գծերը՝ 48 hpi-ով (Boregine, 31 գեն; Mandelup, 85 գեն; և Population 22660, 78 գեն): GO:0055114 ընտանիքի գեների մեծ մասում դիտվել են պատվաստման նկատմամբ երկու տեսակի արձագանքներ (ակտիվացում և արգելակում): Հետաքրքիր է, որ Մանդելուպեում GO: 0055114 տերմինի համար 48 hp հզորությամբ նույնականացված DEG-ների մինչև 97.6%-ը։ Այս դիտարկումները ենթադրում են, որ չնայած զգալիորեն փոքր մասշտաբին (այսինքն՝ մուտացված օքսիդա-վերականգնման գեների քանակը՝ 85 ընդդեմ 503-ի), մանդելուպեի անտրակնոզի նկատմամբ տրանսկրիպտոմային արձագանքի ուշացման օրինաչափությունը նման է 83A:476-ի վաղ արձագանքին։ Բորեգինեում և 22660 պոպուլյացիայում այս կոնվերգենցիան ավելի ցածր է՝ համապատասխանաբար 51.6% և 75.6%։
Բացահայտվել են կենսաբանական գործընթացի «GO:0055114 օքսիդա-վերականգնման գործընթաց» տերմինի հիմնական բաղադրիչների արտահայտման օրինաչափությունները: Log2 սանդղակը ներկայացնում է log2 արժեքները (կրկնակի փոփոխությունը) պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված լուպինի դաշտերից, Վիժենիցա, Լեհաստան, 1999) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերի միջև նույն ժամանակահատվածում: Վերլուծվել են հետևյալ նեղտերև լուպինային գծերը՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ Lanr1 ալելը), Բորեգին (դիմացկուն, գենետիկական նախապատմությունը անհայտ է), Մանդելուպ (միջին դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ AnMan ալելը) և Պոպուլյացիա 22660 (զգայուն):
83A:476 C. lupini-ով (շտամ Col-08) պատվաստմանը տրանսկրիպտոմիկ արձագանքները ներառում էին նաև GO:0015979 «ֆոտոսինթեզ» տերմինին վերագրվող գեների համակարգված լռեցում և այլ կապված կենսաբանական գործընթացներ (Նկար 5): Այս GO:0015979 DEG հավաքածուն պարունակում էր 105 գեն, որոնք զգալիորեն ճնշվել էին 6 hpi-ի դեպքում 83A:476-ում: Այս ենթաբազմությունում 37 գեն նույնպես իջեցված էր Մանդելուպում 48 HPI-ի դեպքում և 35-ը՝ նույն ժամանակային կետում՝ 22660 պոպուլյացիայում, այդ թվում՝ 19 DEG, որոնք ընդհանուր էին երկու գենոտիպերի համար: GO: 0015979 տերմինին վերաբերող ոչ մի DEG զգալիորեն ակտիվացված չէր որևէ համակցությամբ (տող x ժամանակ):
Բացահայտվել են կենսաբանական գործընթացի «GO:0015979 Ֆոտոսինթեզ» տերմինի հիմնական բաղադրիչների արտահայտման օրինաչափությունները: Log2 սանդղակը ներկայացնում է log2 արժեքները (ծավալի փոփոխությունը) պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված լուպինի դաշտերից, Վիժենիցա, Լեհաստան, 1999) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերի միջև նույն ժամանակահատվածում: Վերլուծվել են հետևյալ նեղտերև լուպինային գծերը՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ Lanr1 ալելը), Բորեգին (դիմացկուն, գենետիկական նախապատմությունը անհայտ է), Մանդելուպ (միջին դիմացկուն, կրում է հոմոզիգոտ AnMan ալելը) և Պոպուլյացիա 22660 (զգայուն):
Դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծության արդյունքների հիման վրա և ենթադրաբար պաթոգեն սնկերի դեմ պաշտպանական պատասխաններում ներգրավված լինելու հիման վրա, այս յոթ գեների հավաքածուն ընտրվել է արտահայտման պրոֆիլների քանակական որոշման համար իրական ժամանակի ՊՇՌ-ի միջոցով (Լրացուցիչ աղյուսակ S9):
Ենթադրյալ սպիտակուցային TanjilG_10657 գենը զգալիորեն ինդուկցվել է բոլոր ուսումնասիրված գծերում և ժամանակային կետերում՝ համեմատած վերահսկիչ (նմանակող) բույսերի հետ (Լրացուցիչ աղյուսակներ S10, S11): Բացի այդ, TanjilG_10657-ի արտահայտման պրոֆիլը ցույց է տվել աճի միտում փորձի ընթացքում բոլոր գծերի համար: 22660 պոպուլյացիան ցույց է տվել TanjilG_10657-ի ամենաբարձր զգայունությունը ինոկուլյացիայի նկատմամբ՝ 114-ապատիկ ակտիվացմամբ և ամենաբարձր հարաբերական արտահայտման մակարդակով (4.4 ± 0.4) 24 HPI-ում (Նկար 6ա): PR10 LlR18A սպիտակուցային TanjilG_27015 գենը նույնպես ցույց է տվել ակտիվացում բոլոր գծերում և ժամանակային կետերում՝ վիճակագրական նշանակալիությամբ տվյալների մեծ մասում (Նկար 6բ): TanjilG_10657-ի նման, TanjilG_27015-ի ամենաբարձր հարաբերական արտահայտման մակարդակը դիտվել է 22660 ինոկուլացված պոպուլյացիայի մոտ 24 HPI-ում (19.5 ± 2.4): TanjilG_04706 թթվային էնդոխիտինազի գենը զգալիորեն բարձրացված էր բոլոր գծերում և բոլոր ժամանակային կետերում, բացառությամբ Boregine 6 hpi-ի (Նկար 6c): Այն ուժեղ ինդուկցվել է առաջին ժամանակային կետում (6 HPI) 83A:476-ում (10.5 անգամ) և չափավոր աճել է մյուս գծերում (6.6-7.5 անգամ): Փորձի ընթացքում TanjilG_04706-ի արտահայտությունը մնացել է նմանատիպ մակարդակներում 83A:476-ում և Boregine-ում, մինչդեռ Mandelup-ում և Population 22660-ում այն ​​զգալիորեն աճել է՝ հասնելով համեմատաբար բարձր արժեքների (համապատասխանաբար 5.9 ± 1.5 և 6.2 ± 1.5): TanjilG_23384 էնդոգլուկան-1,3-β-գլյուկոզիդազանման գենը ցույց է տվել բարձր ակտիվացում առաջին երկու ժամանակային կետերում (6 և 12 hpi) բոլոր գծերում, բացառությամբ population 22660-ի (Նկար 6d): TanjilG_23384-ի ամենաբարձր հարաբերական արտահայտման մակարդակները դիտվել են երկրորդ ժամանակային կետում (12 hpi) Մանդելուպում (2.7 ± 0.3) և 83A:476 (1.5 ± 0.1) գենետիկ ցուցանիշներում: 24 HPI-ի դեպքում TanjilG_23384-ի արտահայտումը համեմատաբար ցածր էր բոլոր ուսումնասիրված գծերում (0.04 ± 0.009-ից մինչև 0.44 ± 0.12):
Ընտրված գեների (ag) արտահայտման պրոֆիլները բացահայտվել են քանակական ՊՇՌ-ի միջոցով: 6, 12 և 24 թվերը ներկայացնում են պատվաստումից հետո ժամերը: LanDExH7 և LanTUB6 գեները օգտագործվել են նորմալացման համար, իսկ LanTUB6-ը՝ միջշարային կալիբրացման համար: Սխալի սյուները ներկայացնում են ստանդարտ շեղումը՝ հիմնված երեք կենսաբանական կրկնօրինակների վրա, որոնցից յուրաքանչյուրը երեք տեխնիկական կրկնօրինակների միջինն է: Տվյալների կետերի վերևում նշված են պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված 1999 թվականին Լեհաստանի Վիրժենիցա քաղաքի լուպինի դաշտից) և վերահսկիչ (փորձարկված պատվաստված) բույսերի արտահայտման մակարդակների տարբերությունների վիճակագրական նշանակալիությունը (*P արժեք < 0.05, **P արժեք ≤ 0.01, ***P արժեք ≤ 0.001): Տվյալների կետերի վերևում նշված են պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված 1999 թվականին Լեհաստանի Վիրժենիցա քաղաքի լուպինի դաշտից) և վերահսկիչ (փորձարկված պատվաստված) բույսերի արտահայտման մակարդակների տարբերությունների վիճակագրական նշանակալիությունը (*P արժեք < 0.05, **P արժեք ≤ 0.01, ***P արժեք ≤ 0.001): Статистическая значитемость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и վերահսկել և վերահսկել: точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001): Տվյալների կետերի վերևում նշվում են էքսպրեսիայի մակարդակների վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված 1999 թվականին Լեհաստանի Վիրժենիցե քաղաքի լուպինի դաշտից) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերի միջև (*P արժեք < 0.05, **P-արժեք ≤ 0.01, ***P-արժեք ≤ 0.001):接种 (Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在敼数水平差异的统计学显着性标记在敼数0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 0.001)։接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 թ.之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***0P. Статистически расте значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный с полей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и може контрольномикулими отмечены над точкими данных (* նշանակություն P < 0,05, ** P-նշանակություն ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001): Տվյալների կետերի վերևում նշվում են էքսպրեսիայի մակարդակների վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված լուպինի դաշտերից Վերժենիցեում, Լեհաստան, 1999 թվականին) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերի միջև (*P արժեք < 0.05, **P-արժեք ≤ 0.01, ***P-արժեք ≤ 0.001):Վերլուծված NLL գծերն էին՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրելով Lanr1 հոմոզիգոտ ալելը), Mandelup (միջին դիմացկուն, կրելով AnMan հոմոզիգոտ ալելը), Boregine (դիմացկուն, անհայտ գենետիկական ծագում) և 22660 պոպուլյացիա (զգայուն):
Lanr1 լոկուսում TanjilG_05042 թեկնածու գենը ցույց տվեց զգալիորեն տարբերվող արտահայտման օրինաչափություն՝ համեմատած RNA-seq ուսումնասիրություններից ստացված պրոֆիլների հետ (Նկար 6ե): Այս գենի նշանակալի ակտիվացում նկատվել է Մանդելուպում և 22660 պոպուլյացիայի մոտ (համապատասխանաբար մինչև 39.7 և 11.7 անգամ), ինչը հանգեցրել է համեմատաբար բարձր արտահայտման մակարդակի (համապատասխանաբար մինչև 1.4 ± 0.14 և 7.2 ± 1.3): 83A:476-ը նաև բացահայտել է TanjilG_05042 գենի որոշակի աճ (մինչև 3.8 անգամ), սակայն ձեռք բերված հարաբերական արտահայտման մակարդակները (0.044 ± 0.002) ավելի քան 30 անգամ ցածր էին, քան Մանդելուպում և 22660 պոպուլյացիայի մոտ դիտարկվածները: qPCR մեթոդով վերլուծվածը ցույց տվեց էքսպրեսիայի մակարդակների զգալի տարբերություններ գենոտիպերի միջև՝ կեղծ պատվաստված (վերահսկիչ) տարբերակներում՝ հասնելով 58-ապատիկ տարբերության 22660 և 83A:476 պոպուլյացիաների, ինչպես նաև 22660 և 22660 պոպուլյացիաների միջև: Բորեգինի և Մանդալուպի միջև գրանցվել է կրկնակի տարբերություն:
AnMan լոկուսի թեկնածու գենը՝ TanjilG_12861-ը, ակտիվացել է 83A:476 և Mandelup խմբում պատվաստման պատասխան, չեզոք է եղել 22660 պոպուլյացիայում և նվազել է Բորեգինի մոտ (Նկար 6f): TanjilG_12861 գենի հարաբերական արտահայտությունը ամենաբարձրն էր պատվաստված 83A: 476-ում (0.14±0.01): 17.4 կԴա I դասի ջերմային շոկի սպիտակուցի TanjilG_05080 HSP17.4 գենը ցույց է տվել ավելի ցածր հարաբերական արտահայտման մակարդակներ բոլոր ուսումնասիրված շտամներում և ժամանակային կետերում (Նկար 6g): Ամենաբարձր արժեքը դիտվել է 24 HPI-ում 22660 պոպուլյացիայում (0.14 ± 0.02, պատվաստման պատասխանի ութապատիկ աճ):
Գեների արտահայտման պրոֆիլների համեմատությունը (Նկար 7) բացահայտեց բարձր կոռելյացիա TanjilG_10657-ի և չորս այլ գեների՝ TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.80) և TanjilG_04706 (r = 0.79) միջև: Նման արդյունքները կարող են վկայել այս գեների համատեղ կարգավորման մասին պաշտպանական ռեակցիաների ընթացքում: TanjilG_12861 և TanjilG_23384 գեները ցույց տվեցին տարբեր արտահայտման պրոֆիլներ՝ Պիրսոնի կոռելյացիայի գործակցի ավելի ցածր արժեքներով (համապատասխանաբար 0.08-ից մինչև 0.43 և -0.19-ից մինչև 0.28)՝ համեմատած այլ գեների հետ:
Գեների արտահայտման պրոֆիլների միջև փոխհարաբերությունները հայտնաբերվել են քանակական ՊՇՌ-ի միջոցով: Վերլուծվել են հետևյալ նեղտերև լուպինային գծերը՝ 83A:476 (դիմացկուն, կրելով Lanr1 հոմոզիգոտ ալելը), Mandelup (միջին դիմացկուն, կրելով AnMan հոմոզիգոտ ալելը), Boregine (դիմացկուն, գենետիկական նախապատմությունը անհայտ է) և Population 22660 (զգայուն): Հաշվարկվել են երեք ժամանակային կետեր (պատվաստումից 6, 12 և 24 ժամ անց), ներառյալ պատվաստված (Colletotrichum lupini, Col-08 շտամ, ստացված լուպինի դաշտերից Վիրժենիցեում, Լեհաստան, 1999 թվականին) և վերահսկիչ (կեղծ պատվաստված) բույսերը: Սանդղակը ցույց է տալիս Պիրսոնի փոխհարաբերության գործակցի արժեքը:
6 ձիաուժ մեկ դյույմում ստացված տվյալների հիման վրա, WGCNA-ն իրականացվել է 9981 DEG-ի վրա, որը նույնականացվել է պատվաստված և վերահսկիչ բույսերի համեմատությամբ՝ վաղ պաշտպանական արձագանքների վրա կենտրոնանալու համար (Լրացուցիչ աղյուսակ S12): Հայտնաբերվել են քսաներկու գենային մոդուլներ (կլաստերներ)՝ գենոտիպերի և փորձարարական տարբերակների միջև փոխկապակցված (դրական կամ բացասական) արտահայտման պրոֆիլներով: Միջին հաշվով, գեների արտահայտման մակարդակները նվազման կարգով էին՝ 83A:476 > Մանդելուպ > Բորեգին > Պոպուլյացիա 22660 (սակայն երկու տարբերակներում էլ այս միտումն ավելի ուժեղ էր վերահսկիչ բույսերում): Միջին հաշվով, գեների արտահայտման մակարդակները նվազման կարգով էին՝ 83A:476 > Մանդելուպ > Բորեգին > Պոպուլյացիա 22660 (սակայն երկու տարբերակներում էլ այս միտումն ավելի ուժեղ էր վերահսկիչ բույսերում): В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Բնակչություն 22660 (в обоих варијантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений): Միջին հաշվով, գեների արտահայտման մակարդակը նվազել է հետևյալ հերթականությամբ՝ 83A:476 > Մանդելուպ > Բորեգին > Պոպուլյացիա 22660 (սակայն երկու տարբերակներում էլ այս միտումն ավելի ուժեղ էր վերահսկիչ բույսերում):平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Բնակչություն 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> բնակչություն 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 在 植物 中 更）…………………………………………….. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Բնակչություն 22660 (однако в обоих варијантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений): Միջին հաշվով, գեների արտահայտման մակարդակը նվազել է 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 շարքում (սակայն, երկու տարբերակներում էլ այս միտումն ավելի ուժեղ էր վերահսկիչ բույսերում):Պատվաստումը հանգեցրեց գեների արտահայտման ակտիվացման, հատկապես 18, 19, 14, 6 և 1 մոդուլներում (ազդեցության նվազման կարգով), բացասական կարգավորման (օրինակ՝ 9 և 20 մոդուլներ) կամ չեզոք ազդեցություններով (օրինակ՝ 11, 22, 8 և 13 մոդուլներ): GO տերմինի հարստացման վերլուծությունը (Լրացուցիչ աղյուսակ S13) բացահայտեց «GO: 0006952 Պաշտպանիչ արձագանքներ» պատվաստված մոդուլի (18) համար՝ առավելագույն ակտիվացմամբ, ներառյալ qPCR-ով վերլուծված գեները (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 և TanjilG_27015), ինչպես նաև շատ պատվաստված ֆոտոսինթեզի ամենաճնշված մոդուլներում (9): Մոդուլ 18-ի կոնցենտրատորը (Նկար 8) նույնականացվել է որպես PR-10-անման LlR18B սպիտակուցը կոդավորող TanjilG_26536 գեն, իսկ մոդուլ 9-ի կոնցենտրատորը նույնականացվել է որպես TanjilG_28955 գեն, որը կոդավորում է II ֆոտոհամակարգի PsbQ սպիտակուցը: Անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության Lanr1 թեկնածու գենը՝ TanjilG_05042-ը, հայտնաբերվել է մոդուլ 22-ում (Նկար 9) և կապված է «GO:0044260 Բջջային մակրոմոլեկուլային նյութափոխանակության պրոցեսներ» և «GO:0006355 Տրանսկրիպցիոն կարգավորում, ԴՆԹ-ի ձևանմուշավորում» տերմինների հետ, որոնք կրում են TanjilG_01212 հանգույցը: Գենը կոդավորում է ջերմային սթրեսի տրանսկրիպցիոն գործոն A-4a (HSFA4a):
«GO: 0006952 Պաշտպանական պատասխաններ» գերներկայացված կենսաբանական պրոցեսային տերմիններով մոդուլների գեների համատեղ արտահայտման կշռված ցանցային վերլուծություն: Լիգացիան պարզեցվել է՝ qPCR-ով վերլուծված չորս գեները (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 և TanjilG_27015) ընդգծելու համար:
«GO: 0006355: Տրանսկրիպցիոն կարգավորում, ԴՆԹ-ի ձևանմուշավորում» գերներկայացված կենսաբանական պրոցեսի տերմինով և անտրակնոզի դիմադրության թեկնածու Lanr1 TanjilG_05042 գեն կրող մոդուլի գեների համատեղ արտահայտման կշռված ցանցային վերլուծություն: Լիգացիան պարզեցվել է՝ TanjilG_05042 գենը և կենտրոնական TanjilG_01212 գենը մեկուսացնելու համար:
Ավստրալիայում անցկացված անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության սկրինինգը ցույց տվեց, որ վաղ շրջանի թողարկված սորտերի մեծ մասը զգայուն էին. Kalya-ն, Coromup-ը և Mandelup-ը նկարագրվել են որպես չափավոր դիմադրողական, մինչդեռ Wonga-ն, Tanjil-ը և 83A:476-ը նկարագրվել են որպես բարձր դիմադրողական26,27,31: ունեին նույն դիմադրության ալելը, որը նշանակվել էր Lanr1, իսկ Coromup-ը և Mandelup-ը ունեին այլ ալել, որը նշանակվել էր AnMan10, 26, 39, մինչդեռ Kalya-ն փոխանցեց այլ ալել, Lanr2: Գերմանիայում անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության սկրինինգը հանգեցրեց Bo7212 դիմադրողական գծի նույնականացմանը՝ Lanr1-ից տարբեր թեկնածու ալելով, որը նշանակվել էր LanrBo36:
Մեր ուսումնասիրությունը բացահայտեց Lanr1 ալելի շատ ցածր հաճախականություն (մոտ 6%) փորձարկված գերմապլազմայում: Այս դիտարկումը համապատասխանում է Արևելյան Եվրոպայի գերմապլազմայի սկրինինգի արդյունքներին Anseq3 և Anseq4 մարկերների միջոցով, որոնք ցույց տվեցին, որ Lanr1 ալելը առկա է միայն երկու բելառուսական գծերում: Սա ենթադրում է, որ Lanr1 ալելը դեռևս լայնորեն չի օգտագործվում տեղական բուծման ծրագրերում, ի տարբերություն Ավստրալիայի, որտեղ այն մարկերային օժանդակությամբ բուծման հիմնական ալելներից մեկն է: Սա կարող է պայմանավորված լինել Lanr1 ալելի կողմից եվրոպական դաշտային պայմաններում ապահովվող դիմադրության ավելի ցածր մակարդակով՝ համեմատած Ավստրալիայի զեկույցի հետ: Բացի այդ, Ավստրալիայի բարձր տեղումների տարածքներում անտրակնոզի ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Lanr1 ալելի միջնորդությամբ առաջացած դիմադրության արձագանքները կարող են արդյունավետ չլինել պաթոգենի աճին և արագ զարգացմանը նպաստող եղանակային պայմաններում19,42: Փաստորեն, ներկայիս ուսումնասիրության մեջ անտրակնոզի որոշ ախտանիշներ նկատվել են նաև Lanr1 ալել կրող գենոտիպերում, ինչը ենթադրում է, որ դիմադրողականությունը կարող է անհետանալ C. lupini-ի զարգացման համար օպտիմալ պայմաններում: Բացի այդ, հնարավոր են Anseq3 և Anseq4 մարկերների առկայության կեղծ դրական մեկնաբանություններ, որոնք գտնվում են Lanr1 լոկուսից մոտավորապես 1 սմ հեռավորության վրա 28,30,43:
Մեր ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ Lanr1 ալելը կրող 83A:476-ը արձագանքեց C. lupini-ի պատվաստմանը՝ մեծածավալ տրանսկրիպտոմի վերածրագրավորմամբ առաջին վերլուծված ժամանակային կետում (6 hpi), մինչդեռ AnMan ալելը կրող Մանդելուպում տրանսկրիպտոմիկ արձագանքները դիտվեցին շատ ավելի ուշ (24-ից մինչև 48 hpi): Պաշտպանական արձագանքների այս ժամանակային տատանումները կապված են հիվանդության ախտանիշների տարբերությունների հետ, ինչը ընդգծում է վաղ պաթոգենի ճանաչման կարևորությունը դիմադրությանը հաջող արձագանքի համար: Բույսերի հյուսվածքը վարակելու համար սիբիրախտի սպորները պետք է անցնեն մի քանի զարգացման փուլեր տիրոջ մակերեսին, ներառյալ բողբոջումը, բջջային բաժանումը և ապպրեսորիումի ձևավորումը: Հավելվածը վարակիչ կառուցվածք է, որը կպչում է տիրոջ մակերեսին և նպաստում է ներթափանցմանը տիրոջ հյուսվածքներ: Այսպիսով, ոլոռի քաղվածքում C. gloeosporioides-ի սպորները ցույց տվեցին կորիզի առաջին բաժանումը 75-90 րոպե ինկուբացիայից հետո, մանրէային խողովակի ձևավորումը՝ 90-120 րոպեից հետո, և ճնշում՝ 4 ժամից հետո 45: Մանգոյի C. gloeosporioides-ը 3 ժամ ինկուբացիայից հետո ցույց տվեց ավելի քան 40% կոնիդային ծլում և մոտ 20% ապպրեսորների առաջացում 4 ժամ հետո: C. gloeosporioides-ի վիրուլենտության հետ կապված CAP20 գենը ցույց տվեց տրանսկրիպցիոն ակտիվություն էպիֆիտ առաջացնող կոնիդիաներում 3.5 ժամ ինկուբացիայից հետո ավոկադոյի մակերեսային մոմի մեջ՝ CAP20 սպիտակուցի բարձր կոնցենտրացիաներով 4 ժամ 46 րոպե հետո: Նմանապես, C. trifolii-ում մելանինի կենսասինթեզի գեների ակտիվությունը ինդուկցվել է 2 ժամ տևողությամբ ինկուբացիայի ընթացքում, որին հաջորդել է ապպրեսորիումի առաջացումը 1 ժամ հետո: Տերևի հյուսվածքների ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ C. acutatum-ով պատվաստված ելակը առաջին ճնշումն ունի 8 hpi-ում, մինչդեռ C. coccodes-ով պատվաստված լոլիկը առաջին ճնշումն ունի 4 hpi-ում48,49, ինչը մեծապես համապատասխանում է Colletotrichum spp. վարակիչ գործընթացի ժամանակային մասշտաբին: 83A:476-ի նկատմամբ արագ պաշտպանական արձագանքները ենթադրում են բույսերի դիմադրության և էֆեկտորով ակտիվացված իմունիտետի (ETI) գեների ներգրավվածություն այս գծում, մինչդեռ Մանդելուպի ուշացած արձագանքները հաստատում են միկրոկապակցված մոլեկուլային օրինաչափությամբ ակտիվացված իմունիտետի (MTI) վարկածը 50: 83A: 476-ի և Մանդելուպի նկատմամբ վաղ արձագանքները: Ուշացած արձագանքում բարձրացող կամ ցածր կարգավորվող գեների մասնակի համընկնումը նույնպես հաստատում է այս հայեցակարգը, քանի որ ETI-ն հաճախ համարվում է արագացված և ուժեղացված MTI արձագանք, որը գագաթնակետին է հասնում վարակի վայրում ծրագրավորված բջջային մահվան, որը հայտնի է որպես անաֆիլակտիկ շոկ 51,52:
Գեների գերներկայացված «Պաշտպանական արձագանք» տերմինին վերագրվող գեների մեծ մասը սթրեսից առաջացած ծոմապահության հաղորդագրության 22 սպիտակուցի (նման է SAM22-ին) և յոթ հիմնական լատեքսային սպիտակուցանման (MLP) 11 հոմոլոգներն են։ 31, 34, 43 և 423 սպիտակուցները ցույց տվեցին հաջորդականության նմանություն։ SAM22-անման գեները ցույց տվեցին նշանակալի ակտիվացում, որը տևեց ավելի երկար՝ ցույց տալով անտրակնոզի դիմադրության բարձր մակարդակներ (83A:476 և Boregine): Այնուամենայնիվ, MLP-անման գեները նվազեցված ակտիվություն ունեին միայն դիմադրության թեկնածու ալելը կրող գծերում (83A:476/Lanr1՝ 6 hpi-ով և Mandelup/AnMan՝ 24 hpi-ով): Պետք է նշել, որ բոլոր նույնականացված SAM22-անման հոմոլոգները ծագում են մոտավորապես 105 կբ երկարությամբ գեների կլաստերից, մինչդեռ MLP-անման գեները ծագում են գենոմի առանձին շրջաններից։ Նման SAM22-անման գեների համակարգված ակտիվացում հայտնաբերվել է նաև Diaporthetoxica-ի պատվաստման նկատմամբ NLL-ի դիմադրության մեր նախորդ ուսումնասիրության մեջ, ինչը ենթադրում է, որ դրանք ներգրավված են պաշտպանական արձագանքի հորիզոնական բաղադրիչներում: Այս եզրակացությունը հաստատվում է նաև SAM22-անման գեների վնասվածքին կամ սալիցիլաթթվով, սնկային ինդուկտորներով կամ ջրածնի պերօքսիդով բուժմանը դրական արձագանքի մասին հաղորդագրություններով:
MLP-անման գեները, ինչպես ցույց է տրվել, արձագանքում են տարբեր աբիոտիկ և կենսաբանական սթրեսների, այդ թվում՝ բազմաթիվ բույսերի տեսակների մոտ բակտերիալ, վիրուսային և պաթոգեն սնկային վարակների55: Բույսերի և պաթոգենների միջև որոշակի փոխազդեցությունների արձագանքի ուղղությունները տատանվում էին ուժեղ աճից (այսինքն՝ բամբակի Verticillium dahliae-ով վարակման ժամանակ) մինչև զգալիորեն նվազում (այսինքն՝ խնձորենու Alternaria spp.-ով վարակվելուց հետո)56,57: MLP-անման 423 գենի զգալի նվազում է նկատվել F. niger վարակի դեմ ավոկադոյի պաշտպանության ընթացքում և խնձորենու վարակի ժամանակ: Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola և Alternaria alternata խնձորի պաթոտիպեր են58,59: Բացի այդ, MLP-անման 423 գենը գերարտահայտող խնձորի կոկոսները ունեցել են դիմադրության հետ կապված գեների ավելի ցածր արտահայտություն և ավելի զգայուն են եղել սնկային վարակի նկատմամբ59: Fusarium oxysporum f-ից հետո MLP-անման 423 գենը նույնպես ճնշվել է դիմացկուն սովորական լոբու սաղմնային պլազմայում: cn. Լոբու վարակ 60:
Մեր RNA-seq ուսումնասիրության մեջ բացահայտված PR-10 ընտանիքի այլ անդամներն էին LlR18A և LlR18B գեները՝ ի պատասխան վերագրանցման, ինչպես նաև DIR1 լիպիդային փոխանցման սպիտակուցի վերագրանցման (1 գեն) կամ իջեցման (3 գեն) գենը։ Բացի այդ, WGCNA-ն այս մոդուլի կենտրոն է համարում LlR18B գենը, որը խիստ զգայուն է պատվաստման նկատմամբ և կրում է մի քանի պաշտպանիչ արձագանքման գեներ։ LlR18A և LlR18B գեները ինդուկցվել են դեղին լուպինի տերևներում՝ ի պատասխան պաթոգեն բակտերիաների, ինչպես նաև NLL ցողունների վրա D. toxica-ի պատվաստումից հետո, մինչդեռ այս գեների բրնձի հոմոլոգը՝ RSOsPR10-ը, արագորեն ինդուկցվել է սնկային վարակի կողմից, որը ենթադրաբար ներգրավված է ջասմոնաթթվի ազդանշանային ուղու մեջ53,61, 62։ DIR1 գենը կոդավորում է ոչ սպեցիֆիկ լիպիդային փոխադրման սպիտակուցներ, որոնք անհրաժեշտ են համակարգային ձեռքբերովի դիմադրության (SAR) առաջացման համար։ Պաշտպանիչ ռեակցիաների զարգացման հետ մեկտեղ, DIR1 սպիտակուցը վարակի օջախից տեղափոխվում է ֆլոեմի միջոցով՝ հեռավոր օրգաններում SAR ինդուկցելու համար: Հետաքրքիր է, որ TanjilG_02313 DIR1 գենը զգալիորեն ինդուկցվել է առաջին ժամանակային կետում 84A:476 և 22660 պոպուլյացիաներում, սակայն անտրակնոզի նկատմամբ կայունությունը հաջողությամբ զարգացել է միայն 84A:476 տողում: Սա կարող է վկայել DIR1 գենի որոշակի ենթաֆունկցիոնալացման մասին NLL-ում, քանի որ մնացած երեք հոմոլոգները պատվաստմանը արձագանքել են միայն 83A:476 տողում՝ 6 hpi-ով, և այս արձագանքը ուղղված էր դեպի ներքև:
Մեր ուսումնասիրության մեջ «GO:0055114 օքսիդա-վերականգնման գործընթաց» կոչվող կենսաբանական գործընթացին համապատասխանող ամենատարածված բաղադրիչներն էին ցիտոքրոմ P450 սպիտակուցը, պերօքսիդազը, լինոլեաթթվի 9S-/13S-լիպօքսիգենազը և 1-ամինոցիկլոպրոպան-1-կարբօքսիլաթթվի օքսիդազը: Բացի այդ, մեր WGCNA-ն HSFA4a հոմոլոգը սահմանում է որպես հանգույց կրող մոդուլներ, ինչպիսին է Lanr1 դիմադրության գենի թեկնածու TanjilG_05042-ը: HSFA4a-ն բույսերում միջուկային տրանսկրիպցիայի օքսիդա-վերականգնում-կախյալ կարգավորման բաղադրիչ է:
Ցիտոքրոմ P450 սպիտակուցները օքսիդոռեդուկտազներ են, որոնք կատալիզացնում են NADPH և/կամ O2-կախյալ հիդրօքսիլացման ռեակցիաները առաջնային և երկրորդային նյութափոխանակության մեջ, ներառյալ քսենոբիոտիկների, ինչպես նաև հորմոնների, ճարպաթթուների, ստերոլների, բջջային պատի բաղադրիչների, կենսապոլիմերների և պաշտպանիչ միացությունների կենսասինթեզի նյութափոխանակությունը 69: Մեր ուսումնասիրության մեջ բույսերի ցիտոքրոմ P450 ֆունկցիայի փոփոխականությունը նվազել է -10.6 log2-ից (փոփոխության անգամ) մինչև 5.7՝ փոփոխված հոմոլոգների մեծ թվի (37) և որոշակի գեների միջև արձագանքի օրինաչափությունների տարբերությունների պատճառով, ինչը արտացոլում է վերևում կատարված վերանայումը: Միայն RNA-seq տվյալների օգտագործումը NLL գեների ենթադրյալ կենսաբանական գործառույթը նման մեծ սպիտակուցային գերընտանիքում պարզաբանելու համար խիստ ենթադրական կլիներ: Այնուամենայնիվ, հարկ է նշել, որ որոշ ցիտոքրոմ P450 գեներ կապված են պաթոգեն սնկերի կամ մանրէների նկատմամբ դիմադրության բարձրացման հետ, ներառյալ ալերգիկ ռեակցիաներին նպաստելը 69,70,71:
III դասի պերօքսիդազները բազմաֆունկցիոնալ բուսական ֆերմենտներ են, որոնք մասնակցում են բույսերի աճի և զարգացման ընթացքում նյութափոխանակության լայն շրջանակի գործընթացներին, ինչպես նաև շրջակա միջավայրի սթրեսներին, ինչպիսիք են աղիությունը, երաշտը, լույսի բարձր ինտենսիվությունը և պաթոգենների հարձակումը, ի պատասխան72: Պերօքսիդազները մասնակցում են մի շարք բույսերի տեսակների փոխազդեցությանը Anthracis-ի հետ, ներառյալ Stylosanthes humilis-ը և C. gloeosporioides-ը, Lens culinaris-ը և C. truncatum-ը, Phaseolus vulgaris-ը և C. lindemuthianum-ը, Cucumis sativus-ը և C. lagenarium-ը73,74,75,76: Արձագանքը շատ արագ է, երբեմն նույնիսկ 4 HPI-ում, նախքան սունկը ներթափանցի բույսի հյուսվածք73: Պերօքսիդազի գենը նաև արձագանքել է D. toxica NLL պատվաստմանը: Բացի օքսիդատիվ պայթյունը կարգավորելու կամ օքսիդատիվ սթրեսը վերացնելու իրենց բնորոշ գործառույթներից, պերօքսիդազները կարող են խանգարել պաթոգենների աճին՝ ստեղծելով ֆիզիկական արգելքներ՝ հիմնված բջջային պատի ամրացման վրա՝ որոշակի միացությունների լիգնիֆիկացիայի, ենթամիավորների կամ խաչաձև կապի ընթացքում: Այս ֆունկցիան in silico կարելի է վերագրել TanjilG_03329 գենին, որը կոդավորում է ենթադրյալ լիգնին առաջացնող անիոն պերօքսիդազ, որի ակտիվությունը մեր ուսումնասիրության մեջ զգալիորեն բարձրացել էր 83A:476 կայուն գծում 6 HPI-ի դեպքում, բայց ոչ այլ շտամներում և ժամանակային կետերում, որոնք չարձագանքեցին։
Լինոլաթթվի 9S-/13S-լիպօքսիգենազը լիպիդային կենսասինթեզի օքսիդատիվ ուղու առաջին քայլն է78: Այս ուղու արգասիքները բազմաթիվ գործառույթներ ունեն բույսերի պաշտպանության մեջ, ներառյալ բջջային պատի ամրացումը՝ կալցոզային և պեկտինային նստվածքների առաջացման միջոցով, և օքսիդատիվ սթրեսի կարգավորումը՝ ռեակտիվ թթվածնային տեսակների արտադրության միջոցով79,80,81,82,83: Այս ուսումնասիրության մեջ լինոլաթթվի 9S-/13S-լիպօքսիգենազի արտահայտությունը փոփոխվել է բոլոր շտամներում, սակայն զգայուն պոպուլյացիայի 22660 դեպքում տարբեր ժամանակային կետերում գերակշռել է աճող ակտիվությունը, մինչդեռ դիմացկուն Lanr1 և AnMan ալել կրող շտամներում այն ​​ընդգծում է օքսիլիպինային շերտի դիվերսիֆիկացիան այս գենոտիպերի միջև պաշտպանիչ սիբիրախտի ռեակցիաներում:
1-ամինոցիկլոպրոպան-1-կարբօքսիլատ օքսիդազի (ACO) հոմոլոգը զգալիորեն բարձրացել է (9 գեն) կամ նվազել (2 գեն), երբ այն ներարկվել է լուպինով: Երկու բացառությամբ, այս բոլոր արձագանքները տեղի են ունեցել 6 hp-ի դեպքում՝ 83A:476-ում: ACO սպիտակուցներով միջնորդված ֆերմենտատիվ ռեակցիան էթիլենի արտադրության արագությունը սահմանափակող քայլն է և, հետևաբար, խիստ կարգավորվում է84: Էթիլենը բույսերի հորմոն է, որը տարբեր դերեր է խաղում բույսերի զարգացման և աբիոտիկ և կենսաբանական սթրեսային պայմաններին արձագանքի կարգավորման գործում: ACO տրանսկրիպցիայի ինդուկցիան և էթիլենի ազդանշանային ուղու ակտիվացումը ներգրավված են բրնձի դիմադրողականության բարձրացման մեջ oryzae oryzae հեմիբիոտրոֆիկ սնկի նկատմամբ՝ կարգավորելով ռեակտիվ թթվածնային տեսակների և ֆիտոլեքսինների արտադրությունը: M. oryzae-ի և C. lupini-ի միջև հայտնաբերված շատ նմանատիպ տերևային վարակի գործընթացը88,89, այս ուսումնասիրության մեջ նշված 83A:476 գծում ACO հոմոլոգների զգալի աճի ֆոնին, փոխում է NLL անտրակնոզի նկատմամբ էթիլենի դիմադրողականությունը մոլեկուլային ուղիներում ազդանշանային կենտրոնական քայլ դարձնելու հնարավորությունը։
Այս ուսումնասիրության մեջ, 83A:476-ում 6 hpi-ով և Մանդելուպում և 22660 պոպուլյացիայում 48 hpi-ով դիտվել է ֆոտոսինթեզի հետ կապված բազմաթիվ գեների լայնածավալ ճնշում: Այս փոփոխությունների ծավալը և առաջընթացը համեմատական ​​են մակարդակին: Այս փորձի ընթացքում դիտվել է անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրություն: Վերջերս, ֆոտոսինթեզի հետ կապված տրանսկրիպտների ուժեղ և վաղ ճնշում է հայտնաբերվել բույս-պաթոգեն փոխազդեցությունների մի քանի մոդելներում, այդ թվում՝ պաթոգեն բակտերիաներում և սնկերում: Վարակի նկատմամբ ֆոտոսինթեզի հետ կապված գեների շտապողականությունը (որոշ փոխազդեցություններում 2 HPI-ից) և գլոբալ ճնշումը կարող է առաջացնել բույսերի անձեռնմխելիություն՝ հիմնվելով ռեակտիվ թթվածնային տեսակների տեղակայման և դրանց սալիցիլաթթվի ուղու հետ փոխազդեցության վրա՝ ալերգիկ ռեակցիաները միջնորդելու համար 90,94:
Ամփոփելով՝ ամենակայուն տոհմի համար առաջարկվող պաշտպանական արձագանքի մեխանիզմները (83A:476) ներառում են R գենի կողմից պաթոգենի արագ ճանաչումը (ենթադրաբար TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) և ալերգիկ ռեակցիայի միջոցով միջնորդված սալիցիլաթթվի և էթիլենի ազդանշանային փոխանցումը, որին հաջորդում է երկարատև SAR-ի հաստատումը։ Գործողությունը աջակցվում է DIR-1 սպիտակուցի կողմից։ Պետք է նշել, որ C. lupini վարակի կենսատրոֆիկ ժամանակահատվածը շատ կարճ է (մոտավորապես 2 օր), որին հաջորդում է նեկրոտիկ աճը95։ Այս փուլերի միջև անցումը կարող է կապված լինել նեկրոզի և էթիլեն-ինդուկցվող սպիտակուցների արտահայտման հետ, որոնք հանդես են գալիս որպես հյուրընկալող բույսերում գերզգայունության ռեակցիաների խթանիչներ։ Հետևաբար, կենսատրոֆիկ փուլում C. lupini-ի հաջողությամբ որսալու ժամանակային պատուհանը շատ նեղ է։ 83A:476-ում 6 hpi-ով դիտարկված օքսիդա-վերականգնման և ֆոտոսինթեզի հետ կապված գեների վերածրագրավորումը համապատասխանում է սնկային հիֆերի առաջընթացին և ազդարարում է կենսատրոֆիկ փուլում հաջող պաշտպանիչ արձագանքի զարգացումը։ Մանդելուպի և 22660 պոպուլյացիայի տրանսկրիպտոմիկ արձագանքները կարող են չափազանց ուշացած լինել՝ սնկը նեկրոտիկ աճի անցնելուց առաջ որսալու համար, սակայն Մանդելուպը կարող է ավելի արդյունավետ լինել, քան 22660 պոպուլյացիան, քանի որ PR-10 սպիտակուցի համեմատաբար արագ կարգավորումը խթանում է հորիզոնական դիմադրությունը։
Կանոնիկ R գենով պայմանավորված ETI-ն, կարծես թե, լոբու անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականության տարածված մեխանիզմ է։ Այսպիսով, Medicago truncatula մոդելային լոբազգիների մոտ անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականությունը փոխանցվում է RCT1 գենի միջոցով, որը TIR-NBS-LRR97 բույսի R գեների դասի անդամ է։ Այս գենը նաև լայն սպեկտրի անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականություն է հաղորդում առվույտին, երբ այն փոխանցվում է զգայուն բույսերի։ Սովորական լոբու (P. vulgaris) մոտ մինչ օրս հայտնաբերվել են անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականության երկու տասնյակից ավելի գեներ։ Այս գեներից մի քանիսը հայտնաբերվում են կանոնիկ R գեներ չունեցող շրջաններում, սակայն շատ ուրիշներ գտնվում են NBS-LRR գեների կլաստերը կրող քրոմոսոմների եզրերին, այդ թվում՝ TIR-NBS-LRRs99-ում։ Գենոմի լայնածավալ SSR ուսումնասիրությունը նաև հաստատել է NBS-LRR գենի կապը սովորական լոբու անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրողականության հետ։ Կանոնիկ R գենը հայտնաբերվել է նաև սպիտակ լուպին 101-ի գենոմային շրջանում, որը կրում է անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության հիմնական լոկուսը։
Մեր աշխատանքը ցույց է տալիս, որ բույսերի վարակի վաղ փուլում ակտիվացող անհապաղ դիմադրության ռեակցիան (ցանկալի է ոչ ուշ, քան 12 hpi), արդյունավետորեն պաշտպանում է նեղատերև լուպինը Collelotrichum lupini պաթոգեն սնկի կողմից առաջացած անտրակնոզից: Բարձր թողունակության հաջորդականության միջոցով մենք ցույց տվեցինք Lanr1 և AnMan դիմադրության գեների միջոցով NLL բույսերում անտրակնոզի դիմադրության գեների դիֆերենցիալ արտահայտման պրոֆիլները: Հաջող պաշտպանությունը ենթադրում է օքսիդա-վերականգնման, ֆոտոսինթեզի և պաթոգենեզի մեջ ներգրավված սպիտակուցների գեների ուշադիր նախագծում բույսի պաթոգենի հետ առաջին շփումից հետո մի քանի ժամվա ընթացքում: Նմանատիպ պաշտպանիչ ռեակցիաները, բայց ժամանակի մեջ հետաձգված, շատ ավելի քիչ արդյունավետ են բույսերը հիվանդություններից պաշտպանելու համար: Lanr1 գենի միջոցով սիբիրախտի դիմադրության ռեակցիան նման է R գենի տիպիկ արագ արձագանքին (էֆեկտոր-ակտիվ իմունիտետ), մինչդեռ AnMan գենը, ամենայն հավանականությամբ, ապահովում է հորիզոնական արձագանք (իմունիտետ, որն ակտիվանում է մանրէի հետ կապված մոլեկուլային օրինաչափությամբ), ապահովելով կայունության չափավոր մակարդակ:
Անտրակնոզի մարկերների սկրինինգի համար օգտագործված 215 NLL գծերը բաղկացած էին 74 կուլտիվարից, խաչասերման կամ բուծման միջոցով ստացված 60 գծերից, 5 մուտանտներից և 76 վայրի կամ օրիգինալ գերմապլազմայից: Գծերը եկել են 17 երկրներից, հիմնականում Լեհաստանից (58), Իսպանիայից (47), Գերմանիայից (27), Ավստրալիայից (26), Ռուսաստանից (19), Բելառուսից (7), Իտալիայից (5) և այլ գծերից՝ 10 երկրներից: Հավաքածուն ներառում է նաև հղման դիմացկուն գծեր՝ 83A:476, Tanjil, Wonga, որը կրում է Lanr1 ալելը, և Mandelup, որը կրում է AnMan ալելը: Գծերը ստացվել են Poznań Plant Breeding Ltd.-ի (Վիատրովո, Լեհաստան) կողմից պահպանվող Եվրոպական լուպինային գենետիկական ռեսուրսների տվյալների բազայից (Լրացուցիչ աղյուսակ S1):
Բույսերը աճեցվել են վերահսկվող պայմաններում (ֆոտոպերոդ 16 ժամ, ջերմաստիճան 25°C ցերեկը և 18°C ​​գիշերը): Վերլուծվել են երկու կենսաբանական կրկնօրինակներ: ԴՆԹ-ն մեկուսացվել է երեք շաբաթական տերևներից՝ օգտագործելով DNeasy Plant Mini Kit-ը (Qiagen, Hilden, Germany)՝ համաձայն արձանագրության: Մեկուսացված ԴՆԹ-ի որակը և կոնցենտրացիան գնահատվել են սպեկտրոֆոտոմետրիկ մեթոդներով (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA): Վերլուծվել են անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության AnMan գենը նշող AnManM1 մարկերները (ստացված Mandelup cv-ից) և Lanr1 գենը (ստացված Tanjil cv-ից) շրջապատող Anseq3 և Anseq4 մարկերները 11,26,28: Դիմացկուն ալելի համար հոմոզիգոտները գնահատվել են «1», զգայունները՝ «0», իսկ հետերոզիգոտները՝ 0.5:
AnManM1, AnSeq3 և AnSeq4 մարկերների սկրինինգի արդյունքների և վերջնական հետագա փորձերի համար սերմերի առկայության հիման վրա, անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության ֆենոտիպավորման համար ընտրվել է 50 NLL գիծ: Վերլուծությունը կատարվել է կրկնակի՝ համակարգչային կառավարմամբ ջերմոցում՝ 14-ժամյա լուսապարեզով, ցերեկը 22°C և գիշերը 19°C ջերմաստիճանային միջակայքով: Սերմերը քերծվում են (սաղմի հակառակ կողմում գտնվող սերմի թաղանթը կտրելով սուր շեղբով) ցանելուց առաջ՝ սերմերի հանգստությունը կանխելու համար, քանի որ սերմի թաղանթը չափազանց կարծր է, և միատարր բողբոջումն ապահովելու համար: Բույսերը աճեցվել են ամանների մեջ (11 × 11 × 21 սմ)՝ ստերիլ հողով (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Վարշավա, Լեհաստան): Պատվաստումն իրականացվել է Colletotrichum lupini Col-08 շտամով, որը 1999 թվականին աճեցվել է Մեծ Լեհաստանի Վերժենիցա քաղաքի դաշտում աճեցված նեղատերև լուպինի բույսերի ցողուններից (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ): Վերցրեք որոշակի տարածք: Իզոլյատները 21 օր մշակվել են SNA միջավայրում 20°C ջերմաստիճանում սև լույսի տակ՝ սպորուլյացիա առաջացնելու համար: Ցանելուց չորս շաբաթ անց, երբ բույսերը հասել էին 4-6 տերևի փուլին, պատվաստումն իրականացվել է կոնիդիաների սուսպենզիայով՝ 0.5 x 106 կոնիդիա կոնցենտրացիայով մեկ մլ-ում: Պատվաստումից հետո բույսերը 24 ժամ պահվել են մթության մեջ մոտ 98% խոնավության և 25°C ջերմաստիճանի պայմաններում՝ կոնիդիաների բողբոջումը և վարակի գործընթացը հեշտացնելու համար: Այնուհետև բույսերը աճեցվել են 14-ժամյա ֆոտոպերիոդի պայմաններում՝ 22°C ցերեկ/19°C գիշեր և 70% խոնավություն։ Հիվանդության գնահատականը կազմվել է պատվաստումից 22 օր անց և տատանվել է 0-ից (իմունային) մինչև 9 (շատ զգայուն)՝ կախված ցողունների և տերևների վրա նեկրոտիկ վնասվածքների առկայությունից կամ բացակայությունից։ Բացի այդ, գնահատականը տալուց հետո չափվել է բույսերի քաշը։ Մարկերային գենոտիպերի և հիվանդության ֆենոտիպերի միջև փոխհարաբերությունները հաշվարկվել են որպես կետային երկրորդ հաջորդականության փոխհարաբերություններ (անտրակնոզի նկատմամբ դիմադրության ֆենոտիպի վերլուծության համար գծերի հավաքածուում հետերոզիգոտ մարկերների բացակայություն)։