Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Morfogenesis usus manusia membentuk fitur crypt-villus dari mikroarsitektur epitel 3D dan organisasi spasial. Struktur unik ini diperlukan untuk mempertahankan homeostasis usus dengan melindungi ceruk sel punca di ruang bawah tanah basal dari antigen mikroba eksogen dan metabolitnya. Selain itu, vili usus dan mensekresi lendir menghadirkan sel epitel yang berdiferensiasi secara fungsional dengan penghalang pelindung pada permukaan mukosa usus. Oleh karena itu, membuat ulang struktur epitel 3D sangat penting untuk pembangunan model usus in vitro. Khususnya, organik mimetic gut-on-a-chip dapat menginduksi morfogenesis 3D spontan dari epitel usus dengan fungsi fisiologis dan biomekanik yang ditingkatkan. Di sini, kami menyediakan protokol yang dapat direproduksi untuk secara kuat menginduksi morfogenesis usus dalam usus pada chip mikrofluida serta dalam chip hibrida tertanam Transwell. Kami menjelaskan metode terperinci untuk pembuatan perangkat, pembiakan Caco-2 atau sel epitel organoid usus dalam pengaturan konvensional serta pada platform mikrofluida, induksi morfogenesis 3D , dan karakterisasi epitel 3D yang mapan menggunakan beberapa modalitas pencitraan. Protokol ini mencapai regenerasi mikroarsitektur usus fungsional dengan mengontrol aliran cairan basolateral selama 5 hari. Metode morfogenesis in vitro kami menggunakan tegangan geser dan gerakan mekanis yang relevan secara fisiologis dan tidak memerlukan rekayasa atau manipulasi sel yang kompleks, yang mungkin mengungguli teknik lain yang ada. dan aplikasi farmasi.
Eksperimen menunjukkan bahwa sel Caco-2 epitel usus yang dikultur dalam gut-on-a-chip1,2,3,4,5 atau perangkat mikrofluida bilayer6,7 dapat menjalani morfogenesis 3D spontan in vitro tanpa pemahaman yang jelas tentang mekanisme yang mendasarinya. Dalam penelitian terbaru kami, kami menemukan bahwa penghapusan antagonis morfogen yang disekresikan secara basolateral dari perangkat kultur diperlukan dan cukup untuk menginduksi morfogenesis epitel 3D in vitro, yang telah ditunjukkan oleh Caco-2 dan usus yang diturunkan dari pasien organoid.Sel epitel divalidasi. Dalam penelitian ini, kami secara khusus berfokus pada produksi sel dan distribusi konsentrasi antagonis Wnt yang kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), dalam usus-on-a-chip dan perangkat mikrofluida termodifikasi yang mengandung sisipan Transwell, yang disebut "Chip Hibrid". morfogenesis atau mengganggu lapisan epitel 3D prestruktur, menunjukkan bahwa tekanan antagonis selama kultur bertanggung jawab untuk morfogenesis usus in vitro. Oleh karena itu, pendekatan praktis untuk mencapai morfogenesis yang kuat pada antarmuka epitel adalah dengan menghilangkan atau mempertahankan level antagonis Wnt dalam kompartemen basolateral dengan pembilasan aktif (misalnya, dalam platform gut-on-a-chip atau hybrid-on-a-chip) atau difusi. Media basolateral (misalnya, dari sisipan Transwell ke reservoir basolateral besar di sumur).
Dalam protokol ini, kami menyediakan metode terperinci untuk membuat perangkat mikro gut-on-a-chip dan chip hibrida yang dapat disisipkan Transwell (langkah 1-5) untuk membiakkan sel epitel usus pada membran berpori berbasis polydimethylsiloxane (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) atau membran poliester dari sisipan Transwell (langkah 6B, 7B, 8, 9) dan menginduksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10 ). Kami juga mengidentifikasi fitur seluler dan molekuler yang menunjukkan histogenesis spesifik jaringan dan diferensiasi seluler yang bergantung pada garis keturunan dengan menerapkan beberapa modalitas pencitraan (langkah 11-24). Kami menginduksi morfogenesis menggunakan sel epitel usus manusia, seperti Caco-2 atau organoid usus, dalam dua format kultur dengan perincian teknis termasuk modifikasi permukaan membran berpori, pembuatan monolayer 2D, dan biokimia usus dan Reproduksi lingkungan mikro biomekanik. in vitro. Untuk menginduksi morfogenesis 3D dari 2 D epitel monolayer, kami menghilangkan antagonis morfogen dalam kedua bentuk kultur dengan mengalirkan media ke dalam kompartemen basolateral kultur. Akhirnya, kami memberikan representasi kegunaan lapisan epitel 3D yang dapat diregenerasi yang dapat digunakan untuk memodelkan pertumbuhan epitel yang bergantung pada morfogen, ko-kultur inang-mikrobioma longitudinal, infeksi patogen, cedera inflamasi, disfungsi penghalang epitel, dan terapi berbasis probiotik Contoh.pengaruh.
Protokol kami mungkin berguna untuk berbagai ilmuwan dalam dasar (misalnya, biologi mukosa usus, biologi sel induk, dan biologi perkembangan) dan penelitian terapan (misalnya, pengujian obat praklinis, pemodelan penyakit, rekayasa jaringan, dan gastroenterologi) berdampak luas. Karena reproduktifitas dan ketahanan protokol kami untuk menginduksi morfogenesis 3D epitel usus secara in vitro, kami membayangkan bahwa strategi teknis kami dapat disebarluaskan kepada audiens yang mempelajari dinamika pensinyalan sel selama perkembangan, regenerasi, atau homeostasis usus. Selain itu , protokol kami berguna untuk menginterogasi infeksi di bawah berbagai agen infeksius seperti Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Parah Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 atau Vibrio cholerae.Penonton patologi dan patogenesis penyakit juga berguna. Penggunaan sistem mikrofisiologi usus on-chip memungkinkan kokultur longitudinal 10 dan penilaian selanjutnya dari pertahanan inang, respons imun, dan perbaikan cedera terkait patogen di saluran gastrointestinal (GI) 11. Gangguan GI lainnya yang terkait dengan sindrom usus bocor, penyakit celiac, penyakit Crohn, kolitis ulserativa, pouchitis, atau sindrom iritasi usus besar dapat disimulasikan saat lapisan epitel usus 3D disiapkan menggunakan milik pasien. Lapisan epitel usus 3D , penyakit ini termasuk atrofi vili, pemendekan kripta, kerusakan mukosa, atau gangguan penghalang epitel. Biopsi atau organoid usus turunan sel punca12,13.sel imun spesifik jaringan, 5.
Karena struktur mikro epitel 3D dapat diperbaiki dan divisualisasikan tanpa proses pemotongan, pemirsa yang bekerja pada transkriptomik spasial dan pencitraan resolusi tinggi atau resolusi tinggi mungkin tertarik dengan pemetaan kami tentang dinamika gen dan protein spatiotemporal pada relung epitel.Tertarik pada teknologi. Respons terhadap rangsangan mikroba atau kekebalan. Selanjutnya, crosstalk host-microbiome longitudinal 10, 14 yang mengoordinasikan homeostasis usus dapat dibuat dalam lapisan mukosa usus 3D dengan mengkulturkan berbagai spesies mikroba, komunitas mikroba, atau mikrobiota feses, terutama di usus-on-a-chip.dalam platform. Pendekatan ini sangat menarik bagi audiens yang mempelajari imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobioma manusia, kulturomik, dan mikrobiologi klinis yang ingin menumbuhkan mikrobiota usus yang sebelumnya tidak dikultur di laboratorium. Jika protokol morfogenesis in vitro kami dapat diadaptasi ke format kultur yang dapat diskalakan, seperti sisipan multiwell di pelat sumur 24, 96, atau 384 yang terus mengisi kompartemen basolateral, protokol juga dapat disebarluaskan kepada mereka yang mengembangkan skrining farmasi, biomedis, atau throughput tinggi atau platform validasi untuk industri makanan. Sebagai bukti prinsip, kami baru-baru ini mendemonstrasikan kelayakan sistem morfogenesis throughput tinggi multipleks yang dapat diskalakan ke format pelat 24 sumur. Selain itu, beberapa produk organ-on-a-chip telah dikomersialkan16,17,18. tingkat omic untuk menguji obat atau bioterapi Penyerapan dan pengangkutan kandidat obat dinilai menggunakan pengganti usus 3D atau menggunakan model organ-on-a-chip kustom atau komersial untuk menilai reproduktifitas proses morfogenesis usus.
Sejumlah model eksperimental yang relevan dengan manusia telah digunakan untuk mempelajari morfogenesis epitel usus, terutama karena kurangnya protokol yang dapat diimplementasikan untuk menginduksi morfogenesis 3D in vitro. Faktanya, banyak pengetahuan saat ini tentang morfogenesis usus didasarkan pada studi pada hewan (misalnya, ikan zebra20, tikus21 atau ayam22). Namun, mereka padat karya dan biaya, dapat dipertanyakan secara etis, dan yang paling penting, tidak secara tepat menentukan proses perkembangan manusia. Model ini juga sangat terbatas dalam kemampuan untuk diuji dengan cara skalabel multi-arah. Oleh karena itu, protokol kami untuk meregenerasi struktur jaringan 3D in vitro mengungguli model hewan in vivo serta model kultur sel 2D statis tradisional lainnya. faktor inang (misalnya, lapisan lendir dalam versus luar, sekresi IgA dan peptida antimikroba). Selanjutnya, morfologi epitel 3D dapat memungkinkan kita untuk memahami bagaimana mikrobiota usus menyusun komunitasnya dan secara sinergis menghasilkan metabolit mikroba (misalnya, asam lemak rantai pendek) yang membentuk organisasi seluler dan ceruk sel punca di kriptus basal. Fitur ini hanya dapat ditunjukkan ketika lapisan epitel 3D dibuat secara in vitro.
Selain metode kami untuk membuat struktur epitel usus 3D, ada beberapa metode in vitro. Kultur organoid usus adalah teknik rekayasa jaringan canggih berdasarkan budidaya sel induk usus di bawah kondisi morfogen spesifik23,24,25. Namun, penggunaan model organoid 3D untuk analisis transportasi atau kokultur host-mikrobioma seringkali menantang karena lumen usus tertutup di dalam organoid dan, oleh karena itu, pengenalan komponen luminal seperti sel mikroba atau eksogen. antigen terbatas.Akses ke lumen organoid dapat ditingkatkan dengan menggunakan mikroinjektor,26,27 tetapi metode ini invasif dan padat karya dan membutuhkan pengetahuan khusus untuk melakukannya. Selanjutnya, kultur organoid tradisional yang dipertahankan dalam perancah hidrogel dalam kondisi statis tidak secara akurat mencerminkan biomekanik in vivo yang aktif.
Pendekatan lain yang digunakan oleh beberapa kelompok penelitian menggunakan perancah hidrogel 3D prastruktur untuk meniru struktur epitel usus dengan membiakkan sel usus manusia yang terisolasi pada permukaan gel. Buat perancah hidrogel menggunakan cetakan 3D yang dicetak, digiling mikro, atau dibuat secara litograf. sel stroma dalam perancah. Namun, sifat perancah prestruktur dapat mencegah tampilan proses morfogenetik spontan itu sendiri. Model ini juga tidak memberikan aliran luminal atau interstisial yang dinamis, tidak memiliki tekanan geser cairan yang dibutuhkan sel usus untuk menjalani morfogenesis dan mendapatkan fungsi fisiologis. Studi terbaru lainnya menggunakan perancah hidrogel dalam platform mikrofluida dan struktur epitel usus berpola menggunakan teknik etsa laser. Organoid usus tikus mengikuti pola tergores untuk membentuk struktur tubular usus, dan intra aliran fluida luminal dapat direkapitulasi menggunakan modul mikrofluida. Namun, model ini tidak menunjukkan proses morfogenetik spontan atau termasuk gerakan mekanobiologis usus. Teknik pencetakan 3D dari kelompok yang sama mampu membuat tabung usus miniatur dengan proses morfogenetik spontan. Meskipun fabrikasi rumit dari segmen usus yang berbeda di dalam tabung, model ini juga kekurangan aliran fluida luminal dan deformasi mekanis. Selain itu, pengoperasian model mungkin terbatas, terutama setelah proses bioprinting selesai, mengganggu kondisi eksperimental atau sel- interaksi ke-sel. Alih-alih, protokol yang kami usulkan menyediakan morfogenesis usus spontan, tegangan geser yang relevan secara fisiologis, biomekanik yang meniru motilitas usus, aksesibilitas kompartemen apikal dan basolateral independen, dan pembuatan ulang lingkungan mikro biologis kompleks dari modularitas. Oleh karena itu, protokol morfogenesis 3D in vitro kami dapat memberikan pendekatan pelengkap untuk mengatasi tantangan metode yang ada.
Protokol kami sepenuhnya berfokus pada morfogenesis epitel 3D, dengan hanya sel epitel dalam kultur dan tidak ada jenis sel lain di sekitarnya seperti sel mesenkimal, sel endotel, dan sel imun. Lapisan epitel 3D, kompleksitas biologis tambahan seperti interaksi epitel-mesenkimal33,34, deposisi Matriks ekstraseluler (ECM)35 dan, dalam model kami, fitur crypt-villus yang menyampaikan relung sel punca dalam kripta basal masih harus dipertimbangkan lebih lanjut. Sel stroma (misalnya, fibroblas) dalam mesenkim memainkan peran kunci dalam produksi protein ECM dan regulasi morfogenesis usus in vivo35,37,38. Penambahan sel mesenkim untuk model kami meningkatkan proses morfogenetik dan efisiensi perlekatan sel. Lapisan endotel (yaitu, kapiler atau limfatik) memainkan peran penting dalam mengatur transportasi molekuler39 dan perekrutan sel imun40 di lingkungan mikro usus. Selanjutnya, komponen pembuluh darah yang dapat dihubungkan antara model jaringan adalah prasyarat ketika model jaringan dirancang untuk menunjukkan interaksi multi-organ. Oleh karena itu, sel endotel mungkin perlu dimasukkan untuk memodelkan fitur fisiologis yang lebih akurat dengan resolusi tingkat organ. Sel imun yang diturunkan dari pasien juga penting untuk menampilkan respons imun bawaan, presentasi antigen, crosstalk imun adaptif bawaan, dan imunitas spesifik jaringan dalam konteks meniru penyakit usus.
Penggunaan chip hybrid lebih mudah daripada gut-on-a-chip karena penyiapan perangkat lebih sederhana dan penggunaan insert Transwell memungkinkan kultur epitel usus yang dapat diskalakan. Namun, insert Transwell yang tersedia secara komersial dengan membran poliester tidak elastis dan tidak dapat mensimulasikan gerakan seperti peristaltik. Selain itu, kompartemen apikal insert Transwell yang ditempatkan di chip hybrid tetap diam tanpa tekanan geser pada sisi apikal. Jelas, sifat statis di kompartemen apikal jarang mengaktifkan co bakteri jangka panjang -kultur dalam chip hibrid. Meskipun kami dapat dengan kuat menginduksi morfogenesis 3D dalam sisipan Transwell saat menggunakan chip hibrid, kekurangan biomekanik yang relevan secara fisiologis dan aliran cairan apikal dapat membatasi kelayakan platform cip hibrid untuk aplikasi potensial.
Rekonstruksi skala penuh dari sumbu crypt-villus manusia dalam kultur gut-on-a-chip dan hybrid-on-a-chip belum sepenuhnya ditetapkan. Karena morfogenesis dimulai dari monolayer epitel, mikroarsitektur 3D tidak serta merta memberikan kesamaan morfologis dengan crypt in vivo. meskipun saluran atas yang lebih tinggi pada chip menyebabkan peningkatan ketinggian epitel mikro, ketinggian maksimum masih terbatas pada ~ 300–400 µm. Kedalaman sebenarnya dari kripta usus manusia di usus kecil dan besar masing-masing adalah ~ 135 µm dan ~ 400 µm, dan ketinggian vili usus kecil adalah ~ 600 µm41.
Dari sudut pandang pencitraan, pencitraan mikroarsitektur 3D beresolusi tinggi in situ mungkin terbatas pada usus pada sebuah chip, karena jarak kerja yang diperlukan dari lensa objektif ke lapisan epitel adalah beberapa milimeter. Untuk mengatasi masalah ini, tujuan yang jauh mungkin diperlukan. Selain itu, membuat bagian tipis untuk penyiapan spesimen pencitraan merupakan tantangan karena elastisitas PDMS yang tinggi. sangat menantang untuk membuka atau menghilangkan lapisan atas untuk memeriksa struktur permukaan lapisan epitel. Misalnya, dengan menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM).
Hidrofobisitas PDMS telah menjadi faktor pembatas dalam studi berbasis mikofluida yang berhubungan dengan molekul kecil hidrofobik, karena PDMS dapat mengadsorpsi molekul hidrofobik secara nonspesifik. Alternatif untuk PDMS dapat dipertimbangkan dengan bahan polimer lainnya. Sebagai alternatif, modifikasi permukaan PDMS (misalnya pelapisan dengan bahan lipofilik 42 atau poli(etilen glikol) 43 ) dapat dipertimbangkan untuk meminimalkan adsorpsi molekul hidrofobik.
Akhirnya, metode kami belum dicirikan dengan baik dalam hal menyediakan skrining throughput tinggi atau platform eksperimental ramah pengguna “satu ukuran untuk semua”. Protokol saat ini memerlukan pompa jarum suntik per perangkat mikro, yang memakan ruang dalam inkubator CO2 dan mencegah percobaan skala besar. Keterbatasan ini dapat ditingkatkan secara signifikan dengan skalabilitas format kultur inovatif (misalnya, 24-sumur, 96-sumur, atau 384-sumur sisipan berpori yang memungkinkan pengisian terus menerus dan penghapusan media basolateral).
Untuk menginduksi morfogenesis 3D epitel usus manusia secara in vitro, kami menggunakan perangkat mikrofluida chip usus yang mengandung dua saluran mikro paralel dan membran berpori elastis di antaranya untuk membuat antarmuka lumen-kapiler. Kami juga mendemonstrasikan penggunaan perangkat mikrofluida saluran tunggal (sebuah chip hibrid) yang menyediakan aliran basolateral kontinu di bawah lapisan epitel terpolarisasi yang ditanam pada sisipan Transwell. Di kedua platform, morfogenesis berbagai sel epitel usus manusia dapat ditunjukkan dengan menerapkan manipulasi arah aliran untuk menghilangkan morfogen antagonis dari kompartemen basolateral. Seluruh prosedur eksperimental (Gambar 1) terdiri dari lima bagian: (i) pembuatan mikro chip usus atau chip hibrida yang dapat dimasukkan Transwell (langkah 1-5; Kotak 1), (ii) persiapan sel epitel usus (sel Caco-2) atau organoid usus manusia;kotak 2-5), (iii) kultur sel epitel usus pada chip usus atau chip hibrida (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D in vitro (langkah 10) dan (v) ) untuk mengkarakterisasi mikrostruktur epitel 3D (langkah 11-24). atau kontrol prosedural.
Kami menggunakan dua platform kultur yang berbeda: gut-on-a-chip dengan saluran lurus atau saluran berbelit-belit nonlinier, atau chip hibrida yang mengandung sisipan Transwell (TW) dalam perangkat mikofluida, dibuat seperti yang dijelaskan dalam Kotak 1, dan langkah 1 -5. "Pembuatan Perangkat" menunjukkan langkah utama dalam membuat chip tunggal atau chip hibrida. "Budaya Sel Epitel Usus Manusia" menjelaskan sumber sel (Caco-2 atau organoid usus manusia) dan prosedur kultur yang digunakan dalam protokol ini. "In vitro morphogenesis” menunjukkan langkah-langkah keseluruhan di mana Caco-2 atau sel epitel yang diturunkan dari organoid dikultur pada chip usus atau pada sisipan Transwell dari chip hibrida, diikuti dengan induksi morfogenesis 3D dan pembentukan struktur epitel yang dikarakterisasi. Nomor langkah program atau nomor kotak ditampilkan di bawah setiap panah. Aplikasi ini memberikan contoh bagaimana lapisan epitel usus yang terbentuk dapat digunakan, misalnya, dalam karakterisasi diferensiasi sel, studi fisiologi usus, pembentukan ekosistem inang-mikrobioma, dan pemodelan penyakit. Gambar imunofluoresensi dalam "Diferensiasi Sel" menunjukkan nukleus, F-aktin dan MUC2 yang diekspresikan dalam lapisan epitel Caco-2 3D yang dihasilkan pada chip usus. Pensinyalan MUC2 hadir dalam sel goblet dan lendir yang dikeluarkan dari permukaan mukosa. Gambar fluoresen dalam Fisiologi Gut menunjukkan lendir yang diproduksi dengan pewarnaan untuk asam sialat dan residu N-asetilglukosamin menggunakan aglutinin kuman gandum fluoresen. Dua gambar yang tumpang tindih dalam "Host- Microbe Co-Cultures” menunjukkan ko-kultur inang-mikrobioma representatif dalam usus pada sebuah chip. Panel kiri menunjukkan kultur bersama E. coli yang mengekspresikan protein fluoresen hijau (GFP) dengan sel epitel 3D Caco-2 yang direkayasa secara mikro. Panel kanan menunjukkan lokalisasi GFP E. coli yang dikultur bersama dengan sel epitel Caco-2 3D, diikuti dengan pewarnaan imunofluoresensi dengan F-aktin (merah) dan nuklei (biru). Pemodelan penyakit mengilustrasikan s usus yang sehat versus bocor dalam keripik peradangan usus di bawah tantangan fisiologis dengan antigen bakteri (misalnya, lipopolisakarida, LPS) dan sel kekebalan (misalnya, PBMC;hijau). Sel Caco-2 dikultur untuk membentuk lapisan epitel 3D. Bilah skala, 50 µm. Gambar di baris bawah: “Diferensiasi sel” diadaptasi dengan izin dari referensi.2.Pers Universitas Oxford;Direproduksi dengan izin dari Ref.5.NAS;“Host-Microbe Co-Culture” diadaptasi dengan izin dari ref.3.NAS;"Pemodelan Penyakit" diadaptasi dengan izin dari referensi.5.NAS.
Chip gut-on-chip dan hybrid dibuat menggunakan replika PDMS yang dibongkar dari cetakan silikon dengan litografi lunak1,44 dan dipola dengan SU-8. Desain saluran mikro di setiap chip ditentukan dengan mempertimbangkan hidrodinamika seperti tegangan geser dan tekanan hidrodinamik1,4,12. (Extended Data Fig. 1b) yang mencakup sepasang microchannels melengkung untuk menginduksi Peningkatan waktu tinggal cairan, pola aliran nonlinier, dan deformasi multiaksial dari sel yang dikultur (Gbr. 2a-f) 12. Ketika biomekanik usus yang lebih kompleks perlu dibuat ulang, kompleks gut-on-a-chips dapat dipilih. Gut-Chip asli, terlepas dari jenis sel yang dikultur. Oleh karena itu, untuk menginduksi morfogenesis 3D, desain usus on-chip linier dan kompleks dapat dipertukarkan. Replika PDMS yang disembuhkan pada cetakan silikon dengan pola SU-8 memberikan fitur negatif setelah demolding (Gbr.2a). Untuk membuat usus pada sebuah chip, lapisan PDMS atas yang disiapkan diikat secara berurutan ke film PDMS berpori dan kemudian disejajarkan dengan lapisan PDMS yang lebih rendah dengan ikatan yang tidak dapat diubah menggunakan pengolah korona (Gbr. 2b-f). permukaan replika PDMS dan kaca dengan plasma oksigen atau perawatan korona. Setelah sterilisasi perangkat mikrofabrikasi yang terpasang pada tabung silikon, pengaturan perangkat siap untuk melakukan morfogenesis 3D epitel usus (Gambar 2g).
a, ilustrasi skematis dari persiapan bagian-bagian PDMS dari cetakan silikon bermotif su- Brane.D, serangkaian foto komponen PDMS atas dan bawah dan perangkat usus yang dirakit. IP untuk kultur sel mikrofluida. Usus buatan pada chip yang dirakit dengan tabung silikon dan jarum suntik ditempatkan pada penutup penutup. Perangkat chip ditempatkan pada tutup cawan petri 150 mm untuk pemrosesan. Sel -sel epitel usus dimasukkan ke dalam chip hibrida untuk menginduksi morfogenesis 3D usus. Media ini diperfusi melalui saluran mikro di bawah lapisan sel yang ditetapkan pada insert transwell. Bilah skala, 1 cm.h dicetak ulang dengan izin dari referensi.4.Elsevier.
Dalam protokol ini, garis sel Caco-2 dan organoid usus digunakan sebagai sumber epitel (Gbr. 3a). Kedua jenis sel dikultur secara independen (Kotak 2 dan Kotak 5) dan digunakan untuk menyemai saluran mikro yang dilapisi ECM dari usus on-chip atau sisipan Transwell. Ketika sel-sel konfluen (> 95% cakupan dalam labu), sel Caco-2 yang dikultur secara rutin (antara saluran 10 dan 50) dalam T-flask dipanen untuk mempersiapkan suspensi sel terdisosiasi oleh cairan trypsinization (kotak 2). Organoid usus manusia dari biopsi usus atau reseksi bedah dikultur dalam kubah perancah Matrigel dalam pelat 24-sumur untuk mendukung lingkungan mikro struktural. Media yang mengandung morfogen esensial (seperti Wnt, R-spondin, dan Noggin) dan faktor pertumbuhan yang disiapkan seperti yang dijelaskan dalam Kotak 3 ditambahkan setiap hari sampai organoid tumbuh berdiameter ~ 500 µm. Penuh Organoid yang tumbuh dipanen dan dipisahkan menjadi sel tunggal untuk disemai ke dalam usus atau sisipan Transwell pada chip (Kotak 5). Seperti yang telah kami laporkan sebelumnya, organoid ini dapat dibedakan menurut jenis penyakit12,13 (misalnya kolitis ulserativa, penyakit Crohn, kanker kolorektal, atau donor normal), lokasi lesi (misalnya lesi versus area non-lesi) dan lokasi gastrointestinal di saluran (misalnya duodenum, jejunum, ileum, sekum, usus besar, atau rektum ). Kami menyediakan protokol yang dioptimalkan dalam Kotak 5 untuk membiakkan organoid kolon (koloid) yang biasanya memerlukan konsentrasi morfogen yang lebih tinggi daripada organoid usus kecil.
a, Alur kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam chip usus. Epitel usus manusia Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk mendemonstrasikan morfogenesis 3D. Sel-sel epitel yang diisolasi diunggulkan dalam perangkat gut-on-a-chip yang disiapkan (persiapan chip). Setelah sel diunggulkan (diunggulkan) dan dilekatkan (dilekatkan) ke membran berpori PDMS pada hari ke 0 (D0), aliran apikal (AP) dimulai dan dipertahankan selama 2 hari pertama (aliran, AP, D0-D2). Aliran basolateral (BL) juga dimulai bersamaan dengan gerakan peregangan siklik (peregangan, aliran, AP, dan BL) ketika monolayer 2D lengkap terbentuk. Morfogenesis 3D usus terjadi secara spontan setelah 5 hari kultur mikrofluida (morfogenesis, D5). Gambar kontras fase menunjukkan morfologi perwakilan sel Caco-2 pada setiap langkah percobaan atau titik waktu (grafik batang, 100 µm). Empat diagram skematik ilustrasi kaskade yang sesuai dari morfogenesis usus (kanan atas). Panah putus-putus dalam skema mewakili arah aliran fluida.b, gambar SEM menunjukkan topologi permukaan epitel Caco-2 3D yang sudah mapan (kiri). Inset yang menyoroti area yang diperbesar (kotak putus-putus putih) menunjukkan mikrovili yang diregenerasi pada lapisan Caco-2 3D (kanan).c, Tampilan frontal horizontal dari Caco-2 3D yang sudah mapan, claudin (ZO-1, merah) dan kontinu sikat batas membran berlabel F-aktin (hijau) dan nuklei (biru) Visualisasi confocal imunofluoresensi sel epitel pada chip usus. Panah yang menunjuk ke skema tengah menunjukkan lokasi bidang fokus untuk setiap tampilan confocal.d, Perjalanan waktu perubahan morfologis dalam organoid yang dikultur pada chip yang diperoleh dengan mikroskop kontras fase pada hari ke 3, 7, 9, 11, dan 13. Inset (kanan atas) menunjukkan perbesaran tinggi dari gambar yang disediakan. e, fotomikrograf DIC dari epitel 3D organoid yang terbentuk di usus pada irisan yang diambil pada hari ke 7.f, Gambar imunofluoresensi yang dilapis menunjukkan penanda untuk sel punca (LGR5;magenta), sel goblet (MUC2; hijau), F-aktin (abu-abu) dan inti (cyan) tumbuh pada chip usus selama 3 hari, masing-masing (Kiri) dan organoid 13 hari (tengah) pada lapisan epitel. Lihat juga Data yang Diperpanjang Gambar 3, yang menyoroti pensinyalan LGR5 tanpa pensinyalan MUC2. Gambar fluoresensi menunjukkan struktur mikro epitel (kanan) dari epitel organoid 3D yang terbentuk di usus pada sebuah chip dengan menodai membran plasma dengan Pewarna CellMask (kanan) pada kultur hari ke-13. Bilah skala adalah 50 μm kecuali dinyatakan lain.b Dicetak ulang dengan izin dari referensi.2.Pers Universitas Oxford;c Diadaptasi dengan izin dari Referensi.2.Pers Universitas Oxford;e dan f diadaptasi dengan izin referensi.12 Di bawah Lisensi Creative Commons CC BY 4.0.
Dalam usus pada sebuah chip, perlu untuk memodifikasi permukaan hidrofobik dari membran berpori PDMS untuk pelapisan ECM yang berhasil. Dalam protokol ini, kami menerapkan dua metode berbeda untuk memodifikasi hidrofobisitas membran PDMS. Untuk membiakkan sel Caco-2, aktivasi permukaan dengan perlakuan UV/ozon saja sudah cukup untuk mengurangi hidrofobisitas permukaan PDMS, melapisi ECM dan menempelkan sel Caco-2 ke membran PDMS. Namun, kultur mikrofluida epitel organoid membutuhkan fungsionalisasi permukaan berbasis kimia untuk mencapai pengendapan protein ECM yang efisien dengan menerapkan polietilenimin (PEI) dan glutaraldehida ke saluran mikro PDMS secara berurutan. Setelah modifikasi permukaan, protein ECM disimpan untuk menutupi permukaan PDMS yang difungsikan dan kemudian dimasukkan ke dalam epitel organoid yang diisolasi. Setelah sel dilekatkan, kultur sel mikrofluida dimulai dengan mengalirkan hanya media ke saluran mikro bagian atas sampai sel membentuk lapisan tunggal yang lengkap, sementara saluran mikro yang lebih rendah mempertahankan kondisi statis. Metode yang dioptimalkan untuk aktivasi permukaan dan pelapisan ECM ini memungkinkan perlekatan epitel organoid untuk menginduksi morfogenesis 3D pada permukaan PDMS.
Kultur Transwell juga membutuhkan lapisan ECM sebelum penyemaian sel;namun, kultur Transwell tidak memerlukan langkah-langkah pretreatment yang rumit untuk mengaktifkan permukaan insert berpori. Untuk menumbuhkan sel Caco-2 pada insert Transwell, pelapisan ECM pada insert berpori mempercepat perlekatan sel Caco-2 yang terdisosiasi (<1 jam) dan pembentukan penghalang persimpangan ketat (<1-2 hari). monolayer dengan integritas penghalang. Kultur Transwell dilakukan dalam pelat 24-sumur tanpa menggunakan chip hibrida.
Morfogenesis 3D in vitro dapat dimulai dengan menerapkan aliran cairan ke aspek basolateral dari lapisan epitel yang sudah mapan. Dalam usus pada sebuah chip, morfogenesis epitel dimulai ketika media disalurkan ke saluran mikro atas dan bawah (Gbr. 3a). biasanya menerapkan aliran ganda dalam usus pada sebuah chip. Dalam chip hibrida, sisipan Transwell yang mengandung monolayer epitel dimasukkan ke dalam chip hibrida. Kemudian, media diaplikasikan di bawah sisi basolateral sisipan Transwell berpori melalui saluran mikro. Morfogenesis usus terjadi 3-5 hari setelah inisiasi aliran basolateral di kedua platform kultur.
Fitur morfologis lapisan epitel 3D yang direkayasa mikro dapat dianalisis dengan menerapkan berbagai modalitas pencitraan, termasuk mikroskop fase kontras, mikroskop kontras interferensi diferensial (DIC), SEM, atau mikroskop confocal imunofluoresensi (Gambar 3 dan 4). Kontras fase atau pencitraan DIC dapat dengan mudah dilakukan kapan saja selama kultur untuk memantau bentuk dan penonjolan lapisan epitel 3D. Karena transparansi optik PDMS dan film poliester, baik usus-on- platform a-chip dan hybrid chip dapat memberikan pencitraan real-time in situ tanpa perlu membagi atau membongkar perangkat. Saat melakukan pencitraan imunofluoresensi (Gambar 1, 3c, f dan 4b, c), sel biasanya difiksasi dengan 4% (berat/vol) paraformaldehyde (PFA), diikuti oleh Triton X-100 dan 2% (berat/vol) ) bovine serum albumin (BSA), secara berurutan.Tergantung pada jenis sel, fiksatif yang berbeda, permeabilizer, dan agen pemblokiran dapat digunakan. Antibodi primer yang menargetkan penanda sel atau wilayah yang bergantung garis keturunan digunakan untuk menyorot sel yang diimobilisasi in situ pada chip, diikuti oleh antibodi sekunder bersama dengan pewarna counterstain yang menargetkan baik nukleus (misalnya, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) atau F-actin (misalnya, phalloidin berlabel fluoresensi). Pencitraan langsung berbasis fluoresensi juga dapat dilakukan in situ untuk mendeteksi produksi lendir (Gbr. 1).1, "Diferensiasi sel" dan "fisiologi usus"), kolonisasi acak sel mikroba (Gbr. 1, "kokultur mikroba inang"), perekrutan sel imun (Gbr. 1, 'Pemodelan Penyakit') atau kontur morfologi epitel 3D (Gbr. 3c, f dan 4b, c). Saat memodifikasi usus pada chip untuk memisahkan lapisan atas dari lapisan saluran mikro yang lebih rendah, seperti yang dijelaskan dalam ref. , morfologi epitel 3D serta mikrovili pada batas sikat apikal dapat divisualisasikan oleh SEM (Gbr. 3b). Ekspresi penanda diferensiasi dapat dinilai dengan melakukan PCR5 kuantitatif atau sekuensing RNA sel tunggal. Dalam hal ini, lapisan 3D sel epitel yang ditanam dalam chip usus atau chip hibrida dipanen dengan trypsinization dan kemudian digunakan untuk analisis molekuler atau genetik.
a, Alur kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam chip hibrida. Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk mendemonstrasikan morfogenesis 3D dalam platform chip hibrida. Sel epitel yang dipisahkan diunggulkan dalam sisipan Transwell yang disiapkan (persiapan TW; lihat gambar di bawah). monolayer sel epitel diintegrasikan ke dalam chip hibrida untuk memperkenalkan aliran basolateral (Aliran, BL), yang pada akhirnya mengarah pada pembentukan lapisan epitel 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fase menunjukkan fitur morfologis sel epitel organ manusia yang berasal dari donor normal (garis C103) usus besar yang naik pada setiap langkah percobaan atau titik waktu. Skema di lapisan atas menggambarkan konfigurasi eksperimental untuk setiap langkah.b, Chip hibrida (skema kiri) dapat mengarah pada morfogenesis 3D epi organoid sel sel dengan pandangan mikroskop confocal top-down diambil pada posisi Z yang berbeda (atas, tengah, dan bawah;lihat skema kanan dan garis putus-putus yang sesuai).menunjukkan karakteristik morfologis yang jelas.F-aktin (cyan), nukleus (abu-abu).c, Mikrograf confocal fluoresensi (tampilan sudut 3D) dari sel epitel turunan organoid yang dikultur dalam Transwell statis (TW; inset dalam kotak putus-putus putih) versus chip hibrida (tembakan penuh terbesar) masing-masing membandingkan morfologi 2D versus 3D. Sepasang tampilan potongan vertikal 2D (inset di sudut kanan atas; "XZ") juga menunjukkan fitur 2D dan 3D .Scale bar, 100 µm.c Dicetak ulang dengan izin dari referensi.4.Elsevier.
Kontrol dapat disiapkan dengan membiakkan sel yang sama (Caco-2 atau sel epitel organoid usus) ke dalam monolayer dua dimensi dalam kondisi kultur statis konvensional. Terutama, penipisan nutrisi dapat terjadi karena kapasitas volume yang terbatas dari saluran mikro (yaitu ~ 4 µL di saluran atas pada desain chip usus asli). Oleh karena itu, morfologi epitel sebelum dan sesudah penerapan aliran basolateral juga dapat dibandingkan.
Proses litografi lunak harus dilakukan di ruangan yang bersih. Untuk setiap lapisan pada chip (lapisan atas dan bawah dan membran) dan chip hibrida, photomask berbeda digunakan dan dibuat pada wafer silikon terpisah karena ketinggian saluran mikro berbeda. Ketinggian target saluran mikro bagian atas dan bawah pada chip masing-masing adalah 500 µm dan 200 µm. Tinggi target saluran dari chip hibrida adalah 200 µm.
Tempatkan wafer silikon 3 inci di piring dengan aseton. Putar perlahan piring selama 30 detik, lalu keringkan wafer. Pindahkan wafer ke piring dengan IPA, lalu putar piring selama 30 detik hingga bersih.
Larutan piranha (campuran hidrogen peroksida dan asam sulfat pekat, 1:3 (vol/vol)) secara opsional dapat digunakan untuk memaksimalkan penghilangan residu organik dari permukaan wafer silikon.
Larutan piranha sangat korosif dan menghasilkan panas.Tindakan pencegahan keamanan tambahan diperlukan.Untuk pembuangan limbah, biarkan larutan mendingin dan pindahkan ke wadah limbah yang bersih dan kering.Gunakan wadah sekunder dan beri label wadah limbah dengan benar.Harap ikuti pedoman keselamatan fasilitas untuk prosedur yang lebih terperinci.
Dehidrasi wafer dengan menempatkannya pada hot plate 200 °C selama 10 menit. Setelah dehidrasi, wafer dikocok lima kali di udara hingga dingin.
Tuangkan ~10 g photoresist SU-8 2100 ke bagian tengah wafer silikon yang telah dibersihkan. Gunakan pinset untuk menyebarkan photoresist secara merata pada wafer. Sesekali letakkan wafer di atas hot plate 65°C agar photoresist tidak terlalu lengket dan lebih mudah menyebar. Jangan letakkan wafer langsung di atas hot plate.
SU-8 didistribusikan secara merata pada wafer dengan menjalankan spin coating. Programkan rotasi masuk SU-8 selama 5–10 detik untuk merambat pada 500 rpm dengan akselerasi 100 rpm/dtk. Atur putaran utama untuk ketebalan 200 µm dengan pola pada 1.500 rpm, atau capai ketebalan 250 µm (buat ketinggian 500 µm untuk lapisan atas usus pada chip; lihat “Langkah kritis” di bawah ) disetel pada akselerasi 300 rpm/dtk 30 detik pada 1.200 rpm.
Kecepatan putaran utama dapat diatur menurut ketebalan target pola SU-8 pada wafer silikon.
Untuk membuat pola SU-8 dengan tinggi 500 µm untuk lapisan atas usus pada chip, langkah-langkah spin coating dan soft bake dari Kotak ini (langkah 7 dan 8) diulangi secara berurutan (lihat langkah 9) untuk menghasilkan dua lapisan 250 µm.
Panggang lembut wafer berlapis SU-8 dengan hati-hati menempatkan wafer di atas hot plate pada suhu 65 °C selama 5 menit, lalu alihkan pengaturan ke 95 °C dan inkubasi selama 40 menit lagi.
Untuk mencapai ketinggian 500 μm dari pola SU-8 di microchannel atas, ulangi langkah 7 dan 8 untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 μm.
Dengan menggunakan UV Mask Aligner, lakukan uji lampu sesuai petunjuk produsen untuk menghitung waktu pemaparan wafer.(waktu pemaparan, ms) = (dosis pemaparan, mJ/cm2)/(daya lampu, mW/cm2).
Setelah menentukan waktu pemaparan, letakkan photomask pada penahan masker penyelaras masker UV dan letakkan photomask pada wafer berlapis SU-8.
Tempatkan permukaan cetakan photomask langsung pada sisi wafer silikon yang dilapisi SU-8 untuk meminimalkan dispersi UV.
Paparkan wafer dan photomask berlapis SU-8 secara vertikal ke sinar UV 260 mJ/cm2 selama waktu pemaparan yang telah ditentukan (lihat langkah 10 kotak ini).
Setelah paparan UV, wafer silikon berlapis SU-8 dipanggang pada suhu 65°C selama 5 menit dan 95°C selama 15 menit pada setiap hot plate untuk membuat pola dengan ketinggian 200 μm. Perpanjang waktu pasca-panggang pada suhu 95 °C hingga 30 menit untuk membuat pola dengan ketinggian 500 μm.
Pengembang dituangkan ke dalam piring kaca, dan wafer panggang ditempatkan di piring.Volume pengembang SU-8 dapat bervariasi tergantung pada ukuran pelat kaca.Pastikan untuk menggunakan pengembang SU-8 yang cukup untuk menghilangkan SU-8 yang tidak terpapar sepenuhnya.Misalnya, saat menggunakan piring kaca berdiameter 150 mm dengan kapasitas 1 L, gunakan ~300 mL pengembang SU-8.Kembangkan cetakan selama 25 menit dengan putaran lembut sesekali.
Bilas cetakan yang dikembangkan dengan ~10 mL pengembang segar diikuti dengan IPA dengan menyemprotkan larutan menggunakan pipet.
Tempatkan wafer dalam pembersih plasma dan paparkan ke plasma oksigen (gas atmosfer, tekanan target 1 × 10−5 Torr, daya 125 W) selama 1,5 menit.
Tempatkan wafer dalam desikator vakum dengan slide kaca di dalamnya.Wafer dan slide dapat ditempatkan berdampingan.Jika desikator vakum dibagi menjadi beberapa lapisan oleh sebuah piring, tempatkan slide di ruang bawah dan wafer di ruang atas.Teteskan 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)larutan silan pada slide kaca dan terapkan vakum untuk silanisasi.
Cairkan vial sel Caco-2 beku dalam penangas air 37°C, lalu pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam labu T75 yang berisi 15 mL media Caco-2 37°C yang telah dihangatkan sebelumnya.
Untuk melewatkan sel Caco-2 pada pertemuan ~90%, media Caco-2 hangat pertama, PBS, dan 0,25% trypsin/1 mM EDTA dalam penangas air 37°C.
Aspirasi media dengan aspirasi vakum. Cuci sel dua kali dengan 5 mL PBS hangat dengan mengulangi aspirasi vakum dan tambahkan PBS baru.