Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Evolusi parasit mikroba melibatkan tindakan balasan antara seleksi alam, yang menyebabkan parasit menjadi lebih baik, dan pergeseran genetik, yang menyebabkan parasit kehilangan gen dan mengakumulasikan mutasi yang merusak. Di sini, untuk memahami bagaimana tindakan balasan ini terjadi pada skala satu makromolekul, kami menggambarkan struktur cryo-EM dari ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisme eukariotik dengan salah satu genom terkecil di alam. Pengurangan ekstrem rRNA dalam ribosom E. cuniculi disertai dengan perubahan struktural yang belum pernah terjadi sebelumnya, seperti evolusi penghubung rRNA yang sebelumnya tidak diketahui dan rRNA tanpa tonjolan. Selain itu, ribosom E. cuniculi bertahan dari hilangnya fragmen rRNA dan protein dengan mengembangkan kemampuan untuk menggunakan molekul kecil sebagai tiruan struktural dari fragmen rRNA dan protein yang terdegradasi. Secara keseluruhan, kami menunjukkan bahwa struktur molekuler yang telah lama dianggap berkurang, mengalami degenerasi, dan rentan terhadap mutasi yang melemahkan memiliki sejumlah mekanisme kompensasi yang membuatnya tetap aktif meskipun terjadi kontraksi molekuler yang ekstrem.
Karena sebagian besar kelompok parasit mikroba memiliki perangkat molekuler yang unik untuk mengeksploitasi inangnya, kita sering kali harus mengembangkan terapi yang berbeda untuk kelompok parasit yang berbeda1,2. Namun, bukti baru menunjukkan bahwa beberapa aspek evolusi parasit bersifat konvergen dan sebagian besar dapat diprediksi, yang menunjukkan dasar potensial untuk intervensi terapeutik yang luas pada parasit mikroba3,4,5,6,7,8,9.
Penelitian sebelumnya telah mengidentifikasi tren evolusi umum pada parasit mikroba yang disebut reduksi genom atau peluruhan genom10,11,12,13. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa ketika mikroorganisme melepaskan gaya hidup bebasnya dan menjadi parasit intraseluler (atau endosimbion), genomnya mengalami metamorfosis yang lambat namun menakjubkan selama jutaan tahun9,11. Dalam proses yang dikenal sebagai peluruhan genom, parasit mikroba mengakumulasikan mutasi yang merusak yang mengubah banyak gen yang sebelumnya penting menjadi pseudogen, yang menyebabkan hilangnya gen secara bertahap dan keruntuhan mutasi14,15. Keruntuhan ini dapat menghancurkan hingga 95% gen pada organisme intraseluler tertua dibandingkan dengan spesies hidup bebas yang berkerabat dekat. Dengan demikian, evolusi parasit intraseluler merupakan tarik-menarik antara dua kekuatan yang berlawanan: seleksi alam Darwinian, yang mengarah pada peningkatan parasit, dan keruntuhan genom, yang melemparkan parasit ke dalam kehancuran. Bagaimana parasit berhasil muncul dari tarik-menarik ini dan mempertahankan aktivitas struktur molekulernya masih belum jelas.
Meskipun mekanisme pembusukan genom belum sepenuhnya dipahami, tampaknya hal itu terjadi terutama karena pergeseran genetik yang sering terjadi. Karena parasit hidup dalam populasi yang kecil, aseksual, dan terbatas secara genetik, mereka tidak dapat secara efektif menghilangkan mutasi yang merusak yang terkadang terjadi selama replikasi DNA. Hal ini menyebabkan akumulasi mutasi yang berbahaya dan pengurangan genom parasit yang tidak dapat dipulihkan. Akibatnya, parasit tidak hanya kehilangan gen yang tidak lagi diperlukan untuk kelangsungan hidupnya di lingkungan intraseluler. Ketidakmampuan populasi parasit untuk secara efektif menghilangkan mutasi yang merusak secara sporadis menyebabkan mutasi ini terakumulasi di seluruh genom, termasuk gen mereka yang paling penting.
Sebagian besar pemahaman kita saat ini tentang reduksi genom hanya didasarkan pada perbandingan urutan genom, dengan sedikit perhatian pada perubahan pada molekul aktual yang melakukan fungsi tata graha dan berfungsi sebagai target obat yang potensial. Studi perbandingan telah menunjukkan bahwa beban mutasi mikroba intraseluler yang merusak tampaknya membuat protein dan asam nukleat cenderung salah melipat dan beragregasi, sehingga membuatnya lebih bergantung pada chaperone dan sangat sensitif terhadap panas19,20,21,22,23. Selain itu, berbagai parasit—evolusi independen yang terkadang terpisah hingga 2,5 miliar tahun—mengalami hilangnya pusat kendali kualitas yang serupa dalam sintesis protein5,6 dan mekanisme perbaikan DNA24. Namun, sedikit yang diketahui tentang dampak gaya hidup intraseluler pada semua sifat makromolekul seluler lainnya, termasuk adaptasi molekuler terhadap beban mutasi yang merusak yang semakin meningkat.
Dalam penelitian ini, untuk lebih memahami evolusi protein dan asam nukleat mikroorganisme intraseluler, kami menentukan struktur ribosom parasit intraseluler Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi adalah organisme mirip jamur yang termasuk dalam kelompok mikrosporidia parasit yang memiliki genom eukariotik yang luar biasa kecil dan oleh karena itu digunakan sebagai organisme model untuk mempelajari peluruhan genom25,26,27,28,29,30. Baru-baru ini, struktur ribosom cryo-EM ditentukan untuk genom yang tereduksi sedang dari Microsporidia, Paranosema locustae, dan Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom). Struktur ini menunjukkan bahwa beberapa kehilangan amplifikasi rRNA dikompensasi oleh perkembangan kontak baru antara protein ribosom yang berdekatan atau perolehan protein ribosom msL131,32 yang baru. Spesies Encephalitozoon (genom ~2,5 juta bp), bersama dengan kerabat terdekatnya Ordospora, menunjukkan tingkat reduksi genom tertinggi pada eukariota – mereka memiliki kurang dari 2000 gen penyandi protein, dan diperkirakan ribosom mereka tidak hanya tidak memiliki fragmen ekspansi rRNA (fragmen rRNA yang membedakan ribosom eukariotik dari ribosom bakteri) juga memiliki empat protein ribosom karena kurangnya homolog dalam genom E. cuniculi26,27,28. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa ribosom E. cuniculi dapat mengungkap strategi yang sebelumnya tidak diketahui untuk adaptasi molekuler terhadap peluruhan genom.
Struktur cryo-EM kami merupakan ribosom sitoplasma eukariotik terkecil yang pernah dikarakterisasi dan memberikan wawasan tentang bagaimana tingkat akhir reduksi genom memengaruhi struktur, perakitan, dan evolusi mesin molekuler yang merupakan bagian integral dari sel. Kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi melanggar banyak prinsip pelipatan RNA dan perakitan ribosom yang telah lama dilestarikan, dan menemukan protein ribosom baru yang sebelumnya tidak diketahui. Secara tidak terduga, kami menunjukkan bahwa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan kemampuan untuk mengikat molekul kecil, dan berhipotesis bahwa pemotongan pada rRNA dan protein memicu inovasi evolusi yang pada akhirnya dapat memberikan kualitas yang berguna pada ribosom.
Untuk meningkatkan pemahaman kita tentang evolusi protein dan asam nukleat dalam organisme intraseluler, kami memutuskan untuk mengisolasi spora E. cuniculi dari kultur sel mamalia yang terinfeksi untuk memurnikan ribosomnya dan menentukan struktur ribosom tersebut. Sulit untuk mendapatkan sejumlah besar mikrosporidia parasit karena mikrosporidia tidak dapat dikultur dalam media nutrisi. Sebaliknya, mereka tumbuh dan bereproduksi hanya di dalam sel inang. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biomassa E. cuniculi untuk pemurnian ribosom, kami menginfeksi garis sel ginjal mamalia RK13 dengan spora E. cuniculi dan membudidayakan sel yang terinfeksi ini selama beberapa minggu agar E. cuniculi dapat tumbuh dan berkembang biak. Dengan menggunakan lapisan sel yang terinfeksi sekitar setengah meter persegi, kami dapat memurnikan sekitar 300 mg spora Microsporidia dan menggunakannya untuk mengisolasi ribosom. Kami kemudian mengganggu spora yang dimurnikan dengan manik-manik kaca dan mengisolasi ribosom kasar menggunakan fraksinasi polietilen glikol bertahap dari lisat. Hal ini memungkinkan kami memperoleh sekitar 300 µg ribosom E. cuniculi mentah untuk analisis struktur.
Kami kemudian mengumpulkan gambar cryo-EM menggunakan sampel ribosom yang dihasilkan dan memproses gambar ini menggunakan masker yang sesuai dengan subunit ribosom besar, kepala subunit kecil, dan subunit kecil. Selama proses ini, kami mengumpulkan gambar sekitar 108.000 partikel ribosom dan menghitung gambar cryo-EM dengan resolusi 2,7 Å (Gambar Tambahan 1-3). Kami kemudian menggunakan gambar cryoEM untuk memodelkan rRNA, protein ribosom, dan faktor hibernasi Mdf1 yang terkait dengan ribosom E. cuniculi (Gbr. 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi dalam kompleks dengan faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP). b Peta faktor hibernasi Mdf1 yang terkait dengan ribosom E. cuniculi. c Peta struktur sekunder yang membandingkan rRNA yang diperoleh kembali pada spesies Microsporidian dengan struktur ribosom yang diketahui. Panel menunjukkan lokasi fragmen rRNA yang diperkuat (ES) dan situs aktif ribosom, termasuk situs decoding (DC), loop sarkinisin (SRL), dan pusat peptidil transferase (PTC). d Kepadatan elektron yang sesuai dengan pusat peptidil transferase ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa situs katalitik ini memiliki struktur yang sama pada parasit E. cuniculi dan inangnya, termasuk H. sapiens. e, f Kepadatan elektron yang sesuai dari pusat dekode (e) dan struktur skematis dari pusat dekode (f) menunjukkan bahwa E. cuniculi memiliki residu U1491, bukan A1491 (penomoran E. coli) pada banyak eukariota lainnya. Perubahan ini menunjukkan bahwa E. cuniculi mungkin sensitif terhadap antibiotik yang menargetkan situs aktif ini.
Berbeda dengan struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang telah ditetapkan sebelumnya (kedua struktur tersebut mewakili famili mikrosporidia yang sama, Nosematidae, dan sangat mirip satu sama lain), 31,32 ribosom E. cuniculi mengalami banyak proses fragmentasi rRNA dan protein. Denaturasi lebih lanjut (Gambar Tambahan 4-6). Pada rRNA, perubahan yang paling mencolok mencakup hilangnya fragmen rRNA 25S ES12L yang teramplifikasi secara lengkap dan degenerasi parsial heliks h39, h41, dan H18 (Gbr. 1c, Gambar Tambahan 4). Di antara protein ribosom, perubahan yang paling mencolok mencakup hilangnya protein eS30 secara lengkap dan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, dan eS7 (Gambar Tambahan 4, 5).
Dengan demikian, pengurangan ekstrem genom spesies Encephalotozoon/Ordospora tercermin dalam struktur ribosomnya: ribosom E. cuniculi mengalami kehilangan kandungan protein paling dramatis dalam ribosom sitoplasma eukariotik yang tunduk pada karakterisasi struktural, dan mereka bahkan tidak memiliki rRNA dan fragmen protein yang secara luas dilestarikan tidak hanya pada eukariota, tetapi juga dalam tiga domain kehidupan. Struktur ribosom E. cuniculi menyediakan model molekuler pertama untuk perubahan ini dan mengungkap peristiwa evolusi yang telah diabaikan oleh genomik komparatif dan studi struktur biomolekuler intraseluler (Gambar Tambahan 7). Di bawah ini, kami menjelaskan masing-masing peristiwa ini bersama dengan kemungkinan asal evolusi dan dampak potensialnya pada fungsi ribosom.
Kami kemudian menemukan bahwa, selain pemotongan rRNA yang besar, ribosom E. cuniculi memiliki variasi rRNA di salah satu situs aktifnya. Meskipun pusat peptidil transferase dari ribosom E. cuniculi memiliki struktur yang sama dengan ribosom eukariotik lainnya (Gbr. 1d), pusat decoding berbeda karena variasi urutan pada nukleotida 1491 (penomoran E. coli, Gbr. 1e, f). Pengamatan ini penting karena situs decoding ribosom eukariotik biasanya mengandung residu G1408 dan A1491 dibandingkan dengan residu tipe bakteri A1408 dan G1491. Variasi ini mendasari sensitivitas yang berbeda dari ribosom bakteri dan eukariotik terhadap keluarga aminoglikosida antibiotik ribosom dan molekul kecil lainnya yang menargetkan situs decoding. Pada situs decoding ribosom E. cuniculi, residu A1491 digantikan dengan U1491, yang berpotensi menciptakan antarmuka pengikatan unik untuk molekul kecil yang menargetkan situs aktif ini. Varian A14901 yang sama juga terdapat pada mikrosporidia lain seperti P. locustae dan V. necatrix, yang menunjukkan bahwa varian ini tersebar luas di antara spesies mikrosporidia (Gbr. 1f).
Karena sampel ribosom E. cuniculi kami diisolasi dari spora yang tidak aktif secara metabolik, kami menguji peta cryo-EM E. cuniculi untuk pengikatan ribosom yang dijelaskan sebelumnya dalam kondisi stres atau kelaparan. Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kami mencocokkan struktur ribosom yang berhibernasi yang telah ditetapkan sebelumnya dengan peta cryo-EM ribosom E. cuniculi. Untuk docking, ribosom S. cerevisiae digunakan dalam kompleks dengan faktor hibernasi Stm138, ribosom locust dalam kompleks dengan faktor Lso232, dan ribosom V. necatrix dalam kompleks dengan faktor Mdf1 dan Mdf231. Pada saat yang sama, kami menemukan kepadatan cryo-EM yang sesuai dengan faktor istirahat Mdf1. Mirip dengan pengikatan Mdf1 pada ribosom V. necatrix, Mdf1 juga mengikat ribosom E. cuniculi, di mana ia memblokir situs E ribosom, mungkin membantu membuat ribosom tersedia ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik setelah inaktivasi tubuh (Gambar 2).
Mdf1 memblokir situs E ribosom, yang tampaknya membantu menonaktifkan ribosom ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik. Dalam struktur ribosom E. cuniculi, kami menemukan bahwa Mdf1 membentuk kontak yang sebelumnya tidak diketahui dengan batang ribosom L1, bagian ribosom yang memfasilitasi pelepasan tRNA yang mengalami deasetilasi dari ribosom selama sintesis protein. Kontak ini menunjukkan bahwa Mdf1 terdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA yang mengalami deasetilasi, yang memberikan kemungkinan penjelasan tentang bagaimana ribosom menghilangkan Mdf1 untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Namun, struktur kami mengungkap adanya kontak yang tidak diketahui antara Mdf1 dan kaki ribosom L1 (bagian ribosom yang membantu melepaskan tRNA yang terdeasetilasi dari ribosom selama sintesis protein). Secara khusus, Mdf1 menggunakan kontak yang sama dengan segmen siku molekul tRNA yang terdeasetilasi (Gbr. 2). Pemodelan molekuler yang sebelumnya tidak diketahui ini menunjukkan bahwa Mdf1 terdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama dengan tRNA yang terdeasetilasi, yang menjelaskan bagaimana ribosom menghilangkan faktor hibernasi ini untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Saat menyusun model rRNA, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi memiliki fragmen rRNA yang terlipat secara tidak normal, yang kami sebut rRNA yang menyatu (Gbr. 3). Pada ribosom yang mencakup tiga domain kehidupan, rRNA terlipat menjadi struktur di mana sebagian besar basa rRNA berpasangan dan saling melipat atau berinteraksi dengan protein ribosom38,39,40. Namun, pada ribosom E. cuniculi, rRNA tampaknya melanggar prinsip pelipatan ini dengan mengubah beberapa heliksnya menjadi daerah rRNA yang tidak terlipat.
Struktur heliks H18 25S rRNA pada S. cerevisiae, V. necatrix, dan E. cuniculi. Biasanya, pada ribosom yang mencakup tiga domain kehidupan, penghubung ini melingkar menjadi heliks RNA yang mengandung 24 hingga 34 residu. Sebaliknya, pada Microsporidia, penghubung rRNA ini secara bertahap direduksi menjadi dua penghubung kaya uridina untai tunggal yang hanya mengandung 12 residu. Sebagian besar residu ini terpapar pelarut. Gambar tersebut menunjukkan bahwa mikrosporidia parasit tampaknya melanggar prinsip umum pelipatan rRNA, di mana basa rRNA biasanya digabungkan ke basa lain atau terlibat dalam interaksi rRNA-protein. Pada mikrosporidia, beberapa fragmen rRNA mengalami lipatan yang tidak menguntungkan, di mana heliks rRNA sebelumnya menjadi fragmen untai tunggal yang memanjang hampir dalam garis lurus. Kehadiran daerah yang tidak biasa ini memungkinkan rRNA mikrosporidia untuk mengikat fragmen rRNA yang jauh menggunakan jumlah basa RNA yang minimal.
Contoh paling mencolok dari transisi evolusi ini dapat diamati pada heliks rRNA H18 25S (Gbr. 3). Pada spesies dari E. coli hingga manusia, basa heliks rRNA ini mengandung 24-32 nukleotida, membentuk heliks yang sedikit tidak teratur. Pada struktur ribosom yang diidentifikasi sebelumnya dari V. necatrix dan P. locustae,31,32 basa heliks H18 sebagian tidak tergulung, tetapi pasangan basa nukleotida dipertahankan. Namun, pada E. cuniculi fragmen rRNA ini menjadi penghubung terpendek 228UUUGU232 dan 301UUUUUUUUU307. Tidak seperti fragmen rRNA yang umum, penghubung kaya uridina ini tidak menggulung atau membuat kontak yang luas dengan protein ribosom. Sebaliknya, mereka mengadopsi struktur yang terbuka pelarut dan sepenuhnya tidak terlipat di mana untaian rRNA memanjang hampir lurus. Konformasi yang teregang ini menjelaskan bagaimana E. cuniculi hanya menggunakan 12 basa RNA untuk mengisi celah 33 Å antara heliks rRNA H16 dan H18, sementara spesies lain membutuhkan setidaknya dua kali lebih banyak basa rRNA untuk mengisi celah tersebut.
Dengan demikian, kita dapat menunjukkan bahwa, melalui pelipatan yang secara energetik tidak menguntungkan, mikrosporidia parasit telah mengembangkan strategi untuk mengontraksikan bahkan segmen rRNA yang tetap terkonservasi secara luas di seluruh spesies dalam tiga domain kehidupan. Rupanya, dengan mengakumulasi mutasi yang mengubah heliks rRNA menjadi penghubung poli-U pendek, E. cuniculi dapat membentuk fragmen rRNA yang tidak biasa yang mengandung sesedikit mungkin nukleotida untuk ligasi fragmen rRNA distal. Ini membantu menjelaskan bagaimana mikrosporidia mencapai pengurangan dramatis dalam struktur molekuler dasar mereka tanpa kehilangan integritas struktural dan fungsional mereka.
Ciri lain yang tidak biasa dari rRNA E. cuniculi adalah munculnya rRNA tanpa penebalan (Gbr. 4). Tonjolan adalah nukleotida tanpa pasangan basa yang terpelintir keluar dari heliks RNA alih-alih bersembunyi di dalamnya. Sebagian besar tonjolan rRNA berfungsi sebagai perekat molekuler, membantu mengikat protein ribosom yang berdekatan atau fragmen rRNA lainnya. Beberapa tonjolan berfungsi sebagai engsel, yang memungkinkan heliks rRNA melentur dan terlipat secara optimal untuk sintesis protein yang produktif 41 .
a Tonjolan rRNA (penomoran S. cerevisiae) tidak ada dalam struktur ribosom E. cuniculi, tetapi hadir di sebagian besar eukariota lainnya b Ribosom internal E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, dan E. cuniculi. Parasit tidak memiliki banyak tonjolan rRNA kuno yang sangat terkonservasi. Penebalan ini menstabilkan struktur ribosom; oleh karena itu, ketidakhadirannya dalam mikrosporidia menunjukkan berkurangnya stabilitas pelipatan rRNA pada parasit mikrosporidia. Perbandingan dengan batang P (batang L7/L12 pada bakteri) menunjukkan bahwa hilangnya tonjolan rRNA terkadang bertepatan dengan munculnya tonjolan baru di samping tonjolan yang hilang. Heliks H42 dalam rRNA 23S/28S memiliki tonjolan kuno (U1206 dalam Saccharomyces cerevisiae) yang diperkirakan berusia setidaknya 3,5 miliar tahun karena perlindungannya dalam tiga domain kehidupan. Pada mikrosporidia, tonjolan ini dihilangkan. Namun, tonjolan baru muncul di sebelah tonjolan yang hilang (A1306 pada E. cuniculi).
Yang mengejutkan, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi tidak memiliki sebagian besar tonjolan rRNA yang ditemukan pada spesies lain, termasuk lebih dari 30 tonjolan yang dilestarikan pada eukariota lain (Gbr. 4a). Kehilangan ini menghilangkan banyak kontak antara subunit ribosom dan heliks rRNA yang berdekatan, terkadang menciptakan rongga berongga yang besar di dalam ribosom, membuat ribosom E. cuniculi lebih berpori dibandingkan dengan ribosom yang lebih tradisional (Gbr. 4b). Khususnya, kami menemukan bahwa sebagian besar tonjolan ini juga hilang dalam struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang diidentifikasi sebelumnya, yang diabaikan oleh analisis struktural sebelumnya31,32.
Terkadang hilangnya tonjolan rRNA disertai dengan perkembangan tonjolan baru di samping tonjolan yang hilang. Misalnya, batang P ribosomal mengandung tonjolan U1208 (pada Saccharomyces cerevisiae) yang bertahan hidup dari E. coli hingga manusia dan karenanya diperkirakan berusia 3,5 miliar tahun. Selama sintesis protein, tonjolan ini membantu batang P bergerak di antara konformasi terbuka dan tertutup sehingga ribosom dapat merekrut faktor translasi dan mengirimkannya ke situs aktif. Pada ribosom E. cuniculi, penebalan ini tidak ada; namun, penebalan baru (G883) yang terletak hanya pada tiga pasangan basa dapat berkontribusi pada pemulihan fleksibilitas optimal batang P (Gbr. 4c).
Data kami tentang rRNA tanpa tonjolan menunjukkan bahwa minimisasi rRNA tidak terbatas pada hilangnya elemen rRNA pada permukaan ribosom, tetapi mungkin juga melibatkan inti ribosom, yang menciptakan cacat molekuler khusus parasit yang belum dijelaskan pada sel yang hidup bebas. spesies hidup diamati.
Setelah memodelkan protein ribosom kanonik dan rRNA, kami menemukan bahwa komponen ribosom konvensional tidak dapat menjelaskan tiga bagian dari gambar cryo-EM. Dua dari fragmen ini berukuran molekul kecil (Gbr. 5, Gambar Tambahan 8). Segmen pertama diapit di antara protein ribosom uL15 dan eL18 pada posisi yang biasanya ditempati oleh C-terminus eL18, yang dipersingkat dalam E. cuniculi. Meskipun kami tidak dapat menentukan identitas molekul ini, ukuran dan bentuk pulau kepadatan ini dijelaskan dengan baik oleh keberadaan molekul spermidina. Pengikatannya ke ribosom distabilkan oleh mutasi spesifik mikrosporidia pada protein uL15 (Asp51 dan Arg56), yang tampaknya meningkatkan afinitas ribosom untuk molekul kecil ini, karena memungkinkan uL15 untuk membungkus molekul kecil ke dalam struktur ribosom. Gambar Tambahan 2). 8, data tambahan 1, 2).
Pencitraan Cryo-EM menunjukkan keberadaan nukleotida di luar ribosa yang terikat pada ribosom E. cuniculi. Dalam ribosom E. cuniculi, nukleotida ini menempati tempat yang sama dengan nukleotida 25S rRNA A3186 (penomoran Saccharomyces cerevisiae) di sebagian besar ribosom eukariotik lainnya. b Dalam struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida ini terletak di antara protein ribosom uL9 dan eL20, sehingga menstabilkan kontak antara kedua protein tersebut. cd Analisis konservasi sekuens eL20 di antara spesies mikrosporidia. Pohon filogenetik spesies Microsporidia (c) dan multiple sequence alignment dari protein eL20 (d) menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 dilestarikan di sebagian besar Microsporidia yang khas, dengan pengecualian S. lophii, dengan pengecualian Microsporidia percabangan awal, yang mempertahankan ekstensi rRNA ES39L. Gambar ini menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 hanya ada di eL20 genom microsporidia yang sangat tereduksi, tetapi tidak pada eukariota lainnya. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa ribosom Microsporidia telah mengembangkan situs pengikatan nukleotida yang tampaknya mengikat molekul AMP dan menggunakannya untuk menstabilkan interaksi protein-protein dalam struktur ribosom. Konservasi tinggi situs pengikatan ini di Microsporidia dan ketidakhadirannya pada eukariota lainnya menunjukkan bahwa situs ini dapat memberikan keuntungan kelangsungan hidup selektif untuk Microsporidia. Dengan demikian, kantong pengikat nukleotida dalam ribosom mikrosporidia tampaknya bukan fitur degenerasi atau bentuk akhir degradasi rRNA seperti yang dijelaskan sebelumnya, tetapi lebih merupakan inovasi evolusi yang berguna yang memungkinkan ribosom mikrosporidia untuk secara langsung mengikat molekul kecil, menggunakannya sebagai blok penyusun molekuler. blok penyusun ribosom. Penemuan ini menjadikan ribosom mikrosporidia satu-satunya ribosom yang diketahui menggunakan satu nukleotida sebagai blok penyusun strukturalnya. f Jalur evolusi hipotetis yang berasal dari pengikatan nukleotida.
Kepadatan berat molekul rendah kedua terletak di antarmuka antara protein ribosom uL9 dan eL30 (Gbr. 5a). Antarmuka ini sebelumnya dijelaskan dalam struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae sebagai situs pengikatan untuk nukleotida 25S rRNA A3186 (bagian dari ekstensi rRNA ES39L)38. Telah ditunjukkan bahwa dalam ribosom ES39L P. locustae yang mengalami degenerasi, antarmuka ini mengikat nukleotida tunggal yang tidak diketahui 31, dan diasumsikan bahwa nukleotida ini adalah bentuk akhir rRNA yang direduksi, di mana panjang rRNA adalah ~130-230 basa. ES39L direduksi menjadi nukleotida tunggal 32,43. Gambar cryo-EM kami mendukung gagasan bahwa kepadatan dapat dijelaskan oleh nukleotida. Namun, resolusi yang lebih tinggi dari struktur kami menunjukkan bahwa nukleotida ini adalah molekul ekstraribosomal, mungkin AMP (Gbr. 5a, b).
Kami kemudian menanyakan apakah situs pengikatan nukleotida muncul di ribosom E. cuniculi atau apakah situs tersebut sudah ada sebelumnya. Karena pengikatan nukleotida sebagian besar dimediasi oleh residu Phe170 dan Lys172 dalam protein ribosom eL30, kami menilai konservasi residu ini dalam 4396 eukariota representatif. Seperti dalam kasus uL15 di atas, kami menemukan bahwa residu Phe170 dan Lys172 sangat terkonservasi hanya pada Microsporidia yang khas, tetapi tidak ada pada eukariota lain, termasuk Microsporidia Mitosporidium dan Amphiamblys yang atipikal, di mana fragmen rRNA ES39L tidak tereduksi 44, 45, 46 (Gbr. 5c). -e).
Secara keseluruhan, data ini mendukung gagasan bahwa E. cuniculi dan mungkin mikrosporidia kanonik lainnya telah mengembangkan kemampuan untuk secara efisien menangkap sejumlah besar metabolit kecil dalam struktur ribosom untuk mengimbangi penurunan kadar rRNA dan protein. Dengan demikian, mereka telah mengembangkan kemampuan unik untuk mengikat nukleotida di luar ribosom, yang menunjukkan bahwa struktur molekul parasit mengimbanginya dengan menangkap metabolit kecil yang melimpah dan menggunakannya sebagai tiruan struktural dari fragmen RNA dan protein yang terdegradasi.
Bagian ketiga yang tidak disimulasikan dari peta cryo-EM kami, ditemukan dalam subunit ribosom besar. Resolusi yang relatif tinggi (2,6 Å) dari peta kami menunjukkan bahwa kerapatan ini termasuk dalam protein dengan kombinasi unik residu rantai samping besar, yang memungkinkan kami untuk mengidentifikasi kerapatan ini sebagai protein ribosom yang sebelumnya tidak diketahui yang kami identifikasi sebagai Itu dinamai msL2 (protein spesifik Microsporidia L2) (metode, gambar 6). Pencarian homologi kami menunjukkan bahwa msL2 dilestarikan dalam klade Microsporidia dari genus Encephaliter dan Orosporidium, tetapi tidak ada pada spesies lain, termasuk Microsporidia lainnya. Dalam struktur ribosom, msL2 menempati celah yang dibentuk oleh hilangnya rRNA ES31L yang diperpanjang. Dalam kekosongan ini, msL2 membantu menstabilkan pelipatan rRNA dan dapat mengkompensasi hilangnya ES31L (Gambar 6).
a Kepadatan elektron dan model protein ribosom spesifik Microsporidia msL2 yang ditemukan dalam ribosom E. cuniculi. b Sebagian besar ribosom eukariotik, termasuk ribosom 80S dari Saccharomyces cerevisiae, memiliki amplifikasi rRNA ES19L yang hilang pada sebagian besar spesies Microsporidia. Struktur ribosom V. necatrix microsporidia yang telah ditetapkan sebelumnya menunjukkan bahwa hilangnya ES19L pada parasit ini dikompensasi oleh evolusi protein ribosom msL1 yang baru. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi juga mengembangkan protein mimik RNA ribosom tambahan sebagai kompensasi nyata atas hilangnya ES19L. Namun, msL2 (saat ini diberi anotasi sebagai protein hipotetis ECU06_1135) dan msL1 memiliki asal usul struktural dan evolusi yang berbeda. c Penemuan tentang pembentukan protein ribosom msL1 dan msL2 yang tidak terkait secara evolusi ini menunjukkan bahwa jika ribosom mengakumulasikan mutasi yang merugikan dalam rRNA-nya, mereka dapat mencapai tingkat keragaman komposisi yang belum pernah terjadi sebelumnya bahkan dalam sebagian kecil spesies yang berkerabat dekat. Penemuan ini dapat membantu menjelaskan asal usul dan evolusi ribosom mitokondria, yang dikenal karena rRNA-nya yang sangat berkurang dan variabilitas abnormal dalam komposisi protein di seluruh spesies.
Kami kemudian membandingkan protein msL2 dengan protein msL1 yang dijelaskan sebelumnya, satu-satunya protein ribosom spesifik mikrosporidia yang diketahui yang ditemukan di ribosom V. necatrix. Kami ingin menguji apakah msL1 dan msL2 terkait secara evolusi. Analisis kami menunjukkan bahwa msL1 dan msL2 menempati rongga yang sama dalam struktur ribosom, tetapi memiliki struktur primer dan tersier yang berbeda, yang menunjukkan asal evolusi independen mereka (Gbr. 6). Dengan demikian, penemuan msL2 kami memberikan bukti bahwa kelompok spesies eukariotik kompak dapat secara independen mengembangkan protein ribosom yang secara struktural berbeda untuk mengimbangi hilangnya fragmen rRNA. Temuan ini penting karena sebagian besar ribosom eukariotik sitoplasma mengandung protein invarian, termasuk keluarga yang sama dari 81 protein ribosom. Munculnya msL1 dan msL2 dalam berbagai klade mikrosporidia sebagai respons terhadap hilangnya segmen rRNA yang diperluas menunjukkan bahwa degradasi arsitektur molekuler parasit menyebabkan parasit mencari mutasi kompensasi, yang pada akhirnya dapat menyebabkan perolehannya dalam populasi parasit yang berbeda. struktur.
Akhirnya, ketika model kami selesai, kami membandingkan komposisi ribosom E. cuniculi dengan yang diprediksi dari urutan genom. Beberapa protein ribosom, termasuk eL14, eL38, eL41, dan eS30, sebelumnya dianggap hilang dari genom E. cuniculi karena tidak adanya homolognya dari genom E. cuniculi. Hilangnya banyak protein ribosom juga diprediksi pada sebagian besar parasit intraseluler dan endosimbion yang sangat tereduksi. Misalnya, meskipun sebagian besar bakteri yang hidup bebas mengandung keluarga yang sama dari 54 protein ribosom, hanya 11 dari keluarga protein ini yang memiliki homolog yang dapat dideteksi dalam setiap genom bakteri yang dibatasi inang yang dianalisis. Untuk mendukung gagasan ini, hilangnya protein ribosom telah diamati secara eksperimental pada V. necatrix dan P. locustae microsporidia, yang tidak memiliki protein eL38 dan eL4131,32.
Namun, struktur kami menunjukkan bahwa hanya eL38, eL41, dan eS30 yang benar-benar hilang dalam ribosom E. cuniculi. Protein eL14 dilestarikan dan struktur kami menunjukkan mengapa protein ini tidak dapat ditemukan dalam pencarian homologi (Gbr. 7). Dalam ribosom E. cuniculi, sebagian besar situs pengikatan eL14 hilang karena degradasi ES39L yang diperkuat rRNA. Dengan tidak adanya ES39L, eL14 kehilangan sebagian besar struktur sekundernya, dan hanya 18% dari urutan eL14 yang identik dalam E. cuniculi dan S. cerevisiae. Pelestarian urutan yang buruk ini luar biasa karena bahkan Saccharomyces cerevisiae dan Homo sapiens—organisme yang berevolusi 1,5 miliar tahun terpisah—berbagi lebih dari 51% residu yang sama dalam eL14. Hilangnya konservasi yang tidak lazim ini menjelaskan mengapa E. cuniculi eL14 saat ini dianotasi sebagai protein M970_061160 dan bukan sebagai protein ribosom eL1427.
dan Ribosom Microsporidia kehilangan ekstensi rRNA ES39L, yang menghilangkan sebagian situs pengikatan protein ribosom eL14. Dengan tidak adanya ES39L, protein mikrospora eL14 mengalami kehilangan struktur sekunder, di mana α-heliks pengikat rRNA sebelumnya mengalami degenerasi menjadi loop dengan panjang minimal. b Penjajaran sekuens berganda menunjukkan bahwa protein eL14 sangat terkonservasi pada spesies eukariotik (57% identitas sekuens antara homolog ragi dan manusia), tetapi kurang terkonservasi dan divergen pada mikrosporidia (di mana tidak lebih dari 24% residu identik dengan homolog eL14). dari S. cerevisiae atau H. sapiens). Konservasi sekuens yang buruk dan variabilitas struktur sekunder ini menjelaskan mengapa homolog eL14 tidak pernah ditemukan pada E. cuniculi dan mengapa protein ini diduga telah hilang pada E. cuniculi. Sebaliknya, E. cuniculi eL14 sebelumnya diberi anotasi sebagai protein M970_061160. Pengamatan ini menunjukkan bahwa keragaman genom mikrosporidia saat ini dilebih-lebihkan: beberapa gen yang saat ini dianggap hilang dalam mikrosporidia sebenarnya terpelihara, meskipun dalam bentuk yang sangat terdiferensiasi; sebaliknya, beberapa dianggap mengkode gen mikrosporidia untuk protein khusus cacing (misalnya, protein hipotetis M970_061160) sebenarnya mengkode protein yang sangat beragam yang ditemukan pada eukariota lainnya.
Temuan ini menunjukkan bahwa denaturasi rRNA dapat menyebabkan hilangnya konservasi sekuens secara drastis pada protein ribosom yang berdekatan, sehingga protein ini tidak dapat dideteksi untuk pencarian homologi. Dengan demikian, kita mungkin melebih-lebihkan tingkat degradasi molekuler yang sebenarnya pada organisme genom kecil, karena beberapa protein yang dianggap hilang sebenarnya masih ada, meskipun dalam bentuk yang sangat berubah.
Bagaimana parasit dapat mempertahankan fungsi mesin molekulernya dalam kondisi reduksi genom yang ekstrem? Studi kami menjawab pertanyaan ini dengan menjelaskan struktur molekul kompleks (ribosom) E. cuniculi, organisme dengan salah satu genom eukariotik terkecil.
Telah diketahui selama hampir dua dekade bahwa molekul protein dan RNA dalam parasit mikroba sering berbeda dari molekul homolognya dalam spesies yang hidup bebas karena mereka tidak memiliki pusat kendali mutu, berkurang hingga 50% dari ukurannya dalam mikroba yang hidup bebas, dll. banyak mutasi yang melemahkan yang merusak pelipatan dan fungsi. Misalnya, ribosom organisme genom kecil, termasuk banyak parasit intraseluler dan endosimbion, diperkirakan tidak memiliki beberapa protein ribosom dan hingga sepertiga nukleotida rRNA dibandingkan dengan spesies yang hidup bebas 27, 29, 30, 49. Namun, cara molekul-molekul ini berfungsi dalam parasit sebagian besar masih menjadi misteri, dipelajari terutama melalui genomik komparatif.
Studi kami menunjukkan bahwa struktur makromolekul dapat mengungkap banyak aspek evolusi yang sulit diekstraksi dari studi genomik komparatif tradisional parasit intraseluler dan organisme terbatas inang lainnya (Gambar Tambahan 7). Misalnya, contoh protein eL14 menunjukkan bahwa kita dapat melebih-lebihkan tingkat degradasi aktual aparatus molekuler pada spesies parasit. Parasit ensefalitis kini diyakini memiliki ratusan gen khusus mikrosporidia. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa beberapa gen yang tampaknya spesifik ini sebenarnya hanyalah varian gen yang sangat berbeda yang umum pada eukariota lainnya. Selain itu, contoh protein msL2 menunjukkan bagaimana kita mengabaikan protein ribosom baru dan meremehkan konten mesin molekuler parasit. Contoh molekul kecil menunjukkan bagaimana kita dapat mengabaikan inovasi paling cerdik dalam struktur molekuler parasit yang dapat memberi mereka aktivitas biologis baru.
Secara keseluruhan, hasil ini meningkatkan pemahaman kita tentang perbedaan antara struktur molekuler organisme yang dibatasi inang dan struktur molekuler pada organisme yang hidup bebas. Kami menunjukkan bahwa mesin molekuler, yang selama ini dianggap telah direduksi, mengalami degenerasi, dan rentan terhadap berbagai mutasi yang melemahkan, justru memiliki serangkaian fitur struktural yang tidak biasa yang secara sistematis diabaikan.
Di sisi lain, fragmen rRNA yang tidak besar dan fragmen yang menyatu yang kami temukan dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa reduksi genom dapat mengubah bahkan bagian-bagian dari mesin molekuler dasar yang dilestarikan dalam tiga domain kehidupan – setelah hampir 3,5 miliar tahun evolusi spesies yang independen.
Fragmen rRNA yang bebas tonjolan dan menyatu dalam ribosom E. cuniculi menjadi perhatian khusus mengingat penelitian sebelumnya tentang molekul RNA dalam bakteri endosimbiosis. Misalnya, dalam endosimbion kutu daun Buchnera aphidicola, molekul rRNA dan tRNA telah terbukti memiliki struktur yang peka terhadap suhu karena bias komposisi A+T dan proporsi pasangan basa non-kanonik yang tinggi20,50. Perubahan-perubahan dalam RNA ini, serta perubahan-perubahan dalam molekul protein, sekarang dianggap bertanggung jawab atas ketergantungan berlebihan endosimbion pada pasangannya dan ketidakmampuan endosimbion untuk mentransfer panas21, 23. Meskipun rRNA mikrosporidia parasit memiliki perubahan yang berbeda secara struktural, sifat dari perubahan-perubahan ini menunjukkan bahwa stabilitas termal yang berkurang dan ketergantungan yang lebih tinggi pada protein chaperone mungkin merupakan fitur umum molekul RNA dalam organisme dengan genom yang berkurang.
Di sisi lain, struktur kami menunjukkan bahwa parasit mikrosporidia telah mengembangkan kemampuan unik untuk melawan rRNA dan fragmen protein yang terkonservasi secara luas, mengembangkan kemampuan untuk menggunakan metabolit kecil yang melimpah dan tersedia secara luas sebagai tiruan struktural dari rRNA dan fragmen protein yang mengalami degenerasi. Degradasi struktur molekuler. Pendapat ini didukung oleh fakta bahwa molekul kecil yang mengompensasi hilangnya fragmen protein dalam rRNA dan ribosom E. cuniculi mengikat residu spesifik mikrosporidia dalam protein uL15 dan eL30. Hal ini menunjukkan bahwa pengikatan molekul kecil ke ribosom mungkin merupakan produk seleksi positif, di mana mutasi spesifik Mikrosporidia dalam protein ribosom telah dipilih karena kemampuannya untuk meningkatkan afinitas ribosom terhadap molekul kecil, yang dapat menghasilkan organisme ribosom yang lebih efisien. Penemuan ini mengungkap inovasi cerdas dalam struktur molekuler parasit mikroba dan memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana struktur molekuler parasit mempertahankan fungsinya meskipun terjadi evolusi reduktif.
Saat ini, identifikasi molekul-molekul kecil ini masih belum jelas. Tidak jelas mengapa penampakan molekul-molekul kecil ini dalam struktur ribosom berbeda antara spesies mikrosporidia. Secara khusus, tidak jelas mengapa pengikatan nukleotida diamati dalam ribosom E. cuniculi dan P. locustae, dan tidak dalam ribosom V. necatrix, meskipun terdapat residu F170 dalam protein eL20 dan K172 dari V. necatrix. Penghapusan ini mungkin disebabkan oleh residu 43 uL6 (terletak berdekatan dengan kantong pengikatan nukleotida), yang merupakan tirosin dalam V. necatrix dan bukan treonin dalam E. cuniculi dan P. locustae. Rantai samping aromatik Tyr43 yang besar dapat mengganggu pengikatan nukleotida karena tumpang tindih sterik. Atau, penghapusan nukleotida yang nyata mungkin disebabkan oleh rendahnya resolusi pencitraan krio-EM, yang menghambat pemodelan fragmen ribosom V. necatrix.
Di sisi lain, penelitian kami menunjukkan bahwa proses pembusukan genom mungkin merupakan kekuatan inventif. Secara khusus, struktur ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa hilangnya fragmen rRNA dan protein dalam ribosom mikrosporidia menciptakan tekanan evolusi yang mendorong perubahan dalam struktur ribosom. Varian ini terjadi jauh dari situs aktif ribosom dan tampaknya membantu mempertahankan (atau memulihkan) perakitan ribosom optimal yang jika tidak akan terganggu oleh berkurangnya rRNA. Hal ini menunjukkan bahwa inovasi utama ribosom mikrosporidia tampaknya telah berkembang menjadi kebutuhan untuk menahan pergeseran gen.
Barangkali hal ini paling baik diilustrasikan oleh pengikatan nukleotida, yang sejauh ini belum pernah diamati pada organisme lain. Fakta bahwa residu pengikatan nukleotida hadir dalam mikrosporidia yang khas, tetapi tidak pada eukariota lain, menunjukkan bahwa situs pengikatan nukleotida bukan hanya relik yang menunggu untuk menghilang, atau situs terakhir bagi rRNA untuk dikembalikan ke bentuk nukleotida individu. Sebaliknya, situs ini tampak seperti fitur berguna yang dapat berevolusi selama beberapa putaran seleksi positif. Situs pengikatan nukleotida mungkin merupakan produk sampingan dari seleksi alam: begitu ES39L terdegradasi, mikrosporidia dipaksa untuk mencari kompensasi untuk mengembalikan biogenesis ribosom yang optimal tanpa adanya ES39L. Karena nukleotida ini dapat meniru kontak molekuler nukleotida A3186 dalam ES39L, molekul nukleotida menjadi blok pembangun ribosom, yang pengikatannya selanjutnya ditingkatkan dengan mutasi urutan eL30.
Mengenai evolusi molekuler parasit intraseluler, penelitian kami menunjukkan bahwa gaya seleksi alam Darwin dan pergeseran genetik pembusukan genom tidak beroperasi secara paralel, tetapi berosilasi. Pertama, pergeseran genetik menghilangkan fitur-fitur penting biomolekul, sehingga kompensasi sangat dibutuhkan. Hanya ketika parasit memenuhi kebutuhan ini melalui seleksi alam Darwin, makromolekul mereka akan memiliki kesempatan untuk mengembangkan sifat-sifat mereka yang paling mengesankan dan inovatif. Yang penting, evolusi situs pengikatan nukleotida dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa pola kehilangan-keuntungan evolusi molekuler ini tidak hanya mengamortisasi mutasi yang merusak, tetapi terkadang memberikan fungsi yang sama sekali baru pada makromolekul parasit.
Gagasan ini konsisten dengan teori keseimbangan bergerak Sewell Wright, yang menyatakan bahwa sistem seleksi alam yang ketat membatasi kemampuan organisme untuk berinovasi51,52,53. Namun, jika pergeseran genetik mengganggu seleksi alam, pergeseran ini dapat menghasilkan perubahan yang tidak adaptif (atau bahkan merugikan) tetapi mengarah pada perubahan lebih lanjut yang memberikan kebugaran yang lebih tinggi atau aktivitas biologis baru. Kerangka kerja kami mendukung gagasan ini dengan mengilustrasikan bahwa jenis mutasi yang sama yang mengurangi lipatan dan fungsi biomolekul tampaknya menjadi pemicu utama untuk perbaikannya. Sejalan dengan model evolusi menang-menang, studi kami menunjukkan bahwa pembusukan genom, yang secara tradisional dipandang sebagai proses degeneratif, juga merupakan pendorong utama inovasi, terkadang dan mungkin bahkan sering memungkinkan makromolekul untuk memperoleh aktivitas parasit baru. dapat menggunakannya.