Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Korsel yang menampilkan tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus.
Baru-baru ini, platform antimikroba bebas bahan kimia berdasarkan nanoteknologi menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS) telah dikembangkan. EWNS memiliki muatan permukaan yang tinggi dan jenuh dengan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan sejumlah mikroorganisme, termasuk patogen bawaan makanan. Di sini ditunjukkan bahwa sifat-sifatnya selama sintesis dapat disetel dengan baik dan dioptimalkan untuk lebih meningkatkan potensi antibakterinya. Platform laboratorium EWNS dirancang untuk menyempurnakan sifat-sifat EWNS dengan mengubah parameter sintesis. Karakterisasi sifat-sifat EWNS (muatan, ukuran, dan kandungan ROS) menggunakan metode analisis modern. Selain itu, mereka dievaluasi untuk potensi inaktivasi mikroba mereka terhadap mikroorganisme bawaan makanan seperti Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum, dan Saccharomyces cerevisiae. Hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa sifat-sifat EWNS dapat disetel dengan baik selama sintesis, yang menghasilkan peningkatan eksponensial dalam efisiensi inaktivasi. Secara khusus, muatan permukaan meningkat empat kali lipat dan spesies oksigen reaktif meningkat. Laju penghilangan mikroba bergantung pada mikroba dan berkisar antara 1,0 hingga 3,8 log setelah paparan 45 menit terhadap dosis aerosol 40.000 #/cc EWNS.
Kontaminasi mikroba merupakan penyebab utama penyakit bawaan makanan yang disebabkan oleh konsumsi patogen atau toksinnya. Di Amerika Serikat saja, penyakit bawaan makanan menyebabkan sekitar 76 juta penyakit, 325.000 pasien dirawat di rumah sakit, dan 5.000 kematian setiap tahun1. Selain itu, Departemen Pertanian Amerika Serikat (USDA) memperkirakan bahwa peningkatan konsumsi produk segar bertanggung jawab atas 48% dari semua penyakit bawaan makanan yang dilaporkan di Amerika Serikat2. Biaya penyakit dan kematian yang disebabkan oleh patogen bawaan makanan di Amerika Serikat sangat tinggi, diperkirakan oleh Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) lebih dari US$15,6 miliar per tahun3.
Saat ini, intervensi antimikroba kimia4, radiasi5 dan termal6 untuk memastikan keamanan pangan sebagian besar dilakukan di titik kendali kritis (CCP) terbatas di sepanjang rantai produksi (biasanya setelah panen dan/atau selama pengemasan) daripada secara terus-menerus. Dengan demikian, intervensi tersebut rentan terhadap kontaminasi silang. 7. Pengendalian yang lebih baik terhadap penyakit bawaan makanan dan pembusukan makanan memerlukan intervensi antimikroba yang berpotensi dapat diterapkan di seluruh rangkaian pertanian hingga meja makan sekaligus mengurangi dampak dan biaya lingkungan.
Baru-baru ini, platform antimikroba berbasis nanoteknologi bebas bahan kimia telah dikembangkan yang dapat menonaktifkan bakteri permukaan dan udara menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS). EWNS disintesis menggunakan dua proses paralel, elektrospray dan ionisasi air (Gbr. 1a). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa EWNS memiliki serangkaian sifat fisik dan biologis yang unik8,9,10. EWNS memiliki rata-rata 10 elektron per struktur dan ukuran skala nano rata-rata 25 nm (Gbr. 1b,c)8,9,10. Selain itu, resonansi spin elektron (ESR) menunjukkan bahwa EWNS mengandung sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS), terutama radikal hidroksil (OH•) dan superoksida (O2-) (Gbr. 1c)8. EVNS berada di udara untuk waktu yang lama dan dapat bertabrakan dengan mikroorganisme yang tersuspensi di udara dan hadir di permukaan, mengirimkan muatan ROS mereka dan menyebabkan inaktivasi mikroorganisme (Gbr. 1d). Studi awal ini juga menunjukkan bahwa EWNS dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan berbagai bakteri gram negatif dan gram positif, termasuk mikobakteri, di permukaan dan di udara. Mikroskopi elektron transmisi menunjukkan bahwa inaktivasi tersebut disebabkan oleh gangguan pada membran sel. Selain itu, studi inhalasi akut telah menunjukkan bahwa dosis tinggi EWNS tidak menyebabkan kerusakan paru-paru atau peradangan 8 .
(a) Penyemprotan listrik terjadi ketika tegangan tinggi diberikan antara tabung kapiler berisi cairan dan elektroda lawan. (b) Penerapan tekanan tinggi menghasilkan dua fenomena berbeda: (i) penyemprotan listrik air dan (ii) pembentukan spesies oksigen reaktif (ion) yang terperangkap dalam EWNS. (c) Struktur unik EWNS. (d) Karena sifatnya yang berskala nano, EWNS sangat mudah bergerak dan dapat berinteraksi dengan patogen di udara.
Kemampuan platform antimikroba EWNS untuk menonaktifkan mikroorganisme bawaan makanan pada permukaan makanan segar juga baru-baru ini ditunjukkan. Telah ditunjukkan pula bahwa muatan permukaan EWNS yang dikombinasikan dengan medan listrik dapat digunakan untuk mencapai pengiriman yang ditargetkan. Selain itu, hasil awal untuk tomat organik setelah paparan selama 90 menit pada EWNS sekitar 50.000 #/cm3 cukup menggembirakan, dengan berbagai mikroorganisme bawaan makanan seperti E. coli dan Listeria 11 yang diamati. Selain itu, uji organoleptik awal tidak menunjukkan efek sensoris dibandingkan dengan tomat kontrol. Meskipun hasil inaktivasi awal ini menggembirakan untuk aplikasi keamanan pangan bahkan pada dosis EWNS yang sangat rendah yaitu 50.000#/cc. lihat, jelas bahwa potensi inaktivasi yang lebih tinggi akan lebih bermanfaat untuk lebih mengurangi risiko infeksi dan pembusukan.
Di sini, kami akan memfokuskan penelitian kami pada pengembangan platform pembangkitan EWNS untuk memungkinkan penyempurnaan parameter sintesis dan pengoptimalan sifat fisikokimia EWNS untuk meningkatkan potensi antibakterinya. Secara khusus, pengoptimalan difokuskan pada peningkatan muatan permukaannya (untuk meningkatkan pengiriman yang ditargetkan) dan kandungan ROS (untuk meningkatkan efisiensi inaktivasi). Mengkarakterisasi sifat fisikokimia yang dioptimalkan (ukuran, muatan, dan kandungan ROS) menggunakan metode analitis modern dan menggunakan mikroorganisme makanan umum seperti E. .
EVNS disintesis melalui penyemprotan listrik dan ionisasi air dengan kemurnian tinggi (18 MΩ cm–1) secara bersamaan. Nebulizer listrik 12 biasanya digunakan untuk atomisasi cairan dan sintesis partikel polimer dan keramik 13 serta serat 14 dengan ukuran yang terkontrol.
Seperti yang dijelaskan secara rinci dalam publikasi sebelumnya 8, 9, 10, 11, dalam percobaan yang umum, tegangan tinggi diterapkan antara kapiler logam dan elektroda lawan yang diarde. Selama proses ini, dua fenomena berbeda terjadi: i) penyemprotan elektro dan ii) ionisasi air. Medan listrik yang kuat antara kedua elektroda menyebabkan muatan negatif terbentuk di permukaan air yang terkondensasi, sehingga menghasilkan pembentukan kerucut Taylor. Akibatnya, tetesan air bermuatan tinggi terbentuk, yang terus terpecah menjadi partikel yang lebih kecil, seperti dalam teori Rayleigh16. Pada saat yang sama, medan listrik yang kuat menyebabkan beberapa molekul air terbelah dan melepaskan elektron (terionisasi), yang mengarah pada pembentukan sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS)17. ROS18 yang dihasilkan secara bersamaan dienkapsulasi dalam EWNS (Gbr. 1c).
Pada gambar 2a menunjukkan sistem pembangkitan EWNS yang dikembangkan dan digunakan dalam sintesis EWNS dalam penelitian ini. Air murni yang disimpan dalam botol tertutup dimasukkan melalui tabung Teflon (diameter dalam 2 mm) ke dalam jarum baja tahan karat 30G (kapiler logam). Aliran air dikontrol oleh tekanan udara di dalam botol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b. Jarum dipasang pada konsol Teflon dan dapat disesuaikan secara manual pada jarak tertentu dari elektroda lawan. Elektroda lawan adalah cakram aluminium yang dipoles dengan lubang di tengah untuk pengambilan sampel. Di bawah elektroda lawan terdapat corong pengambilan sampel aluminium, yang dihubungkan ke seluruh perangkat eksperimen melalui port pengambilan sampel (Gbr. 2b). Untuk menghindari penumpukan muatan yang dapat mengganggu pengoperasian pengambil sampel, semua komponen pengambil sampel diarde secara elektrik.
(a) Sistem Pembangkit Nanostruktur Air Rekayasa (EWNS). (b) Potongan melintang alat pengambil sampel dan semprotan elektro, yang menunjukkan parameter terpenting. (c) Pengaturan eksperimen untuk inaktivasi bakteri.
Sistem pembangkitan EWNS yang dijelaskan di atas mampu mengubah parameter operasi utama untuk memfasilitasi penyempurnaan properti EWNS. Sesuaikan tegangan yang diberikan (V), jarak antara jarum dan elektroda lawan (L), dan aliran air (φ) melalui kapiler untuk menyempurnakan karakteristik EWNS. Simbol yang digunakan untuk mewakili berbagai kombinasi: [V (kV), L (cm)]. Sesuaikan aliran air untuk mendapatkan kerucut Taylor yang stabil dengan himpunan tertentu [V, L]. Untuk tujuan penelitian ini, diameter bukaan elektroda lawan (D) dipertahankan pada 0,5 inci (1,29 cm).
Karena keterbatasan geometri dan asimetri, kekuatan medan listrik tidak dapat dihitung dari prinsip dasar. Sebagai gantinya, perangkat lunak QuickField™ (Svendborg, Denmark)19 digunakan untuk menghitung medan listrik. Medan listrik tidak seragam, sehingga nilai medan listrik di ujung kapiler digunakan sebagai nilai referensi untuk berbagai konfigurasi.
Selama penelitian, beberapa kombinasi tegangan dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktifitas. Berbagai kombinasi ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1.
Output dari sistem pembangkit EWNS dihubungkan langsung ke Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) untuk pengukuran konsentrasi jumlah partikel, serta ke Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) untuk arus aerosol diukur seperti yang dijelaskan dalam publikasi kami sebelumnya. Baik SMPS maupun elektrometer aerosol diambil sampelnya pada laju alir 0,5 L/menit (aliran sampel total 1 L/menit). Konsentrasi jumlah partikel dan aliran aerosol diukur selama 120 detik. Pengukuran diulang sebanyak 30 kali. Berdasarkan pengukuran arus, total muatan aerosol dihitung dan muatan EWNS rata-rata diperkirakan untuk sejumlah total partikel EWNS terpilih. Biaya rata-rata EWNS dapat dihitung menggunakan Persamaan (1):
di mana IEl adalah arus terukur, NSMPS adalah konsentrasi digital yang diukur dengan SMPS, dan φEl adalah laju aliran per elektrometer.
Karena kelembaban relatif (RH) mempengaruhi muatan permukaan, suhu dan (RH) dijaga konstan selama percobaan pada 21°C dan 45%, masing-masing.
Mikroskopi gaya atom (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) dan probe AC260T (Olympus, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengukur ukuran dan masa pakai EWNS. Frekuensi pemindaian AFM adalah 1 Hz, area pemindaian adalah 5 μm × 5 μm, dan 256 garis pindai. Semua gambar dikenai penyelarasan gambar orde 1 menggunakan perangkat lunak Asylum (jangkauan masker 100 nm, ambang batas 100 pm).
Corong uji dilepaskan dan permukaan mika ditempatkan pada jarak 2,0 cm dari elektroda lawan selama waktu rata-rata 120 detik untuk menghindari penggumpalan partikel dan pembentukan tetesan tidak beraturan pada permukaan mika. EWNS disemprotkan langsung ke permukaan mika yang baru dipotong (Ted Pella, Redding, CA). Gambar permukaan mika segera setelah sputtering AFM. Sudut kontak permukaan mika yang baru dipotong dan tidak dimodifikasi mendekati 0°, sehingga EVNS didistribusikan pada permukaan mika dalam bentuk kubah. Diameter (a) dan tinggi (h) tetesan yang berdifusi diukur langsung dari topografi AFM dan digunakan untuk menghitung volume difusi kubah EWNS menggunakan metode kami yang telah divalidasi sebelumnya. Dengan asumsi EWNS di dalam pesawat memiliki volume yang sama, diameter ekuivalen dapat dihitung menggunakan Persamaan (2):
Berdasarkan metode yang kami kembangkan sebelumnya, perangkap spin resonansi spin elektron (ESR) digunakan untuk mendeteksi keberadaan perantara radikal berumur pendek di EWNS. Aerosol digelembungkan melalui sparger Midget 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) yang berisi larutan DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) 235 mM (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Semua pengukuran ESR dilakukan menggunakan spektrometer Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, AS) dan sel panel datar. Perangkat lunak Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, AS) digunakan untuk mengumpulkan dan menganalisis data. Penentuan karakteristik ROS dilakukan hanya untuk serangkaian kondisi operasi [-6,5 kV, 4,0 cm]. Konsentrasi EWNS diukur menggunakan SMPS setelah memperhitungkan kehilangan EWNS pada penumbuk.
Tingkat ozon dipantau menggunakan 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Untuk semua atribut EWNS, nilai rata-rata digunakan sebagai nilai pengukuran, dan simpangan baku digunakan sebagai kesalahan pengukuran. Uji-T dilakukan untuk membandingkan nilai atribut EWNS yang dioptimalkan dengan nilai EWNS dasar yang sesuai.
Gambar 2c menunjukkan sistem "tarik" presipitasi elektrostatik (EPES) yang dikembangkan dan dikarakterisasi sebelumnya yang dapat digunakan untuk pengiriman EWNS yang ditargetkan di permukaan. EPES menggunakan muatan EVNS yang dapat "dipandu" langsung ke permukaan target di bawah pengaruh medan listrik yang kuat. Rincian sistem EPES disajikan dalam publikasi terbaru oleh Pyrgiotakis et al. 11 . Dengan demikian, EPES terdiri dari ruang PVC cetak 3D dengan ujung meruncing dan berisi dua pelat logam baja tahan karat paralel (baja tahan karat 304, dilapisi cermin) di bagian tengah dengan jarak 15,24 cm. Papan dihubungkan ke sumber tegangan tinggi eksternal (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), pelat bawah selalu dihubungkan ke tegangan positif, dan pelat atas selalu dihubungkan ke tanah (tanah mengambang). Dinding ruang ditutupi dengan aluminium foil, yang diarde secara elektrik untuk mencegah hilangnya partikel. Ruangan tersebut memiliki pintu pemuatan depan tertutup yang memungkinkan permukaan uji diletakkan pada dudukan plastik yang mengangkatnya di atas pelat logam bawah untuk menghindari gangguan tegangan tinggi.
Efisiensi deposisi EWNS dalam EPES dihitung berdasarkan protokol yang dikembangkan sebelumnya yang dirinci dalam Gambar Tambahan S111.
Sebagai ruang kontrol, ruang aliran silinder kedua dihubungkan secara seri ke sistem EPES, di mana filter HEPA perantara digunakan untuk menghilangkan EWNS. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2c, aerosol EWNS dipompa melalui dua ruang yang terpasang. Filter antara ruang kontrol dan EPES menghilangkan EWNS yang tersisa sehingga menghasilkan suhu (T), kelembapan relatif (RH), dan tingkat ozon yang sama.
Mikroorganisme penting yang ditularkan melalui makanan telah ditemukan mengontaminasi makanan segar seperti E. coli (ATCC #27325), indikator tinja, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen yang ditularkan melalui makanan, Listeria tidak berbahaya (ATCC #33090), pengganti Listeria monocytogenes patogen, yang berasal dari ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), pengganti ragi pembusuk, dan bakteri yang dinonaktifkan yang lebih resistan, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Belilah tomat anggur organik dalam kotak-kotak acak dari pasar lokal dan simpan dalam lemari es pada suhu 4°C hingga digunakan (hingga 3 hari). Semua tomat percobaan berukuran sama, berdiameter sekitar 1/2 inci.
Protokol kultur, inokulasi, paparan, dan penghitungan koloni dirinci dalam publikasi kami sebelumnya dan dirinci dalam Data Tambahan. Efektivitas EWNS dievaluasi dengan memaparkan tomat yang diinokulasi pada 40.000 #/cm3 selama 45 menit. Secara singkat, tiga tomat digunakan untuk mengevaluasi mikroorganisme yang bertahan hidup pada waktu t = 0 menit. Tiga tomat ditempatkan dalam EPES dan dipaparkan pada EWNS pada 40.000 #/cc (tomat yang terpapar EWNS) dan tiga tomat sisanya ditempatkan di ruang kontrol (tomat kontrol). Pemrosesan tambahan tomat pada kedua kelompok tidak dilakukan. Tomat yang terpapar EWNS dan tomat kontrol dikeluarkan setelah 45 menit untuk mengevaluasi efek EWNS.
Setiap percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Analisis data dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam Data Tambahan.
Mekanisme inaktivasi dinilai dengan sedimentasi sampel EWNS yang terpapar (45 menit pada konsentrasi aerosol EWNS 40.000 #/cm3) dan sampel bakteri E. coli, Salmonella enterica, dan Lactobacillus yang tidak diradiasi. Partikel difiksasi dalam 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehid, dan 0,03% asam pikrat dalam buffer natrium kakodilat 0,1 M (pH 7,4) selama 2 jam pada suhu ruangan. Setelah dicuci, fiksasi akhir dengan 1% osmium tetroksida (OsO4)/1,5% kalium ferrosianida (KFeCN6) selama 2 jam, cuci 3 kali dalam air dan inkubasi dalam 1% uranil asetat selama 1 jam, lalu cuci dua kali dalam air, lalu dehidrasi selama 10 menit dalam alkohol 50%, 70%, 90%, 100%. Sampel kemudian ditempatkan dalam propilena oksida selama 1 jam dan diresapi dengan campuran 1:1 propilena oksida dan TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Sampel dibenamkan dalam TAAB Epon dan dipolimerisasi pada suhu 60°C selama 48 jam. Resin granular yang diawetkan dipotong dan divisualisasikan melalui TEM menggunakan mikroskop elektron transmisi konvensional JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, AS).
Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Untuk setiap titik waktu, pencucian bakteri disemai dalam rangkap tiga, menghasilkan total sembilan titik data per titik, yang rata-ratanya digunakan sebagai konsentrasi bakteri untuk mikroorganisme tertentu. Simpangan baku digunakan sebagai kesalahan pengukuran. Semua titik dihitung.
Logaritma penurunan konsentrasi bakteri dibandingkan dengan t = 0 menit dihitung menggunakan rumus berikut:
di mana C0 adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu 0 (yaitu setelah permukaan mengering tetapi sebelum ditempatkan di dalam bilik) dan Cn adalah konsentrasi bakteri pada permukaan setelah n menit pemaparan.
Untuk memperhitungkan degradasi alami bakteri selama paparan 45 menit, pengurangan log dibandingkan dengan kontrol setelah 45 menit juga dihitung sebagai berikut:
di mana Cn adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu n dan Cn-Kontrol adalah konsentrasi bakteri kontrol pada waktu n. Data disajikan sebagai pengurangan logaritma dibandingkan dengan kontrol (tanpa paparan EWNS).
Selama penelitian, beberapa kombinasi voltase dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktifitas. Berbagai kombinasi ditunjukkan dalam Tabel Tambahan S1. Dua kasus yang menunjukkan sifat stabil dan reproduktif (kerucut Taylor, pembentukan EWNS, dan stabilitas dari waktu ke waktu) dipilih untuk studi komprehensif. Pada gbr. Gambar 3 menunjukkan hasil untuk muatan, ukuran, dan kandungan ROS dalam kedua kasus. Hasilnya juga ditunjukkan dalam Tabel 1. Sebagai referensi, Gambar 3 dan Tabel 1 menyertakan sifat-sifat EWNS8, 9, 10, 11 yang tidak dioptimalkan yang disintesis sebelumnya (baseline-EWNS). Perhitungan signifikansi statistik menggunakan uji-t dua sisi dipublikasikan ulang dalam Tabel Tambahan S2. Selain itu, data tambahan mencakup studi tentang efek diameter lubang pengambilan sampel elektroda lawan (D) dan jarak antara elektroda arde dan ujung (L) (Gambar Tambahan S2 dan S3).
(ac) Distribusi ukuran diukur dengan AFM. (df) Karakteristik muatan permukaan. (g) Karakterisasi ROS dari EPR.
Penting juga untuk dicatat bahwa untuk semua kondisi di atas, arus ionisasi yang diukur adalah antara 2 dan 6 μA dan tegangan antara -3,8 dan -6,5 kV, sehingga menghasilkan konsumsi daya kurang dari 50 mW untuk modul kontak pembangkit EWNS tunggal ini. Meskipun EWNS disintesis di bawah tekanan tinggi, kadar ozon sangat rendah, tidak pernah melebihi 60 ppb.
Gambar Tambahan S4 menunjukkan medan listrik yang disimulasikan untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm]. Untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], perhitungan medan masing-masing adalah 2 × 105 V/m dan 4,7 × 105 V/m. Hal ini diharapkan, karena dalam kasus kedua rasio tegangan-jarak jauh lebih tinggi.
Pada gambar 3a,b menunjukkan diameter EWNS yang diukur dengan AFM8. Diameter EWNS rata-rata yang dihitung adalah 27 nm dan 19 nm untuk skema [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm]. Untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], simpangan baku geometrik dari distribusinya masing-masing adalah 1,41 dan 1,45, yang menunjukkan distribusi ukuran yang sempit. Baik ukuran rata-rata maupun simpangan baku geometrik sangat dekat dengan EWNS dasar, masing-masing pada 25 nm dan 1,41. Pada gambar 3c menunjukkan distribusi ukuran EWNS dasar yang diukur menggunakan metode yang sama dalam kondisi yang sama.
Pada gambar 3d,e menunjukkan hasil karakterisasi muatan. Data adalah pengukuran rata-rata dari 30 pengukuran simultan konsentrasi (#/cm3) dan arus (I). Analisis menunjukkan bahwa muatan rata-rata pada EWNS adalah 22 ± 6 e- dan 44 ± 6 e- untuk [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm]. Muatan permukaannya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan EWNS dasar (10 ± 2 e-), dua kali lebih besar dari skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan empat kali lebih besar dari [-3,8 kV, 0,5 cm]. Gambar 3f menunjukkan data muatan untuk EWNS Dasar.
Dari peta konsentrasi jumlah EWNS (Gambar Tambahan S5 dan S6), dapat dilihat bahwa skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] memiliki partikel yang jauh lebih banyak daripada skenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Perlu dicatat juga bahwa konsentrasi jumlah EWNS dipantau hingga 4 jam (Gambar Tambahan S5 dan S6), di mana stabilitas pembangkitan EWNS menunjukkan tingkat konsentrasi jumlah partikel yang sama dalam kedua kasus.
Pada gambar 3g menunjukkan spektrum EPR setelah pengurangan kontrol EWNS yang dioptimalkan (latar belakang) pada [-6,5 kV, 4,0 cm]. Spektrum ROS juga dibandingkan dengan skenario Baseline-EWNS dalam karya yang diterbitkan sebelumnya. Jumlah EWNS yang bereaksi dengan perangkap spin dihitung menjadi 7,5 × 104 EWNS/s, yang mirip dengan Baseline-EWNS8 yang diterbitkan sebelumnya. Spektrum EPR dengan jelas menunjukkan keberadaan dua jenis ROS, dengan O2- sebagai spesies yang dominan dan OH• yang kurang melimpah. Selain itu, perbandingan langsung intensitas puncak menunjukkan bahwa EWNS yang dioptimalkan memiliki kandungan ROS yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan EWNS dasar.
Pada gambar 4 menunjukkan efisiensi pengendapan EWNS dalam EPES. Data tersebut juga dirangkum dalam Tabel I dan dibandingkan dengan data EWNS asli. Untuk kedua kasus EUNS, pengendapan mendekati 100% bahkan pada tegangan rendah 3,0 kV. Biasanya, 3,0 kV cukup untuk pengendapan 100%, terlepas dari perubahan muatan permukaan. Dalam kondisi yang sama, efisiensi pengendapan Baseline-EWNS hanya 56% karena muatannya yang lebih rendah (rata-rata 10 elektron per EWNS).
Pada gambar 5 dan tabel 2 diringkas nilai inaktivasi mikroorganisme yang diinokulasi pada permukaan tomat setelah terpapar sekitar 40.000 #/cm3 EWNS selama 45 menit pada mode optimum [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli dan Lactobacillus innocuous yang diinokulasi menunjukkan penurunan signifikan sebesar 3,8 log selama paparan 45 menit. Dalam kondisi yang sama, S. enterica mengalami penurunan sebesar 2,2 log, sedangkan S. cerevisiae dan M. parafortutum mengalami penurunan sebesar 1,0 log.
Mikrograf elektron (Gambar 6) menggambarkan perubahan fisik yang disebabkan oleh EWNS pada sel Escherichia coli, Streptococcus, dan Lactobacillus yang tidak berbahaya yang menyebabkan inaktivasinya. Bakteri kontrol memiliki membran sel yang utuh, sedangkan bakteri yang terpapar memiliki membran luar yang rusak.
Pencitraan mikroskopis elektron pada bakteri kontrol dan bakteri yang terpapar menunjukkan kerusakan membran.
Data tentang sifat fisikokimia EWNS yang dioptimalkan secara kolektif menunjukkan bahwa sifat-sifat (muatan permukaan dan kandungan ROS) EWNS ditingkatkan secara signifikan dibandingkan dengan data dasar EWNS yang dipublikasikan sebelumnya8,9,10,11. Di sisi lain, ukurannya tetap dalam kisaran nanometer, sangat mirip dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya, yang memungkinkannya tetap berada di udara untuk jangka waktu yang lama. Polidispersitas yang diamati dapat dijelaskan oleh perubahan muatan permukaan yang menentukan ukuran EWNS, keacakan efek Rayleigh, dan potensi koalesensi. Namun, seperti yang dijelaskan oleh Nielsen et al.22, muatan permukaan yang tinggi mengurangi penguapan dengan secara efektif meningkatkan energi/tegangan permukaan tetesan air. Dalam publikasi kami sebelumnya8 teori ini dikonfirmasi secara eksperimental untuk tetesan mikro22 dan EWNS. Kehilangan muatan selama lembur juga dapat memengaruhi ukuran dan berkontribusi pada distribusi ukuran yang diamati.