Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Evolusi parasit mikroba melibatkan perlawanan antara seleksi alam, yang menyebabkan parasit berkembang, dan pergeseran genetik, yang menyebabkan parasit kehilangan gen dan mengakumulasi mutasi yang merusak.Di sini, untuk memahami bagaimana penangkal ini terjadi pada skala makromolekul tunggal, kami menjelaskan struktur cryo-EM dari ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisme eukariotik dengan salah satu genom terkecil di alam.Pengurangan ekstrim rRNA dalam ribosom E. cuniculi disertai dengan perubahan struktural yang belum pernah terjadi sebelumnya, seperti evolusi penghubung rRNA yang sebelumnya tidak diketahui dan rRNA tanpa tonjolan.Selain itu, ribosom E. cuniculi selamat dari hilangnya fragmen rRNA dan protein dengan mengembangkan kemampuan untuk menggunakan molekul kecil sebagai tiruan struktural dari fragmen dan protein rRNA yang terdegradasi.Secara keseluruhan, kami menunjukkan bahwa struktur molekuler yang telah lama dianggap tereduksi, merosot, dan tunduk pada mutasi yang melemahkan memiliki sejumlah mekanisme kompensasi yang membuatnya tetap aktif meskipun terjadi kontraksi molekuler yang ekstrem.
Karena sebagian besar kelompok parasit mikroba memiliki alat molekuler yang unik untuk mengeksploitasi inangnya, kita sering harus mengembangkan terapi yang berbeda untuk kelompok parasit yang berbeda1,2.Namun, bukti baru menunjukkan bahwa beberapa aspek evolusi parasit bersifat konvergen dan sebagian besar dapat diprediksi, menunjukkan dasar potensial untuk intervensi terapeutik yang luas pada parasit mikroba3,4,5,6,7,8,9.
Pekerjaan sebelumnya telah mengidentifikasi tren evolusi umum pada parasit mikroba yang disebut pengurangan genom atau peluruhan genom10,11,12,13.Penelitian saat ini menunjukkan bahwa ketika mikroorganisme melepaskan gaya hidup bebas mereka dan menjadi parasit intraseluler (atau endosimbion), genom mereka mengalami metamorfosis yang lambat namun menakjubkan selama jutaan tahun9,11.Dalam proses yang dikenal sebagai peluruhan genom, parasit mikroba mengakumulasi mutasi yang merusak yang mengubah banyak gen yang sebelumnya penting menjadi pseudogen, yang menyebabkan hilangnya gen secara bertahap dan keruntuhan mutasi14,15.Keruntuhan ini dapat menghancurkan hingga 95% gen dalam organisme intraseluler tertua dibandingkan dengan spesies yang hidup bebas yang berkerabat dekat.Dengan demikian, evolusi parasit intraseluler adalah tarik-menarik antara dua kekuatan yang berlawanan: seleksi alam Darwinian, yang mengarah pada peningkatan parasit, dan runtuhnya genom, membuat parasit terlupakan.Bagaimana parasit berhasil muncul dari tarik-menarik ini dan mempertahankan aktivitas struktur molekulnya masih belum jelas.
Meskipun mekanisme peluruhan genom tidak sepenuhnya dipahami, hal itu tampaknya terjadi terutama karena penyimpangan genetik yang sering terjadi.Karena parasit hidup dalam populasi kecil, aseksual, dan terbatas secara genetik, mereka tidak dapat secara efektif menghilangkan mutasi yang merusak yang terkadang terjadi selama replikasi DNA.Hal ini menyebabkan akumulasi mutasi berbahaya yang tidak dapat diubah dan pengurangan genom parasit.Akibatnya, parasit tidak hanya kehilangan gen yang tidak lagi diperlukan untuk bertahan hidup di lingkungan intraseluler.Ketidakmampuan populasi parasit untuk secara efektif menghilangkan mutasi merusak sporadis yang menyebabkan mutasi ini terakumulasi di seluruh genom, termasuk gen terpenting mereka.
Sebagian besar pemahaman kita saat ini tentang pengurangan genom hanya didasarkan pada perbandingan urutan genom, dengan sedikit perhatian pada perubahan molekul aktual yang melakukan fungsi rumah tangga dan berfungsi sebagai target obat potensial.Studi perbandingan telah menunjukkan bahwa beban mutasi mikroba intraseluler yang merusak tampaknya mempengaruhi protein dan asam nukleat untuk salah melipat dan berkumpul, membuat mereka lebih bergantung dan hipersensitif terhadap panas19,20,21,22,23.Selain itu, berbagai parasit—evolusi independen yang terkadang terpisah hingga 2,5 miliar tahun—mengalami kehilangan pusat kontrol kualitas yang serupa dalam sintesis protein5,6 dan mekanisme perbaikan DNA24.Namun, sedikit yang diketahui tentang dampak gaya hidup intraseluler pada semua sifat makromolekul seluler lainnya, termasuk adaptasi molekuler terhadap peningkatan beban mutasi yang merusak.
Dalam karya ini, untuk lebih memahami evolusi protein dan asam nukleat mikroorganisme intraseluler, kami menentukan struktur ribosom parasit intraseluler Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi adalah organisme mirip jamur yang termasuk dalam kelompok mikrosporidia parasit yang memiliki genom eukariotik yang sangat kecil dan karenanya digunakan sebagai organisme model untuk mempelajari peluruhan genom 25,26,27,28,29,30.Baru-baru ini, struktur ribosom cryo-EM ditentukan untuk genom Microsporidia, Paranosema locustae, dan Vairimorpha necatrix31,32 yang tereduksi sedang (~ genom 3,2 Mb).Struktur ini menunjukkan bahwa beberapa hilangnya amplifikasi rRNA dikompensasi oleh pengembangan kontak baru antara protein ribosom tetangga atau akuisisi protein ribosom msL131,32 baru.Spesies Encephalitozoon (genom ~2,5 juta bp), bersama dengan Ordospora kerabat terdekat mereka, menunjukkan tingkat tertinggi pengurangan genom pada eukariota – mereka memiliki kurang dari 2000 gen penyandi protein, dan diharapkan bahwa ribosom mereka tidak hanya tanpa fragmen ekspansi rRNA (fragmen rRNA yang membedakan ribosom eukariotik dari ribosom bakteri) juga memiliki empat protein ribosom karena kurangnya homolog dalam genom E. cuniculi 26,27,28.Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa ribosom E. cuniculi dapat mengungkapkan strategi yang sebelumnya tidak diketahui untuk adaptasi molekuler terhadap peluruhan genom.
Struktur cryo-EM kami mewakili ribosom sitoplasma eukariotik terkecil yang akan dicirikan dan memberikan wawasan tentang bagaimana tingkat tertinggi pengurangan genom memengaruhi struktur, perakitan, dan evolusi mesin molekuler yang merupakan bagian integral dari sel.Kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi melanggar banyak prinsip pelipatan RNA dan perakitan ribosom yang dilestarikan secara luas, dan menemukan protein ribosom baru yang sebelumnya tidak dikenal.Secara tidak terduga, kami menunjukkan bahwa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan kemampuan untuk mengikat molekul kecil, dan berhipotesis bahwa pemotongan rRNA dan protein memicu inovasi evolusioner yang pada akhirnya dapat memberikan kualitas yang berguna pada ribosom.
Untuk meningkatkan pemahaman kami tentang evolusi protein dan asam nukleat dalam organisme intraseluler, kami memutuskan untuk mengisolasi spora E. cuniculi dari kultur sel mamalia yang terinfeksi untuk memurnikan ribosomnya dan menentukan struktur ribosom ini.Sulit untuk mendapatkan mikrosporidia parasit dalam jumlah besar karena mikrosporidia tidak dapat dibiakkan dalam media nutrisi.Sebaliknya, mereka tumbuh dan bereproduksi hanya di dalam sel inang.Oleh karena itu, untuk mendapatkan biomassa E. cuniculi untuk pemurnian ribosom, kami menginfeksi garis sel ginjal mamalia RK13 dengan spora E. cuniculi dan membiakkan sel yang terinfeksi ini selama beberapa minggu untuk memungkinkan E. cuniculi tumbuh dan berkembang biak.Dengan menggunakan lapisan tunggal sel yang terinfeksi berukuran sekitar setengah meter persegi, kami dapat memurnikan sekitar 300 mg spora Microsporidia dan menggunakannya untuk mengisolasi ribosom.Kami kemudian mengganggu spora yang dimurnikan dengan manik-manik kaca dan mengisolasi ribosom mentah menggunakan fraksinasi polietilen glikol bertahap dari lisat.Ini memungkinkan kami memperoleh sekitar 300 µg ribosom E. cuniculi mentah untuk analisis struktural.
Kami kemudian mengumpulkan gambar cryo-EM menggunakan sampel ribosom yang dihasilkan dan memproses gambar ini menggunakan masker yang sesuai dengan subunit ribosom besar, kepala subunit kecil, dan subunit kecil.Selama proses ini, kami mengumpulkan gambar sekitar 108.000 partikel ribosom dan menghitung gambar cryo-EM dengan resolusi 2,7 Å (Gambar Tambahan 1-3).Kami kemudian menggunakan gambar cryoEM untuk memodelkan rRNA, protein ribosom, dan faktor hibernasi Mdf1 yang terkait dengan ribosom E. cuniculi (Gbr. 1a, b).
struktur ribosom E. cuniculi dalam kompleks dengan faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP).b Peta faktor hibernasi Mdf1 yang terkait dengan ribosom E. cuniculi.c Peta struktur sekunder membandingkan rRNA yang dipulihkan pada spesies Microsporidian dengan struktur ribosom yang diketahui.Panel menunjukkan lokasi fragmen rRNA yang diamplifikasi (ES) dan situs aktif ribosom, termasuk situs decoding (DC), loop sarcinicin (SRL), dan pusat transferase peptidil (PTC).d Kepadatan elektron yang sesuai dengan pusat transferase peptidil dari ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa situs katalitik ini memiliki struktur yang sama pada parasit E. cuniculi dan inangnya, termasuk H. sapiens.e, f Kepadatan elektron yang sesuai dari pusat decoding (e) dan struktur skematik dari pusat decoding (f) menunjukkan bahwa E. cuniculi memiliki residu U1491, bukan A1491 (penomoran E. coli) di banyak eukariota lainnya.Perubahan ini menunjukkan bahwa E. cuniculi mungkin sensitif terhadap antibiotik yang menargetkan situs aktif ini.
Berbeda dengan struktur sebelumnya dari ribosom V. necatrix dan P. locustae (kedua struktur mewakili keluarga mikrosporidia Nosematidae yang sama dan sangat mirip satu sama lain), 31,32 ribosom E. cuniculi mengalami banyak proses rRNA dan fragmentasi protein.Denaturasi lebih lanjut (Gambar Tambahan 4-6).Dalam rRNA, perubahan yang paling mencolok termasuk hilangnya total fragmen 25S rRNA ES12L yang diamplifikasi dan degenerasi parsial heliks h39, h41, dan H18 (Gbr. 1c, Gbr. Tambahan 4).Di antara protein ribosom, perubahan yang paling mencolok termasuk hilangnya protein eS30 dan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, dan eS7 (Gambar Tambahan 4, 5).
Dengan demikian, pengurangan ekstrim genom spesies Encephalotozoon / Ordospora tercermin dalam struktur ribosomnya: ribosom E. cuniculi mengalami kehilangan kandungan protein yang paling dramatis dalam ribosom sitoplasma eukariotik yang tunduk pada karakterisasi struktural, dan mereka bahkan tidak memiliki rRNA dan fragmen protein yang secara luas dilestarikan tidak hanya pada eukariota, tetapi juga dalam tiga domain kehidupan.Struktur ribosom E. cuniculi memberikan model molekuler pertama untuk perubahan ini dan mengungkapkan peristiwa evolusi yang telah diabaikan oleh genomik komparatif dan studi tentang struktur biomolekuler intraseluler (Gambar Tambahan 7).Di bawah ini, kami menjelaskan masing-masing peristiwa ini beserta kemungkinan asal usul evolusinya dan dampak potensialnya terhadap fungsi ribosom.
Kami kemudian menemukan bahwa, selain pemotongan rRNA yang besar, ribosom E. cuniculi memiliki variasi rRNA di salah satu situs aktifnya.Meskipun pusat transferase peptidil dari ribosom E. cuniculi memiliki struktur yang sama dengan ribosom eukariotik lainnya (Gbr. 1d), pusat decoding berbeda karena variasi urutan pada nukleotida 1491 (penomoran E. coli, Gbr. 1e, f).Pengamatan ini penting karena situs decoding ribosom eukariotik biasanya mengandung residu G1408 dan A1491 dibandingkan dengan residu tipe bakteri A1408 dan G1491.Variasi ini mendasari kepekaan yang berbeda dari ribosom bakteri dan eukariotik terhadap keluarga aminoglikosida dari antibiotik ribosom dan molekul kecil lainnya yang menargetkan situs decoding.Di situs decoding ribosom E. cuniculi, residu A1491 diganti dengan U1491, berpotensi menciptakan antarmuka pengikatan unik untuk molekul kecil yang menargetkan situs aktif ini.Varian A14901 yang sama juga terdapat pada mikrosporidia lain seperti P. locustae dan V. necatrix, menunjukkan bahwa ia tersebar luas di antara spesies mikrosporidia (Gbr. 1f).
Karena sampel ribosom E. cuniculi kami diisolasi dari spora yang tidak aktif secara metabolik, kami menguji peta cryo-EM dari E. cuniculi untuk pengikatan ribosom yang dijelaskan sebelumnya dalam kondisi stres atau kelaparan.Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kami mencocokkan struktur ribosom hibernasi yang telah ditetapkan sebelumnya dengan peta cryo-EM dari ribosom E. cuniculi.Untuk docking digunakan ribosom S. cerevisiae kompleks dengan faktor hibernasi Stm138, ribosom locust kompleks dengan faktor Lso232, dan ribosom V. necatrix kompleks dengan faktor Mdf1 dan Mdf231.Pada saat yang sama, kami menemukan kepadatan cryo-EM yang sesuai dengan faktor Mdf1 lainnya.Mirip dengan Mdf1 yang mengikat ribosom V. necatrix, Mdf1 juga mengikat ribosom E. cuniculi, di mana ia memblokir situs E ribosom, mungkin membantu membuat ribosom tersedia ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik setelah inaktivasi tubuh (Gambar 2).).
Mdf1 memblokir situs E ribosom, yang tampaknya membantu menonaktifkan ribosom ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik.Dalam struktur ribosom E. cuniculi, kami menemukan bahwa Mdf1 membentuk kontak yang sebelumnya tidak diketahui dengan batang ribosom L1, bagian ribosom yang memfasilitasi pelepasan tRNA deasilasi dari ribosom selama sintesis protein.Kontak ini menunjukkan bahwa Mdf1 berdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama dengan tRNA yang terdeasetilasi, memberikan penjelasan yang mungkin tentang bagaimana ribosom menghilangkan Mdf1 untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Namun, struktur kami mengungkapkan kontak yang tidak diketahui antara Mdf1 dan kaki ribosom L1 (bagian dari ribosom yang membantu melepaskan tRNA deasilasi dari ribosom selama sintesis protein).Secara khusus, Mdf1 menggunakan kontak yang sama dengan segmen siku dari molekul tRNA terdeasilasi (Gbr. 2).Pemodelan molekuler yang sebelumnya tidak diketahui ini menunjukkan bahwa Mdf1 berdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama dengan tRNA terdeasetilasi, yang menjelaskan bagaimana ribosom menghilangkan faktor hibernasi ini untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Ketika membangun model rRNA, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi telah melipat fragmen rRNA secara tidak normal, yang kami sebut rRNA fusi (Gbr. 3).Dalam ribosom yang menjangkau tiga domain kehidupan, rRNA terlipat ke dalam struktur di mana sebagian besar basis rRNA baik berpasangan dan melipat satu sama lain atau berinteraksi dengan protein ribosom 38,39,40.Namun, dalam ribosom E. cuniculi, rRNA tampaknya melanggar prinsip pelipatan ini dengan mengubah beberapa heliksnya menjadi daerah rRNA yang tidak terlipat.
Struktur heliks rRNA H18 25S di S. cerevisiae, V. necatrix, dan E. cuniculi.Biasanya, dalam ribosom yang mencakup tiga domain kehidupan, penghubung ini bergulung menjadi heliks RNA yang berisi 24 hingga 34 residu.Di Microsporidia, sebaliknya, penghubung rRNA ini secara bertahap direduksi menjadi dua penghubung kaya uridin beruntai tunggal yang hanya mengandung 12 residu.Sebagian besar residu ini terkena pelarut.Gambar tersebut menunjukkan bahwa mikrosporidia parasit tampaknya melanggar prinsip umum pelipatan rRNA, di mana basa rRNA biasanya digabungkan dengan basa lain atau terlibat dalam interaksi rRNA-protein.Dalam mikrosporidia, beberapa fragmen rRNA mengambil lipatan yang tidak menguntungkan, di mana heliks rRNA sebelumnya menjadi fragmen beruntai tunggal yang memanjang hampir dalam garis lurus.Kehadiran daerah yang tidak biasa ini memungkinkan mikrosporidia rRNA untuk mengikat fragmen rRNA yang jauh menggunakan jumlah basis RNA yang minimal.
Contoh paling mencolok dari transisi evolusioner ini dapat diamati pada heliks H18 25S rRNA (Gbr. 3).Pada spesies dari E. coli hingga manusia, basis heliks rRNA ini mengandung 24-32 nukleotida, membentuk heliks yang sedikit tidak beraturan.Pada struktur ribosom yang telah diidentifikasi sebelumnya dari V. necatrix dan P. locustae,31,32 basa heliks H18 sebagian tidak tergulung, tetapi pasangan basa nukleotida dipertahankan.Namun, pada E. cuniculi fragmen rRNA ini menjadi linker terpendek 228UUUGU232 dan 301UUUUUUUUUU307.Tidak seperti fragmen rRNA tipikal, penghubung kaya uridin ini tidak menggulung atau melakukan kontak ekstensif dengan protein ribosom.Alih-alih, mereka mengadopsi struktur terbuka pelarut dan tidak terlipat penuh di mana untaian rRNA diperpanjang hampir lurus.Konformasi yang membentang ini menjelaskan bagaimana E. cuniculi hanya menggunakan 12 basis RNA untuk mengisi celah 33 Å antara heliks rRNA H16 dan H18, sementara spesies lain membutuhkan setidaknya dua kali lebih banyak basis rRNA untuk mengisi celah tersebut.
Dengan demikian, kita dapat menunjukkan bahwa, melalui pelipatan yang tidak menguntungkan secara energetik, mikrosporidia parasit telah mengembangkan strategi untuk mengontraksi bahkan segmen rRNA yang tetap terkonservasi secara luas di seluruh spesies dalam tiga domain kehidupan.Rupanya, dengan mengakumulasi mutasi yang mengubah heliks rRNA menjadi penghubung poli-U pendek, E. cuniculi dapat membentuk fragmen rRNA yang tidak biasa yang mengandung nukleotida sesedikit mungkin untuk ligasi fragmen rRNA distal.Ini membantu menjelaskan bagaimana microsporidia mencapai pengurangan dramatis dalam struktur molekul dasarnya tanpa kehilangan integritas struktural dan fungsionalnya.
Fitur lain yang tidak biasa dari rRNA E. cuniculi adalah munculnya rRNA tanpa penebalan (Gbr. 4).Tonjolan adalah nukleotida tanpa pasangan basa yang keluar dari heliks RNA alih-alih bersembunyi di dalamnya.Sebagian besar tonjolan rRNA bertindak sebagai perekat molekuler, membantu mengikat protein ribosom yang berdekatan atau fragmen rRNA lainnya.Beberapa tonjolan bertindak sebagai engsel, memungkinkan heliks rRNA untuk melenturkan dan melipat secara optimal untuk sintesis protein yang produktif 41 .
a Penonjolan rRNA (penomoran S. cerevisiae) tidak ada pada struktur ribosom E. cuniculi, tetapi terdapat pada kebanyakan eukariota lain b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, dan ribosom internal E. cuniculi.parasit kekurangan banyak tonjolan rRNA kuno yang sangat terkonservasi.Penebalan ini menstabilkan struktur ribosom;oleh karena itu, ketidakhadiran mereka dalam mikrosporidia menunjukkan penurunan stabilitas pelipatan rRNA pada parasit mikrosporidia.Perbandingan dengan batang P (batang L7/L12 pada bakteri) menunjukkan bahwa hilangnya benjolan rRNA terkadang bersamaan dengan munculnya benjolan baru di samping benjolan yang hilang.Heliks H42 di rRNA 23S/28S memiliki tonjolan kuno (U1206 di Saccharomyces cerevisiae) yang diperkirakan berusia setidaknya 3,5 miliar tahun karena perlindungannya di tiga domain kehidupan.Pada microsporidia, tonjolan ini dihilangkan.Namun, tonjolan baru muncul di sebelah tonjolan yang hilang (A1306 di E. cuniculi).
Yang mengejutkan, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi kekurangan sebagian besar tonjolan rRNA yang ditemukan pada spesies lain, termasuk lebih dari 30 tonjolan yang dilestarikan pada eukariota lain (Gbr. 4a).Kehilangan ini menghilangkan banyak kontak antara subunit ribosom dan heliks rRNA yang berdekatan, kadang-kadang menciptakan rongga berongga besar di dalam ribosom, membuat ribosom E. cuniculi lebih berpori dibandingkan dengan ribosom yang lebih tradisional (Gbr. 4b).Khususnya, kami menemukan bahwa sebagian besar tonjolan ini juga hilang pada struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang diidentifikasi sebelumnya, yang diabaikan oleh analisis struktur sebelumnya31,32.
Terkadang hilangnya tonjolan rRNA disertai dengan perkembangan tonjolan baru di sebelah tonjolan yang hilang.Sebagai contoh, batang P ribosom mengandung tonjolan U1208 (dalam Saccharomyces cerevisiae) yang bertahan dari E. coli ke manusia dan karena itu diperkirakan berusia 3,5 miliar tahun.Selama sintesis protein, tonjolan ini membantu batang P bergerak antara konformasi terbuka dan tertutup sehingga ribosom dapat merekrut faktor translasi dan mengirimkannya ke situs aktif.Pada ribosom E. cuniculi, penebalan ini tidak ada;namun, penebalan baru (G883) yang terletak hanya pada tiga pasangan basa dapat berkontribusi pada pemulihan fleksibilitas batang P yang optimal (Gbr. 4c).
Data kami tentang rRNA tanpa tonjolan menunjukkan bahwa minimalisasi rRNA tidak terbatas pada hilangnya elemen rRNA pada permukaan ribosom, tetapi mungkin juga melibatkan inti ribosom, menciptakan cacat molekul spesifik parasit yang belum dijelaskan dalam sel yang hidup bebas.spesies hidup diamati.
Setelah memodelkan protein ribosom kanonik dan rRNA, kami menemukan bahwa komponen ribosom konvensional tidak dapat menjelaskan tiga bagian gambar cryo-EM.Dua dari fragmen ini berukuran molekul kecil (Gbr. 5, Gbr. 8 Tambahan).Segmen pertama terjepit di antara protein ribosom uL15 dan eL18 dalam posisi yang biasanya ditempati oleh ujung-C eL18, yang diperpendek pada E. cuniculi.Meskipun kami tidak dapat menentukan identitas molekul ini, ukuran dan bentuk pulau kerapatan ini dijelaskan dengan baik oleh keberadaan molekul spermidine.Pengikatannya ke ribosom distabilkan oleh mutasi spesifik mikrosporidia pada protein uL15 (Asp51 dan Arg56), yang tampaknya meningkatkan afinitas ribosom untuk molekul kecil ini, karena memungkinkan uL15 untuk membungkus molekul kecil menjadi struktur ribosom.Tambahan Gambar 2).8, data tambahan 1, 2).
Pencitraan Cryo-EM menunjukkan adanya nukleotida di luar ribosa yang terikat pada ribosom E. cuniculi.Dalam ribosom E. cuniculi, nukleotida ini menempati tempat yang sama dengan nukleotida 25S rRNA A3186 (penomoran Saccharomyces cerevisiae) di sebagian besar ribosom eukariotik lainnya.b Dalam struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida ini terletak di antara protein ribosom uL9 dan eL20, sehingga menstabilkan kontak antara kedua protein.analisis konservasi urutan cd eL20 di antara spesies microsporidia.Pohon filogenetik dari spesies Microsporidia ( c ) dan penyelarasan urutan ganda dari protein eL20 ( d ) menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 dilestarikan di sebagian besar Microsporidia tipikal, dengan pengecualian S. lophii, dengan pengecualian Microsporidia bercabang awal, yang mempertahankan ekstensi ES39L rRNA.e Gambar ini menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 hanya ada pada eL20 dari genom mikrosporidia yang sangat tereduksi, tetapi tidak pada eukariota lainnya.Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa ribosom Microsporidian telah mengembangkan situs pengikatan nukleotida yang tampaknya mengikat molekul AMP dan menggunakannya untuk menstabilkan interaksi protein-protein dalam struktur ribosom.Konservasi yang tinggi dari situs pengikatan ini di Microsporidia dan ketidakhadirannya di eukariota lain menunjukkan bahwa situs ini dapat memberikan keuntungan kelangsungan hidup selektif untuk Microsporidia.Dengan demikian, kantong pengikat nukleotida dalam ribosom mikrosporidia tampaknya bukan fitur degenerasi atau bentuk akhir degradasi rRNA seperti yang dijelaskan sebelumnya, melainkan inovasi evolusioner yang berguna yang memungkinkan ribosom mikrosporidia mengikat molekul kecil secara langsung, menggunakannya sebagai blok pembangun molekuler.blok bangunan untuk ribosom.Penemuan ini menjadikan ribosom microsporidia satu-satunya ribosom yang diketahui menggunakan nukleotida tunggal sebagai blok bangunan strukturalnya.f Jalur evolusi hipotetis yang berasal dari pengikatan nukleotida.
Kepadatan berat molekul rendah kedua terletak pada antarmuka antara protein ribosom uL9 dan eL30 (Gbr. 5a).Antarmuka ini sebelumnya dijelaskan dalam struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae sebagai situs pengikatan untuk nukleotida 25S rRNA A3186 (bagian dari ekstensi rRNA ES39L)38.Terlihat bahwa dalam degenerasi ribosom P. locustae ES39L, antarmuka ini mengikat nukleotida tunggal 31 yang tidak diketahui, dan diasumsikan bahwa nukleotida ini adalah bentuk akhir rRNA yang tereduksi, di mana panjang rRNA adalah ~130-230 basa.ES39L direduksi menjadi satu nukleotida 32.43.Gambar cryo-EM kami mendukung gagasan bahwa kerapatan dapat dijelaskan oleh nukleotida.Namun, resolusi yang lebih tinggi dari struktur kami menunjukkan bahwa nukleotida ini adalah molekul ekstraribosomal, kemungkinan AMP (Gbr. 5a, b).
Kami kemudian bertanya apakah situs pengikatan nukleotida muncul di ribosom E. cuniculi atau apakah sudah ada sebelumnya.Karena pengikatan nukleotida terutama dimediasi oleh residu Phe170 dan Lys172 dalam protein ribosom eL30, kami menilai konservasi residu ini pada 4396 perwakilan eukariota.Seperti dalam kasus uL15 di atas, kami menemukan bahwa residu Phe170 dan Lys172 sangat terkonservasi hanya pada Microsporidia tipikal, tetapi tidak ada pada eukariota lain, termasuk Microsporidia Mitosporidium dan Amphiamblys atipikal, di mana fragmen ES39L rRNA tidak berkurang 44, 45, 46 (Gbr. 5c).-e).
Secara keseluruhan, data ini mendukung gagasan bahwa E. cuniculi dan mungkin mikrosporidia kanonik lainnya telah mengembangkan kemampuan untuk secara efisien menangkap sejumlah besar metabolit kecil dalam struktur ribosom untuk mengkompensasi penurunan tingkat rRNA dan protein.Dengan melakukan itu, mereka telah mengembangkan kemampuan unik untuk mengikat nukleotida di luar ribosom, menunjukkan bahwa struktur molekul parasit mengkompensasi dengan menangkap metabolit kecil yang melimpah dan menggunakannya sebagai tiruan struktural dari RNA yang terdegradasi dan fragmen protein..
Bagian ketiga yang tidak disimulasikan dari peta cryo-EM kami, ditemukan di subunit ribosom besar.Resolusi yang relatif tinggi (2,6 Å) dari peta kami menunjukkan bahwa kepadatan ini milik protein dengan kombinasi unik dari residu rantai samping yang besar, yang memungkinkan kami untuk mengidentifikasi kepadatan ini sebagai protein ribosom yang sebelumnya tidak diketahui yang kami identifikasi sebagai Itu dinamai msL2 (Microsporidia- protein spesifik L2) (metode, gambar 6).Pencarian homologi kami menunjukkan bahwa msL2 dilestarikan dalam clade Microsporidia dari genus Encephaliter dan Orosporidium, tetapi tidak ada pada spesies lain, termasuk Microsporidia lainnya.Dalam struktur ribosom, msL2 menempati celah yang dibentuk oleh hilangnya rRNA ES31L yang diperpanjang.Dalam kekosongan ini, msL2 membantu menstabilkan pelipatan rRNA dan dapat mengkompensasi hilangnya ES31L (Gambar 6).
kerapatan elektron dan model protein ribosom spesifik Microsporidia msL2 yang ditemukan di ribosom E. cuniculi.b Kebanyakan ribosom eukariotik, termasuk ribosom 80S dari Saccharomyces cerevisiae, memiliki amplifikasi rRNA ES19L yang hilang pada sebagian besar spesies Microsporidian.Struktur sebelumnya dari ribosom V. necatrix microsporidia menunjukkan bahwa hilangnya ES19L pada parasit ini dikompensasi oleh evolusi protein ribosom msL1 baru.Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi juga mengembangkan protein mimik RNA ribosom tambahan sebagai kompensasi nyata atas hilangnya ES19L.Namun, msL2 (saat ini dijelaskan sebagai protein ECU06_1135 hipotetis) dan msL1 memiliki asal struktural dan evolusi yang berbeda.c Penemuan generasi protein ribosom msL1 dan msL2 yang tidak terkait secara evolusioner ini menunjukkan bahwa jika ribosom mengakumulasi mutasi yang merusak dalam rRNA mereka, mereka dapat mencapai tingkat keragaman komposisi yang belum pernah terjadi sebelumnya bahkan dalam subset kecil dari spesies yang terkait erat.Penemuan ini dapat membantu memperjelas asal dan evolusi ribosom mitokondria, yang dikenal dengan rRNA yang sangat berkurang dan variabilitas abnormal dalam komposisi protein lintas spesies.
Kami kemudian membandingkan protein msL2 dengan protein msL1 yang dijelaskan sebelumnya, satu-satunya protein ribosom spesifik mikrosporidia yang diketahui ditemukan di ribosom V. necatrix.Kami ingin menguji apakah msL1 dan msL2 terkait secara evolusioner.Analisis kami menunjukkan bahwa msL1 dan msL2 menempati rongga yang sama dalam struktur ribosom, tetapi memiliki struktur primer dan tersier yang berbeda, yang menunjukkan asal evolusinya yang independen (Gbr. 6).Dengan demikian, penemuan msL2 kami memberikan bukti bahwa kelompok spesies eukariotik kompak dapat secara mandiri mengembangkan protein ribosom yang berbeda secara struktural untuk mengkompensasi hilangnya fragmen rRNA.Temuan ini penting karena sebagian besar ribosom eukariotik sitoplasma mengandung protein invarian, termasuk keluarga yang sama dari 81 protein ribosom.Munculnya msL1 dan msL2 di berbagai lapisan mikrosporidia sebagai respons terhadap hilangnya segmen rRNA yang diperluas menunjukkan bahwa degradasi arsitektur molekuler parasit menyebabkan parasit mencari mutasi kompensasi, yang pada akhirnya dapat menyebabkan akuisisi mereka pada populasi parasit yang berbeda.struktur.
Akhirnya, ketika model kami selesai, kami membandingkan komposisi ribosom E. cuniculi dengan yang diprediksi dari urutan genom.Beberapa protein ribosom, termasuk eL14, eL38, eL41, dan eS30, sebelumnya dianggap hilang dari genom E. cuniculi karena tidak adanya homolog mereka dari genom E. cuniculi.Hilangnya banyak protein ribosom juga diprediksi pada sebagian besar parasit intraseluler dan endosimbion yang sangat tereduksi.Sebagai contoh, meskipun sebagian besar bakteri yang hidup bebas mengandung keluarga yang sama dari 54 protein ribosom, hanya 11 dari keluarga protein ini yang memiliki homolog yang dapat dideteksi dalam setiap genom yang dianalisis dari bakteri yang dibatasi inang.Untuk mendukung gagasan ini, hilangnya protein ribosom telah diamati secara eksperimental pada V. necatrix dan P. locustae microsporidia, yang kekurangan protein eL38 dan eL4131,32.
Namun, struktur kami menunjukkan bahwa hanya eL38, eL41, dan eS30 yang benar-benar hilang di ribosom E. cuniculi.Protein eL14 dipertahankan dan struktur kami menunjukkan mengapa protein ini tidak dapat ditemukan dalam pencarian homologi (Gbr. 7).Pada ribosom E. cuniculi, sebagian besar situs pengikatan eL14 hilang karena degradasi ES39L yang diperkuat rRNA.Dengan tidak adanya ES39L, eL14 kehilangan sebagian besar struktur sekundernya, dan hanya 18% dari urutan eL14 yang identik pada E. cuniculi dan S. cerevisiae.Pelestarian urutan yang buruk ini luar biasa karena bahkan Saccharomyces cerevisiae dan Homo sapiens — organisme yang berevolusi terpisah 1,5 miliar tahun — berbagi lebih dari 51% residu yang sama di eL14.Hilangnya konservasi anomali ini menjelaskan mengapa E. cuniculi eL14 saat ini dianotasi sebagai protein diduga M970_061160 dan bukan sebagai protein ribosom eL1427.
dan Ribosom Microsporidia kehilangan ekstensi rRNA ES39L, yang sebagian menghilangkan situs pengikatan protein ribosomal eL14.Dengan tidak adanya ES39L, protein mikrospora eL14 mengalami kehilangan struktur sekunder, di mana α-helix pengikat rRNA sebelumnya merosot menjadi loop panjang minimal.b Penyelarasan urutan ganda menunjukkan bahwa protein eL14 sangat terkonservasi pada spesies eukariotik (57% urutan identitas antara ragi dan homolog manusia), tetapi kurang terkonservasi dan berbeda dalam mikrosporidia (di mana tidak lebih dari 24% residu identik dengan homolog eL14).dari S. cerevisiae atau H. sapiens).Konservasi urutan yang buruk dan variabilitas struktur sekunder ini menjelaskan mengapa homolog eL14 tidak pernah ditemukan di E. cuniculi dan mengapa protein ini dianggap telah hilang di E. cuniculi.Sebaliknya, E. cuniculi eL14 sebelumnya dianotasi sebagai protein M970_061160 diduga.Pengamatan ini menunjukkan bahwa keragaman genom mikrosporidia saat ini terlalu ditaksir terlalu tinggi: beberapa gen yang saat ini dianggap hilang dalam mikrosporidia sebenarnya diawetkan, meskipun dalam bentuk yang sangat terdiferensiasi;sebaliknya, beberapa dianggap mengkode gen mikrosporidia untuk protein khusus cacing (misalnya, protein hipotetis M970_061160) sebenarnya mengkode protein yang sangat beragam yang ditemukan pada eukariota lain.
Temuan ini menunjukkan bahwa denaturasi rRNA dapat menyebabkan hilangnya konservasi urutan secara dramatis pada protein ribosom yang berdekatan, membuat protein ini tidak terdeteksi untuk pencarian homologi.Dengan demikian, kita mungkin melebih-lebihkan tingkat degradasi molekuler yang sebenarnya dalam organisme genom kecil, karena beberapa protein yang dianggap hilang sebenarnya bertahan, meskipun dalam bentuk yang sangat berubah.
Bagaimana parasit dapat mempertahankan fungsi mesin molekulernya dalam kondisi pengurangan genom yang ekstrem?Studi kami menjawab pertanyaan ini dengan mendeskripsikan struktur molekul kompleks (ribosom) E. cuniculi, organisme dengan salah satu genom eukariotik terkecil.
Telah diketahui selama hampir dua dekade bahwa molekul protein dan RNA dalam parasit mikroba sering berbeda dari molekul homolognya pada spesies yang hidup bebas karena kurangnya pusat kontrol kualitas, berkurang hingga 50% dari ukurannya pada mikroba yang hidup bebas, dll. .banyak mutasi yang melemahkan yang merusak pelipatan dan fungsi.Misalnya, ribosom organisme genom kecil, termasuk banyak parasit intraseluler dan endosimbion, diperkirakan kekurangan beberapa protein ribosom dan hingga sepertiga nukleotida rRNA dibandingkan dengan spesies yang hidup bebas 27, 29, 30, 49. Namun, cara molekul ini berfungsi dalam parasit sebagian besar masih menjadi misteri, dipelajari terutama melalui genomik komparatif.
Studi kami menunjukkan bahwa struktur makromolekul dapat mengungkapkan banyak aspek evolusi yang sulit diekstraksi dari studi genomik komparatif tradisional parasit intraseluler dan organisme terbatas inang lainnya (Gambar Tambahan 7).Sebagai contoh, contoh protein eL14 menunjukkan bahwa kita dapat melebih-lebihkan tingkat degradasi sebenarnya dari peralatan molekuler pada spesies parasit.Parasit ensefalitis sekarang diyakini memiliki ratusan gen spesifik mikrosporidia.Namun, hasil kami menunjukkan bahwa beberapa dari gen yang tampaknya spesifik ini sebenarnya hanyalah varian gen yang sangat berbeda yang umum pada eukariota lainnya.Selain itu, contoh protein msL2 menunjukkan bagaimana kita mengabaikan protein ribosom baru dan meremehkan kandungan mesin molekuler parasit.Contoh molekul kecil menunjukkan bagaimana kita dapat mengabaikan inovasi paling cerdik dalam struktur molekul parasit yang dapat memberi mereka aktivitas biologis baru.
Secara keseluruhan, hasil ini meningkatkan pemahaman kita tentang perbedaan antara struktur molekul organisme yang dibatasi inang dan rekan mereka dalam organisme yang hidup bebas.Kami menunjukkan bahwa mesin molekuler, yang telah lama dianggap tereduksi, merosot, dan tunduk pada berbagai mutasi yang melemahkan, malah memiliki serangkaian fitur struktural tidak biasa yang diabaikan secara sistematis.
Di sisi lain, fragmen rRNA non-besar dan fragmen menyatu yang kami temukan di ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa reduksi genom dapat mengubah bahkan bagian-bagian dari mesin molekuler dasar yang diawetkan dalam tiga domain kehidupan – setelah hampir 3,5 miliar tahun.evolusi independen spesies.
Fragmen rRNA yang bebas tonjolan dan menyatu dalam ribosom E. cuniculi menjadi perhatian khusus mengingat penelitian sebelumnya tentang molekul RNA dalam bakteri endosimbiotik.Sebagai contoh, pada aphid endosymbiont Buchnera aphidicola, molekul rRNA dan tRNA telah terbukti memiliki struktur yang sensitif terhadap suhu karena bias komposisi A+T dan tingginya proporsi pasangan basa non-kanonik20,50.Perubahan RNA ini, serta perubahan molekul protein, sekarang dianggap bertanggung jawab atas ketergantungan endosimbion yang berlebihan pada mitra dan ketidakmampuan endosimbion untuk mentransfer panas 21, 23 .Meskipun mikrosporidia rRNA parasit memiliki perubahan struktural yang berbeda, sifat dari perubahan ini menunjukkan bahwa stabilitas termal yang berkurang dan ketergantungan yang lebih tinggi pada protein pendamping mungkin merupakan ciri umum molekul RNA dalam organisme dengan genom yang berkurang.
Di sisi lain, struktur kami menunjukkan bahwa mikrosporidia parasit telah mengembangkan kemampuan unik untuk melawan rRNA dan fragmen protein yang dilestarikan secara luas, mengembangkan kemampuan untuk menggunakan metabolit kecil yang melimpah dan tersedia sebagai peniruan struktural dari rRNA dan fragmen protein yang merosot.Degradasi struktur molekul..Pendapat ini didukung oleh fakta bahwa molekul kecil yang mengkompensasi hilangnya fragmen protein pada rRNA dan ribosom E. cuniculi berikatan dengan residu spesifik mikrosporidia pada protein uL15 dan eL30.Ini menunjukkan bahwa pengikatan molekul kecil ke ribosom mungkin merupakan produk seleksi positif, di mana mutasi spesifik Microsporidia pada protein ribosom telah dipilih karena kemampuannya untuk meningkatkan afinitas ribosom untuk molekul kecil, yang dapat menyebabkan organisme ribosom lebih efisien.Penemuan ini mengungkapkan inovasi cerdas dalam struktur molekul parasit mikroba dan memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana struktur molekul parasit mempertahankan fungsinya meskipun mengalami evolusi reduktif.
Saat ini, identifikasi molekul kecil ini masih belum jelas.Tidak jelas mengapa penampakan molekul kecil ini dalam struktur ribosom berbeda antara spesies mikrosporidia.Secara khusus, tidak jelas mengapa pengikatan nukleotida diamati pada ribosom E. cuniculi dan P. locustae, dan tidak pada ribosom V. necatrix, meskipun terdapat residu F170 pada protein eL20 dan K172 dari V. necatrix.Penghapusan ini mungkin disebabkan oleh residu 43 uL6 (terletak berdekatan dengan kantong pengikat nukleotida), yaitu tirosin pada V. necatrix dan bukan treonin pada E. cuniculi dan P. locustae.Rantai samping aromatik Tyr43 yang besar dapat mengganggu pengikatan nukleotida karena tumpang tindih sterik.Atau, penghapusan nukleotida yang jelas mungkin disebabkan oleh rendahnya resolusi pencitraan cryo-EM, yang menghambat pemodelan fragmen ribosom V. necatrix.
Di sisi lain, pekerjaan kami menunjukkan bahwa proses peluruhan genom mungkin merupakan kekuatan inventif.Secara khusus, struktur ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa hilangnya rRNA dan fragmen protein dalam ribosom mikrosporidia menciptakan tekanan evolusioner yang mendorong perubahan struktur ribosom.Varian ini terjadi jauh dari situs aktif ribosom dan tampaknya membantu mempertahankan (atau memulihkan) perakitan ribosom optimal yang jika tidak akan terganggu oleh rRNA yang berkurang.Ini menunjukkan bahwa inovasi besar dari ribosom microsporidia tampaknya telah berevolusi menjadi kebutuhan untuk menahan penyimpangan gen.
Mungkin ini paling baik diilustrasikan oleh pengikatan nukleotida, yang belum pernah diamati pada organisme lain sejauh ini.Fakta bahwa residu pengikat nukleotida terdapat pada mikrosporidia tipikal, tetapi tidak pada eukariota lain, menunjukkan bahwa situs pengikat nukleotida bukan hanya peninggalan yang menunggu untuk menghilang, atau situs terakhir untuk rRNA dikembalikan ke bentuk nukleotida individu.Alih-alih, situs ini tampak seperti fitur berguna yang dapat berkembang selama beberapa putaran seleksi positif.Situs pengikatan nukleotida mungkin merupakan produk sampingan dari seleksi alam: setelah ES39L terdegradasi, mikrosporidia terpaksa mencari kompensasi untuk mengembalikan biogenesis ribosom yang optimal tanpa adanya ES39L.Karena nukleotida ini dapat meniru kontak molekuler nukleotida A3186 di ES39L, molekul nukleotida menjadi bahan penyusun ribosom, pengikatan yang selanjutnya ditingkatkan dengan mutasi urutan eL30.
Sehubungan dengan evolusi molekuler parasit intraseluler, penelitian kami menunjukkan bahwa kekuatan seleksi alam Darwinian dan penyimpangan genetik dari peluruhan genom tidak bekerja secara paralel, tetapi berosilasi.Pertama, pergeseran genetik menghilangkan fitur penting dari biomolekul, membuat kompensasi sangat dibutuhkan.Hanya ketika parasit memenuhi kebutuhan ini melalui seleksi alam Darwin, makromolekul mereka akan memiliki kesempatan untuk mengembangkan sifat mereka yang paling mengesankan dan inovatif.Yang penting, evolusi situs pengikatan nukleotida di ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa pola evolusi molekuler yang kalah-mendapatkan ini tidak hanya mengamortisasi mutasi yang merusak, tetapi kadang-kadang memberikan fungsi yang sama sekali baru pada makromolekul parasit.
Gagasan ini konsisten dengan teori keseimbangan bergerak Sewell Wright, yang menyatakan bahwa sistem seleksi alam yang ketat membatasi kemampuan organisme untuk berinovasi51,52,53.Namun, jika hanyutan genetik mengganggu seleksi alam, hanyutan ini dapat menghasilkan perubahan yang tidak dengan sendirinya adaptif (atau bahkan merugikan) tetapi menyebabkan perubahan lebih lanjut yang memberikan kebugaran yang lebih tinggi atau aktivitas biologis baru.Kerangka kerja kami mendukung gagasan ini dengan mengilustrasikan bahwa jenis mutasi yang sama yang mengurangi lipatan dan fungsi biomolekul tampaknya menjadi pemicu utama perbaikannya.Sejalan dengan model evolusi win-win, penelitian kami menunjukkan bahwa peluruhan genom, yang secara tradisional dipandang sebagai proses degeneratif, juga merupakan pendorong utama inovasi, terkadang dan bahkan mungkin sering memungkinkan makromolekul memperoleh aktivitas parasit baru.dapat menggunakannya.