Akuisisi dan distribusi nutrisi memadukan ciri-ciri pencarian makan dan riwayat hidup serangga. Untuk mengimbangi kekurangan nutrisi tertentu pada berbagai tahap kehidupan, serangga dapat memperoleh nutrisi ini melalui pemberian makanan tambahan, misalnya dengan memakan sekresi vertebrata dalam suatu proses yang dikenal sebagai genangan air. Nyamuk Anopheles arabiani tampaknya kekurangan gizi dan, oleh karena itu, membutuhkan nutrisi untuk metabolisme dan reproduksi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai apakah agitasi An. arabiensis pada urin sapi untuk akuisisi nutrisi meningkatkan karakteristik riwayat hidup.
Pastikan aman.arabiensis tertarik pada bau urin sapi segar, berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam, dan betina yang mencari inang dan yang diberi darah (48 jam setelah makan darah) diukur dalam olfaktometer tabung-Y, dan betina yang hamil dinilai untuk uji pemijahan.Analisis kimia dan elektrofisiologi gabungan kemudian digunakan untuk mengidentifikasi senyawa bioaktif dalam urin sapi pada keempat kelas umur.Campuran sintetis senyawa bioaktif dievaluasi dalam uji coba tabung-Y dan lapangan.Untuk menyelidiki urin sapi dan senyawa utamanya yang mengandung nitrogen urea sebagai suplemen makanan potensial untuk vektor malaria, parameter pemberian makan dan karakteristik riwayat hidup diukur.Proporsi nyamuk betina dan jumlah urin sapi dan urea yang diserap dinilai.Setelah makan, betina dinilai untuk kelangsungan hidup, terbang dengan tali, dan reproduksi.
Mencari darah dan makanan bagi inangnya. Dalam penelitian di laboratorium dan lapangan, orang-orang Arab tertarik pada aroma alami maupun sintetis dari urin sapi segar maupun yang sudah tua. Betina yang hamil bersikap acuh tak acuh terhadap respons urin sapi di lokasi pemijahan. Betina yang mencari inang dan menghisap darah secara aktif menyerap urin dan urea sapi serta mengalokasikan sumber daya ini menurut keseimbangan riwayat hidup sebagai fungsi dari kondisi fisiologis untuk terbang, bertahan hidup, atau bereproduksi.
Akuisisi dan distribusi urin sapi oleh Anopheles arabinis untuk memperbaiki karakteristik riwayat hidup. Pemberian tambahan urin sapi memengaruhi kapasitas vektor secara langsung dengan meningkatkan kelangsungan hidup harian dan kepadatan vektor, dan secara tidak langsung dengan mengubah aktivitas terbang dan karenanya harus dipertimbangkan dalam model masa depan.
Akuisisi dan distribusi nutrisi mengintegrasikan pencarian makan serangga dan karakteristik riwayat hidup [1,2,3]. Serangga mampu memilih dan memperoleh makanan dan melakukan pemberian makan kompensasi berdasarkan ketersediaan makanan dan kebutuhan nutrisi [1, 3]. Distribusi nutrisi bergantung pada proses riwayat hidup dan dapat menyebabkan persyaratan yang berbeda untuk kualitas dan kuantitas makanan pada berbagai tahap kehidupan serangga [1, 2]. Untuk mengimbangi kekurangan nutrisi tertentu, serangga dapat memperoleh nutrisi ini melalui pemberian makanan tambahan, seperti pada lumpur, berbagai kotoran dan sekresi vertebrata, dan bangkai, suatu proses yang dikenal sebagai genangan air [2]. Meskipun berbagai spesies kupu-kupu dan ngengat terutama dijelaskan, lubang air juga terjadi pada ordo serangga lain, dan ketertarikan dan memakan jenis sumber daya ini dapat memiliki efek signifikan pada kesehatan dan sifat riwayat hidup lainnya [2, 4, 5, 6], 7]. Nyamuk malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) muncul sebagai orang dewasa yang 'kurang gizi' [8], sehingga penyiraman dapat memainkan peran penting dalam hidupnya. karakteristik sejarah, tetapi perilaku ini sejauh ini diabaikan. Penggunaan agitasi sebagai sarana untuk meningkatkan asupan nutrisi dalam kendaraan penting ini perlu mendapat perhatian karena hal ini dapat menimbulkan konsekuensi epidemiologis yang penting.
Asupan nitrogen pada nyamuk Anopheles betina dewasa terbatas karena cadangan kalori rendah yang dibawa dari tahap larva dan pemanfaatan darah yang tidak efisien [9]. Ann.gambiae sl betina biasanya mengimbanginya dengan suplemen darah [10, 11], sehingga membuat lebih banyak orang berisiko tertular penyakit dan membuat nyamuk berisiko lebih besar dimangsa. Sebagai alternatif, nyamuk dapat menggunakan makanan tambahan berupa ekskreta vertebrata untuk memperoleh senyawa nitrogen yang meningkatkan adaptasi dan kemampuan manuver terbang, seperti yang ditunjukkan oleh serangga lain [2]. Dalam hal ini, daya tarik yang kuat dan berbeda dari salah satu spesies saudara dalam An. Kompleks spesies sl Gambia, Anopheles arabinis, urin sapi segar dan tua [12,13,14], menarik. Anopheles arabinis oportunistik dalam preferensi inangnya dan diketahui berasosiasi dengan dan memakan sapi. Urine sapi merupakan sumber daya yang kaya akan senyawa nitrogen, dengan urea menyumbang 50-95% dari total nitrogen dalam urin segar. [15, 16].Seiring bertambahnya usia urin sapi, mikroorganisme memanfaatkan sumber daya ini untuk mengurangi kompleksitas senyawa nitrogen dalam waktu 24 jam [15].Dengan peningkatan amonia yang cepat, terkait dengan penurunan nitrogen organik, mikroorganisme alkalofilik (banyak di antaranya menghasilkan senyawa yang beracun bagi nyamuk) tumbuh subur [15], yang mungkin betina Ann.arabiensis lebih tertarik pada urin yang berumur 24 jam atau kurang [13, 14].
Dalam penelitian ini, Ans inang dan yang menghisap darah dicari. Selama siklus gonadotropin pertamanya, arabiensis dinilai untuk perolehan senyawa nitrogen, termasuk urea, dengan pencampuran urin. Berikutnya, serangkaian percobaan dilakukan untuk menilai bagaimana nyamuk betina mengalokasikan sumber nutrisi potensial ini untuk meningkatkan kelangsungan hidup, reproduksi, dan mencari makan lebih lanjut. Akhirnya, bau urin sapi segar dan tua dinilai untuk menentukan apakah ini memberikan petunjuk yang dapat diandalkan untuk An inang dan yang menghisap darah. Dalam pencarian mereka untuk sumber nutrisi potensial ini, arabiensis menemukan korelasi kimia di balik daya tarik diferensial yang diamati. Campuran bau sintetis dari senyawa organik volatil (VOC) yang diidentifikasi dalam urin yang berumur 24 jam dievaluasi lebih lanjut dalam kondisi lapangan, memperluas hasil yang diperoleh dalam kondisi laboratorium dan menunjukkan efek bau urin sapi pada berbagai keadaan fisiologis. Daya tarik nyamuk. Hasil yang diperoleh mengonfirmasi bahwa An. arabiensis memperoleh dan mendistribusikan senyawa nitrogen yang ditemukan dalam urin vertebrata untuk memengaruhi karakteristik riwayat hidup. Hasil ini dibahas dalam konteks konsekuensi epidemiologi potensial dan bagaimana hasil tersebut dapat digunakan untuk pengawasan dan pengendalian vektor.
Anopheles arabicans (strain Dongola) dipelihara pada suhu 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH dan siklus terang:gelap 12:12 jam. Larva dibesarkan dalam nampan plastik (20 cm × 18 cm × 7 cm) yang diisi dengan air suling dan diberi makan makanan ikan Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Pupa dikumpulkan dalam cangkir 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) dan kemudian dipindahkan ke kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) untuk memungkinkan munculnya dewasa. Dewasa diberi larutan sukrosa 10% ad libitum sampai 4 hari pasca-kemunculan (dpe), di mana betina yang mencari inang diberi makanan segera sebelum percobaan, atau dibiarkan kelaparan semalaman dengan air suling sebelum percobaan, seperti yang diuraikan di bawah ini. Betina yang digunakan untuk percobaan tabung terbang dibiarkan kelaparan hanya selama 4-6 jam dengan air sepuasnya. Untuk menyiapkan nyamuk penghisap darah untuk bioassay berikutnya, 4 betina dpe diberi darah domba defibrotik (Håtunalab, Bro, SE) menggunakan sistem pemberian makan membran (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Inggris). Betina yang sudah sepenuhnya sesak kemudian dipindahkan ke kandang individu dan diberi makanan secara langsung, seperti yang diuraikan di bawah ini, atau sukrosa 10% sepuasnya selama 3 hari sebelum percobaan yang diuraikan di bawah ini. Betina yang terakhir digunakan untuk bioassay tabung terbang dan dipindahkan ke laboratorium, dan kemudian diberi air suling sepuasnya selama 4-6 jam sebelum percobaan.
Uji pemberian makanan digunakan untuk mengukur konsumsi urin dan urea pada nyamuk An.Arab betina dewasa. Nyamuk betina yang mencari inang dan yang diberi darah diberi makanan yang mengandung 1% urin sapi segar dan tua yang diencerkan, berbagai konsentrasi urea, dan dua kontrol (10% sukrosa dan air) selama 48 jam. Selain itu, pewarna makanan (1 mg ml-1 xylene cyanide FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) ditambahkan ke makanan dan diberikan dalam matriks 4 × 4 dalam tabung mikrocentrifuge 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, AS; Gambar 1A) Isi hingga penuh (~300 µl). Untuk menghindari persaingan antar nyamuk dan potensi efek warna pewarna, tempatkan 10 nyamuk dalam cawan Petri besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Gambar 1A) dalam kegelapan total pada 25 ± 2 cm °C dan kelembaban relatif 65 ± 5%. Percobaan ini diulang 5 hingga 10 kali. Setelah terpapar makanan, nyamuk ditempatkan pada suhu -20 °C hingga dilakukan analisis lebih lanjut.
Carilah urin sapi dan urea yang diserap oleh inang dan Anopheles arabianus betina penghisap darah. Dalam uji pemberian makan (A), nyamuk betina diberi makanan yang terdiri dari urin sapi segar dan tua, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O). Betina yang mencari inang (B) dan yang diberi darah (C) menyerap lebih banyak sukrosa daripada makanan lain yang diuji. Perhatikan bahwa betina yang mencari inang menyerap urin sapi 72 jam lebih sedikit daripada urin sapi 168 jam (B). Kandungan nitrogen total rata-rata (± simpangan baku) urin direpresentasikan dalam sisipan. Betina yang mencari inang (D, F) dan penghisap darah (E, G) menyerap urea dengan cara yang bergantung pada dosis. Volume rata-rata yang dihirup (D, E) dengan nama huruf yang berbeda secara signifikan berbeda satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05). Batang kesalahan mewakili kesalahan standar rata-rata (BE). Garis putus-putus lurus mewakili garis regresi log-linier (F, G)
Bahasa Indonesia: Untuk melepaskan makanan yang terserap, nyamuk ditempatkan secara individual ke dalam tabung mikrocentrifuge 1,5 ml yang berisi 230 µl air suling dan jaringan diganggu menggunakan alu sekali pakai dan motor nirkabel (VWR International, Lund, SE), diikuti dengan sentrifugasi pada 10 krpm selama 10 menit. Supernatan (200 µl) dipindahkan ke mikroplat 96-sumur (Sigma-Aldrich) dan absorbansi (λ620) ditentukan menggunakan pembaca mikroplat berbasis spektrofotometer (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Atau, nyamuk ditumbuk dalam 1 ml air suling, 900 µl di antaranya dipindahkan ke kuvet untuk analisis spektrofotometri (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Untuk mengukur asupan makanan, kurva standar disiapkan dengan pengenceran serial untuk menghasilkan 0,2 µl hingga 2,4 µl dari 1 mg ml-1 xilena sianida. Kemudian, kerapatan optik dari konsentrasi pewarna yang diketahui digunakan untuk menentukan jumlah makanan yang ditelan setiap nyamuk.
Data volume dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti oleh perbandingan berpasangan post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, AS, 1989–2007). Analisis regresi linier menggambarkan asupan urea yang bergantung pada konsentrasi dan membandingkan respons antara nyamuk pencari inang dan nyamuk penghisap darah (GraphPad Prism v8.0.0 untuk Mac, Perangkat Lunak GraphPad, San Diego, CA, AS).
Sekitar 20 µl sampel urin dari setiap kelompok usia diikat pada Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) dan dienkapsulasi dalam kapsul timah (8 mm × 5 mm). Kapsul dimasukkan ke dalam ruang pembakaran penganalisa CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) untuk menentukan kandungan nitrogen dalam urin segar dan lama menurut protokol pabrik. Nitrogen total (g N l-1) dihitung berdasarkan konsentrasi urea yang diketahui yang digunakan sebagai standar.
Bahasa Indonesia:Untuk menilai efek diet terhadap kelangsungan hidup nyamuk betina yang mencari inang dan menghisap darah, nyamuk ditempatkan secara individual dalam cawan Petri besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni) dengan lubang yang ditutup kasa di tutupnya (diameter 3 cm) untuk ventilasi dan suplai makanan. Diet diberikan langsung setelah 4 hari setelah melahirkan dan meliputi 1% urin sapi segar dan tua yang diencerkan, empat konsentrasi urea, dan dua kontrol, 10% sukrosa dan air. Setiap diet dipipet ke tampon gigi (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) yang dimasukkan ke dalam spuit 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), pendorong dilepas, dan ditempatkan di atas cawan petri (gambar 1). 1A). Ubah diet Anda setiap hari. Pertahankan lab seperti yang dijelaskan di atas. Nyamuk yang bertahan hidup dihitung dua kali sehari, sedangkan nyamuk yang mati dibuang sampai nyamuk terakhir mati (n = 40 per perlakuan). Kelangsungan hidup nyamuk yang diberi berbagai diet dianalisis secara statistik menggunakan kurva kelangsungan hidup Kaplan-Meyer dan uji log-rank untuk membandingkan distribusi kelangsungan hidup antara diet (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Sebuah kincir nyamuk terbang yang dibuat khusus berdasarkan Attisano et al.[17], terbuat dari panel akrilik bening setebal 5 mm (lebar 10 cm x panjang 10 cm x tinggi 10 cm) tanpa panel depan dan belakang (Gbr. 3: atas). Sebuah rakitan pivot dengan tabung vertikal yang terbuat dari kolom kromatografi gas (0,25 mm id; 7,5 cm L) dengan ujung-ujung yang direkatkan ke jarum serangga yang digantung di antara sepasang magnet neodymium yang berjarak 9 cm. Sebuah tabung horizontal yang terbuat dari bahan yang sama (6,5 cm L) membagi dua tabung vertikal untuk membentuk lengan yang diikat dan lengan yang membawa sepotong kecil aluminium foil sebagai sinyal pengganggu cahaya.
Betina yang dibiarkan kelaparan selama 24 jam diberi diet di atas selama 30 menit sebelum ditahan. Nyamuk betina yang sudah diberi makan penuh kemudian dibius satu per satu di atas es selama 2-3 menit dan ditempelkan pada peniti serangga dengan lilin lebah (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) lalu diikatkan pada lengan tabung horizontal. Penggilingan Terbang. Putaran tiap penerbangan direkam oleh pencatat data yang dibuat khusus, lalu disimpan dan ditampilkan menggunakan perangkat lunak PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Penggilingan terbang ditempatkan di ruangan dengan iklim yang diatur (12 jam:12 jam, terang: gelap, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Untuk memvisualisasikan pola aktivitas terbang, jarak tempuh total (m) dan jumlah total aktivitas terbang berturut-turut dihitung per jam selama periode 24 jam. Selain itu, jarak rata-rata yang ditempuh oleh masing-masing betina dibandingkan di seluruh perlakuan dan dianalisis menggunakan ANOVA satu arah dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), di mana jarak rata-rata dianggap sebagai variabel dependen, sedangkan perlakuan merupakan faktor independen. Selain itu, jumlah rata-rata putaran dihitung dalam kelipatan 10 menit.
Bahasa Indonesia: Untuk mengkaji efek diet terhadap performa reproduksi An.arabiensis, enam betina (4 dpe) dipindahkan langsung ke kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) setelah pengambilan darah, lalu diberi diet eksperimen selama 48 jam seperti dijelaskan di atas. Diet kemudian dikeluarkan dan cawan pemijahan (30 ml; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 ml air suling disediakan pada hari ketiga selama 48 jam, diganti setiap 24 jam. Ulangi setiap rejimen diet 20-50 kali. Telur dihitung dan dicatat untuk setiap kandang eksperimen. Subsampel telur digunakan untuk mengkaji ukuran rata-rata dan variasi panjang telur individu (n ≥ 200 per diet) menggunakan mikroskop Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) yang dilengkapi dengan Kamera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Telur yang tersisa disimpan di ruangan ber-AC dengan kondisi pemeliharaan standar selama 24 jam, dan sub-sampel larva instar pertama yang baru muncul (n ≥ 200 per diet) diukur, seperti dijelaskan di atas. Jumlah telur dan ukuran telur serta larva dibandingkan antar perlakuan dan menggunakan ANOVA satu arah dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Zat volatil ruang kepala dari urin segar (1 jam pasca-pengambilan sampel), urin berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam dikumpulkan dari sampel yang dikumpulkan dari sapi Zebu, ras Arsi. Demi kenyamanan, sampel urin dikumpulkan pagi-pagi sekali saat sapi-sapi masih di kandang. Sampel urin dikumpulkan dari 10 individu dan 100-200 ml dari setiap sampel dipindahkan ke kantong kue poliamida individual (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) dalam poliamida 3 l dengan tutup dalam drum plastik vinil klorida. Zat volatil ruang kepala dari setiap sampel urin sapi dikumpulkan baik secara langsung (segar) atau setelah pematangan pada suhu ruangan selama 24 jam, 72 jam, dan 168 jam, yaitu setiap sampel urin mewakili setiap kelompok umur.
Untuk pengumpulan volatil ruang kepala, sistem loop tertutup digunakan untuk mengalirkan aliran gas yang disaring karbon aktif (100 ml min-1) melalui kantong poliamida ke kolom adsorpsi selama 2,5 jam dengan menggunakan pompa vakum diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Sebagai kontrol, pengumpulan ruang kepala dilakukan dari kantong poliamida kosong. Kolom adsorpsi terbuat dari tabung Teflon (5,5 cm x 3 mm id) yang berisi 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, AS) di antara sumbat wol kaca. Sebelum digunakan, kolom dibilas dengan 1 ml n-heksana suling ulang (Merck, Darmstadt, DE) dan 1 ml pentana (pelarut murni 99,0% kelas GC, Sigma Aldrich). Volatil yang teradsorpsi dielusi dengan 400 μl pentana. Pengumpulan ruang kepala digabungkan dan kemudian disimpan pada -20 °C hingga digunakan. untuk analisis lebih lanjut.
Respons perilaku An yang mencari inang dan pemakan darah.Ekstrak volatil headspace yang dikumpulkan dari urin segar, berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam dianalisis untuk ekstrak volatil dari nyamuk Arabidopsis menggunakan olfaktometer tabung kaca lurus [18].Eksperimen dilakukan selama ZT 13-15, periode puncak aktivitas pencarian rumah An.Arab [19].Olfaktometer tabung kaca (80 cm × 9,5 cm id) disinari dengan 3 ± 1 lx cahaya merah dari atas.Aliran udara yang disaring dan dilembabkan dengan arang (25 ± 2 °C, kelembaban relatif 65 ± 2%) lolos bioassay pada 30 cm s-1.Udara dialirkan melalui serangkaian saringan jaring baja tahan karat, menciptakan aliran laminar dan struktur gumpalan yang seragam.Dispenser tampon gigi (4 cm × 1 cm; P:D; DAB Dental AB), digantung dari kumparan 5 cm pada ujung olfaktometer yang menghadap angin, dengan perubahan stimulator setiap 5 menit. Untuk analisis, 10 μl dari setiap ekstrak headspace, diencerkan 1:10, digunakan sebagai stimulus. Jumlah pentana yang sama digunakan sebagai kontrol. Nyamuk pencari inang atau penghisap darah ditempatkan di kandang pelepasan individu 2-3 jam sebelum dimulainya percobaan. Kandang pelepasan ditempatkan di sisi olfaktometer yang berlawanan arah angin, dan nyamuk dibiarkan beraklimatisasi selama 1 menit, kemudian katup kupu-kupu kandang dibuka untuk melepaskan. Ketertarikan pada perlakuan atau kontrol dianalisis sebagai proporsi nyamuk yang bersentuhan dengan sumber dalam waktu 5 menit setelah pelepasan. Setiap ekstrak volatil headspace dan kontrol direplikasi setidaknya 30 kali, dan untuk menghindari efek dari satu hari, jumlah perlakuan dan kontrol yang sama diuji pada setiap hari percobaan. Mencari respons dari inang dan yang diberi darah Jawaban. Set Arab versus headspace dianalisis menggunakan regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk rasio ganjil (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Respons pemijahan An. Ekstrak ruang kepala dari urin sapi segar dan tua dianalisis dalam kandang Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Gelas plastik (30 mL; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 mL air suling menyediakan substrat pemijahan dan ditempatkan di sudut kandang yang berlawanan, dengan jarak 24 cm. Gelas perlakuan disesuaikan dengan 10 μl setiap ekstrak ruang kepala pada pengenceran 1:10. Jumlah pentana yang sama digunakan untuk menyesuaikan gelas kontrol. Gelas perlakuan dan kontrol dipertukarkan di antara setiap percobaan untuk mengendalikan efek posisi. Sepuluh betina yang diberi makan darah dilepaskan ke dalam kandang percobaan pada ZT 9-11 dan telur dalam gelas dihitung 24 jam kemudian. Rumus untuk menghitung indeks pemijahan adalah: (jumlah telur yang diletakkan di gelas perlakuan – jumlah telur yang diletakkan di gelas kontrol)/(jumlah total telur yang diletakkan). Setiap perlakuan diulang sebanyak 8 kali.
Analisis kromatografi gas dan deteksi pola antena elektron (GC-EAD) dari An.arabiensis betina dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [20]. Secara singkat, ekstrak volatil ruang kepala segar dipisahkan menggunakan Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, AS) yang dilengkapi dengan kolom HP-5 (id 30 m × 0,25 mm, ketebalan film 0,25 μm, Agilent Technologies). dan urin yang menua.Hidrogen digunakan sebagai fase mobil dengan laju alir linier rata-rata 45 cm s-1.Setiap sampel (2 μl) disuntikkan selama 30 detik dalam mode splitless dengan suhu masuk 225 °C.Suhu oven GC diprogram dari 35 °C (tahan 3 menit) hingga 300 °C (tahan 10 menit) pada 10 °C min-1.Dalam pemisah efluen GC, 4 psi nitrogen ditambahkan dan dibagi 1:1 dalam persilangan volume mati rendah Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) antara detektor ionisasi nyala dan EAD.Kapiler efluen GC untuk EAD dilewatkan melalui jalur transfer Gerstel ODP-2, yang melacak suhu oven GC ditambah 5 °C, ke dalam tabung gelas (10 cm × 8 mm), di mana ia dicampur dengan karbon yang disaring, udara lembab (1,5 l menit−1). Antena ditempatkan 0,5 cm dari outlet tabung. Setiap nyamuk individu menyumbang satu replikasi, dan untuk nyamuk pencari inang, setidaknya tiga replikasi dilakukan pada sampel urin setiap usia.
Identifikasi senyawa bioaktif dalam koleksi ruang kepala urin sapi segar dan tua menggunakan gabungan GC dan spektrometer massa (GC-MS; 6890 GC dan 5975 MS; Agilent Technologies) untuk memperoleh respons antena dalam analisis GC-EAD, yang beroperasi dalam mode ionisasi dampak elektron pada 70 eV. GC dilengkapi dengan kolom kapiler silika lebur berlapis HP-5MS UI (60 m × 0,25 mm diameter dalam, ketebalan film 0,25 μm) menggunakan helium sebagai fase gerak dengan laju aliran linier rata-rata 35 cm s-1. Sampel 2 μl disuntikkan menggunakan pengaturan injektor dan suhu oven yang sama seperti untuk analisis GC-EAD. Senyawa diidentifikasi berdasarkan waktu retensi (indeks Kovát) dan spektrum massa dibandingkan dengan pustaka khusus dan pustaka NIST14 (Agilent). Senyawa yang teridentifikasi dikonfirmasi dengan menyuntikkan standar autentik (File Tambahan 1: Tabel S2).Untuk kuantifikasi, heptil asetat (10 ng, kemurnian kimia 99,8%, Aldrich) disuntikkan sebagai standar eksternal.
Mengevaluasi kemanjuran campuran bau sintetis yang terdiri dari senyawa bioaktif yang diidentifikasi dalam urin segar dan lama untuk menarik Ans.arabiensis pencari inang dan penghisap darah, menggunakan olfaktometer dan protokol yang sama seperti di atas. Campuran sintetis meniru komposisi dan proporsi senyawa dalam ekstrak volatil ruang kepala campuran urin segar, 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 168 jam (Gambar 5D-G; File Tambahan 1: Tabel S2). Untuk analisis, gunakan 10 μl pengenceran 1:100 dari campuran sintetis penuh, dengan laju pelepasan keseluruhan berkisar sekitar 140-2400 ng h-1, untuk menilai daya tarik bagi nyamuk inang dan penghisap darah. Setelah itu, pengujian dilakukan pada campuran lengkap, di mana campuran subtraktif dari senyawa tunggal dari campuran lengkap dihilangkan. Mencari respons dari inang dan Ans. Arab yang diberi darah vs campuran sintetis dan subtraktif dianalisis menggunakan regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk rasio ganjil (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Untuk mengkaji apakah urin sapi dapat berfungsi sebagai habitat inang bagi nyamuk malaria, urin sapi segar dan lama yang dikumpulkan seperti dijelaskan di atas, dan air ditempatkan dalam ember berjaring 3 l (100 ml) dan dipasang dalam perangkap umpan inang. (versi BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Sepuluh perangkap ditempatkan dengan jarak 50 m di padang rumput, 400 m dari komunitas desa (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) dan tidak ada ternak, di tempat perkembangbiakan permanen dan desa-desa. Lima perangkap dipanaskan untuk mensimulasikan keberadaan inang, sementara lima perangkap dibiarkan tidak dipanaskan. Setiap lokasi perawatan dirotasi setiap malam selama total lima malam. Jumlah nyamuk yang ditangkap dalam perangkap yang diberi umpan urin dengan usia yang berbeda dibandingkan menggunakan regresi logistik dengan distribusi binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Di sebuah desa endemis malaria dekat kota Maki, wilayah Oromia, Ethiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Gambar 6A). Penelitian dilakukan antara pertengahan Agustus dan pertengahan September sebelum penyemprotan residu dalam ruangan tahunan, bersamaan dengan musim hujan yang panjang. Lima pasang rumah (berjarak 20–50 m) yang terletak di pinggiran desa dipilih untuk penelitian (Gbr. 6A). Kriteria yang digunakan untuk memilih rumah adalah: tidak ada hewan yang diizinkan di dalam rumah, tidak diizinkan memasak di dalam ruangan (mengambil kayu bakar atau arang) (setidaknya selama periode percobaan), dan rumah dengan maksimal dua penghuni, tidur tanpa insektisida. di bawah kelambu yang telah diberi perlakuan. Persetujuan etis telah diberikan oleh Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) dari Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam (CNS-IRB), Universitas Addis Ababa, sesuai dengan pedoman yang ditetapkan oleh Deklarasi Helsinki dari Asosiasi Medis Dunia. Persetujuan dari setiap kepala keluarga diperoleh dengan bantuan staf penyuluhan kesehatan. Seluruh proses ini disetujui oleh pemerintah daerah di tingkat distrik dan bangsal ('kebele'). Desain percobaan mengikuti desain kotak Latin 2 × 2, di mana campuran sintetis dan kontrol diberikan ke rumah-rumah yang dipasangkan pada malam pertama dan ditukar antar-rumah pada malam percobaan berikutnya. Proses ini diulang sepuluh kali. Selain itu, untuk memperkirakan aktivitas nyamuk di rumah-rumah terpilih, perangkap CDC diatur untuk berjalan lima malam berturut-turut di awal, tengah, dan akhir uji lapangan pada waktu yang sama setiap hari.
Campuran sintetis yang mengandung enam senyawa bioaktif dilarutkan dalam heptana (pelarut 97,0% mutu GC, Sigma Aldrich) dan dilepaskan pada 140 ng h-1 menggunakan dispenser sumbu kapas [20]. Dispenser sumbu memungkinkan semua senyawa dilepaskan dalam proporsi konstan selama percobaan 12 jam. Heptana digunakan sebagai kontrol. Botol digantung di sebelah titik masuk perangkap cahaya Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, AS; Gambar 6A). Perangkap digantung 0,8 – 1 m di atas tanah, dekat kaki tempat tidur, dan seorang relawan tidur di bawah kelambu yang tidak dirawat dan dioperasikan antara pukul 18:00 dan 06:30. Nyamuk yang ditangkap berdasarkan jenis kelamin dan status fisiologis (tidak diberi makan, diberi makan, setengah hamil, dan hamil [21] kemudian disaring menggunakan analisis reaksi berantai polimerase (PCR) untuk mengidentifikasi spesies yang secara morfologis diidentifikasi sebagai A. gambiae Anggota kompleks [23]. Dalam studi lapangan, perangkap perangkap rumah berpasangan dianalisis menggunakan model kecocokan logistik nominal, di mana daya tarik adalah variabel dependen dan perlakuan (campuran sintetis vs kontrol) adalah efek tetap (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Di sini, kami melaporkan nilai χ2 dan p dari uji rasio kemungkinan.
Mengevaluasi apakah aman.arabiensis mampu memperoleh urin, sumber nitrogen utamanya, urea, dengan pemberian makanan langsung, dalam waktu 48 jam setelah pemberian selama 4 hari pasca (dpe) percobaan pemberian makanan pada betina yang mencari inang dan yang diberi makan darah (Gbr. 1A). Baik betina yang mencari inang maupun yang menghisap darah menyerap sukrosa secara signifikan lebih banyak daripada makanan atau air lainnya (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 dan F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, masing-masing; Gbr. 1B,C). Lebih jauh lagi, betina yang mencari inang makan lebih sedikit dalam urin pada 72 jam dibandingkan dengan urin pada 168 jam (Gbr. 1B). Ketika diberi makanan yang mengandung urea, betina yang mencari inang menyerap urea dalam jumlah yang jauh lebih banyak pada 2,69 mM dibandingkan dengan semua konsentrasi dan air lainnya, sementara tidak dapat dibedakan dari sukrosa 10%. (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Gambar 1D). Ini berbeda dengan respons betina yang diberi makan darah, yang biasanya menyerap lebih banyak makanan yang mengandung urea daripada air, meskipun secara signifikan kurang dari 10% sukrosa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Gambar 1).1E). Lebih jauh lagi, ketika membandingkan antara dua keadaan fisiologis, betina yang diflebotomi menyerap lebih banyak urea daripada betina yang mencari inang pada konsentrasi terendah, dan betina ini menyerap jumlah urea yang sama pada konsentrasi yang lebih tinggi (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Gambar 1F, G). Sementara asupan dari makanan yang mengandung urea tampaknya memiliki nilai optimal (Gambar 1D,E), betina dalam kedua keadaan fisiologis mampu memodulasi jumlah urea yang diserap pada seluruh rentang konsentrasi urea. secara log-linier (Gambar 1F,G).).Demikian pula, nyamuk tampaknya mengendalikan penyerapan nitrogennya dengan mengatur jumlah urin yang diserap, karena jumlah nitrogen dalam urin tercermin dalam jumlah yang diserap (sisipan Gambar 1B, C dan B).
Untuk menilai efek urin dan urea pada kelangsungan hidup nyamuk pencari inang dan penghisap darah, nyamuk betina diberi urin dari keempat umur (segar, 24 jam, 72 jam, dan 168 jam pasca-deposisi) dan berbagai konsentrasi urea, serta air suling dan sukrosa 10% berfungsi sebagai kontrol (Gambar 2A). Analisis kelangsungan hidup ini menunjukkan bahwa diet memiliki efek signifikan pada kelangsungan hidup keseluruhan pada nyamuk betina pencari inang (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Gambar 2B, C) dan nyamuk betina yang diberi darah (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Gambar 2D,E). Dalam semua percobaan, betina yang diberi diet urin, urea, dan air memiliki tingkat kelangsungan hidup yang lebih rendah secara signifikan dibandingkan dengan betina yang diberi diet sukrosa (Gambar 2B-E). Betina pencari inang yang diberi urin segar dan basi menunjukkan tingkat kelangsungan hidup yang berbeda, dengan yang diberi urin basi 72 jam (p = 0,016) memiliki probabilitas kelangsungan hidup terendah (Gbr. 2B). Lebih jauh lagi, betina pencari inang yang diberi urea 135 mM bertahan hidup lebih lama daripada kontrol air (p < 0,04) (Gbr. 2C). Dibandingkan dengan air, wanita yang diberi urin segar dan urin 24 jam bertahan hidup lebih lama (masing-masing p = 0,001 dan p = 0,012; Gambar 2D), sementara wanita yang diberi urin 72 jam bertahan hidup lebih lama daripada yang diberi urin segar pendek betina dan urin berumur 24 jam (masing-masing p < 0,0001 dan p = 0,013; Gambar 2D).Ketika diberi 135 mM urea, betina yang diberi darah bertahan hidup lebih lama daripada semua konsentrasi urea dan air lainnya (p < 0,013; Gambar 2E).
Kelangsungan hidup nyamuk Anopheles arabinis betina penghisap darah dan inang yang memakan urin sapi dan urea. Dalam uji hayati (A), nyamuk betina diberi makanan yang terdiri dari urin sapi segar dan tua, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%) dan air suling (H2O). Kelangsungan hidup nyamuk pencari inang (B, C) dan penghisap darah (D, E) dicatat setiap 12 jam sampai semua nyamuk betina yang memakan urin (B, D) dan urea (C, E), dan kontrol, Sukrosa dan air, mati.
Total jarak dan jumlah putaran yang ditentukan dalam uji pabrik penerbangan selama periode 24 jam berbeda antara nyamuk pencari inang dan penghisap darah, yang menunjukkan aktivitas terbang yang lebih sedikit secara keseluruhan (Gbr. 3). Nyamuk pencari inang yang menyediakan urin segar dan tua atau sukrosa dan air menunjukkan pola terbang yang berbeda (Gbr. 3), dengan nyamuk betina yang memakan urin segar lebih aktif saat fajar, sementara yang diberi makan berusia 24 dan 168 jam. Nyamuk yang memakan urin menunjukkan pola terbang yang berbeda dan terutama diurnal. Nyamuk betina yang menyediakan sukrosa atau urin 72 jam menunjukkan aktivitas sepanjang periode 24 jam, sementara nyamuk betina yang menyediakan air lebih aktif selama pertengahan periode. Nyamuk yang diberi sukrosa menunjukkan tingkat aktivitas tertinggi pada larut malam dan dini hari, sementara yang menelan urin berusia 72 jam mengalami penurunan aktivitas yang stabil selama 24 jam (Gambar 3).
Performa terbang nyamuk Anopheles arabinis betina penghisap darah yang mencari mangsa dengan memakan urin sapi dan urea. Dalam uji terbang, nyamuk betina yang diberi makan urin sapi segar dan tua, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) diikatkan pada lengan horizontal yang berputar bebas (atas). Untuk nyamuk betina yang mencari inang (kiri) dan penghisap darah (kanan), total jarak dan jumlah terbang per jam untuk setiap pola makan selama periode 24 jam dicatat (gelap: abu-abu; terang: putih). Jarak rata-rata dan jumlah rata-rata serangan ditunjukkan di sebelah kanan grafik aktivitas sirkadian. Batang kesalahan menunjukkan kesalahan standar rata-rata. Analisis statistik lihat teks
Secara umum, aktivitas terbang keseluruhan dari betina pencari inang mengikuti pola yang mirip dengan jarak terbang selama periode 24 jam. Jarak terbang rata-rata dipengaruhi secara signifikan oleh makanan yang ditelan (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), dan betina pencari inang yang menelan urin selama 72 jam terbang dalam jarak yang jauh lebih jauh dibandingkan dengan semua makanan lainnya (p < 0,0001), dan nyamuk yang diberi makan sukrosa terbang lebih lama daripada nyamuk yang diberi makan urin segar (p = 0,022) dan nyamuk yang diberi makan urin berumur 24 jam (p = 0,022). Berbeda dengan pola aktivitas terbang yang dijelaskan oleh makanan urin, betina pencari inang yang diberi makan urea menunjukkan aktivitas terbang yang terus-menerus selama periode 24 jam, memuncak selama paruh kedua fase gelap (Gbr. 3). Meskipun pola aktivitasnya serupa, betina pencari inang yang diberi makan urea secara signifikan meningkatkan jarak terbang rata-rata tergantung pada konsentrasi yang diserap (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Betina pencari inang yang diberi urea dalam konsentrasi berapa pun terbang lebih lama daripada betina yang diberi air atau sukrosa (p < 0,03).
Aktivitas terbang keseluruhan nyamuk penghisap darah stabil dan berlangsung selama 24 jam di seluruh pola makan, dengan peningkatan aktivitas urine selama paruh kedua periode gelap untuk nyamuk betina yang diberi air serta pada nyamuk betina yang diberi makan air segar dan berumur 24 jam (gambar 3). Sementara pola makan urine secara signifikan mempengaruhi jarak terbang rata-rata pada nyamuk betina yang diberi darah (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), pola makan urea tidak mempengaruhi (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) dengan urine lain dan pola makan kontrol (segar, p = 0.0091; 72 jam, p = 0.0022; 168 jam, p = 0.001; sukrosa, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036).
Efek pemberian urin dan urea pada parameter reproduksi dinilai dalam uji hayati bertelur (Gambar 4A) dan diselidiki menurut jumlah telur yang diletakkan oleh setiap betina, ukuran telur, dan larva instar pertama yang baru menetas. Jumlah telur yang diletakkan. Betina Arab yang diberi urin bervariasi berdasarkan pola makan (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Gambar 4B). Betina yang diberi makanan urin dan darah selama 24 jam bertelur secara signifikan lebih banyak daripada betina yang diberi makanan urin lainnya dan serupa dengan yang diberi sukrosa (Gambar 4B). Demikian pula, ukuran telur yang diletakkan oleh betina yang diberi urin bervariasi berdasarkan pola makan (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), dengan betina yang diberi urin dan sukrosa selama 24 jam bertelur secara signifikan lebih besar daripada betina yang diberi makan air, sementara telur betina yang diberi urin selama 168 jam secara signifikan lebih kecil (Gambar. 4C). Selain itu, diet urin secara signifikan mempengaruhi ukuran larva (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), dengan larva yang secara signifikan lebih besar muncul dari telur yang diletakkan oleh betina berumur 24 dan 72 jam yang diberi makan urin dibandingkan dari telur yang diletakkan oleh larva betina berumur 24 dan 72 jam yang diberi makan urin dibandingkan dari telur yang diletakkan oleh larva betina berumur 24 dan 72 jam yang diberi makan urin (Gambar 4D).
Kinerja reproduksi Anopheles arabinis betina yang memakan urin sapi dan urea. Nyamuk betina yang diberi makan darah diberi diet yang terdiri dari urin sapi segar dan tua, berbagai konsentrasi urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) selama 48 jam sebelum dimasukkan ke dalam bioassay dan memperoleh substrat bertelur selama 48 jam (A). Jumlah telur (B, E), ukuran telur (C, F) dan ukuran larva (D, G) secara signifikan dipengaruhi oleh diet yang diberikan (urin sapi: BD; urea: EG). Rata-rata untuk setiap parameter yang diukur menggunakan nama huruf yang berbeda secara signifikan berbeda satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05). Batang kesalahan mewakili kesalahan standar rata-rata
Sebagai komponen nitrogen utama dalam urin, urea, ketika diberikan sebagai makanan untuk betina yang diberi darah, secara signifikan mempengaruhi parameter reproduksi dalam semua penelitian. Jumlah telur yang diletakkan oleh betina yang diberi urea, setelah makan darah, tergantung pada konsentrasi urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), betina yang diberi konsentrasi urea antara 134 µM dan 1,34 mM bertelur lebih banyak (Gambar 4E). Betina yang diberi konsentrasi urea 134 µM atau lebih bertelur lebih besar daripada betina yang diberi air (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Gambar 4F), dan ukuran larva, meskipun dipengaruhi oleh konsentrasi urea yang sama pada induknya (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) lebih bervariasi (Gbr. 4G).
Daya tarik keseluruhan terhadap ekstrak volatil ruang kepala urin sapi yang mencari inang.Arabiensis yang dinilai dalam olfaktometer tabung kaca (Gbr. 5A) secara signifikan dipengaruhi oleh usia urin (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Gbr. 5B).Analisis post hoc menunjukkan bahwa bau urin basi pada 24 jam menyebabkan tingkat daya tarik yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan semua perlakuan lainnya (72 jam: p = 0,0060, 168 jam: p = 0,012, pentana: p = 0,00070), Kecuali untuk bau urin segar (p = 0,13; Gambar 5B).Meskipun daya tarik keseluruhan nyamuk penghisap darah terhadap bau urin tidak berbeda secara signifikan (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Gbr. 5C), betina ini ditemukan secara signifikan lebih menarik terhadap ekstrak volatil ruang kepala dibandingkan dengan Urine berumur 72 jam dibandingkan dengan kontrol (p = 0,0066; Gambar 5C).
Respons perilaku terhadap bau urin sapi alami dan sintetis dalam pencarian inang dan Anopheles arabianus yang menghisap darah. Skema olfaktometer tabung gelas (A). Daya tarik ekstrak volatil ruang kepala dari urin sapi segar dan tua ke inang (B) dan nyamuk penghisap darah (C). Temukan reaksi tentakel Lord An. Ekstrak ruang kepala yang diisolasi dari urin sapi segar (D), 24 jam (E), 72 jam (F), dan 168 jam (G) ditunjukkan. Jejak deteksi antena elektron (EAD) menunjukkan perubahan tegangan sebagai respons terhadap senyawa bioaktif di ruang kepala yang dielusi dari kromatografi gas dan dideteksi oleh detektor ionisasi nyala (FID). Batang skala mewakili amplitudo respons (mV) versus waktu retensi (s). Properti dan laju pelepasan (µg h-1) dari senyawa aktif biologis ditunjukkan. Tanda bintang tunggal (*) menunjukkan respons amplitudo rendah yang konsisten. Tanda bintang ganda (**) menunjukkan respons yang tidak dapat direproduksi respons.Temukan inang (H) dan penghisap darah (I) An.arabiensis memiliki daya tarik yang berbeda terhadap campuran sintetis bau urin sapi segar dan tua.Proporsi rata-rata nyamuk yang tertarik pada nama huruf yang berbeda secara signifikan berbeda satu sama lain (ANOVA satu arah menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0,05).Batang kesalahan mewakili kesalahan standar skala
Ann.arabiensis betina, 72 jam dan 120 jam setelah menghisap darah, selama pemijahan, tidak menunjukkan preferensi terhadap ekstrak volatil ruang kepala dari urin sapi segar dan tua dibandingkan dengan kontrol pentana (χ2 = 3,07, p > 0,05; Berkas tambahan 1: Gambar S1).
Untuk Ann.arabiensis betina, analisis GC-EAD dan GC-MS mengidentifikasi delapan, enam, tiga, dan tiga senyawa bioaktif (Gambar 5D-G). Meskipun perbedaan dalam jumlah senyawa yang menimbulkan respons elektrofisiologis diamati, sebagian besar senyawa ini terdapat dalam setiap ekstrak volatil headspace yang dikumpulkan dari urin segar dan lama. Oleh karena itu, untuk setiap ekstrak, hanya senyawa yang menghasilkan respons fisiologis dari antena betina di atas ambang batas yang disertakan dalam analisis lebih lanjut.
Total laju pelepasan senyawa volatil bioaktif dalam koleksi headspace meningkat dari 29 µg h-1 dalam urin segar menjadi 242 µg h-1 dalam urin yang berumur 168 jam, terutama karena peningkatan p-kresol dan m-formaldehida Fenol serta fenol. Sebaliknya, laju pelepasan senyawa lain, seperti 2-sikloheksen-1-on dan dekanal, menurun seiring bertambahnya umur urin, yang berkorelasi dengan penurunan yang diamati dalam intensitas sinyal (kelimpahan) dalam kromatogram (Gbr. 5D)-G panel kiri) dan respons fisiologis terhadap senyawa ini (Gbr. 5D-G panel kanan).
Secara keseluruhan, campuran sintetis tersebut memiliki rasio alami senyawa bioaktif serupa yang diidentifikasi dalam ekstrak volatil dari ruang kepala urin segar dan lama (Gbr. 5D–G) dan tampaknya tidak menimbulkan daya tarik signifikan dalam pencarian inang (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Gbr. 5H) atau nyamuk penghisap darah (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Gbr. 5I). Namun, perbandingan berpasangan post hoc antara perlakuan menunjukkan bahwa nyamuk pencari inang secara signifikan menarik bagi campuran sintetis urin lama 24 jam dibandingkan dengan kontrol pentana (p = 0,0086; Gambar 5H).
Untuk mengkaji peran komponen-komponen individual dalam campuran sintetis urin berumur 24 jam, enam campuran subtraktif dievaluasi terhadap campuran lengkap dalam uji tabung-Y, di mana senyawa-senyawa individual dihilangkan. Bagi nyamuk pencari inang, pengurangan senyawa-senyawa individual dari campuran lengkap memiliki efek signifikan pada respons perilaku (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Berkas tambahan 1: Gambar S2A), semua campuran subtraktif lebih menarik daripada yang lebih kecil daripada yang tercampur sepenuhnya. Sebaliknya, penghilangan senyawa-senyawa individual dari campuran sintetis penuh tidak memengaruhi respons perilaku nyamuk penghisap darah (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), dengan pengecualian dekanal, yang menghasilkan kadar yang lebih rendah dibandingkan dengan campuran lengkap Daya Tarik (p = 0,022; Berkas Tambahan 1: Gambar S2B).
Di sebuah desa endemis malaria di Ethiopia, kemanjuran campuran sintetis urin sapi 24 jam dalam menarik nyamuk di bawah kondisi lapangan dievaluasi selama sepuluh malam (Gbr. 6A). Sebanyak 4.861 nyamuk ditangkap dan diidentifikasi, yang mana 45,7% adalah Anthropus.gambiae sl, 18,9% adalah Anopheles pharoensis dan 35,4% adalah Culex spp. (File tambahan 1: Tabel S1). Anopheles arabinis adalah satu-satunya anggota kompleks spesies An.Gambian yang diidentifikasi dengan analisis PCR. Rata-rata, 320 nyamuk ditangkap per malam, selama waktu itu perangkap dengan umpan campuran sintetis menangkap lebih banyak nyamuk daripada perangkap berpasangan tanpa campuran (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Perangkap tanpa umpan dipasang pada masing-masing dari lima malam kontrol di awal, tengah, dan akhir percobaan. Jumlah nyamuk yang tertangkap pada setiap perangkap pasangan serupa, yang menunjukkan tidak ada bias antar rumah (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) dan tidak ada penurunan populasi selama periode penelitian. Dibandingkan dengan perangkap kontrol, jumlah nyamuk yang tertangkap pada perangkap berisi campuran sintetis meningkat secara signifikan: mencari inang (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), baru saja menghisap darah (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) dan kehamilan (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Berkas tambahan 1: Tabel S1). Hal ini juga tercermin pada jumlah total nyamuk yang tertangkap: mencari inang > menghisap darah > hamil > setengah hamil > jantan.
Evaluasi lapangan tentang kemanjuran campuran bau urin sapi sintetis selama 24 jam. Uji coba lapangan dilakukan di Ethiopia tengah-selatan (peta), dekat kota Maki (sisipan), menggunakan perangkap cahaya Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) (kanan) di rumah-rumah berpasangan, dengan desain kotak Latin (gambar udara) (A). Fotoperangkap CDC dengan umpan bau sintetis menarik dan menangkap nyamuk Anopheles arabesque betina (B), tetapi tidak Anopheles farroes (C), dengan cara yang berbeda, efek yang bergantung pada keadaan fisiologis. Selain itu, perangkap ini menangkap jumlah nyamuk Culex inang yang meningkat secara signifikan. (D) Dibandingkan dengan kontrol. Batang di sebelah kiri menunjukkan indeks seleksi rata-rata nyamuk yang tertangkap dalam perangkap umpan bau (hijau) dan kontrol (terbuka) berpasangan (N = 10), sedangkan batang di sebelah kanan menunjukkan indeks seleksi rata-rata dalam perangkap kontrol berpasangan (terbuka; N = 5). ).Tanda bintang menunjukkan tingkat signifikansi statistik (*p = 0,01 dan ***p < 0,0001)
Ketiga spesies ditangkap secara berbeda dalam perangkap yang berisi campuran sintetis. Mencari inang (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), menghisap darah (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) dan kebuntingan (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) a.arabiensis terperangkap dalam perangkap yang melepaskan campuran sintetis (Gbr. 6B), sedangkan jumlah An tidak berbeda. Pharoensis dalam berbagai keadaan fisiologis ditemukan (Gbr. 6C). Untuk Culex, hanya peningkatan signifikan dalam jumlah nyamuk yang mencari inang ditemukan dalam perangkap yang diberi umpan campuran sintetis (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Gbr. 6D), dibandingkan dengan perangkap kontrol.
Perangkap umpan inang yang ditempatkan di luar inang potensial antara lokasi perkembangbiakan dan komunitas pedesaan di Ethiopia digunakan untuk menilai apakah nyamuk malaria menggunakan bau urin sapi sebagai isyarat habitat inang. Dengan tidak adanya isyarat inang, panas, dan dengan atau tanpa adanya bau urin sapi, tidak ada nyamuk yang tertangkap (Berkas Tambahan 1: Gambar S3). Namun, dengan adanya suhu tinggi dan bau urin sapi, nyamuk malaria betina tertarik dan tertangkap, meskipun dalam jumlah kecil, terlepas dari usia urin (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Berkas Tambahan 1: Gambar S3). Sebaliknya, kontrol air tidak menangkap nyamuk malaria pada suhu tinggi (Berkas Tambahan 1: Gambar S3).
Nyamuk malaria memperoleh dan mendistribusikan senyawa yang mengandung nitrogen melalui pemberian makan kompensasi pada urin sapi (yaitu, genangan air) untuk meningkatkan sifat riwayat hidup, mirip dengan serangga lainnya [2, 4, 24, 25, 26]. Urine sapi merupakan sumber daya terbarukan yang tersedia dan erat kaitannya dengan tempat istirahat vektor malaria, seperti kandang sapi dan tumbuhan tinggi yang dekat dengan rumah pedesaan dan tempat pemijahan. Nyamuk betina menemukan sumber daya ini melalui penciuman dan mampu mengatur penyerapan senyawa nitrogen dalam urin, termasuk urea, komponen nitrogen utama dalam urin [15, 16]. Bergantung pada keadaan fisiologis nyamuk betina, nutrisi dalam urin dialokasikan untuk meningkatkan aktivitas terbang dan kelangsungan hidup nyamuk betina yang mencari inang, serta kelangsungan hidup dan karakteristik reproduksi individu yang diberi makan darah selama siklus gonadotropik pertama. Oleh karena itu, pencampuran urin memainkan peran nutrisi penting bagi vektor malaria yang tertutup seperti orang dewasa yang kekurangan gizi [8], karena memberikan nyamuk betina kemampuan untuk memperoleh senyawa nitrogen penting dengan melakukan aktivitas berisiko rendah. pemberian makan. Penemuan ini memiliki konsekuensi epidemiologis yang signifikan, karena betina meningkatkan harapan hidup, aktivitas, dan hasil reproduksi mereka, yang semuanya memengaruhi kapasitas vektor. Lebih jauh lagi, perilaku ini mungkin menjadi target program pengelolaan vektor di masa mendatang.