Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը կներկայացնենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Անհրաժեշտ է հուսալի in vitro համակարգ, որը կարող է ճշգրիտ վերարտադրել սրտի ֆիզիոլոգիական միջավայրը դեղորայքի փորձարկման համար:Մարդու սրտի հյուսվածքների կուլտուրայի համակարգերի սահմանափակ հասանելիությունը հանգեցրել է սրտի դեղամիջոցի ազդեցության ոչ ճշգրիտ մեկնաբանությունների:Այստեղ մենք մշակել ենք սրտի հյուսվածքի կուլտուրայի մոդել (CTCM), որը էլեկտրամեխանիկորեն խթանում է սրտի հատվածները և ենթարկվում ֆիզիոլոգիական ձգման սրտի ցիկլի սիստոլիկ և դիաստոլիկ փուլերի ընթացքում:Մշակույթի 12 օրից հետո այս մոտեցումը մասամբ բարելավեց սրտի հատվածների կենսունակությունը, բայց ամբողջությամբ չպահպանեց դրանց կառուցվածքային ամբողջականությունը:Հետևաբար, փոքր մոլեկուլների զննումից հետո մենք պարզեցինք, որ 100 նՄ տրիյոդոթիրոնինի (T3) և 1 մկմ դեքսամետազոնի (Dex) ավելացումը մեր միջավայրին պահպանեց հատվածների միկրոկառուցվածքը 12 օր:T3/Dex բուժման հետ միասին CTCM համակարգը պահպանեց տրանսկրիպցիոն պրոֆիլները, կենսունակությունը, նյութափոխանակության ակտիվությունը և կառուցվածքային ամբողջականությունը նույն մակարդակի վրա, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքը 12 օրվա ընթացքում:Բացի այդ, կուլտուրայում սրտի հյուսվածքի չափից ավելի ձգումը հրահրում է հիպերտրոֆիկ սրտի ազդանշան, ինչը վկայում է CTCM-ի ունակության մասին՝ ընդօրինակելու հիպերտրոֆիկ պայմանները, որոնք առաջացել են սրտի ձգման հետևանքով:Եզրափակելով, CTCM-ը կարող է երկար ժամանակ մոդելավորել մշակույթի մեջ սրտի ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիան՝ հնարավորություն տալով դեղերի հուսալի զննում:
Կլինիկական հետազոտություններից առաջ անհրաժեշտ են հուսալի in vitro համակարգեր, որոնք կարող են ճշգրիտ վերարտադրել մարդու սրտի ֆիզիոլոգիական միջավայրը:Նման համակարգերը պետք է ընդօրինակեն փոփոխված մեխանիկական ձգումը, սրտի հաճախությունը և էլեկտրաֆիզիոլոգիական հատկությունները:Կենդանական մոդելները սովորաբար օգտագործվում են որպես սրտի ֆիզիոլոգիայի զննման հարթակ՝ մարդու սրտում դեղերի ազդեցությունն արտացոլելու սահմանափակ հուսալիությամբ1,2:Ի վերջո, Իդեալական սրտի հյուսվածքների կուլտուրայի փորձարարական մոդելը (CTCM) մոդել է, որը շատ զգայուն և հատուկ է տարբեր թերապևտիկ և դեղաբանական միջամտությունների համար՝ ճշգրիտ վերարտադրելով մարդու սրտի ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիան3:Նման համակարգի բացակայությունը սահմանափակում է սրտի անբավարարության բուժման նոր միջոցների հայտնաբերումը4,5 և հանգեցրել է դեղորայքի կարդիոտոքսիկությանը՝ որպես շուկայից դուրս գալու հիմնական պատճառ6:
Վերջին տասնամյակի ընթացքում ութ ոչ սրտանոթային դեղամիջոցներ դուրս են բերվել կլինիկական օգտագործումից, քանի որ դրանք առաջացնում են QT ինտերվալի երկարացում՝ հանգեցնելով փորոքային առիթմիաների և հանկարծակի մահվան7:Այսպիսով, սրտանոթային արդյունավետությունը և թունավորությունը գնահատելու համար հուսալի նախակլինիկական սկրինինգային ռազմավարությունների աճող անհրաժեշտություն կա:Մարդկանց կողմից առաջացած ցողունային բջիջներից ստացված պլյուրիպոտենցիալ կարդիոմիոցիտների (hiPS-CM) վերջին օգտագործումը դեղերի սկրինինգում և թունավորության թեստում տալիս է այս խնդրի մասնակի լուծումը:Այնուամենայնիվ, hiPS-CM-ների ոչ հասուն բնույթը և սրտի հյուսվածքի բազմաբջիջ բարդության բացակայությունը այս մեթոդի հիմնական սահմանափակումներն են:Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ այս սահմանափակումը կարող է մասամբ հաղթահարել՝ օգտագործելով վաղ hiPS-CM՝ ինքնաբուխ կծկումների սկսվելուց անմիջապես հետո սրտի հյուսվածքի հիդրոգելներ ձևավորելու և ժամանակի ընթացքում աստիճանաբար մեծացնելով էլեկտրական խթանումը:Այնուամենայնիվ, այս hiPS-CM միկրոհյուսվածքները չունեն մեծահասակների սրտամկանի հասուն էլեկտրաֆիզիոլոգիական և կծկվող հատկությունները:Բացի այդ, մարդու սրտի հյուսվածքն ունի ավելի բարդ կառուցվածք, որը բաղկացած է տարբեր տեսակի բջիջների տարասեռ խառնուրդից, ներառյալ էնդոթելային բջիջները, նեյրոնները և ստրոմալ ֆիբրոբլաստները, որոնք փոխկապակցված են արտաբջջային մատրիցային սպիտակուցների հատուկ խմբերով:Մեծահասակ կաթնասունների սրտում ոչ կարդիոմիոցիտային պոպուլյացիաների այս տարասեռությունը11,12,13 մեծ խոչընդոտ է սրտի հյուսվածքի մոդելավորման համար՝ օգտագործելով առանձին բջիջների տեսակները:Այս հիմնական սահմանափակումները ընդգծում են ֆիզիոլոգիական և պաթոլոգիական պայմաններում սրտամկանի անձեռնմխելի հյուսվածքի մշակման մեթոդների մշակման կարևորությունը:
Մարդու սրտի մշակված բարակ (300 մկմ) հատվածներն ապացուցվել են, որ անձեռնմխելի մարդու սրտամկանի խոստումնալից մոդել են:Այս մեթոդը ապահովում է մարդու սրտի հյուսվածքի նման ամբողջական 3D բազմաբջջային համակարգ:Այնուամենայնիվ, մինչև 2019 թվականը մշակված սրտի հատվածների օգտագործումը սահմանափակվում էր մշակույթի կարճատև (24 ժամ) գոյատևմամբ:Դա պայմանավորված է մի շարք գործոններով, ներառյալ ֆիզիկա-մեխանիկական ձգման բացակայությունը, օդ-հեղուկ միջերեսը և պարզ միջավայրերի օգտագործումը, որոնք չեն բավարարում սրտի հյուսվածքի կարիքները:2019 թվականին մի քանի հետազոտական ​​խմբեր ցույց տվեցին, որ մեխանիկական գործոնների ներդրումը սրտի հյուսվածքների կուլտուրայի համակարգերում կարող է երկարացնել կուլտուրայի կյանքը, բարելավել սրտի արտահայտվածությունը և ընդօրինակել սրտի պաթոլոգիան:Երկու նրբագեղ հետազոտություններ 17 և 18 ցույց են տալիս, որ միակողմանի մեխանիկական բեռնումը դրականորեն ազդում է սրտի ֆենոտիպի վրա մշակույթի ընթացքում:Այնուամենայնիվ, այս ուսումնասիրությունները չեն օգտագործել սրտի ցիկլի դինամիկ եռաչափ ֆիզիկա-մեխանիկական բեռնումը, քանի որ սրտի հատվածները բեռնված են եղել կա՛մ իզոմետրիկ առաձգական ուժերով 17, կա՛մ գծային ավքսոտոնիկ բեռնվածությամբ 18 :Հյուսվածքների ձգման այս մեթոդները հանգեցրել են սրտի բազմաթիվ գեների ճնշման կամ գեների գերարտահայտմանը, որոնք կապված են աննորմալ ձգվող պատասխանների հետ:Հատկանշական է, որ Պիտուլիսը և այլք.19-ը մշակել է դինամիկ սրտի հատվածի կուլտուրայի լոգանք՝ սրտի ցիկլի վերականգնման համար՝ օգտագործելով ուժային փոխարկիչի հետադարձ կապը և լարվածության շարժիչները:Չնայած այս համակարգը թույլ է տալիս ավելի ճշգրիտ in vitro սրտի ցիկլի մոդելավորում, մեթոդի բարդությունն ու ցածր թողունակությունը սահմանափակում են այս համակարգի կիրառումը:Մեր լաբորատորիան վերջերս մշակել է պարզեցված կուլտուրայի համակարգ՝ օգտագործելով էլեկտրական խթանումը և օպտիմիզացված միջավայրը, որպեսզի պահպանի խոզի և մարդու սրտի հյուսվածքի հատվածների կենսունակությունը մինչև 6 օր20,21:
Ընթացիկ ձեռագրում մենք նկարագրում ենք սրտի հյուսվածքների կուլտուրայի մոդելը (CTCM)՝ օգտագործելով խոզի սրտի հատվածները, որոնք ներառում են հումորալ նշաններ՝ սրտի եռաչափ ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիական ընդլայնումը սրտի ցիկլի ընթացքում ամփոփելու համար:Այս CTCM-ը կարող է բարձրացնել նախակլինիկական դեղերի կանխատեսման ճշգրտությունը մինչև այն մակարդակը, որը նախկինում երբեք չի եղել՝ տրամադրելով ծախսարդյունավետ, միջին թողունակության սրտային համակարգ, որը նմանակում է կաթնասունների սրտի ֆիզիոլոգիան/պաթոֆիզիոլոգիան դեղորայքի նախաքլինիկական փորձարկման համար:
Հեմոդինամիկ մեխանիկական ազդանշանները կարևոր դեր են խաղում սրտամոցիտի ֆունկցիայի պահպանման գործում in vitro 22,23,24:Ընթացիկ ձեռագրում մենք մշակել ենք CTCM (Նկար 1ա), որը կարող է ընդօրինակել մեծահասակների սրտի միջավայրը՝ առաջացնելով ինչպես էլեկտրական, այնպես էլ մեխանիկական խթանում ֆիզիոլոգիական հաճախականություններում (1,2 Հց, 72 զարկ/րոպե):Դիաստոլի ժամանակ հյուսվածքների ավելորդ ձգումից խուսափելու համար օգտագործվել է 3D տպիչ սարք՝ հյուսվածքների չափը 25%-ով մեծացնելու համար (նկ. 1բ):C-PACE համակարգի կողմից հրահրված էլեկտրական ռիթմը սկսվում էր սիստոլից 100 մվ առաջ՝ օգտագործելով տվյալների հավաքագրման համակարգ՝ սրտի ցիկլը ամբողջությամբ վերարտադրելու համար:Հյուսվածքների կուլտուրայի համակարգը օգտագործում է ծրագրավորվող օդաճնշական մղիչ (LB Engineering, Գերմանիա)՝ ճկուն սիլիկոնե թաղանթը ցիկլային ընդլայնելու համար՝ առաջացնելով սրտի հատվածների ընդլայնում վերին խցիկում:Համակարգը ճնշման փոխարկիչի միջոցով միացված էր արտաքին օդային գծին, ինչը հնարավորություն տվեց ճշգրտորեն կարգավորել ճնշումը (± 1 մմ Hg) և ժամանակը (± 1 ms) (նկ. 1c):
a Կցեք հյուսվածքի հատվածը սարքի կուլտուրայի խցիկի ներսում 7 մմ աջակցող օղակին, որը ցուցադրված է կապույտ գույնով:Մշակույթի խցիկը օդային խցիկից բաժանված է բարակ ճկուն սիլիկոնե թաղանթով:Յուրաքանչյուր խցիկի միջև դրեք միջադիր՝ արտահոսքից խուսափելու համար:Սարքի կափարիչը պարունակում է գրաֆիտային էլեկտրոդներ, որոնք ապահովում են էլեկտրական խթանում։բ Հյուսվածքային մեծ սարքի, ուղեցույցի օղակի և աջակցող օղակի սխեմատիկ պատկերը:Հյուսվածքային հատվածները (շագանակագույն) տեղադրվում են մեծ չափսերով սարքի վրա՝ սարքի արտաքին եզրի ակոսում տեղադրված ուղեցույցի օղակով։Օգտագործելով ուղեցույցը, զգուշորեն տեղադրեք հենակետային օղակը, որը պատված է հյուսվածքային ակրիլային սոսինձով, սրտի հյուսվածքի հատվածի վրա:գ Գրաֆիկ, որը ցույց է տալիս էլեկտրական գրգռման ժամանակը որպես օդային խցիկի ճնշման ֆունկցիա, որը վերահսկվում է ծրագրավորվող օդաճնշական մղիչով (PPD):Էլեկտրական գրգռումը ճնշման սենսորների միջոցով համաժամեցնելու համար օգտագործվել է տվյալների հավաքման սարք:Երբ կուլտուրայի խցիկում ճնշումը հասնում է սահմանված շեմին, իմպուլսային ազդանշան է ուղարկվում C-PACE-EM՝ էլեկտրական խթանումը հրահրելու համար:դ Ինկուբատորի դարակում տեղադրված չորս CTCM-ների պատկեր:Չորս սարքեր միացված են մեկ PPD-ին օդաճնշական շղթայի միջոցով, և ճնշման սենսորները տեղադրվում են հեմոստատիկ փականի մեջ՝ օդաճնշական շղթայում ճնշումը վերահսկելու համար:Յուրաքանչյուր սարքը պարունակում է վեց հյուսվածքային բաժին:
Օգտագործելով մեկ օդաճնշական շարժիչ, մենք կարողացանք կառավարել 4 CTCM սարքեր, որոնցից յուրաքանչյուրը կարող էր պահել հյուսվածքների 6 հատված (նկ. 1դ):CTCM-ում օդի ճնշումը օդային խցիկում փոխակերպվում է սինխրոն ճնշման հեղուկի խցիկում և առաջացնում է սրտի շերտի ֆիզիոլոգիական ընդլայնում (Նկար 2ա և Լրացուցիչ ֆիլմ 1):Հյուսվածքների ձգման գնահատում 80 մմ Hg-ով:Արվեստ.ցույց է տվել հյուսվածքների հատվածների ձգում 25%-ով (նկ. 2բ):Ցույց է տրված, որ այս տոկոսային ձգումը համապատասխանում է 2,2–2,3 մկմ սարկոմերի ֆիզիոլոգիական երկարությանը սրտի հատվածի նորմալ կծկման համար17,19,25:Հյուսվածքների շարժումը գնահատվել է հատուկ տեսախցիկի կարգավորումների միջոցով (Լրացուցիչ նկար 1):Հյուսվածքների շարժման ամպլիտուդը և արագությունը (նկ. 2c, d) համապատասխանում էին ձգմանը սրտի ցիկլի և ժամանակի սիստոլի և դիաստոլի ժամանակ (նկ. 2b):Սրտի հյուսվածքի ձգումը և արագությունը կծկման և թուլացման ժամանակ մնացել են անփոփոխ 12 օր կուլտուրայում (նկ. 2f):Մշակույթի ընթացքում կծկողականության վրա էլեկտրական խթանման ազդեցությունը գնահատելու համար մենք մշակեցինք ակտիվ դեֆորմացիան որոշելու մեթոդ՝ օգտագործելով ստվերային ալգորիթմ (Լրացուցիչ Նկ. 2ա, բ) և կարողացանք տարբերակել դեֆորմացիաները էլեկտրական խթանմամբ և առանց էլեկտրական գրգռման:Սրտի նույն հատվածը (նկ. 2զ):Կտրվածքի շարժական հատվածում (R6-9) էլեկտրական գրգռման ժամանակ լարումը 20%-ով ավելի բարձր է եղել, քան էլեկտրական գրգռման բացակայության դեպքում, ինչը ցույց է տալիս էլեկտրական գրգռման ներդրումը կծկման ֆունկցիայի մեջ։
Օդային խցիկի ճնշման ներկայացուցչական հետքերը, հեղուկի խցիկի ճնշման և հյուսվածքների շարժման չափումները հաստատում են, որ պալատի ճնշումը փոխում է հեղուկի խցիկի ճնշումը՝ առաջացնելով հյուսվածքի շերտի համապատասխան շարժում:բ Հյուսվածքային հատվածների տոկոսային ձգման (կապույտ) հետքեր, որոնք համապատասխանում են տոկոսային ձգմանը (նարնջագույն):գ Սրտի հատվածի չափված շարժումը համահունչ է շարժման չափված արագությանը:դ) Ցիկլային շարժման (կապույտ գիծ) և արագության (նարնջագույն կետավոր գիծ) ներկայացուցչական հետագծերը սրտի մի հատվածում:ե Ցիկլի ժամանակի քանակականացում (n = 19 շերտ մեկ խմբին, տարբեր խոզերից), կծկման ժամանակի (n = 19 շերտ մեկ խմբին), թուլացման ժամանակի (n = 19 շերտ մեկ խմբի, տարբեր խոզերի), հյուսվածքների շարժման (n = 25):կտորներ)/խումբ տարբեր խոզերից), գագաթնակետային սիստոլիկ արագություն (n = 24(D0), 25(D12) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից) և հանգստի առավելագույն արագություն (n=24(D0), 25(D12) շերտ/խումբ տարբեր խոզերից):Երկկողմանի Student-ի t-թեստը որևէ պարամետրում էական տարբերություն ցույց չի տվել:զ (կարմիր) և առանց (կապույտ) էլեկտրական գրգռվածությամբ հյուսվածքների հատվածների ներկայացուցչական լարվածության վերլուծության հետքեր, նույն հատվածից հյուսվածքային հատվածների տասը տարածաշրջանային տարածքներ:Ներքևի վահանակները ցույց են տալիս լարման տոկոսային տարբերության քանակականությունը հյուսվածքների հատվածներում էլեկտրական խթանմամբ և առանց էլեկտրական խթանման տասը հատվածներում տարբեր հատվածներից: (n = 8 շերտ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկու պոչ ուսանողական t-թեստ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05): (n = 8 շերտ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկու պոչ ուսանողական t-թեստ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05): (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05): (n = 8 բաժին/խումբ տարբեր խոզերից, երկկողմանի ուսանողական t-թեստ; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05): （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05): (n = 8 բաժին/խումբ, տարբեր խոզերից, երկկողմանի ուսանողական t-թեստ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05):Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
Մեր նախորդ ստատիկ բիոմիմետիկ սրտի շերտի կուլտուրայի համակարգում [20, 21], մենք 6 օր պահպանեցինք սրտի կտորների կենսունակությունը, գործառույթը և կառուցվածքային ամբողջականությունը՝ կիրառելով էլեկտրական խթանում և օպտիմալացնելով միջավայրի կազմը:Սակայն 10 օր անց այս ցուցանիշները կտրուկ անկում ապրեցին։Մենք կանդրադառնանք մեր նախորդ ստատիկ բիոմիմետիկ կուլտուրայի համակարգում 20, 21 վերահսկման պայմաններում մշակված հատվածներին (Ctrl) և կօգտագործենք մեր նախկինում օպտիմիզացված միջավայրը որպես MC պայմաններ և մշակույթ՝ միաժամանակ մեխանիկական և էլեկտրական խթանման (CTCM) պայմաններում:կոչված .Նախ, մենք որոշեցինք, որ առանց էլեկտրական խթանման մեխանիկական խթանումը անբավարար էր հյուսվածքների կենսունակությունը 6 օր պահպանելու համար (Լրացուցիչ Նկ. 3ա,բ):Հետաքրքիր է, որ STCM-ի միջոցով ֆիզիո-մեխանիկական և էլեկտրական խթանման ներդրմամբ սրտի 12-օրյա հատվածների կենսունակությունը մնաց նույնը, ինչ թարմ սրտի հատվածներում MS պայմաններում, բայց ոչ Ctrl պայմաններում, ինչպես ցույց է տրված MTT վերլուծությամբ (նկ. 1):3ա):Սա ենթադրում է, որ սրտի ցիկլի մեխանիկական խթանումը և մոդելավորումը կարող են հյուսվածքների հատվածները կենսունակ պահել երկու անգամ ավելի երկար, քան մեր նախորդ ստատիկ կուլտուրայի համակարգում նշված էր:Այնուամենայնիվ, հյուսվածքների հատվածների կառուցվածքային ամբողջականության գնահատումը սրտի տրոպոնին T-ի և կոնեքսին 43-ի իմունային պիտակավորման միջոցով ցույց տվեց, որ կոնեքսին 43-ի էքսպրեսիան զգալիորեն ավելի բարձր է եղել MC հյուսվածքներում 12-րդ օրը, քան նույն օրվա հսկիչները:Այնուամենայնիվ, միատեսակ կոնեքսին 43 արտահայտությունը և Z-սկավառակի ձևավորումը լիովին չեն պահպանվել (նկ. 3b):Մենք օգտագործում ենք արհեստական ​​ինտելեկտի (AI) շրջանակ՝ հյուսվածքների կառուցվածքի ամբողջականությունը քանակականացնելու համար26, պատկերի վրա հիմնված խորը ուսուցման խողովակաշար, որը հիմնված է տրոպոնին-T-ի և կոնեքսինի ներկման վրա43՝ ավտոմատ կերպով չափելու սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը և ֆլուորեսցենտությունը տեղայնացման ուժի տեսանկյունից:Այս մեթոդը օգտագործում է կոնվոլյուցիոն նեյրոնային ցանց (CNN) և խորը ուսուցման շրջանակ՝ վստահելիորեն չափելու սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականությունը ավտոմատացված և անկողմնակալ ձևով, ինչպես նկարագրված է հղումում:26. ԲԿ հյուսվածքը 0 օրվա համեմատ բարելավված կառուցվածքային նմանություն է ցույց տվել՝ համեմատած ստատիկ հսկողության հատվածների հետ:Ի հավելումն, Masson-ի տրիքրոմի ներկումը բացահայտեց ֆիբրոզի զգալիորեն ավելի ցածր տոկոս MS պայմաններում՝ համեմատած վերահսկման պայմանների հետ մշակույթի 12-րդ օրվա ընթացքում (նկ. 3c):Թեև CTCM-ն 12-րդ օրը բարձրացրեց սրտի հյուսվածքի հատվածների կենսունակությունը մինչև թարմ սրտի հյուսվածքի մակարդակի նման մակարդակ, այն էականորեն չբարելավեց սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը:
գծապատկերը ցույց է տալիս թարմ սրտի կտորների (D0) կամ սրտի կտորների կուլտուրայի MTT կենսունակության քանակականացումը 12 օրվա ընթացքում կամ ստատիկ կուլտուրայում (D12 Ctrl) կամ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) տարբեր թեստերից: .0001 D0-ի համեմատ և **p <0.01 D12 Ctrl-ի համեմատ): գծապատկերը ցույց է տալիս թարմ սրտի կտորների (D0) կամ սրտի կտորների կուլտուրայի MTT կենսունակության քանակականացումը 12 օրվա ընթացքում ստատիկ կուլտուրայում (D12 Ctrl) կամ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, մեկ ճանապարհով, արվում է տարբեր թեստերից: 0,0001 D0-ի համեմատ և **p <0,01 D12 Ctrl-ի համեմատ):հիստոգրամը ցույց է տալիս MTT թարմ սրտի հատվածների (D0) կամ սրտի հատվածների կենսունակության քանակականացումը 12 օրվա ընթացքում ստատիկ կուլտուրայում (D12 վերահսկում) կամ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 վերահսկում).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl): ####p < 0,0001՝ համեմատած D0-ի և **p < 0,01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切燺养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向盛行单向向人 测0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)։ a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏 (D0) 中新鲜心脏 (D0)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相*)Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս MTT-ի կենսունակության քանակականությունը թարմ սրտի հատվածներում (D0) կամ սրտի հատվածներում, որոնք մշակվել են 12 օր ստատիկ կուլտուրաներում (D12 հսկողություն) կամ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 հսկողություն)), 12 (D12 MC) բաժիններ/միակողմանի ANOVA փորձարկումներ,####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl): ####p < 0,0001 D0-ի համեմատ, **p < 0,01 D12 Ctrl-ի համեմատ):b Troponin-T (կանաչ), connexin 43 (կարմիր) և DAPI (կապույտ) սրտի թարմ մեկուսացված հատվածներում (D0) կամ սրտի հատվածներում, որոնք մշակվել են ստատիկ պայմաններում (Ctrl) կամ CTCM պայմաններում (MC) 12 օրվա ընթացքում) ներկայացուցչական իմունոֆլյորեսցենտ պատկերների (դատարկ սանդղակ = 100 մկմ): Կատարվում է սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​ինտելեկտի քանակականացում (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) շերտ/խումբ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվում է. Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​ինտելեկտի քանակական գնահատում (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) շերտ/խումբ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերից, կատարվում է միակողմանի ANOVA թեստ. Количественная оценка структурной целости сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп сразных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный. D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակականացում արհեստական ​​ինտելեկտի միջոցով (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) բաժիններ/խմբեր տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվեց.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) շերտ/խմբի յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերի, միակողմանի ANOVA թեստ.比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）։人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) շերտ/խումբ յուրաքանչյուր տարբեր խոզեր, միակողմանի ANOVA թեստ.##000p; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）։ Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней vs. v. внения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Արհեստական ​​ինտելեկտ՝ սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակականացման համար (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) բաժիններ/խումբ յուրաքանչյուր տարբեր խոզերի, միակողմանի ANOVA թեստ; ####p<0.0001 vs. գ Ներկայացուցիչ պատկերներ (ձախից) և քանակական (աջ) սրտի կտորների համար, որոնք ներկված են Մասսոնի տրիքրոմի ներկով (Scale bare = 500 մկմ) (n = 10 շերտ/խմբում յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվում է. ####p <0.0001 համեմատած D. գ Ներկայացուցիչ պատկերներ (ձախից) և քանակական (աջ) սրտի կտորների համար, որոնք ներկված են Մասսոնի տրիքրոմի ներկով (Scale bare = 500 մկմ) (n = 10 շերտ/խումբ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվում է. #### p <0.0001 համեմատած D20001): c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масшнаб без покрытия = 500 mkm) (n = 10 срезот, разных групный тест). ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl): գ Մասսոնի տրիքրոմ ներկով ներկված սրտի հատվածների (ձախից) ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և քանակական (աջ) չափումներ (չպատված մասշտաբներ = 500 մկմ) (n = 10 հատված/խումբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվեց; #### p < 0 .0001՝ համեմատած D0.20tr-ի հետ): c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸M）（表性图像（左）和量化（右）（裸 50µ =切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比︎D0 相比Ｘ0*** C. . C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣尣度 表性度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 绋比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）։ c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая од шкала = 500 մկմ) (n = 10 срезов/групыфа, кажо протести друго построй/групыпа, кажи протести друго построй погрупыпа, кажо протестим побрымьпа. кторного дисперсионного վերլուծություն ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). գ Մասսոնի տրիքրոմ ներկով ներկված սրտի հատվածների (ձախ) ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և քանակական (աջ) (դատարկ = 500 մկմ) (n = 10 հատված/խումբ, յուրաքանչյուրը տարբեր խոզից, փորձարկվել է միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծությամբ ;### # p <0.0001 0.0001 <1 C-ի համեմատ D0, համեմատած):Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
Մենք ենթադրեցինք, որ փոքր մոլեկուլներ ավելացնելով կուլտուրայի միջավայրին, կարդիոմիոցիտների ամբողջականությունը կարող է բարելավվել, և ֆիբրոզի զարգացումը կրճատվել CTCM մշակույթի ընթացքում:Հետևաբար, մենք ստուգեցինք փոքր մոլեկուլները՝ օգտագործելով մեր ստատիկ հսկողության մշակույթները20,21՝ շփոթեցնող գործոնների փոքր քանակի պատճառով:Այս էկրանի համար ընտրվել են դեքսամետազոն (Dex), տրիյոդոթիրոնին (T3) և SB431542 (SB):Այս փոքր մոլեկուլները նախկինում օգտագործվել են hiPSC-CM մշակույթներում՝ խթանելու կարդիոմիոցիտների հասունացումը՝ ավելացնելով սարկոմերների երկարությունը, T-խողովակները և հաղորդման արագությունը:Բացի այդ, ինչպես Dex-ը (գլյուկոկորտիկոիդ), այնպես էլ SB-ն, ինչպես հայտնի է, ճնշում են բորբոքումը29,30:Հետևաբար, մենք փորձարկեցինք, թե արդյոք այս փոքր մոլեկուլների մեկ կամ համակցությունը կբարելավի սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը:Նախնական զննման համար յուրաքանչյուր միացության դոզան ընտրվել է բջիջների կուլտուրայի մոդելներում սովորաբար օգտագործվող կոնցենտրացիաների հիման վրա (1 μM Dex27, 100 nM T327 և 2,5 μM SB31):Մշակույթից 12 օր հետո, T3-ի և Dex-ի համադրությունը հանգեցրեց սրտամկանի կառուցվածքի օպտիմալ ամբողջականության և մանրաթելային նվազագույն վերափոխման (Լրացուցիչ նկարներ 4 և 5):Բացի այդ, T3-ի և Dex-ի այս կոնցենտրացիաների կրկնակի կամ կրկնակի օգտագործումը վնասակար ազդեցություն է թողել նորմալ կոնցենտրացիաների համեմատ (Լրացուցիչ Նկար 6ա,բ):
Նախնական զննումից հետո մենք կատարեցինք 4 կուլտուրայի պայմանների գլխից գլուխ համեմատություն (Նկար 4ա).20.21 TD. T3 և Ctrl s Ավելացված Dex չորեքշաբթի;MC. սրտի հատվածներ մշակված CTCM-ում՝ օգտագործելով մեր նախկինում օպտիմիզացված միջավայրը;և MT. CTCM՝ T3-ով և Dex-ով ավելացված միջավայրին:Մշակումից 12 օր հետո MS և MT հյուսվածքների կենսունակությունը մնաց նույնը, ինչ թարմ հյուսվածքներում, որոնք գնահատվել են MTT վերլուծությամբ (նկ. 4b):Հետաքրքիր է, որ T3-ի և Dex-ի ավելացումը transwell մշակույթներին (TD) չի հանգեցրել կենսունակության զգալի բարելավման՝ համեմատած Ctrl պայմանների հետ, ինչը ցույց է տալիս մեխանիկական խթանման կարևոր դերը սրտի հատվածների կենսունակության պահպանման գործում:
Փորձարարական նախագծման դիագրամ, որը պատկերում է մշակույթի չորս պայմանները, որոնք օգտագործվում են մեխանիկական խթանման և T3/Dex հավելումների ազդեցությունը միջավայրի վրա 12 օրվա ընթացքում գնահատելու համար: b Գծավոր գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակականությունը կուլտուրից 12 օր հետո բոլոր 4 կուլտուրայի պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 MC-ը տարբերվում է տարբեր տեսակի փորձարկումներից: 0,0001, ###p < 0,001՝ համեմատած D0-ի և **p < 0,01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): b Գծավոր գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակականությունը կուլտուրից 12 օր հետո բոլոր 4 կուլտուրայի պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 MC-ը տարբերվում է տարբեր տեսակի փորձարկումներից: 0,0001, ###p < 0,001 D0-ի համեմատ և **p <0,01՝ համեմատած D12 ctrl-ի հետ): b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (D101, CRD) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односоронний тест ANOVA; b Գծային գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակականությունը կուլտուրից հետո 12 օրվա ընթացքում բոլոր 4 կուլտուրայի պայմաններում (հսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 միակողմանի MC) տարբեր բաժիններից:#0. 001, ###p <0.001 ընդդեմ D0-ի և **p <0.01 ըստ D12 Ctrl-ի): b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 、21 (D5) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，#0##p < 0.0001，#0##p 0.01 դ12 է.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2, D12 TD2 и D12) группа, односоронний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս կուլտուրայի բոլոր 4 պայմանները (հսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), տարբեր խոզերից 12 (D12 MC) բաժիններ/խմբ, միակողմանի ANOVA թեստ: #0#0#0<0. 0, **p<0.01 ընդդեմ հսկողության D12-ի): գ Գծաձև գրաֆիկը ցույց է տալիս գլյուկոզայի հոսքի քանակականությունը կուլտուրից 12 օր հետո բոլոր 4 կուլտուրայի պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի շերտերի (D0) (n = 6 շերտ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է միակողմանի ANOVA թեստ. գ Գծաձև գրաֆիկը ցույց է տալիս գլյուկոզայի հոսքի քանակականությունը կուլտուրից 12 օր հետո բոլոր 4 կուլտուրայի պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի շերտերի (D0) (n = 6 շերտ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է միակողմանի ANOVA թեստ. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (վերահսկել, TD, MC եւ MT) по сравнению со свежими срезами (6 резами) ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl): գ Հիստոգրամը ցույց է տալիս գլյուկոզայի հոսքի քանակականացումը 12 օր հետո կուլտուրայի բոլոր 4 պայմաններում (հսկողություն, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 6 բաժին/խումբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվեց; ###p <0.001՝ համեմատած D0.20tr-ի հետ <D0.20tr): c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掯2，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，䛌10p C ես։ C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组试；###p < 0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 պայմաններй культивирования (контроль, TD, MC եւ MT) по сравнерезми (6, сравнерезми со свежи) от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (կառավարում): գ Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս գլյուկոզայի հոսքի քանակականացումը մշակումից հետո 12 օրվա ընթացքում բոլոր 4 կուլտուրական պայմանների համար (հսկողություն, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 6 բաժին/խումբ, տարբեր խոզերից, միակողմանի: Կատարվել են ANOVA թեստեր, ###p <0,001-ի համեմատությամբ):դ Թարմ (կապույտ), 12-րդ օրվա MC (կանաչ) և 12-րդ օրվա MT (կարմիր) հյուսվածքների լարման վերլուծության սյուժեները տասը ռեգիոնալ հյուսվածքային հատվածի կետերում (n = 4 շերտ/խումբ, միակողմանի ANOVA թեստ. խմբերի միջև էական տարբերություն չկար):ե Հրաբխի գծապատկեր, որը ցույց է տալիս տարբեր արտահայտված գեներ սրտի թարմ հատվածներում (D0) համեմատած սրտի հատվածների հետ, որոնք մշակվել են ստատիկ պայմաններում (Ctrl) կամ MT պայմաններում (MT) 10-12 օրվա ընթացքում:f Սարկոմերային գեների ջերմային քարտեզ՝ յուրաքանչյուր կուլտուրայի պայմաններում մշակված սրտի հատվածների համար:Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
Նյութափոխանակության կախվածությունը ճարպաթթուների օքսիդացումից դեպի գլիկոլիզ անցումից հանդիսանում է կարդիոմիոցիտների դիֆերենցիայի բնորոշ հատկանիշ:Անհաս կարդիոմիոցիտները հիմնականում օգտագործում են գլյուկոզա ATP-ի արտադրության համար և ունեն հիպոպլաստիկ միտոքոնդրիաներ՝ մի քանի cristae-ներով5,32:Գլյուկոզայի օգտագործման անալիզները ցույց են տվել, որ MC և MT պայմաններում գլյուկոզայի օգտագործումը նման է 0-րդ օրվա հյուսվածքներում (Նկար 4c):Այնուամենայնիվ, Ctrl նմուշները ցույց են տվել գլյուկոզայի օգտագործման զգալի աճ՝ համեմատած թարմ հյուսվածքի հետ:Սա ցույց է տալիս, որ CTCM-ի և T3/Dex-ի համադրությունը մեծացնում է հյուսվածքների կենսունակությունը և պահպանում է 12-օրյա կուլտիվացված սրտի հատվածների նյութափոխանակության ֆենոտիպը:Բացի այդ, լարվածության վերլուծությունը ցույց է տվել, որ լարման մակարդակը մնացել է նույնը, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքում 12 օր MT և MS պայմաններում (նկ. 4d):
CTCM-ի և T3/Dex-ի ընդհանուր ազդեցությունը սրտի կտոր հյուսվածքի գլոբալ տրանսկրիպցիոն լանդշաֆտի վրա վերլուծելու համար մենք կատարեցինք RNAseq սրտի կտորների վրա բոլոր չորս տարբեր մշակութային պայմաններից (Լրացուցիչ տվյալներ 1):Հետաքրքիր է, որ MT բաժինները ցույց են տվել տրանսկրիպցիոն բարձր նմանություն սրտի թարմ հյուսվածքի հետ, 13642 գեներից միայն 16-ն են տարբեր կերպ արտահայտված:Այնուամենայնիվ, ինչպես մենք ցույց տվեցինք ավելի վաղ, Ctrl-ի հատվածները ցույց տվեցին 1229 դիֆերենցիալ արտահայտված գեներ 10-12 օր մշակույթից հետո (նկ. 4e):Այս տվյալները հաստատվել են սրտի և ֆիբրոբլաստների գեների qRT-PCR-ով (Լրացուցիչ Նկ. 7ա-գ):Հետաքրքիր է, որ Ctrl բաժինները ցույց են տվել սրտի և բջջային ցիկլի գեների նվազեցում և բորբոքային գենային ծրագրերի ակտիվացում:Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ դետարբերակումը, որը սովորաբար տեղի է ունենում երկարատև կուլտուրայից հետո, ամբողջովին թուլանում է ՄՏ պայմաններում (Լրացուցիչ նկար 8ա,բ):Սարկոմերների գեների մանրակրկիտ ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ միայն MT պայմաններում են պահպանվում սարկոմերները (նկ. 4f) և իոնային ալիքը (Լրացուցիչ նկար 9) կոդավորող գեները՝ պաշտպանելով դրանք Ctrl, TD և MC պայմաններում ճնշումից:Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ մեխանիկական և հումորալ գրգռման (T3/Dex) համակցությամբ սրտի հատվածի տրանսկրիպտոմը կարող է մնալ թարմ սրտի կտորների նման՝ կուլտուրայից հետո 12 օր հետո:
Այս տրանսկրիպցիոն բացահայտումները հաստատվում են այն փաստով, որ սրտամկանի հատվածներում կարդիոմիոցիտների կառուցվածքային ամբողջականությունը լավագույնս պահպանվում է MT պայմաններում 12 օր շարունակ, ինչպես ցույց է տրված անձեռնմխելի և տեղայնացված կոնեքսին 43-ով (նկ. 5ա):Ի լրումն, ֆիբրոզը սրտի հատվածներում MT պայմաններում զգալիորեն կրճատվել է Ctrl-ի համեմատ և նման է թարմ սրտի հատվածներին (նկ. 5b):Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ մեխանիկական խթանման և T3/Dex բուժման համադրությունը արդյունավետորեն պահպանում է սրտի կառուցվածքը մշակույթի մեջ սրտի հատվածներում:
ա Տրոպոնին-T-ի (կանաչ), կոնեքսին 43-ի (կարմիր) և DAPI-ի (կապույտ) ներկայացուցչական իմունոֆլյորեսցենտային պատկերները թարմ մեկուսացված սրտի հատվածներում (D0) կամ 12 օր մշակված բոլոր չորս սրտի հատվածի կուլտուրայի պայմաններում (սանդղակի բար = 100 մկմ):) Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​ինտելեկտի քանակականացում (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) շերտ/խմբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստ է կատարվում. լ). Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​ինտելեկտի քանակական գնահատում (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) շերտ/խմբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվում է. լ). Количественная оценка структурной целости ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу од разных свифаной, срезов/группу од разных свифаной, 01 по сравнению с D0 и *p < 0,05 կամ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական գնահատում արհեստական ​​ինտելեկտի միջոցով (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) բաժիններ/խումբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստը կատարվեց; #### p <0.0001՝ համեմատած D0 և *p .对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 丂1DC < 0,000对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 和 d12 ctrl) （5 (d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 缛 0 l相比）։Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական հաշվարկ՝ օգտագործելով արհեստական ​​ինտելեկտը տարբեր խոզերի մեջ (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) բաժիններ/խումբ) միակողմանի ANOVA թեստով;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): #### p < 0,0001 համեմատ D0-ի և *p <0,05 կամ ****p <0,0001 համեմատ D12 Ctrl-ի հետ): բ Մասսոնի տրիքրոմի ներկով ներկված սրտի կտորների համար ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական գնահատում (Մասշտաբի սանդղակ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), 9 (D12 MT) շերտ/խումբը տարբեր խոզերի համեմատությամբ A#0#0, կատարվում է մեկ ուղի #0#0-ի համեմատ: և ***p <0.001, կամ ****p <0.0001` համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): բ Մասսոնի տրիքրոմի ներկով ներկված սրտի կտորների համար ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական գնահատում (Մասշտաբի սանդղակ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), 9 (D12 MT) շերտ/խումբը տարբեր խոզերի համեմատությամբ A#0#0, կատարվում է մեկ ուղի #0#0-ի համեմատ: և ***p <0.001, կամ ****p <0.0001` համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 D12 TD) и D12 Ctrl (D12 TD) ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): b Մասսոնի տրիքրոմի ներկով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակականացում (մասշտաբային բար = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), 9 (D12 MT) բաժիններ/խմբ տարբեր խոզերից, կատարված միակողմանի ANOVA:##00. 001 կամ ****p < 0,0001 ընդդեմ D12 Ctrl): b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = 500 μm）10（D和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####P 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）։ b 用 մասսոն 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分方差分析01. ***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）։ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): բ Մասսոնի տրիքրոմով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակականացում (սանդղակի բար = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), 9 (D12 MT) բաժիններ տարբեր խոզերից/խմբերից, մեկ ANOVA մեթոդով, համեմատած <0#0#0: ****p < 0,0001 D12 Ctrl-ի համեմատ):Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
Ի վերջո, CTCM-ի կարողությունը նմանակելու սրտի հիպերտրոֆիան գնահատվել է սրտի հյուսվածքի ձգման մեծացմամբ:CTCM-ում օդային խցիկի գագաթնակետային ճնշումը 80 մմ Hg-ից աճել է մինչև 80 մմ Hg:Արվեստ.(նորմալ ձգում) մինչև 140 մմ Hg Արտ.(նկ. 6ա):Սա համապատասխանում է ձգման 32% աճին (նկ. 6b), որը նախկինում ցուցադրված էր որպես համապատասխան տոկոսային ձգում, որը պահանջվում է սրտի հատվածների համար սարկոմերի երկարության հասնելու համար, որը նման է հիպերտրոֆիայի դեպքում:Սրտի հյուսվածքի ձգումն ու արագությունը կծկման և թուլացման ժամանակ մնացին հաստատուն մշակույթի վեց օրվա ընթացքում (նկ. 6c):Սրտի հյուսվածքը MT պայմաններից ենթարկվել է նորմալ ձգման (MT (Նորմալ)) կամ գերլարվածության (MT (OS)) վեց օրվա ընթացքում:Արդեն չորս օր մշակույթից հետո, NT-ProBNP հիպերտրոֆիկ կենսամարկերը զգալիորեն բարձրացել է միջավայրում MT (OS) պայմաններում՝ համեմատած MT (նորմալ) պայմանների հետ (նկ. 7ա):Բացի այդ, վեց օր մշակելուց հետո MT (OS)-ում բջիջների չափը (Նկար 7b) զգալիորեն ավելացել է MT սրտի հատվածների համեմատ (նորմալ):Բացի այդ, NFATC4 միջուկային փոխադրումը զգալիորեն ավելացել է գերձգված հյուսվածքներում (նկ. 7c):Այս արդյունքները ցույց են տալիս հիպերդիտենզիայից հետո պաթոլոգիական վերափոխման առաջանցիկ զարգացումը և աջակցում են այն հայեցակարգին, որ CTCM սարքը կարող է օգտագործվել որպես հարթակ՝ ուսումնասիրելու ձգվող հրահրված սրտի հիպերտրոֆիայի ազդանշանը:
Օդային խցիկի ճնշման ներկայացուցչական հետքերը, հեղուկի խցիկի ճնշման և հյուսվածքների շարժման չափումները հաստատում են, որ պալատի ճնշումը փոխում է հեղուկի խցիկի ճնշումը՝ առաջացնելով հյուսվածքի շերտի համապատասխան շարժում:b Ձգվող տոկոսի և ձգման արագության ներկայացուցչական կորեր սովորական ձգվող (նարնջագույն) և գերձգված (կապույտ) հյուսվածքների հատվածների համար:գ գծապատկեր, որը ցույց է տալիս ցիկլի ժամանակը (n = 19 շերտ մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), կծկման ժամանակը (n = 18-19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), թուլացման ժամանակը (n = 19 կտոր մեկ խմբին, տարբեր խոզերից) ), հյուսվածքների շարժման լայնությունը (n = 14 շերտ/խոզի զանգված, 4 խմբաքանակ, տարբեր խոզեր): տարբեր խոզերից) և թուլացման առավելագույն արագությունը (n = 14 (D0), 15 (D6) ) բաժիններ/խմբեր) տարբեր խոզերից), երկկողմանի Student-ի t-թեստը որևէ պարամետրում էական տարբերություն չի ցույց տվել, ինչը ցույց է տալիս, որ այս պարամետրերը մնացին անփոփոխ 6 օրվա ընթացքում գերլարումով կուլտուրայի ընթացքում:Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական գծապատկեր NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական գծապատկերում NT-ProBNP-ի կոնցենտրացիայի քանակականացում կուլտուրայի միջավայրում՝ սրտի կտորներից, որոնք աճեցված են MT նորմալ ձգվող (Նորմ) կամ գերձգվող (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4 MTOS) կտորներ/խմբում տարբեր խոզերի միջև: NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական գծապատկեր NT-ProBNP-ի կուլտուրայի միջավայրում՝ MT նորմալ ձգվող (Նորմ) կամ գերձգվող (OS) պայմաններում մշակված սրտի կտորներից (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4 MTOS) կտորներ/խումբը տարբեր խոզերի համեմատությամբ:NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական հիստոգրամը կուլտուրայի մեջ սրտի կտորներից, որոնք մշակվել են նորմալ MT ձգման (նորմա) կամ գերձգվածության (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4). MTOS) կտորներ / խումբ տարբեր խոզերի վերլուծություն, կատարվել է երկու-իսֆա:**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 համեմատած նորմալ ձգման հետ): a 在MT 正常拉伸(Նորմ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基靭NT-ProBNP = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTՆորմ 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分同猪的切片/组，进行双向方差分向減行双向方差分分，p <0.01）։ NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական գնահատում սրտի կտորներում, որոնք մշակվել են MT նորմալ ձգման (Նորմ) կամ գերձգվածության (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) տարբեր 猪摚发取叐叐 猪暄切片/组，动; **համեմատած նորմալ ձգման հետ, p <0.01):Հիստոգրամ NT-ProBNP կոնցենտրացիաների քանակականացում սրտի կտորներում, որոնք մշակվել են նորմալ MT ձգման (նորմա) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) և D4 MTOS) կտորներ/խմբում տարբեր խոզերից, շեղումների երկկողմանի վերլուծություն;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 համեմատած նորմալ ձգման հետ): բ Տրոպոնին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ և բջջի չափի քանակականացում (աջ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջներ/խումբ տարբեր խոզերի 10 տարբեր կտորներից, Երկկողմանի ուսանողական t-թեստը համեմատվում է նորմալ 000 p-ի հետ: բ Տրոպոնին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ և բջիջների չափի քանակականացում (աջ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջներ/խումբ տարբեր խոզերի 10 տարբեր կտորներից, երկկողմանի ուսանողական t-թեստը համեմատվում է նորմալ ****0-ի հետ: b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного որոշված ​​է размера свиок (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). բ տրոպոնին-T-ով և AZP-ով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և բջիջների չափի քանակական հաշվարկ (աջ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջներ/խումբ տարբեր խոզերի 10 տարբեր հատվածներից, երկկողմանի ուսանողական t-թեստը համեմատվել է <000p-ի հետ: b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表惞3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比,****p < 0,0001）: բ կալկարեին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և բջջի չափս (աջ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 տարբեր հատվածներից (D6 MTNorm)) Բջիջներ/组，两方法有得0,0001): b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm/D6 MTNorm) из 10. , двусторонние критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). բ Տրոպոնին-T-ով և AZP-ով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և բջջի չափի քանակականացում (աջ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTՆորմ) տարբեր խոզերի 10 տարբեր հատվածներից) Բջիջներ/խումբ, երկկողմանի չափանիշ Ուսանողի t;****p < 0,0001 համեմատած նորմալ լարվածության հետ): c Ներկայացուցչական պատկերներ 0-րդ և 6-րդ օրվա MTOS սրտի հատվածների համար, որոնք իմունային պիտակավորված են տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար և NFATC4-ի տեղափոխման քանակական հաշվարկը դեպի CM-ների միջուկներ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտորներ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկու պոչ: c Ներկայացուցչական պատկերներ 0-րդ և 6-րդ օրվա MTOS սրտի հատվածների համար, որոնք իմունային պիտակավորված են տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար և NFATC4-ի տեղափոխումը CM-ների միջուկներին (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) շերտ/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկու պոչ: c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (D6/MTOS) (D6 =MTOS) ных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента;*p < 0,05)։ գ Սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերները 0 և 6 օր MTOS-ում, իմունային պիտակավորված տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար, և NFATC4-ի տեղափոխման քանակական հաշվարկը քարանձավային բջիջների միջուկում (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) շերտ/խմբ տարբեր խոզերից) իրականացվել են ուսանողների երկու պոչով փորձարկում;* p < 0,05): c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性弛的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学甪t <0Ｃ曀 5. գ calcanin-T և NFATC4 իմունային պիտակավորման ներկայացուցչական պատկերներ 第0天和第6天MTOS սրտի կտորների և NFATC4-ի տարբեր NFATC4 易位至CM բջջային միջուկից 的 քանակություն化 (n = 4 (D6 MTOS),间双尾学生et 电影；*p <0.05): c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свипай (n = 4 (Drez-MT6) 2 (n = 4 (Drez-MT6), т. -критерий Стьюдента; *p < 0,05): գ MTOS սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ 0-րդ և 6-րդ օրը տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի իմունային պիտակավորման և NFATC4-ի տեղափոխման քանակականացման համար CM-ի միջուկում տարբեր խոզերից (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտոր/խումբ, երկու պոչ ուսանողների t.Սխալների գծերը ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղում:
Թարգմանական սրտանոթային հետազոտությունը պահանջում է բջջային մոդելներ, որոնք ճշգրիտ կերպով վերարտադրում են սրտի միջավայրը:Այս հետազոտության ընթացքում մշակվել և բնութագրվել է CTCM սարք, որը կարող է խթանել սրտի գերբարակ հատվածները:CTCM համակարգը ներառում է ֆիզիոլոգիապես սինխրոնացված էլեկտրամեխանիկական խթանում և T3 և Dex հեղուկի հարստացում:Երբ խոզի սրտի հատվածները ենթարկվեցին այս գործոններին, դրանց կենսունակությունը, կառուցվածքային ամբողջականությունը, նյութափոխանակության ակտիվությունը և տրանսկրիպցիոն արտահայտությունը մնացին նույնը, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքում 12 օր մշակույթից հետո:Բացի այդ, սրտի հյուսվածքի չափից ավելի ձգումը կարող է առաջացնել սրտի հիպերտրոֆիա, որն առաջանում է հիպերարտեզիայի հետևանքով:Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները աջակցում են ֆիզիոլոգիական կուլտուրայի պայմանների կարևոր դերին սրտի նորմալ ֆենոտիպը պահպանելու գործում և հարթակ են ապահովում թմրամիջոցների զննման համար:
Շատ գործոններ նպաստում են կարդիոմիոցիտների գործունեության և գոյատևման համար օպտիմալ միջավայրի ստեղծմանը:Այս գործոններից ամենաակնառուները կապված են (1) միջբջջային փոխազդեցությունների, (2) էլեկտրամեխանիկական խթանման, (3) հումորալ գործոնների և (4) նյութափոխանակության սուբստրատների հետ:Բջջ-բջջ ֆիզիոլոգիական փոխազդեցությունները պահանջում են բազմաթիվ բջիջների տիպերի բարդ եռաչափ ցանցեր, որոնք ապահովված են արտաբջջային մատրիցով:Բջջային նման բարդ փոխազդեցությունները դժվար է in vitro-ում վերակառուցվել առանձին բջիջների տեսակների համատեղ մշակմամբ, սակայն կարելի է հեշտությամբ հասնել՝ օգտագործելով սրտի հատվածների օրգանոտիպիկ բնույթը:
Կարդիոմիոցիտների մեխանիկական ձգումը և էլեկտրական խթանումը կարևոր նշանակություն ունեն սրտի ֆենոտիպը33,34,35 պահպանելու համար:Թեև մեխանիկական խթանումը լայնորեն օգտագործվում է hiPSC-CM-ի կոնդիցիոներների և հասունացման համար, մի քանի նրբագեղ ուսումնասիրություններ վերջերս փորձել են մշակույթում սրտի հատվածների մեխանիկական խթանումը՝ օգտագործելով միակողմանի բեռնում:Այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ 2D միակողմանի մեխանիկական բեռնումը դրականորեն ազդում է սրտի ֆենոտիպի վրա մշակույթի ընթացքում:Այս ուսումնասիրություններում սրտի հատվածները կա՛մ բեռնված էին իզոմետրիկ առաձգական ուժերով17, գծային ավքսոտոնիկ բեռնումով18, կա՛մ սրտի ցիկլը վերստեղծվեց՝ օգտագործելով ուժային փոխարկիչի հետադարձ կապը և լարվածության շարժիչները:Այնուամենայնիվ, այս մեթոդները օգտագործում են հյուսվածքի միակողմանի ձգում առանց շրջակա միջավայրի օպտիմալացման, ինչը հանգեցնում է սրտի բազմաթիվ գեների ճնշման կամ գեների գերարտահայտմանը, որոնք կապված են աննորմալ ձգվող պատասխանների հետ:Այստեղ նկարագրված CTCM-ն ապահովում է 3D էլեկտրամեխանիկական խթան, որը նմանակում է բնական սրտի ցիկլը ցիկլի ժամանակի և ֆիզիոլոգիական ձգման առումով (25% ձգում, 40% սիստոլ, 60% դիաստոլ և 72 զարկ րոպեում):Թեև այս եռաչափ մեխանիկական գրգռումը միայն բավարար չէ հյուսվածքների ամբողջականությունը պահպանելու համար, հումորային և մեխանիկական խթանման համակցությունը, օգտագործելով T3/Dex, անհրաժեշտ է հյուսվածքների կենսունակությունը, գործառույթը և ամբողջականությունը պատշաճ կերպով պահպանելու համար:
Հումորային գործոնները կարևոր դեր են խաղում մեծահասակների սրտի ֆենոտիպը կարգավորելու գործում:Սա ընդգծվել է HiPS-CM ուսումնասիրություններում, որոնցում T3-ը և Dex-ը ավելացվել են կուլտուրայի միջավայրին՝ բջիջների հասունացումը արագացնելու համար:T3-ը կարող է ազդել ամինաթթուների, շաքարների և կալցիումի տեղափոխման վրա բջջային թաղանթներով36:Բացի այդ, T3-ը նպաստում է MHC-α արտահայտմանը և MHC-β-ի նվազակարգմանը, նպաստելով հասուն կարդիոմիոցիտներում արագ կծկվող միոֆիբրիլների ձևավորմանը՝ համեմատած պտղի CM-ի դանդաղ ճեղքման միոֆիբրիլների հետ:Հիպոթիրեոզով հիվանդների մոտ T3-ի անբավարարությունը հանգեցնում է միոֆիբրիլյար ժապավենների կորստի և տոնուսի զարգացման արագության նվազմանը37:Dex-ը գործում է գլյուկոկորտիկոիդ ընկալիչների վրա և ցույց է տվել, որ մեծացնում է սրտամկանի կծկողականությունը մեկուսացված պերֆուզացված սրտերում;Ենթադրվում է, որ այս բարելավումը կապված է կալցիումի ավանդների վրա հիմնված մուտքի (SOCE) վրա ազդեցության հետ 39,40:Բացի այդ, Dex-ը կապվում է իր ընկալիչների հետ՝ առաջացնելով լայն ներբջջային պատասխան, որը ճնշում է իմունային ֆունկցիան և բորբոքումը30:
Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ֆիզիկական մեխանիկական խթանումը (MS) բարելավեց մշակույթի ընդհանուր կատարումը Ctrl-ի համեմատ, բայց չհաջողվեց պահպանել կենսունակությունը, կառուցվածքային ամբողջականությունը և սրտի արտահայտումը 12 օրվա ընթացքում մշակույթի մեջ:Ctrl-ի համեմատ՝ T3-ի և Dex-ի ավելացումը CTCM (MT) մշակույթներին բարելավեց կենսունակությունը և պահպանեց նմանատիպ տառադարձման պրոֆիլները, կառուցվածքային ամբողջականությունը և նյութափոխանակության ակտիվությունը թարմ սրտի հյուսվածքի հետ 12 օրվա ընթացքում:Բացի այդ, վերահսկելով հյուսվածքների ձգման աստիճանը, ստեղծվել է հիպերարտեզիայով պայմանավորված սրտի հիպերտրոֆիայի մոդել՝ օգտագործելով STCM, որը ցույց է տալիս STCM համակարգի բազմակողմանիությունը:Պետք է նշել, որ թեև սրտի վերափոխումը և ֆիբրոզը սովորաբար ներառում են անձեռնմխելի օրգաններ, որոնց շրջանառվող բջիջները կարող են ապահովել համապատասխան ցիտոկիններ, ինչպես նաև ֆագոցիտոզ և այլ վերականգնող գործոններ, սրտի հատվածները դեռ կարող են ընդօրինակել ֆիբրոտիկ պրոցեսը` ի պատասխան սթրեսի և տրավմայի:միոֆիբրոբլաստների մեջ:Սա նախկինում գնահատվել է այս սրտի շերտի մոդելում:Պետք է նշել, որ CTCM պարամետրերը կարող են մոդուլավորվել՝ փոխելով ճնշումը/էլեկտրական ամպլիտուդը և հաճախականությունը՝ նմանակելու բազմաթիվ պայմաններ, ինչպիսիք են տախիկարդիան, բրադիկարդիան և մեխանիկական շրջանառության աջակցությունը (մեխանիկական բեռնաթափված սիրտ):Սա համակարգը դարձնում է միջին թողունակություն դեղերի փորձարկման համար:CTCM-ի կարողությունը մոդելավորելու գերլարվածության հետեւանքով առաջացած սրտի հիպերտրոֆիան ճանապարհ է հարթում անհատականացված թերապիայի համար այս համակարգի փորձարկման համար:Եզրափակելով, այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ մեխանիկական ձգումը և հումորալ խթանումը կարևոր նշանակություն ունեն սրտի հյուսվածքի հատվածների մշակույթը պահպանելու համար:
Թեև այստեղ ներկայացված տվյալները ցույց են տալիս, որ CTCM-ը շատ խոստումնալից հարթակ է անձեռնմխելի սրտամկանի մոդելավորման համար, մշակության այս մեթոդը որոշ սահմանափակումներ ունի:CTCM մշակույթի հիմնական սահմանափակումն այն է, որ այն ստիպում է շարունակական դինամիկ մեխանիկական սթրեսներ շերտերի վրա, ինչը բացառում է յուրաքանչյուր ցիկլի ընթացքում սրտի հատվածի կծկումների ակտիվ վերահսկման հնարավորությունը:Բացի այդ, սրտի հատվածների փոքր չափի պատճառով (7 մմ) սահմանափակ է ավանդական ուժային սենսորների միջոցով մշակութային համակարգերից դուրս սիստոլիկ ֆունկցիան գնահատելու հնարավորությունը:Ներկայիս ձեռագրում մենք մասամբ հաղթահարում ենք այս սահմանափակումը՝ գնահատելով օպտիկական լարումը որպես կծկման ֆունկցիայի ցուցիչ։Այնուամենայնիվ, այս սահմանափակումը կպահանջի հետագա աշխատանք և կարող է լուծվել ապագայում՝ մշակույթում սրտի հատվածների ֆունկցիայի օպտիկական մոնիտորինգի մեթոդների ներդրմամբ, ինչպես օրինակ՝ օպտիկական քարտեզագրումը կալցիումի և լարման զգայուն ներկերի միջոցով:CTCM-ի մեկ այլ սահմանափակումն այն է, որ աշխատանքային մոդելը չի ​​շահարկում ֆիզիոլոգիական սթրեսը (նախաբեռնված և հետբեռնված):CTCM-ում ճնշումն առաջացել է հակառակ ուղղություններով, որպեսզի վերարտադրվի 25% ֆիզիոլոգիական ձգում դիաստոլում (լրիվ ձգում) և սիստոլում (էլեկտրական գրգռման ժամանակ կծկման երկարությունը) շատ մեծ հյուսվածքներում:Այս սահմանափակումը պետք է վերացվի CTCM-ի ապագա նախագծում՝ սրտի հյուսվածքի վրա երկու կողմից համապատասխան ճնշման և սրտի խցերում տեղի ունեցող ճնշում-ծավալ ճշգրիտ հարաբերությունների կիրառմամբ:
Այս ձեռագրում հաղորդված գերձգվածությունից առաջացած վերափոխումը սահմանափակված է հիպերտրոֆիկ հիպերձգվածության ազդանշանների նմանակմամբ:Այսպիսով, այս մոդելը կարող է օգնել ձգվող հիպերտրոֆիկ ազդանշանների ուսումնասիրության մեջ՝ առանց հումորալ կամ նյարդային գործոնների (որոնք գոյություն չունեն այս համակարգում) անհրաժեշտության:Հետագա ուսումնասիրություններ են անհրաժեշտ CTCM-ի բազմակիությունը մեծացնելու համար, օրինակ՝ իմունային բջիջների հետ համատեղ մշակումը, շրջանառվող պլազմայի հումորալ գործոնները և նյարդայնացումը, երբ նեյրոնային բջիջների հետ համատեղ մշակումը կբարելավի հիվանդության մոդելավորման հնարավորությունները CTCM-ով:
Այս հետազոտության ընթացքում օգտագործվել է տասներեք խոզ:Կենդանիների բոլոր ընթացակարգերը կատարվել են ինստիտուցիոնալ ուղեցույցների համաձայն և հաստատվել են Լուիսվիլի համալսարանի Կենդանիների խնամքի և օգտագործման ինստիտուցիոնալ կոմիտեի կողմից:Աորտայի կամարը սեղմվեց և սիրտը ներարկվեց 1 լ ստերիլ կարդիոպլեգիայով (110 մՄ NaCl, 1,2 մՄ CaCl2, 16 մՄ KCl, 16 մՄ MgCl2, 10 մՄ NaHCO3, 5 U/mL հեպարին, pH մինչև 7); սրտերը պահվում էին սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում, մինչև տեղափոխվեցին լաբորատորիա սառույցի վրա, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե: սրտերը պահվում էին սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում, մինչև տեղափոխվեցին լաբորատորիա սառույցի վրա, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե: сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. սրտերը պահվում էին սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում մինչև լաբորատորիա տեղափոխելը սառույցով, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե:将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Պահպանեք սրտերը սառցե կարդիոպլեգիայով մինչև լաբորատորիա տեղափոխելը սառույցով, սովորաբար <10 րոպե:
CTCM սարքը մշակվել է SolidWorks համակարգչային օժանդակ դիզայնի (CAD) ծրագրաշարով:Մշակույթի խցիկները, բաժանարարները և օդային խցիկները պատրաստված են CNC թափանցիկ ակրիլային պլաստիկից:7 մմ տրամագծով պահուստային օղակը պատրաստված է բարձր խտության պոլիէթիլենից (HDPE) կենտրոնում և ունի օ-օղակային ակոս՝ սիլիկոնե օ-օղակին տեղավորելու համար, որն օգտագործվում է տակի միջերեսը փակելու համար:Բարակ սիլիցիումի թաղանթն առանձնացնում է կուլտուրայի խցիկը բաժանման ափսեից:Սիլիկոնե թաղանթը լազերային կտրված է 0,02 դյույմ հաստ սիլիկոնե թերթից և ունի 35 Ա կարծրություն:Ներքևի և վերևի սիլիկոնե միջադիրները լազերային կտրված են 1/16 դյույմ հաստ սիլիկոնե թերթից և ունեն 50A կարծրություն:316L չժանգոտվող պողպատից պտուտակներ և թևի ընկույզներ օգտագործվում են բլոկը ամրացնելու և հերմետիկ կնիք ստեղծելու համար:
Հատուկ տպագիր տպատախտակ (PCB) նախագծված է C-PACE-EM համակարգի հետ ինտեգրվելու համար:PCB-ի վրա շվեյցարական մեքենայի միակցիչի վարդակները միացված են գրաֆիտային էլեկտրոդներին արծաթապատ պղնձե լարերով և էլեկտրոդների մեջ պտուտակված բրոնզե 0-60 պտուտակներով:Տպագիր տպատախտակը տեղադրված է 3D տպիչի շապիկի մեջ։
CTCM սարքը կառավարվում է ծրագրավորվող օդաճնշական մղիչով (PPD), որը ստեղծում է վերահսկվող շրջանառության ճնշում, որը նման է սրտի ցիկլին:Երբ օդային խցիկի ներսում ճնշումը մեծանում է, ճկուն սիլիկոնե թաղանթը ընդլայնվում է դեպի վեր՝ ստիպելով միջավայրը հյուսվածքի տեղանքի տակ:Հյուսվածքի տարածքն այնուհետև կձգվի հեղուկի այս արտամղմամբ՝ ընդօրինակելով սրտի ֆիզիոլոգիական ընդլայնումը դիաստոլի ժամանակ:Ռելաքսացիայի գագաթնակետին գրաֆիտային էլեկտրոդների միջոցով կիրառվել է էլեկտրական խթանում, ինչը նվազեցրել է ճնշումը օդային խցիկում և առաջացրել հյուսվածքների հատվածների կծկում:Խողովակի ներսում տեղադրված է հեմոստատիկ փական՝ ճնշման սենսորով՝ օդային համակարգում ճնշումը հայտնաբերելու համար:Ճնշման սենսորի կողմից ընկալվող ճնշումը կիրառվում է նոութբուքին միացված տվյալների հավաքիչի վրա:Սա թույլ է տալիս շարունակական վերահսկել ճնշումը գազի խցիկի ներսում:Երբ խցիկի առավելագույն ճնշումը հասավ (ստանդարտ 80 մմ Hg, 140 մմ Hg ՕՀ), տվյալների հավաքագրման սարքին հրամայվեց ազդանշան ուղարկել C-PACE-EM համակարգին՝ 2 ms-ի համար երկֆազային լարման ազդանշան ստեղծելու համար, որը դրված էր 4 Վ-ի վրա:
Ձեռք բերվեցին սրտի հատվածներ և 6 հորերում իրականացվեցին կուլտուրայի պայմանները հետևյալ կերպ. Հավաքած սրտերը տեղափոխման անոթից տեղափոխեք սառը (4°C) կարդիոպլեգիա պարունակող սկուտեղ:Ձախ փորոքը մեկուսացվել է ստերիլ շեղբով և կտրվել 1-2 սմ3-ի կտորների։Այս հյուսվածքային բլոկները կցվեցին հյուսվածքային հենարաններին հյուսվածքային սոսինձով և տեղադրվեցին թրթռացող միկրոտոմի հյուսվածքային լոգարանում, որը պարունակում է Tyrode-ի լուծույթ և շարունակաբար թթվածնով լցված (3 գ/լ 2,3-բուտանեդիոն մոնոքսիմ (BDM), 140 մՄ NaCl (8,18 գ) .), 6 մՄ KCl (D71-01-0), 6 մՄ KCl (D71-01-0): mM HEPES (2,38 գ), 1 mM MgCl2 (1 մլ 1 M լուծույթ), 1,8 mM CaCl2 (1,8 մլ 1 M լուծույթ), մինչև 1 L ddH2O):Թրթռացող միկրոտոմը նախատեսված էր կտրելու 300 մկմ հաստությամբ շերտեր 80 Հց հաճախականությամբ, 2 մմ հորիզոնական թրթռման ամպլիտուդով և 0,03 մմ/վ առաջխաղացման արագությամբ:Հյուսվածքային լոգանքը շրջապատված էր սառույցով, որպեսզի լուծումը սառը մնա, իսկ ջերմաստիճանը պահպանվեց 4°C-ում:Հյուսվածքների հատվածները միկրոտոմի բաղնիքից տեղափոխեք ինկուբացիոն բաղնիք, որը պարունակում է սառույցի վրա անընդհատ թթվածնով լցված Tyrode լուծույթ, մինչև ստացվի բավարար հատվածներ մեկ կուլտուրայի ափսեի համար:Տրանսհեղեղի կուլտուրաների համար հյուսվածքների հատվածները կցվեցին 6 մմ լայնությամբ ստերիլ պոլիուրեթանային հենարաններին և տեղադրվեցին 6 մլ օպտիմիզացված միջավայրում (199 միջավայր, 1x ITS հավելում, 10% FBS, 5 նգ/մլ VEGF, 10 նգ/մլ FGF-ալկալային և 2X հակաբիոտիկ-հակաբիոտիկ):Հյուսվածքների հատվածների վրա կիրառվել է էլեկտրական խթանում (10 Վ, հաճախականությունը 1,2 Հց) C-Pace-ի միջոցով:TD պայմանների համար թարմ T3 և Dex ավելացվել են 100 nM և 1 μM յուրաքանչյուր միջավայրի փոփոխության դեպքում:Միջոցը հագեցված է թթվածնով, փոխարինելուց առաջ օրական 3 անգամ:Հյուսվածքների հատվածները մշակվել են ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2:
CTCM մշակույթների համար հյուսվածքների հատվածները տեղադրվել են հատուկ պատրաստված 3D տպիչի վրա Petri ափսեի մեջ, որը պարունակում է փոփոխված Tyrode լուծույթ:Սարքը նախատեսված է աջակցող օղակի տարածքի 25%-ով մեծացնելու սրտի շերտի չափը։Դա արվում է, որպեսզի սրտի հատվածները չձգվեն Տիրոդի լուծույթից միջավայր տեղափոխելուց հետո և դիաստոլի ժամանակ։Օգտագործելով հիստոակրիլային սոսինձ, 300 մկմ հաստությամբ հատվածները ամրացվել են 7 մմ տրամագծով հենարանային օղակի վրա:Հյուսվածքի հատվածները հենակետային օղակին ամրացնելուց հետո կտրեք հյուսվածքի ավելցուկային հատվածները և կցված հյուսվածքի հատվածները նորից տեղադրեք սառույցի վրա (4°C) Tyrode լուծույթի լոգանքի մեջ, մինչև մեկ սարքի համար բավարար հատվածներ պատրաստվեն:Բոլոր սարքերի մշակման ընդհանուր ժամանակը չպետք է գերազանցի 2 ժամը:Այն բանից հետո, երբ հյուսվածքների 6 հատվածները կցվեցին դրանց աջակցող օղակներին, հավաքվեց CTCM սարքը:CTCM կուլտուրայի խցիկը նախապես լցված է 21 մլ նախապես թթվածնային միջավայրով:Հյուսվածքների հատվածները տեղափոխեք կուլտուրայի խցիկ և զգուշորեն հեռացրեք օդային փուչիկները պիպետտով:Այնուհետև հյուսվածքի հատվածը ուղղորդվում է անցքի մեջ և նրբորեն սեղմվում տեղում:Վերջում տեղադրեք էլեկտրոդի գլխարկը սարքի վրա և սարքը տեղափոխեք ինկուբատոր:Այնուհետև միացրեք CTCM-ը օդային խողովակին և C-PACE-EM համակարգին:Օդաճնշական շարժիչը բացվում է, իսկ օդային փականը բացում է CTCM-ը:C-PACE-EM համակարգը կազմաձևված էր այնպես, որ մատակարարի 4 Վ 1,2 Հց հաճախականությամբ երկֆազային 2 մս արագության ընթացքում:Միջոցը փոխվում էր օրական երկու անգամ, իսկ էլեկտրոդները փոխվում էին օրը մեկ անգամ՝ էլեկտրոդների վրա գրաֆիտի կուտակումից խուսափելու համար:Անհրաժեշտության դեպքում, հյուսվածքների հատվածները կարող են հեռացվել իրենց կուլտուրայի հորերից՝ հեռացնելու օդային փուչիկները, որոնք կարող էին ընկած լինել դրանց տակ:MT բուժման պայմանների համար T3/Dex-ը ավելացվել է թարմ յուրաքանչյուր միջավայրի փոփոխությամբ 100 նՄ T3 և 1 μM Dex-ով:CTCM սարքերը մշակվել են ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2:
Սրտի կտորների ձգված հետագծեր ստանալու համար մշակվել է հատուկ տեսախցիկի համակարգ։SLR տեսախցիկ (Canon Rebel T7i, Canon, Տոկիո, Ճապոնիա) օգտագործվել է Navitar Zoom 7000 18-108 մմ մակրո ոսպնյակի հետ (Navitar, San Francisco, CA):Վիզուալիզացիան իրականացվել է սենյակային ջերմաստիճանում՝ կրիչը թարմ միջավայրով փոխարինելուց հետո:Տեսախցիկը տեղադրված է 51° անկյան տակ և տեսագրվում է վայրկյանում 30 կադր արագությամբ:Նախ, բաց կոդով ծրագրակազմը (MUSCLEMOTION43) օգտագործվել է Image-J-ի հետ՝ սրտի հատվածների շարժումը քանակականացնելու համար:Դիմակը ստեղծվել է MATLAB-ի միջոցով (MathWorks, Natick, MA, ԱՄՆ)՝ աղմուկից խուսափելու համար բաբախող սրտի հատվածների համար հետաքրքրող շրջանները սահմանելու համար:Ձեռքով հատվածավորված դիմակները կիրառվում են բոլոր պատկերների վրա՝ շրջանակի հաջորդականությամբ, այնուհետև փոխանցվում են MUSCLEMOTION plug-in-ին:Մկանային շարժումը օգտագործում է պիքսելների միջին ինտենսիվությունը յուրաքանչյուր կադրում, որպեսզի քանակականացնի իր շարժումը հղումային շրջանակի նկատմամբ:Տվյալները գրանցվեցին, զտվեցին և օգտագործվեցին ցիկլի ժամանակը քանակականացնելու և սրտի ցիկլի ընթացքում հյուսվածքների ձգվածությունը գնահատելու համար:Ձայնագրված տեսանյութը հետմշակվել է առաջին կարգի զրոյական փուլային թվային ֆիլտրի միջոցով:Հյուսվածքների ձգվածությունը (գագաթից մինչև գագաթ) քանակականացնելու համար կատարվեց գագաթից գագաթ վերլուծություն՝ գրանցված ազդանշանի գագաթնակետերն ու շեղումները տարբերելու համար:Բացի այդ, դետրենդինգն իրականացվում է 6-րդ կարգի բազմանդամի միջոցով՝ ազդանշանի շեղումը վերացնելու համար:Ծրագրի կոդը մշակվել է MATLAB-ում՝ հյուսվածքների գլոբալ շարժումը, ցիկլի ժամանակը, թուլացման ժամանակը և կծկման ժամանակը որոշելու համար (Լրացուցիչ ծրագրի կոդը 44):
Լարվածության վերլուծության համար, օգտագործելով նույն տեսանյութերը, որոնք ստեղծվել են մեխանիկական ձգման գնահատման համար, մենք նախ հետևեցինք երկու պատկեր, որոնք ներկայացնում էին շարժման գագաթները (շարժման ամենաբարձր (վերին) և ամենացածր (ներքև) կետերը)՝ ըստ MUSCLEMOTION ծրագրի:Այնուհետև մենք հատվածավորեցինք հյուսվածքների շրջանները և կիրառեցինք ստվերային ալգորիթմի ձև հատվածավորված հյուսվածքի վրա (Լրացուցիչ նկար 2ա):Սեգմենտավորված հյուսվածքն այնուհետև բաժանվեց տասը ենթամակերևույթի, և յուրաքանչյուր մակերևույթի վրա լարվածությունը հաշվարկվեց հետևյալ հավասարման միջոցով. Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, որտեղ Sup և Sdown ձևի հեռավորություններն են համապատասխանաբար գործվածքների վերին և ստորին ստվերներից (Լրացուցիչ նկ. .2b):
Սրտի հատվածները 48 ժամ ֆիքսել են 4% պարաֆորմալդեհիդում:Ֆիքսված հյուսվածքները ջրազրկվել են 10% և 20% սախարոզայի մեջ 1 ժամ, այնուհետև 30% սախարոզայի մեջ մեկ գիշերվա ընթացքում:Այնուհետև հատվածները տեղադրվեցին կտրման օպտիմալ ջերմաստիճանի միացության մեջ (OCT միացություն) և աստիճանաբար սառեցվեցին իզոպենտան/չոր սառույցի լոգարանում:Պահպանեք OCT ներկառուցման բլոկները -80 °C ջերմաստիճանում մինչև բաժանումը:Սլայդները պատրաստվել են 8 մկմ հաստությամբ հատվածների տեսքով։
OCT-ը սրտի հատվածներից հեռացնելու համար տաքացրեք սլայդները տաքացնող բլոկի վրա 95 °C ջերմաստիճանում 5 րոպե:Յուրաքանչյուր սլայդին ավելացրեք 1 մլ PBS և ինկուբացրեք 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, այնուհետև ներթափանցեք հատվածները՝ 0,1% Triton-X PBS-ում 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում դնելով:Որպեսզի ոչ սպեցիֆիկ հակամարմինները չկապվեն նմուշի հետ, սլայդներին ավելացրեք 1 մլ 3% BSA լուծույթ և 1 ժամ ինկուբացրեք սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև BSA-ն հեռացվեց և սլայդները լվացվեցին PBS-ով:Նշեք յուրաքանչյուր նմուշ մատիտով:Առաջնային հակամարմինները (նոսրացված 1:200 1% BSA-ում) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) և տրոպոնին-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ավելացվել են 90 րոպեի ընթացքում, այնուհետև 1% BSA-ի դեմ երկրորդական 0-լյուոր հակամարմիններ են ավելացվել (di0eluor) 488 (Thermo Scientific; #A16079), նապաստակի Alexa Fluor 594-ի դեմ (Thermo Scientific; #T6391) ևս 90 րոպե Լվացվեց 3 անգամ PBS-ով Թիրախային ներկումը ֆոնից տարբերելու համար որպես հսկիչ օգտագործեցինք միայն երկրորդական հակամարմինը: Վերջում ավելացվեց DAPI միջուկային բիծը և տեղադրվեցին slicks. -x խոշորացում) և Keyence մանրադիտակ 40x խոշորացումով։
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 մկգ/մլ PBS-ում օգտագործվել է WGA ներկման համար և կիրառվել է ֆիքսված հատվածների վրա 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև սլայդները լվացվեցին PBS-ով և յուրաքանչյուր սլայդի վրա ավելացվեց սուդանի սևը և ինկուբացվեց 30 րոպե:Այնուհետև սլայդները լվացվեցին PBS-ով և ավելացվեց vectashield ներկառուցող միջավայր:Սլայդները տեսանելի են եղել Keyence մանրադիտակի վրա 40x խոշորացմամբ:
OCT-ը հանվել է նմուշներից, ինչպես նկարագրված է վերևում:OCT-ը հեռացնելուց հետո սլայդները ամբողջ գիշեր ընկղմեք Բուենի լուծույթի մեջ:Այնուհետև սլայդները ողողում էին թորած ջրով 1 ժամ և այնուհետև 10 րոպեով դրվում Bibrich ալոեի թթվի ֆուքսին լուծույթի մեջ:Այնուհետև սլայդները լվացվեցին թորած ջրով և 10 րոպեով տեղադրվեցին 5% ֆոսֆոմոլիբդենի/5% ֆոսֆոտնգսթաթթվի լուծույթում:Առանց ողողելու, 15 րոպեով սլայդները տեղափոխեք անմիջապես անիլին կապույտ լուծույթի մեջ:Այնուհետև սլայդները լվացվեցին թորած ջրով և 2 րոպե տեղադրվեցին 1% քացախաթթվի լուծույթում:Սլայդները չորացվեցին 200 N էթանոլի մեջ և տեղափոխվեցին քսիլեն:Ներկված սլայդները վիզուալացվել են Keyence մանրադիտակի միջոցով՝ 10x օբյեկտով:Ֆիբրոզի տարածքի տոկոսը քանակականացվել է Keyence Analyzer ծրագրի միջոցով:
CyQUANT™ MTT բջջային կենսունակության վերլուծություն (Invitrogen, Carlsbad, CA), կատալոգի համարը V13154, ըստ արտադրողի արձանագրության՝ որոշ փոփոխություններով:Մասնավորապես, 6 մմ տրամագծով վիրաբուժական դակիչ է օգտագործվել՝ MTT վերլուծության ժամանակ հյուսվածքների միատեսակ չափս ապահովելու համար:Հյուսվածքները առանձին-առանձին տեղադրվել են 12 հորատանցք ունեցող ափսեի մեջ, որը պարունակում է MTT ենթաշերտ՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:Բաժինները ինկուբացվում են 37°C ջերմաստիճանում 3 ժամ, և կենդանի հյուսվածքը մետաբոլիզացնում է MTT սուբստրատը՝ ձևավորելով մանուշակագույն ֆորմազանային միացություն:Փոխարինեք MTT լուծույթը 1 մլ DMSO-ով և ինկուբացրեք 37 °C ջերմաստիճանում 15 րոպե՝ սրտի հատվածներից մանուշակագույն ֆորմազան հանելու համար:Նմուշները նոսրացվել են 1:10 DMSO-ում 96 հորատանցքի թափանցիկ ներքևի թիթեղներում և մանուշակագույն գույնի ինտենսիվությունը չափվել է 570 նմ-ում՝ օգտագործելով Cytation թիթեղների ընթերցիչ (BioTek):Ընթերցումները նորմալացվել են սրտի յուրաքանչյուր շերտի քաշին:
Սրտի հատվածի կրիչները փոխարինվել են 1 μCi/ml [5-3H]-գլյուկոզա պարունակող կրիչներով (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), ինչպես նախկինում նկարագրված էր գլյուկոզայի օգտագործման վերլուծության համար:4 ժամ ինկուբացիայից հետո 100 մկլ 0,2 N HCl պարունակող բաց միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ ավելացրեք 100 մկլ միջավայր:Այնուհետև խողովակը դրվեց ցինտիլացիոն խողովակի մեջ, որը պարունակում էր 500 μl dH2O, որպեսզի գոլորշիացվի [3H]2O 72 ժամ 37°C ջերմաստիճանում:Այնուհետև հեռացրեք միկրոցենտրիֆուգային խողովակը ցինտիլացիոն խողովակից և ավելացրեք 10 մլ ցինտիլացիոն հեղուկ:Ցինտիլյացիայի հաշվարկները կատարվել են Tri-Carb 2900TR հեղուկ ցինտիլացիոն անալիզատորի միջոցով (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ԱՄՆ):Այնուհետև հաշվարկվել է գլյուկոզայի օգտագործումը՝ հաշվի առնելով [5-3H]-գլյուկոզայի հատուկ ակտիվությունը, թերի հավասարակշռությունը և ֆոնը, [5-3H]-ի նոսրացումը դեպի չպիտակավորված գլյուկոզա և ցինտիլյացիայի հակազդող արդյունավետությունը:Տվյալները նորմալացվում են սրտի հատվածների զանգվածին:
Տրիզոլում հյուսվածքների համասեռացումից հետո ՌՆԹ-ն մեկուսացվել է սրտի հատվածներից՝ օգտագործելով Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:RNAsec գրադարանի պատրաստումը, հաջորդականությունը և տվյալների վերլուծությունը կատարվել են հետևյալ կերպ.
1 մկգ ՌՆԹ-ն մեկ նմուշի համար օգտագործվել է որպես ելակետ ՌՆԹ գրադարանի պատրաստման համար:Հաջորդականացման գրադարանները ստեղծվել են՝ օգտագործելով NEBNext UltraTM RNA գրադարանի պատրաստման հավաքածուն Illumina-ի համար (NEB, ԱՄՆ)՝ հետևելով արտադրողի առաջարկություններին, և յուրաքանչյուր նմուշի ատրիբուտների հաջորդականություններին ավելացվել են ինդեքսի կոդերը:Համառոտ, mRNA-ն մաքրվել է ընդհանուր ՌՆԹ-ից՝ օգտագործելով մագնիսական ուլունքներ՝ կցված պոլի-Տ օլիգոնուկլեոտիդներով:Ֆրագմենտացիան իրականացվում է երկվալենտ կատիոնների միջոցով բարձր ջերմաստիճանում NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer-ում (5X):Առաջին շղթայի cDNA-ն սինթեզվել է՝ օգտագործելով պատահական հեքսամեր պրայմերներ և M-MuLV հակադարձ տրանսկրիպտազ (RNase H-):Երկրորդ շղթայի cDNA-ն այնուհետև սինթեզվում է ԴՆԹ պոլիմերազ I և RNase H-ի միջոցով: Մնացած ելուստները էկզոնուկլեազ/պոլիմերազային ակտիվությամբ վերածվում են բութ ծայրերի:ԴՆԹ-ի հատվածի 3' ծայրի ադենիլացումից հետո դրան կցվում է NEBNext ադապտեր՝ մազակալի հանգույցի կառուցվածքով, որպեսզի պատրաստի այն հիբրիդացմանը:150-200 bp նախընտրելի երկարությամբ cDNA բեկորների ընտրության համար:գրադարանի բեկորները մաքրվել են AMPure XP համակարգի միջոցով (Beckman Coulter, Beverly, ԱՄՆ):Այնուհետև, 3 մկլ USER Enzyme (NEB, ԱՄՆ) չափի ընտրված cDNA-ով, որը միացված էր ադապտերով, օգտագործվել է 15 րոպե 37°C-ում և այնուհետև 5 րոպե 95°C-ում PCR-ից առաջ:Այնուհետև PCR-ն իրականացվել է՝ օգտագործելով Phusion High-Fidelity ԴՆԹ պոլիմերազ, ունիվերսալ PCR պրայմերներ և Index (X) պրայմերներ:Վերջապես, PCR արտադրանքները մաքրվեցին (AMPure XP համակարգ) և գրադարանի որակը գնահատվեց Agilent Bioanalyzer 2100 համակարգի վրա:Այնուհետև cDNA գրադարանը հաջորդականացվել է՝ օգտագործելով Novaseq sequencer:Illumina-ի հում պատկերի ֆայլերը վերածվել են չմշակված ընթերցումների՝ օգտագործելով CASAVA Base Calling:Հում տվյալները պահվում են FASTQ(fq) ֆորմատի ֆայլերում, որոնք պարունակում են ընթերցման հաջորդականություններ և համապատասխան բազային որակներ:Ընտրեք HISAT2՝ զտված հաջորդականության ընթերցումները Sscrofa11.1 հղումային գենոմին համապատասխանելու համար:Ընդհանուր առմամբ, HISAT2-ն աջակցում է ցանկացած չափի գենոմներին, ներառյալ 4 միլիարդ հիմքից ավելի գենոմները, և պարամետրերի մեծ մասի համար սահմանված են լռելյայն արժեքներ:ՌՆԹ-ի Seq-ի տվյալների միացման ընթերցումները կարող են արդյունավետորեն հավասարեցվել HISAT2-ի միջոցով՝ ներկայումս առկա ամենաարագ համակարգը, նույն կամ ավելի լավ ճշգրտությամբ, քան ցանկացած այլ մեթոդ:
Տրանսկրիպտների առատությունն ուղղակիորեն արտացոլում է գեների արտահայտման մակարդակը։Գենային արտահայտման մակարդակները գնահատվում են գենոմի կամ էկզոնների հետ կապված տրանսկրիպտների (հաջորդականության քանակի) առատությամբ:Ընթերցումների քանակը համաչափ է գեների արտահայտման մակարդակին, գենի երկարությանը և հաջորդականության խորությանը:FPKM (հատվածներ հազար բազային զույգ տառադարձման հաջորդականությամբ մեկ միլիոն բազային զույգի համար) և որոշվել են դիֆերենցիալ արտահայտման P արժեքները՝ օգտագործելով DESeq2 փաթեթը:Այնուհետև մենք հաշվարկեցինք կեղծ հայտնաբերման արագությունը (FDR) յուրաքանչյուր P արժեքի համար՝ օգտագործելով Benjamini-Hochberg մեթոդը9՝ հիմնված ներկառուցված «p.adjust» R ֆունկցիայի վրա:
Սրտի հատվածներից մեկուսացված ՌՆԹ-ն փոխարկվել է cDNA-ի 200 նգ/մկլ կոնցենտրացիայով՝ օգտագործելով Thermo-ից SuperScript IV Vilo Master խառնուրդը (Thermo, cat. no. 11756050):Քանակական RT-PCR-ն իրականացվել է Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 ջրհորի թափանցիկ ռեակցիայի թիթեղով (Thermo, cat. no. 4483319) և միկրոամպային օպտիկական սոսինձով (Thermo, cat. no. 4311971):Ռեակցիոն խառնուրդը բաղկացած էր 5 մկլ Taqman Fast Advanced Master խառնուրդից (Thermo, cat # 4444557), 0,5 μl Taqman Primer-ից և 3,5 μl H2O-ից՝ խառնված մեկ հորատանցքում:Ստանդարտ qPCR ցիկլերը գործարկվել են, և CT արժեքները չափվել են՝ օգտագործելով Applied Biosystems Quantstudio 5 իրական ժամանակի PCR գործիքը (384 հորատանցքի մոդուլ, արտադրանքի թիվ A28135):Taqman այբբենարանները գնվել են Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL81 (Ss03375629_u1), RGL81 (Ss06908795_m1) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_245 տնային արժեքները նորմալացվել են) ԳԱՊԴՀ.
NT-ProBNP-ի մեդիա թողարկումը գնահատվել է օգտագործելով NT-ProBNP հավաքածու (խոզուկ) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource)՝ ըստ արտադրողի արձանագրության:Հակիրճ, յուրաքանչյուր հորատանցքին կրկնօրինակով ավելացվել է 250 մկլ յուրաքանչյուր նմուշ և ստանդարտ:Նմուշը ավելացնելուց անմիջապես հետո յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 50 մկլ վերլուծության ռեակտիվ A:Մեղմորեն թափահարեք ափսեը և կնքեք հերմետիկով:Այնուհետև հաբերը 1 ժամ ինկուբացրել են 37°C ջերմաստիճանում:Այնուհետև ներծծեք լուծույթը և 4 անգամ լվացեք հորերը 350 մկլ 1X լվացման լուծույթով, ամեն անգամ ինկուբացնելով լվացքի լուծույթը 1-2 րոպե:Այնուհետև ավելացրեք 100 µl Assay Reagent B յուրաքանչյուր ջրհորի և փակեք ափսեի հերմետիկով:Պլանշետը նրբորեն թափահարվեց և ինկուբացվեց 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե:Շնչեք լուծույթը և լվացեք հորերը 5 անգամ 350 մկլ 1X լվացքի լուծույթով:Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 90 մկլ ենթաշերտի լուծույթ և փակեք ափսեը:Ինկուբացնել ափսեը 37°C ջերմաստիճանում 10-20 րոպե:Յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 50 մկլ կանգառի լուծույթ:Թիթեղը անմիջապես չափվել է Cytation (BioTek) ափսեի ընթերցիչի միջոցով, որը սահմանված է 450 նմ:
Կատարվել են հզորության վերլուծություններ՝ ընտրելու խմբի չափերը, որոնք կապահովեն >80% հզորություն՝ հայտնաբերելու պարամետրի 10% բացարձակ փոփոխություն՝ 5% տիպի I սխալի գործակիցով: Կատարվել են հզորության վերլուծություններ՝ ընտրելու խմբի չափերը, որոնք կապահովեն >80% հզորություն՝ հայտնաբերելու պարամետրի 10% բացարձակ փոփոխություն՝ 5% տիպի I սխալի գործակիցով: Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечаток >80% мощности для обнаружения 10% absolutnogo изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Հզորության վերլուծությունը կատարվել է խմբի չափսերի ընտրության համար, որոնք կապահովեն >80% հզորություն՝ հայտնաբերելու 10% բացարձակ պարամետրի փոփոխություն՝ 5% տիպի I սխալի գործակիցով:进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% թույլատրելիություն для обнаружения 10% absolutnogo изменения параметров и 5% частоты ошибок տիպի I. Կատարվել է հզորության վերլուծություն՝ խմբի չափը ընտրելու համար, որը կապահովի >80% հզորություն՝ հայտնաբերելու 10% բացարձակ պարամետրի փոփոխություն և 5% տիպի I սխալի գործակից:Հյուսվածքների հատվածները պատահականորեն ընտրվել են փորձից առաջ:Բոլոր անալիզները եղել են կույր վիճակում, իսկ նմուշները վերծանվել են միայն բոլոր տվյալների վերլուծությունից հետո:GraphPad Prism ծրագրաշարը (Սան Դիեգո, Կալիֆորնիա) օգտագործվել է բոլոր վիճակագրական վերլուծությունները կատարելու համար: Բոլոր վիճակագրության համար p-արժեքները նշանակալի են համարվել <0,05 արժեքներով: Բոլոր վիճակագրության համար p-արժեքները նշանակալի են համարվել <0,05 արժեքներով: Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Բոլոր վիճակագրության համար p-արժեքները նշանակալի են համարվել <0,05 արժեքներով:对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Բոլոր վիճակագրության համար p-արժեքները նշանակալի են համարվել <0,05 արժեքներով:Տվյալների վրա կատարվել է երկու պոչ ուսանողի t-թեստ՝ ընդամենը 2 համեմատությամբ:Միակողմանի կամ երկկողմանի ANOVA-ն օգտագործվել է բազմաթիվ խմբերի միջև նշանակությունը որոշելու համար:Հետհոկ թեստեր կատարելիս Թուկիի ուղղումը կիրառվել է բազմաթիվ համեմատությունների համար:RNAsec-ի տվյալները հատուկ վիճակագրական նկատառումներ ունեն FDR-ը և p.adjust-ը հաշվարկելիս, ինչպես նկարագրված է Մեթոդներ բաժնում:
Ուսումնասիրության նախագծման մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս «Nature Research Report»-ի համառոտագիրը՝ կապված այս հոդվածի հետ: