Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan carousel tiga slide sekaligus.Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk menelusuri tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk menelusuri tiga slide sekaligus.
Penghalang darah-otak dan penghalang darah-otak mencegah agen bioterapi mencapai target mereka di sistem saraf pusat, sehingga menghambat pengobatan penyakit saraf yang efektif.Untuk menemukan pengangkut otak baru secara in vivo, kami memperkenalkan perpustakaan peptida fag T7 dan darah yang dikumpulkan secara serial dan cairan serebrospinal (CSF) menggunakan model kolam besar tikus yang sadar dan terkanulasi.Klon fag tertentu sangat diperkaya dalam CSF setelah empat putaran seleksi.Pengujian peptida kandidat individu mengungkapkan pengayaan lebih dari 1000 kali lipat di CSF.Bioaktivitas pengiriman yang dimediasi peptida ke otak dikonfirmasi oleh penurunan 40% pada tingkat amiloid-β dalam cairan serebrospinal menggunakan penghambat peptida BACE1 yang dikaitkan dengan peptida transit baru yang diidentifikasi.Hasil ini menunjukkan bahwa peptida yang diidentifikasi dengan metode seleksi fag in vivo dapat menjadi kendaraan yang berguna untuk pengiriman makromolekul sistemik ke otak dengan efek terapeutik.
Penelitian terapi bertarget sistem saraf pusat (SSP) sebagian besar berfokus pada mengidentifikasi obat dan agen yang dioptimalkan yang menunjukkan sifat penargetan SSP, dengan sedikit upaya untuk menemukan mekanisme yang mendorong pengiriman obat aktif ke otak.Ini mulai berubah sekarang karena pengiriman obat, terutama molekul besar, merupakan bagian integral dari pengembangan obat ilmu saraf modern.Lingkungan sistem saraf pusat dilindungi dengan baik oleh sistem penghalang serebrovaskular, yang terdiri dari penghalang darah-otak (BBB) ​​​​dan penghalang darah-otak (BCBB)1, sehingga sulit untuk mengantarkan obat ke otak1,2.Diperkirakan hampir semua obat molekul besar dan lebih dari 98% obat molekul kecil dieliminasi dari otak3.Itulah mengapa sangat penting untuk mengidentifikasi sistem transportasi otak baru yang memberikan pengiriman obat terapeutik yang efisien dan spesifik ke SSP 4,5.Namun, BBB dan BCSFB juga menghadirkan peluang bagus untuk penghantaran obat karena mereka menembus dan memasuki semua struktur otak melalui pembuluh darahnya yang luas.Dengan demikian, upaya saat ini untuk menggunakan metode pengiriman non-invasif ke otak sebagian besar didasarkan pada mekanisme transportasi yang dimediasi reseptor (PMT) menggunakan reseptor BBB6 endogen.Meskipun kemajuan kunci baru-baru ini menggunakan jalur reseptor transferin7,8, pengembangan lebih lanjut dari sistem pengiriman baru dengan sifat yang lebih baik diperlukan.Untuk tujuan ini, tujuan kami adalah untuk mengidentifikasi peptida yang mampu memediasi transportasi CSF, karena pada prinsipnya dapat digunakan untuk mengirimkan makromolekul ke SSP atau untuk membuka jalur reseptor baru.Secara khusus, reseptor dan transporter spesifik dari sistem serebrovaskular (BBB dan BSCFB) dapat berfungsi sebagai target potensial untuk pengiriman obat bioterapi yang aktif dan spesifik.Cairan serebrospinal (CSF) adalah produk sekretorik dari pleksus koroid (CS) dan berhubungan langsung dengan cairan interstitial otak melalui ruang subarachnoid dan ruang ventrikel4.Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa cairan serebrospinal subarachnoid berdifusi secara berlebihan ke dalam interstitium otak9.Kami berharap dapat mengakses ruang parenkim menggunakan saluran masuk subarachnoid ini atau langsung melalui BBB.Untuk mencapai ini, kami menerapkan strategi pemilihan fag in vivo yang kuat yang secara ideal mengidentifikasi peptida yang diangkut oleh salah satu dari dua jalur berbeda ini.
Kami sekarang menjelaskan metode skrining tampilan fag in vivo berurutan dengan pengambilan sampel CSF ditambah dengan high throughput sequencing (HTS) untuk memantau putaran seleksi awal dengan keragaman perpustakaan tertinggi.Skrining dilakukan pada tikus yang sadar dengan kanula cisterna (CM) besar yang ditanam secara permanen untuk menghindari kontaminasi darah.Yang penting, pendekatan ini memilih penargetan otak dan peptida dengan aktivitas transportasi melintasi penghalang serebrovaskular.Kami menggunakan fag T7 karena ukurannya yang kecil (~60 nm)10 dan menyatakan bahwa fag ini cocok untuk pengangkutan vesikel yang memungkinkan penyeberangan transelular dari penghalang endotel dan/atau epitel-medula.Setelah empat putaran panning, populasi fag diisolasi menunjukkan pengayaan CSF ​​in vivo yang kuat dan asosiasi pembuluh mikro serebral.Yang penting, kami dapat mengkonfirmasi temuan kami dengan menunjukkan bahwa peptida kandidat terbaik yang disukai dan disintesis secara kimiawi mampu mengangkut muatan protein ke dalam cairan serebrospinal.Pertama, efek farmakodinamik dari SSP ditetapkan dengan menggabungkan peptida transit terkemuka dengan penghambat peptida BACE1.Selain menunjukkan bahwa strategi penyaringan fungsional in vivo dapat mengidentifikasi peptida transpor otak baru sebagai pembawa muatan protein yang efektif, kami berharap pendekatan seleksi fungsional serupa juga menjadi penting dalam mengidentifikasi jalur transpor otak baru.
Berdasarkan unit pembentuk plak (PFU), setelah langkah pengemasan fag, perpustakaan peptida fag T7 linier 12-mer acak dengan keragaman sekitar 109 dirancang dan dibuat (lihat Bahan dan Metode).Penting untuk dicatat bahwa kami dengan hati-hati menganalisis pustaka ini sebelum melakukan panning in vivo.Amplifikasi PCR dari sampel pustaka fag menggunakan primer yang dimodifikasi menghasilkan amplikon yang langsung dapat diterapkan ke HTS (Gambar Tambahan 1a).Karena a) kesalahan sekuensing HTS11, b) berdampak pada kualitas primer (NNK) 1-12, dan c) adanya fag tipe liar (wt) (sisipan kerangka) di perpustakaan siaga, prosedur pemfilteran urutan diimplementasikan untuk mengekstrak hanya informasi urutan yang diverifikasi (Gambar Tambahan 1b).Langkah-langkah filter ini berlaku untuk semua pustaka pengurutan HTS.Untuk perpustakaan standar, total 233.868 bacaan diperoleh, 39% di antaranya lulus kriteria filter dan digunakan untuk analisis dan pemilihan perpustakaan untuk putaran berikutnya (Gambar Tambahan 1c – e).Pembacaan sebagian besar adalah kelipatan dari 3 pasangan basa dengan puncak pada 36 nukleotida (Gambar Tambahan 1c), yang mengkonfirmasi desain perpustakaan (NNK) 1-12.Khususnya, sekitar 11% dari anggota perpustakaan berisi insert PAGISRELVDKL 12-dimensi wild-type (wt), dan hampir setengah dari urutan (49%) berisi penyisipan atau penghapusan.HTS dari perpustakaan perpustakaan mengkonfirmasi keragaman peptida yang tinggi di perpustakaan: lebih dari 81% sekuens peptida hanya ditemukan sekali dan hanya 1,5% terjadi pada ≥4 salinan (Gambar Tambahan 2a).Frekuensi asam amino (aa) di semua 12 posisi dalam repertoar berkorelasi baik dengan frekuensi yang diharapkan untuk jumlah kodon yang dihasilkan oleh repertoar NKK yang merosot (Gambar Tambahan 2b).Frekuensi yang diamati dari residu aa yang dikodekan oleh sisipan ini berkorelasi baik dengan frekuensi yang dihitung (r = 0, 893) (Gambar Tambahan 2c).Persiapan perpustakaan fag untuk injeksi meliputi langkah-langkah amplifikasi dan penghilangan endotoksin.Ini sebelumnya telah terbukti berpotensi mengurangi keragaman perpustakaan fag12,13.Oleh karena itu, kami mengurutkan pustaka fag yang diamplifikasi pelat yang telah mengalami penghilangan endotoksin dan membandingkannya dengan pustaka asli untuk memperkirakan frekuensi AA.Korelasi yang kuat (r = 0, 995) diamati antara kumpulan asli dan kumpulan yang diamplifikasi dan dimurnikan (Gambar Tambahan 2d), menunjukkan bahwa persaingan antara klon yang diamplifikasi pada pelat menggunakan fag T7 tidak menyebabkan bias besar.Perbandingan ini didasarkan pada frekuensi motif tripeptida di setiap pustaka, karena keragaman pustaka (~109) tidak dapat ditangkap sepenuhnya bahkan dengan HTS.Analisis frekuensi aa di setiap posisi mengungkapkan bias kecil yang bergantung pada posisi di tiga posisi terakhir dari repertoar yang dimasukkan (Gambar Tambahan 2e).Sebagai kesimpulan, kami menyimpulkan bahwa kualitas dan keragaman perpustakaan dapat diterima dan hanya sedikit perubahan keragaman yang diamati karena amplifikasi dan persiapan perpustakaan fag antara beberapa putaran seleksi.
Pengambilan sampel cairan serebrospinal serial dapat dilakukan dengan pembedahan menanamkan kanula ke dalam CM tikus yang sadar untuk memfasilitasi identifikasi fag T7 yang disuntikkan secara intravena (iv) melalui BBB dan / atau BCSFB (Gbr. 1a-b).Kami menggunakan dua lengan seleksi independen (lengan A dan B) dalam tiga putaran pertama seleksi in vivo (Gbr. 1c).Kami secara bertahap meningkatkan ketatnya seleksi dengan mengurangi jumlah total fag yang diperkenalkan dalam tiga putaran pertama seleksi.Untuk panning putaran keempat, kami menggabungkan sampel dari cabang A dan B dan melakukan tiga pilihan independen tambahan.Untuk mempelajari sifat in vivo partikel fag T7 dalam model ini, fag tipe liar (insert master PAGISRELVDKL) disuntikkan ke tikus melalui vena ekor.Pemulihan fag dari cairan serebrospinal dan darah pada titik waktu yang berbeda menunjukkan bahwa fag ikosahedral T7 yang relatif kecil memiliki fase pembersihan awal yang cepat dari kompartemen darah (Gambar Tambahan 3).Berdasarkan titer yang diberikan dan volume darah tikus, kami menghitung bahwa hanya sekitar 1% berat.fag dari dosis yang diberikan terdeteksi dalam darah 10 menit setelah injeksi intravena.Setelah penurunan cepat awal ini, klirens primer yang lebih lambat diukur dengan waktu paruh 27,7 menit.Yang penting, hanya sedikit fag yang diambil dari kompartemen CSF, menunjukkan latar belakang rendah untuk migrasi fag tipe liar ke dalam kompartemen CSF (Gambar Tambahan 3).Rata-rata, hanya sekitar 1 x 10-3% titer fag T7 dalam darah dan 4 x 10-8% fag yang diinfus awal terdeteksi dalam cairan serebrospinal selama seluruh periode pengambilan sampel (0-250 menit).Khususnya, waktu paruh (25,7 menit) fag tipe liar dalam cairan serebrospinal mirip dengan yang diamati dalam darah.Data ini menunjukkan bahwa penghalang yang memisahkan kompartemen CSF dari darah masih utuh pada tikus yang dikanulasi CM, memungkinkan pemilihan perpustakaan fag secara in vivo untuk mengidentifikasi klon yang siap diangkut dari darah ke dalam kompartemen CSF.
(a) Menyiapkan metode pengambilan sampel ulang cairan serebrospinal (CSF) dari kolam besar.(b) Diagram yang menunjukkan lokasi seluler dari penghalang sistem saraf pusat (SSP) dan strategi pemilihan yang digunakan untuk mengidentifikasi peptida yang melintasi penghalang darah-otak (BBB) ​​​​dan penghalang darah-otak.( c ) Bagan alur penyaringan tampilan fag in vivo.Di setiap putaran seleksi, fag (pengidentifikasi hewan di dalam panah) disuntikkan secara intravena.Dua cabang alternatif independen (A, B) disimpan secara terpisah hingga pemilihan putaran ke-4.Untuk putaran seleksi 3 dan 4, setiap klon fag yang diekstraksi dari CSF diurutkan secara manual.( d ) Kinetika fag yang diisolasi dari darah (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (segitiga hijau) selama putaran pertama seleksi pada dua tikus yang dikanulasi setelah injeksi intravena perpustakaan peptida T7 (2 x 1012 fag / hewan).Kotak biru menunjukkan konsentrasi awal rata-rata fag dalam darah, dihitung dari jumlah fag yang disuntikkan, dengan mempertimbangkan total volume darah.Kotak hitam menunjukkan titik perpotongan garis y yang diekstrapolasi dari konsentrasi fag darah.( e, f ) Sajikan frekuensi dan distribusi relatif dari semua kemungkinan motif tripeptida yang tumpang tindih yang ditemukan dalam peptida.Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 bacaan ditampilkan.Secara signifikan (p <0,001) motif yang diperkaya ditandai dengan titik merah.( e ) Correlation scatterplot membandingkan frekuensi relatif dari motif tripeptida dari perpustakaan yang disuntikkan dengan fag yang diturunkan dari darah dari hewan #1.1 dan #1.2.( f ) Correlation scatterplot membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida fag hewan #1.1 dan #1.2 yang diisolasi dalam darah dan cairan serebrospinal.( g, h ) Representasi ID urutan fag yang diperkaya dalam darah ( g ) versus perpustakaan yang disuntikkan dan fag yang diperkaya dalam CSF ( h ) versus darah setelah putaran seleksi in vivo pada kedua hewan.Besar kecilnya kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino tersebut muncul pada posisi tersebut.Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam dan hitam = asam amino hidrofobik.Gambar 1a, b dirancang dan diproduksi oleh Eduard Urich.
Kami menyuntikkan pustaka peptida fag ke dalam dua tikus instrumen CM (clade A dan B) dan mengisolasi fag dari cairan serebrospinal dan darah (Gambar 1d).Pembersihan cepat awal perpustakaan kurang menonjol dibandingkan dengan fag tipe liar.Waktu paruh rata-rata perpustakaan yang disuntikkan pada kedua hewan adalah 24,8 menit dalam darah, mirip dengan fag tipe liar, dan 38,5 menit dalam CSF.Sampel fag darah dan cairan serebrospinal dari masing-masing hewan menjadi sasaran HTS dan semua peptida yang teridentifikasi dianalisis untuk mengetahui adanya motif tripeptida pendek.Motif tripeptida dipilih karena memberikan dasar minimal untuk pembentukan struktur dan interaksi peptida-protein14,15.Kami menemukan korelasi yang baik dalam distribusi motif antara pustaka fag yang disuntikkan dan klon yang diekstraksi dari darah kedua hewan (Gbr. 1e).Data menunjukkan bahwa komposisi perpustakaan hanya sedikit diperkaya dalam kompartemen darah.Frekuensi asam amino dan urutan konsensus dianalisis lebih lanjut pada setiap posisi menggunakan adaptasi perangkat lunak Weblogo16.Menariknya, kami menemukan pengayaan yang kuat dalam residu glisin darah (Gbr. 1g).Ketika darah dibandingkan dengan klon yang dipilih dari CSF, seleksi yang kuat dan beberapa deseleksi motif diamati (Gbr. 1f), dan asam amino tertentu lebih disukai hadir pada posisi yang telah ditentukan pada 12 anggota (Gbr. 1h).Khususnya, masing-masing hewan berbeda secara signifikan dalam cairan serebrospinal, sedangkan pengayaan glisin darah diamati pada kedua hewan (Gambar Tambahan 4a-j).Setelah penyaringan data urutan yang ketat dalam cairan serebrospinal hewan # 1.1 dan # 1.2, total 964 dan 420 peptida 12-mer unik diperoleh (Gambar Tambahan 1d – e).Klon fag yang terisolasi diamplifikasi dan dilakukan seleksi in vivo putaran kedua.Fag yang diekstraksi dari seleksi putaran kedua menjadi sasaran HTS pada setiap hewan dan semua peptida yang teridentifikasi digunakan sebagai masukan untuk program pengenalan motif untuk menganalisis terjadinya motif tripeptida (Gbr. 2a, b, ef).Dibandingkan dengan siklus pertama fag yang dipulihkan dari CSF, kami mengamati seleksi lebih lanjut dan deseleksi banyak motif di CSF di cabang A dan B (Gbr. 2).Algoritme identifikasi jaringan diterapkan untuk menentukan apakah mereka mewakili pola yang berbeda dari urutan yang konsisten.Kesamaan yang jelas diamati antara urutan 12 dimensi yang dipulihkan oleh CSF dalam alternatif clade A (Gbr. 2c, d) dan clade B (Gbr. 2g, h).Analisis gabungan di setiap cabang mengungkapkan profil seleksi yang berbeda untuk peptida 12-mer (Gambar Tambahan 5c, d) dan peningkatan rasio CSF ​​/ titer darah dari waktu ke waktu untuk klon yang dikumpulkan setelah putaran kedua seleksi dibandingkan dengan putaran pertama seleksi (Gambar Tambahan 5e).).
Pengayaan motif dan peptida dalam cairan serebrospinal dengan dua putaran berturut-turut pemilihan tampilan fag fungsional in vivo.
Semua fag cairan serebrospinal pulih dari putaran pertama setiap hewan (hewan #1.1 dan #1.2) dikumpulkan, diamplifikasi, diurutkan HT dan disuntikkan kembali bersama (2 x 1010 fag/hewan) 2 tikus kanulasi SM (#1.1 → #).2.1 dan 2.2, 1.2 → 2.3 dan 2.4).( a, b, e, f ) Korelasi scatterplot membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida dari semua fag yang diturunkan CSF pada putaran seleksi pertama dan kedua.Frekuensi relatif dan distribusi motif mewakili semua kemungkinan tripeptida yang tumpang tindih yang ditemukan dalam peptida di kedua orientasi.Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 bacaan ditampilkan.Motif yang secara signifikan (p <0,001) dipilih atau dikecualikan di salah satu perpustakaan yang dibandingkan disorot dengan titik merah.(c, d, g, h) Representasi logo urutan dari semua urutan panjang 12 asam amino yang kaya CSF berdasarkan putaran 2 dan 1 seleksi in vivo.Besar kecilnya kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino tersebut muncul pada posisi tersebut.Untuk mewakili logo, frekuensi sekuens CSF yang diekstrak dari masing-masing hewan antara dua putaran seleksi dibandingkan dan sekuens yang diperkaya pada putaran kedua diperlihatkan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dan (h) #1.2–#2.4.Asam amino yang paling diperkaya pada posisi tertentu pada (c, d) hewan no.2.1 dan no.2.2 atau (g, h) pada hewan no.2.3 dan no.2.4 ditampilkan dalam warna.Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam dan hitam = asam amino hidrofobik.
Setelah seleksi putaran ketiga, kami mengidentifikasi 124 sekuens peptida unik (#3.1 dan #3.2) dari 332 klon fag yang dilarutkan CSF yang diisolasi dari dua hewan (Gambar Tambahan 6a).Urutan LGSVS (18,7%) memiliki proporsi relatif tertinggi, diikuti oleh sisipan tipe liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), dan SARGSWREIVSLS (2,2%).Di babak keempat terakhir, kami mengumpulkan dua cabang yang dipilih secara independen dari tiga hewan terpisah (Gbr. 1c).Dari 925 klon fag yang diurutkan yang dipulihkan dari CSF, pada putaran keempat kami menemukan 64 sekuens peptida unik (Gambar Tambahan 6b), di antaranya proporsi relatif dari fag tipe liar turun menjadi 0,8%.Klon CSF yang paling umum pada putaran keempat adalah LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) dan RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Kisaran panjang peptida yang dipilih adalah karena penyisipan / penghapusan nukleotida atau kodon stop prematur di primer perpustakaan saat menggunakan kodon degenerasi untuk desain perpustakaan NNK.Kodon stop prematur menghasilkan peptida yang lebih pendek dan dipilih karena mengandung motif aa yang disukai.Peptida yang lebih panjang dapat dihasilkan dari penyisipan/penghapusan di primer pustaka sintetik.Ini memposisikan kodon stop yang dirancang di luar bingkai dan membacanya sampai kodon stop baru muncul di hilir.Secara umum, kami menghitung faktor pengayaan untuk keempat putaran seleksi dengan membandingkan data masukan dengan data keluaran sampel.Untuk putaran pertama penyaringan, kami menggunakan titer fag tipe liar sebagai referensi latar belakang non-spesifik.Menariknya, pemilihan fag negatif sangat kuat pada siklus CSF pertama, tetapi tidak dalam darah (Gbr. 3a), yang mungkin disebabkan oleh rendahnya kemungkinan difusi pasif sebagian besar anggota perpustakaan peptida ke dalam kompartemen CSF atau fag relatif cenderung lebih efisien dipertahankan atau dihilangkan dari aliran darah daripada bakteriofag.Namun, pada putaran kedua panning, pemilihan fag yang kuat di CSF diamati pada kedua clade, menunjukkan bahwa putaran sebelumnya diperkaya dengan fag yang menampilkan peptida yang mendorong penyerapan CSF (Gbr. 3a).Sekali lagi, tanpa pengayaan darah yang signifikan.Juga di putaran ketiga dan keempat, klon fag diperkaya secara signifikan di CSF.Membandingkan frekuensi relatif dari setiap sekuens peptida unik antara dua putaran seleksi terakhir, kami menemukan bahwa sekuens tersebut bahkan lebih diperkaya pada putaran keempat seleksi (Gbr. 3b).Sebanyak 931 motif tripeptida diekstraksi dari semua 64 urutan peptida unik menggunakan kedua orientasi peptida.Motif yang paling diperkaya di babak keempat diperiksa lebih dekat untuk profil pengayaannya di semua putaran dibandingkan dengan perpustakaan yang disuntikkan (batas: pengayaan 10%) (Gambar Tambahan 6c).Pola seleksi umum menunjukkan bahwa sebagian besar motif yang dipelajari diperkaya di semua putaran sebelumnya dari kedua cabang seleksi.Namun, beberapa motif (mis. SGL, VSG, LGS GSV) sebagian besar berasal dari clade alternatif A, sementara yang lain (mis. FGW, RTN, WGF, NTR) diperkaya dengan clade alternatif B.
Validasi transpor CSF dari peptida yang ditampilkan fag yang diperkaya CSF dan peptida pemimpin terbiotinilasi yang terkonjugasi ke muatan streptavidin.
( a ) Rasio pengayaan dihitung dalam keempat putaran (R1-R4) berdasarkan titer fag (input = I) fag (PFU) yang disuntikkan dan titer fag CSF yang ditentukan (keluaran = O).Faktor pengayaan untuk tiga putaran terakhir (R2-R4) dihitung dengan membandingkan putaran sebelumnya dan putaran pertama (R1) dengan data bobot.Batang terbuka adalah cairan serebrospinal, batang yang diarsir adalah plasma.(*** p<0,001, berdasarkan uji-t Student).( B ) Daftar peptida fag yang paling banyak, diberi peringkat menurut proporsi relatifnya terhadap semua fag yang dikumpulkan dalam CSF setelah putaran 4 seleksi.Enam klon fag yang paling umum disorot dalam warna, nomor dan faktor pengayaannya antara putaran 3 dan 4 seleksi (inset).( c, d ) Enam klon fag yang paling diperkaya, perpustakaan fag kosong dan pustaka peptida fag orangtua dari putaran 4 dianalisis secara individual dalam model pengambilan sampel CSF.CSF dan sampel darah dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan.(c) Jumlah yang sama dari 6 klon fag kandidat (2 x 1010 fag/hewan), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/hewan) dan stok pustaka peptida fag (2 x 1012 fag/hewan) Suntikkan setidaknya 3 CM diberikan ke hewan yang dikanulasi secara terpisah melalui vena ekor.Farmakokinetik CSF dari setiap klon fag yang disuntikkan dan pustaka peptida fag dari waktu ke waktu ditampilkan.(d) menunjukkan rasio CSF/darah rata-rata untuk semua fag/mL yang dipulihkan selama waktu pengambilan sampel.( e ) Empat peptida pemimpin sintetik dan satu kontrol acak dihubungkan dengan biotin ke streptavidin melalui N-terminus (tampilan tetramer) diikuti dengan injeksi (vena ekor iv, 10 mg streptavidin / kg).Setidaknya tiga tikus yang diintubasi (N = 3).).Sampel CSF dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan dan konsentrasi streptavidin diukur dengan ELISA anti-streptavidin CSF (nd = tidak terdeteksi).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, berdasarkan uji ANOVA).( f ) Perbandingan urutan asam amino dari klon peptida fag yang paling diperkaya # 2002 (ungu) dengan klon peptida fag terpilih lainnya dari putaran seleksi ke-4.Fragmen asam amino yang identik dan serupa diberi kode warna.
Dari semua fag yang diperkaya pada putaran keempat (Gbr. 3b), enam kandidat klon dipilih untuk analisis individu lebih lanjut dalam model pengambilan sampel CSF.Jumlah yang sama dari enam kandidat fag, fag kosong (tanpa sisipan) dan pustaka peptida profag disuntikkan ke dalam tiga hewan CM yang dikanulasi, dan farmakokinetik ditentukan dalam pengujian CSF (Gambar 3c) dan darah (Gambar Tambahan 7).Semua klon fag yang diuji menargetkan kompartemen CSF pada level 10-1000 kali lebih tinggi daripada fag kontrol kosong (#1779).Misalnya, klon #2020 dan #2077 memiliki titer CSF sekitar 1000 kali lebih tinggi daripada fag kontrol.Profil farmakokinetik dari setiap peptida yang dipilih berbeda, tetapi semuanya memiliki kemampuan homing CSF yang tinggi.Kami mengamati penurunan konstan dari waktu ke waktu untuk klon #1903 dan #2011, sedangkan untuk klon #2077, #2002 dan #2009 peningkatan selama 10 menit pertama mungkin menunjukkan transpor aktif tetapi perlu diverifikasi.Klon #2020, #2002, dan #2077 stabil pada level tinggi, sedangkan konsentrasi CSF klon #2009 perlahan menurun setelah peningkatan awal.Kami kemudian membandingkan frekuensi relatif dari setiap kandidat CSF dengan konsentrasi darahnya (Gbr. 3d).Korelasi titer rata-rata dari setiap kandidat CSF dengan titer darahnya pada semua waktu pengambilan sampel menunjukkan bahwa tiga dari enam kandidat diperkaya secara signifikan dalam CSF darah.Menariknya, klon #2077 menunjukkan stabilitas darah yang lebih tinggi (Gambar Tambahan 7).Untuk mengonfirmasi bahwa peptida itu sendiri mampu secara aktif mengangkut kargo selain partikel fag ke dalam kompartemen CSF, kami mensintesis empat peptida pemimpin yang diturunkan dengan biotin di N-terminus tempat peptida menempel pada partikel fag.Peptida terbiotinilasi (no. 2002, 2009, 2020 dan 2077) dikonjugasikan dengan streptavidin (SA) untuk mendapatkan bentuk multimerik yang menyerupai geometri fag.Format ini juga memungkinkan kami untuk mengukur paparan SA dalam darah dan cairan serebrospinal sebagai peptida protein pengangkut kargo.Yang penting, data fag sering kali dapat direproduksi ketika peptida sintetik diberikan dalam format terkonjugasi-SA ini (Gbr. 3e).Peptida yang diacak memiliki paparan awal yang lebih sedikit dan pembersihan CSF lebih cepat dengan tingkat yang tidak terdeteksi dalam waktu 48 jam.Untuk mendapatkan wawasan tentang jalur pengiriman klon fag peptida ini ke dalam ruang CSF, kami menganalisis lokalisasi serangan peptida fag individu menggunakan imunohistokimia (IHC) untuk secara langsung mendeteksi partikel fag 1 jam setelah injeksi intravena in vivo.Khususnya, klon #2002, #2077, dan #2009 dapat dideteksi dengan pewarnaan yang kuat di kapiler otak, sementara fag kontrol (#1779) dan klon #2020 tidak terdeteksi (Gambar Tambahan 8).Ini menunjukkan bahwa peptida ini berkontribusi pada efek otak secara tepat dengan melintasi BBB.Analisis terperinci lebih lanjut diperlukan untuk menguji hipotesis ini, karena rute BSCFB mungkin juga terlibat.Saat membandingkan urutan asam amino dari klon yang paling diperkaya (#2002) dengan peptida terpilih lainnya, tercatat bahwa beberapa di antaranya memiliki ekstensi asam amino yang serupa, yang mungkin menunjukkan mekanisme transportasi yang serupa (Gbr. 3f).
Karena profil plasmanya yang unik dan peningkatan CSF yang signifikan dari waktu ke waktu, klon tampilan fag # 2077 dieksplorasi lebih lanjut selama periode 48 jam yang lebih lama dan mampu mereproduksi peningkatan cepat CSF yang diamati terkait dengan level SA yang berkelanjutan (Gbr. 4a).Mengenai klon fag lain yang teridentifikasi, # 2077 diwarnai dengan kuat untuk kapiler otak dan menunjukkan kolokalisasi yang signifikan dengan lektin penanda kapiler bila dilihat pada resolusi yang lebih tinggi dan mungkin beberapa pewarnaan di ruang parenkim (Gambar 4b).Untuk menyelidiki apakah efek farmakologis yang dimediasi peptida dapat diperoleh di SSP, kami melakukan percobaan di mana versi biotinilasi dari i) peptida transit #2077 dan peptida penghambat BACE1 dicampur dengan SA pada dua rasio berbeda.Untuk satu kombinasi kami hanya menggunakan penghambat peptida BACE1 dan untuk yang lain kami menggunakan rasio 1:3 dari penghambat peptida BACE1 dengan peptida #2077.Kedua sampel diberikan secara intravena dan kadar beta-amiloid peptida 40 (Abeta40) dalam darah dan cairan serebrospinal diukur dari waktu ke waktu.Abeta40 diukur dalam CSF karena mencerminkan penghambatan BACE1 di parenkim otak.Seperti yang diharapkan, kedua kompleks tersebut secara signifikan mengurangi kadar darah Abeta40 (Gbr. 4c, d).Namun, hanya sampel yang mengandung campuran peptida no.2077 dan penghambat peptida BACE1 terkonjugasi ke SA menyebabkan penurunan Abeta40 yang signifikan dalam cairan serebrospinal (Gbr. 4c).Data menunjukkan bahwa peptida no.2077 mampu mengangkut protein SA 60 kDa ke dalam SSP dan juga menginduksi efek farmakologis dengan inhibitor terkonjugasi SA dari peptida BACE1.
( a ) Injeksi klonal (2 × 10 fag / hewan) dari fag T7 yang menunjukkan profil farmakokinetik jangka panjang dari peptida CSF # 2077 (RLSSVDSDLSGC) dan fag kontrol yang tidak disuntikkan (# 1779) pada setidaknya tiga tikus yang diintubasi CM.( B ) Gambar mikroskopis confocal dari pembuluh mikro kortikal yang representatif pada tikus yang disuntik fag (2 × 10 10 fag / hewan) menunjukkan pewarnaan balik peptida # 2077 dan pembuluh (lektin).Klon fag ini diberikan kepada 3 tikus dan dibiarkan bersirkulasi selama 1 jam sebelum perfusi.Otak dipotong dan diwarnai dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap kapsid fag T7.Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, lektin berlabel DyLight594 diberikan secara intravena.Gambar neon menunjukkan pewarnaan lektin (merah) dari sisi luminal pembuluh mikro dan fag (hijau) di lumen kapiler dan jaringan otak perivaskular.Bilah skala sesuai dengan 10 µm.( c, d ) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide sendiri atau dalam kombinasi dengan biotinylated transit peptide #2077 digabungkan dengan streptavidin diikuti dengan injeksi intravena dari setidaknya tiga tikus CM terkanulasi (10 mg streptavidin / kg).Reduksi yang dimediasi penghambat peptida BACE1 dalam Aβ40 diukur dengan Aβ1-40 ELISA dalam darah (merah) dan cairan serebrospinal (oranye) pada titik waktu yang ditunjukkan.Untuk kejelasan yang lebih baik, garis putus-putus digambar pada grafik dengan skala 100%.( c ) Pengurangan persentase Aβ40 dalam darah (segitiga merah) dan cairan serebrospinal (segitiga oranye) pada tikus yang diobati dengan streptavidin terkonjugasi menjadi peptida transit # 2077 dan peptida penghambat BACE1 dalam rasio 3: 1.( d ) Persentase penurunan darah Aβ40 (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (lingkaran oranye) tikus yang diobati dengan streptavidin digabungkan dengan peptida penghambat BACE1 saja.Konsentrasi Aβ pada kontrol adalah 420 pg/ml (standar deviasi = 101 pg/ml).
Tampilan fag telah berhasil diterapkan di beberapa bidang penelitian biomedis17.Metode ini telah digunakan untuk studi keragaman vaskular in vivo18,19 serta studi yang menargetkan pembuluh otak20,21,22,23,24,25,26.Dalam penelitian ini, kami memperluas penerapan metode seleksi ini tidak hanya untuk identifikasi langsung peptida yang menargetkan pembuluh darah otak, tetapi juga untuk penemuan kandidat dengan sifat transpor aktif untuk melintasi penghalang darah-otak.Kami sekarang menjelaskan pengembangan prosedur pemilihan in vivo pada tikus yang diintubasi CM dan menunjukkan potensinya untuk mengidentifikasi peptida dengan sifat homing CSF.Dengan menggunakan fag T7 yang menampilkan perpustakaan peptida acak 12-mer, kami dapat menunjukkan bahwa fag T7 cukup kecil (berdiameter sekitar 60 nm)10 untuk beradaptasi dengan penghalang darah-otak, sehingga secara langsung melintasi penghalang darah-otak atau pleksus koroid.Kami mengamati bahwa pengambilan CSF dari tikus CM yang dikanulasi adalah metode skrining fungsional in vivo yang terkontrol dengan baik, dan bahwa fag yang diekstraksi tidak hanya terikat pada pembuluh darah tetapi juga berfungsi sebagai pengangkut melintasi penghalang darah-otak.Selain itu, dengan mengumpulkan darah secara bersamaan dan menerapkan HTS ke CSF ​​dan fag yang diturunkan dari darah, kami mengonfirmasi bahwa pilihan CSF kami tidak dipengaruhi oleh pengayaan darah atau kesesuaian untuk perluasan antar putaran seleksi.Namun, kompartemen darah merupakan bagian dari prosedur seleksi, karena fag yang mampu mencapai kompartemen CSF harus bertahan dan bersirkulasi dalam aliran darah cukup lama untuk memperkaya dirinya sendiri di otak.Untuk mengekstrak informasi urutan yang andal dari data HTS mentah, kami menerapkan filter yang diadaptasi ke kesalahan pengurutan khusus platform dalam alur kerja analisis.Dengan memasukkan parameter kinetik ke dalam metode skrining, kami mengonfirmasi farmakokinetik cepat fag T7 tipe liar (t½ ~ 28 menit) dalam darah24, 27, 28 dan juga menentukan waktu paruhnya dalam cairan serebrospinal (t½ ~ 26 menit) per menit).Meskipun profil farmakokinetik serupa dalam darah dan CSF, hanya 0,001% dari konsentrasi darah fag yang dapat dideteksi di CSF, menunjukkan mobilitas latar belakang yang rendah dari fag T7 tipe liar melintasi penghalang darah-otak.Pekerjaan ini menyoroti pentingnya seleksi putaran pertama saat menggunakan strategi panning in vivo, terutama untuk sistem fag yang dibersihkan dengan cepat dari sirkulasi, karena hanya sedikit klon yang dapat mencapai kompartemen CNS.Dengan demikian, pada putaran pertama, pengurangan keragaman perpustakaan sangat besar, karena hanya sejumlah kecil klon yang akhirnya dikumpulkan dalam model CSF yang sangat ketat ini.Strategi panning in vivo ini mencakup beberapa langkah seleksi seperti akumulasi aktif dalam kompartemen CSF, kelangsungan hidup klon dalam kompartemen darah, dan penghapusan cepat klon fag T7 dari darah dalam 10 menit pertama (Gbr. 1d dan Gbr. Tambahan 4M).).Jadi, setelah putaran pertama, klon fag yang berbeda diidentifikasi di CSF, meskipun kumpulan awal yang sama digunakan untuk masing-masing hewan.Hal ini menunjukkan bahwa beberapa langkah seleksi yang ketat untuk perpustakaan sumber dengan sejumlah besar anggota perpustakaan menghasilkan pengurangan keragaman yang signifikan.Oleh karena itu, kejadian acak akan menjadi bagian integral dari proses pemilihan awal, yang sangat mempengaruhi hasil.Kemungkinan banyak klon di perpustakaan asli memiliki kecenderungan pengayaan CSF yang sangat mirip.Namun, bahkan di bawah kondisi percobaan yang sama, hasil seleksi mungkin berbeda karena jumlah klon tertentu yang kecil di kumpulan awal.
Motif yang diperkaya dalam CSF berbeda dari yang ada di dalam darah.Menariknya, kami mencatat pergeseran pertama menuju peptida kaya glisin dalam darah masing-masing hewan.(Gbr. 1g, Gambar Tambahan. 4e, 4f).Fag yang mengandung peptida glisin mungkin lebih stabil dan lebih kecil kemungkinannya untuk dikeluarkan dari peredaran.Namun, peptida kaya glisin ini tidak terdeteksi dalam sampel cairan serebrospinal, menunjukkan bahwa perpustakaan yang dikuratori melewati dua langkah seleksi yang berbeda: satu di dalam darah dan yang lain dibiarkan menumpuk di cairan serebrospinal.Klon yang diperkaya CSF yang dihasilkan dari seleksi putaran keempat telah diuji secara ekstensif.Hampir semua klon yang diuji secara individual dipastikan diperkaya dalam CSF dibandingkan dengan fag kontrol kosong.Satu hit peptida (#2077) diperiksa lebih detail.Ini menunjukkan waktu paruh plasma yang lebih lama dibandingkan dengan hit lainnya (Gambar 3d dan Gambar Tambahan 7), dan yang menarik, peptida ini mengandung residu sistein di terminal-C.Baru-baru ini ditunjukkan bahwa penambahan sistein ke peptida dapat meningkatkan sifat farmakokinetiknya dengan mengikat albumin 29 .Ini saat ini tidak diketahui untuk peptida #2077 dan memerlukan penelitian lebih lanjut.Beberapa peptida menunjukkan ketergantungan valensi dalam pengayaan CSF (data tidak ditampilkan), yang mungkin terkait dengan geometri permukaan kapsid T7 yang ditampilkan.Sistem T7 yang kami gunakan menunjukkan 5-15 salinan dari setiap peptida per partikel fag.IHC dilakukan pada calon klon fag timbal yang disuntikkan secara intravena ke dalam korteks serebral tikus (Gambar Tambahan 8).Data menunjukkan bahwa setidaknya tiga klon (No. 2002, No. 2009 dan No. 2077) berinteraksi dengan BBB.Masih harus ditentukan apakah interaksi BBB ini menghasilkan akumulasi CSF atau pergerakan klon ini langsung ke BCSFB.Yang penting, kami menunjukkan bahwa peptida terpilih mempertahankan kapasitas transportasi CSF mereka ketika disintesis dan terikat pada muatan protein.Pengikatan peptida terbiotinilasi N-terminal ke SA pada dasarnya mengulangi hasil yang diperoleh dengan masing-masing klon fag dalam darah dan cairan serebrospinal (Gbr. 3e).Akhirnya, kami menunjukkan bahwa peptida timbal #2077 mampu mempromosikan aksi otak dari penghambat peptida terbiotinilasi dari BACE1 yang terkonjugasi ke SA, menyebabkan efek farmakodinamik yang jelas di SSP dengan secara signifikan mengurangi kadar Abeta40 di CSF (Gbr. 4).Kami tidak dapat mengidentifikasi homolog apa pun dalam database dengan melakukan pencarian homologi urutan peptida dari semua hit.Penting untuk dicatat bahwa ukuran perpustakaan T7 adalah sekitar 109, sedangkan ukuran perpustakaan teoretis untuk 12-mers adalah 4 x 1015. Oleh karena itu, kami hanya memilih sebagian kecil dari ruang keanekaragaman perpustakaan peptida 12-mer, yang dapat berarti bahwa peptida yang lebih optimal dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi ruang urutan yang berdekatan dari hit yang diidentifikasi ini.Secara hipotetis, salah satu alasan mengapa kami belum menemukan homolog alami dari peptida ini mungkin adalah deseleksi selama evolusi untuk mencegah masuknya motif peptida tertentu ke dalam otak secara tidak terkendali.
Secara keseluruhan, hasil kami memberikan dasar untuk pekerjaan di masa depan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi sistem transportasi penghalang serebrovaskular in vivo secara lebih rinci.Pengaturan dasar dari metode ini didasarkan pada strategi seleksi fungsional yang tidak hanya mengidentifikasi klon dengan sifat pengikatan pembuluh darah otak, tetapi juga mencakup langkah penting di mana klon yang berhasil memiliki aktivitas intrinsik untuk melintasi penghalang biologis in vivo ke dalam kompartemen SSP.adalah untuk menjelaskan mekanisme pengangkutan peptida ini dan preferensi mereka untuk mengikat mikrovaskulatur khusus ke wilayah otak.Ini dapat mengarah pada penemuan jalur baru untuk pengangkutan BBB dan reseptor.Kami berharap peptida yang teridentifikasi dapat langsung berikatan dengan reseptor serebrovaskular atau ligan sirkulasi yang diangkut melalui BBB atau BCSFB.Vektor peptida dengan aktivitas transportasi CSF yang ditemukan dalam karya ini akan diselidiki lebih lanjut.Kami saat ini sedang menyelidiki kekhususan otak dari peptida ini untuk kemampuannya melintasi BBB dan/atau BCSFB.Peptida baru ini akan menjadi alat yang sangat berharga untuk penemuan potensial reseptor atau jalur baru dan untuk pengembangan platform baru yang sangat efisien untuk pengiriman makromolekul, seperti biologi, ke otak.
Kanulasi cisterna besar (CM) menggunakan modifikasi dari metode yang dijelaskan sebelumnya.Tikus Wistar yang dibius (200-350 g) dipasang pada alat stereotaxic dan sayatan median dibuat di atas kulit kepala yang dicukur dan disiapkan secara aseptik untuk membuka tengkorak.Bor dua lubang di area selempang atas dan kencangkan sekrup pengencang di lubang.Lubang tambahan dibor di puncak oksipital lateral untuk panduan stereotactic dari kanula stainless steel ke dalam CM.Oleskan semen gigi di sekitar kanula dan kencangkan dengan sekrup.Setelah photocuring dan pengerasan semen, luka kulit ditutup dengan jahitan supramid 4/0.Penempatan kanula yang benar dikonfirmasi oleh kebocoran spontan cairan serebrospinal (CSF).Keluarkan tikus dari alat stereotaxic, terima perawatan pasca operasi yang tepat dan manajemen nyeri, dan biarkan pulih setidaknya satu minggu sampai tanda-tanda darah diamati dalam cairan serebrospinal.Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diperoleh dari Sungai Charles (Prancis).Semua tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu.Semua percobaan hewan telah disetujui oleh Kantor Kedokteran Hewan Kota Basel, Swiss, dan dilakukan sesuai dengan Lisensi Hewan No. 2474 (Penilaian Transpor Otak Aktif dengan Mengukur Tingkat Kandidat Terapi dalam Cairan Serebrospinal dan Otak Tikus).
Pertahankan agar tikus tetap sadar dengan kanula CM di tangan.Hapus Datura dari kanula dan kumpulkan 10 μl cairan serebrospinal yang mengalir secara spontan.Karena patensi kanula pada akhirnya terganggu, hanya sampel cairan serebrospinal bening tanpa bukti kontaminasi darah atau perubahan warna yang dimasukkan dalam penelitian ini.Secara paralel, sekitar 10-20 μl darah diambil dari sayatan kecil di ujung ekor ke dalam tabung dengan heparin (Sigma-Aldrich).CSF dan darah dikumpulkan pada berbagai titik waktu setelah injeksi fag T7 intravena.Sekitar 5–10 μl cairan dibuang sebelum setiap sampel CSF dikumpulkan, yang sesuai dengan volume mati kateter.
Perpustakaan dihasilkan menggunakan vektor T7Select 10-3b seperti yang dijelaskan dalam manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Secara singkat, sisipan DNA 12-mer acak disintesis dalam format berikut:
Kodon NNK digunakan untuk menghindari kodon stop ganda dan ekspresi berlebih asam amino pada sisipan.N adalah rasio ekuimolar yang dicampur secara manual dari setiap nukleotida, dan K adalah rasio ekuimolar yang dicampur secara manual dari nukleotida adenin dan sitosin.Daerah beruntai tunggal dikonversi menjadi DNA beruntai ganda dengan inkubasi lebih lanjut dengan dNTP (Novagen) dan enzim Klenow (New England Biolabs) dalam penyangga Klenow (New England Biolabs) selama 3 jam pada suhu 37°C.Setelah reaksi, DNA beruntai ganda diperoleh kembali dengan presipitasi EtOH.DNA yang dihasilkan dicerna dengan enzim restriksi EcoRI dan HindIII (keduanya dari Roche).Sisipan yang dibelah dan dimurnikan (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) kemudian diikat dalam bingkai menjadi vektor T7 yang telah dibelah sebelumnya setelah asam amino 348 dari gen kapsid 10B.Reaksi ligasi diinkubasi pada 16°C selama 18 jam sebelum pengemasan in vitro.Pengemasan fag secara in vitro dilakukan sesuai dengan instruksi yang disertakan dengan kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) dan larutan pengemasan diamplifikasi sekali untuk dilisis menggunakan Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lisat disentrifugasi, dititrasi dan dibekukan pada -80°C sebagai larutan stok gliserol.
Amplifikasi PCR langsung dari daerah variabel fag diamplifikasi dalam kaldu atau piring menggunakan primer fusi 454/Roche-amplikon yang dipatenkan.Primer fusi maju berisi urutan yang mengapit wilayah variabel (NNK) 12 (khusus templat), GS FLX Titanium Adapter A, dan urutan kunci pustaka empat basis (TCAG) (Gambar Tambahan 1a):
Reverse fusion primer juga mengandung biotin yang melekat untuk menangkap manik-manik dan GS FLX Titanium Adapter B diperlukan untuk amplifikasi klon selama PCR emulsi:
Amplikon kemudian dikenai pirosequencing 454/Roche menurut protokol 454 GS-FLX Titanium.Untuk pengurutan Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 diamplifikasi oleh PCR dan diurutkan dengan pasangan primer berikut:
Sisipan dari masing-masing plak dikenakan amplifikasi PCR menggunakan Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sesuai dengan instruksi pabrik).Lakukan start panas (10 menit pada suhu 95 °C) dan 35 siklus peningkatan (50 detik pada suhu 95 °C, 1 menit pada suhu 50 °C, dan 1 menit pada suhu 72 °C).
Fag dari perpustakaan, fag tipe liar, fag yang diselamatkan dari CSF dan darah, atau klon individu diamplifikasi dalam Escherichia coli BL5615 dalam kaldu TB (Sigma Aldrich) atau dalam cawan berukuran 500 cm2 (Thermo Scientific) selama 4 jam pada suhu 37°C.Fag diekstraksi dari pelat dengan membilas pelat dengan buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) atau dengan mengumpulkan plak dengan ujung pipet steril.Fag diisolasi dari supernatan kultur atau buffer ekstraksi dengan satu putaran presipitasi polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) dan disuspensikan kembali dalam buffer Tris-EDTA.
Fag yang diamplifikasi menjadi sasaran 2-3 putaran penghilangan endotoksin menggunakan manik-manik penghilang endotoksin (Miltenyi Biotec) sebelum injeksi intravena (IV) (500 μl / hewan).Di babak pertama, fag 2×1012 diperkenalkan;yang kedua, fag 2×1010;pada putaran seleksi ketiga dan keempat, 2×109 fag per hewan.Konten fag dalam CSF dan sampel darah yang dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan ditentukan dengan penghitungan plak sesuai dengan instruksi pabrik (manual sistem T7Select).Seleksi fag dilakukan dengan injeksi intravena perpustakaan murni ke dalam vena ekor atau dengan injeksi ulang fag yang diekstraksi dari CSF dari putaran seleksi sebelumnya, dan panen berikutnya dilakukan masing-masing pada 10 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 180 menit, dan 240 menit sampel CSF dan darah.Sebanyak empat putaran panning in vivo dilakukan di mana dua cabang terpilih disimpan dan dianalisis secara terpisah selama tiga putaran pertama seleksi.Semua sisipan fag yang diekstraksi dari CSF dari dua putaran pertama seleksi menjadi sasaran pirosequencing 454/Roche, sementara semua klon yang diekstraksi dari CSF dari dua putaran seleksi terakhir diurutkan secara manual.Semua fag darah dari putaran pertama seleksi juga dikenai pirosequencing 454/Roche.Untuk injeksi klon fag, fag terpilih diamplifikasi dalam E. coli (BL5615) pada pelat berukuran 500 cm2 pada suhu 37°C selama 4 jam.Klon yang dipilih secara individual dan diurutkan secara manual disebarkan dalam media TB.Setelah ekstraksi fag, pemurnian dan penghilangan endotoksin (seperti dijelaskan di atas), fag / hewan 2x1010 dalam 300 μl disuntikkan secara intravena ke dalam satu vena ekor.
Pemrosesan awal dan pemfilteran kualitatif data sekuens.Data mentah 454/Roche dikonversi dari format peta aliran standar biner (sff) ke format yang dapat dibaca manusia (fasta) Pearson menggunakan perangkat lunak vendor.Pemrosesan lebih lanjut dari urutan nukleotida dilakukan menggunakan program dan skrip C berpemilik (paket perangkat lunak yang belum dirilis) seperti yang dijelaskan di bawah ini.Analisis data primer mencakup prosedur pemfilteran multi-tahap yang ketat.Untuk memfilter bacaan yang tidak berisi urutan DNA sisipan 12mer yang valid, bacaan tersebut diselaraskan secara berurutan untuk memulai label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), menghentikan label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dan sisipan latar belakang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) menggunakan uji Needleman-Wunsch global.penjajaran memungkinkan hingga 2 ketidakkonsistenan per penjajaran31.Oleh karena itu, pembacaan tanpa tag awal dan akhir serta pembacaan yang berisi sisipan latar belakang, yaitu, perataan yang melebihi jumlah ketidaksesuaian yang diizinkan, telah dihapus dari pustaka.Adapun bacaan yang tersisa, urutan DNA N-mer memanjang dari tanda awal dan berakhir sebelum tanda berhenti dipotong dari urutan baca asli dan diproses lebih lanjut (selanjutnya disebut sebagai "sisipkan").Setelah translasi sisipan, bagian setelah kodon stop pertama pada ujung 5' primer dikeluarkan dari sisipan.Selain itu, nukleotida yang menyebabkan kodon tidak lengkap pada ujung 3′ primer juga dihilangkan.Untuk mengecualikan sisipan yang hanya berisi urutan latar belakang, sisipan terjemahan yang dimulai dengan pola asam amino "PAG" juga dihilangkan.Peptida dengan panjang pasca-translasi kurang dari 3 asam amino dikeluarkan dari perpustakaan.Terakhir, hapus redundansi di kumpulan sisipan dan tentukan frekuensi setiap sisipan unik.Hasil analisis ini termasuk daftar urutan nukleotida (sisipan) dan frekuensi (baca) mereka (Gambar Tambahan 1c dan 2).
Sisipan DNA N-mer grup berdasarkan kesamaan urutan: Untuk menghilangkan kesalahan urutan spesifik 454/Roche (seperti masalah dengan ekstensi homopolimer pengurutan) dan menghapus redudansi yang kurang penting, penyisipan urutan DNA N-mer yang difilter sebelumnya (sisipan) diurutkan berdasarkan kesamaan.penyisipan (hingga 2 basis yang tidak cocok diperbolehkan) menggunakan algoritme iteratif yang didefinisikan sebagai berikut: penyisipan diurutkan terlebih dahulu berdasarkan frekuensinya (tertinggi ke terendah), dan jika sama, berdasarkan pengurutan sekunder berdasarkan panjang (terpanjang ke terpendek) ).Jadi, penyisipan yang paling sering dan paling lama menentukan "grup" pertama.Frekuensi grup diatur ke frekuensi kunci.Kemudian, setiap penyisipan yang tersisa dalam daftar yang disortir dicoba untuk ditambahkan ke grup dengan penyelarasan Needleman-Wunsch berpasangan.Jika jumlah ketidaksesuaian, penyisipan, atau penghapusan dalam penyelarasan tidak melebihi ambang 2, penyisipan ditambahkan ke grup, dan frekuensi grup keseluruhan ditingkatkan dengan seberapa sering penyisipan ditambahkan.Sisipan yang ditambahkan ke grup ditandai sebagai digunakan dan dikecualikan dari pemrosesan lebih lanjut.Jika insert sequence tidak dapat ditambahkan ke grup yang sudah ada, insert sequence digunakan untuk membuat grup baru dengan frekuensi insert yang sesuai dan ditandai sebagai digunakan.Iterasi berakhir ketika setiap urutan penyisipan telah digunakan untuk membentuk grup baru atau dapat dimasukkan ke dalam grup yang sudah ada.Bagaimanapun, sisipan yang dikelompokkan yang terdiri dari nukleotida akhirnya diterjemahkan ke dalam urutan peptida (perpustakaan peptida).Hasil dari analisis ini adalah satu set penyisipan dan frekuensi yang sesuai yang membentuk jumlah pembacaan berturut-turut (Gambar Tambahan 2).
Generasi Motif: Berdasarkan daftar peptida unik, sebuah perpustakaan dibuat yang berisi semua kemungkinan pola asam amino (aa) seperti yang ditunjukkan di bawah ini.Setiap kemungkinan pola dengan panjang 3 diekstraksi dari peptida dan pola kebalikannya ditambahkan bersama dengan pustaka motif umum yang berisi semua pola (tripeptida).Pustaka dengan motif yang sangat berulang diurutkan dan redundansi dihilangkan.Kemudian, untuk setiap tripeptida di pustaka motif, kami memeriksa keberadaannya di pustaka menggunakan alat komputasi.Dalam hal ini, frekuensi peptida yang mengandung tripeptida motif yang ditemukan ditambahkan dan ditetapkan ke motif dalam pustaka motif (“jumlah motif”).Hasil pembangkitan motif adalah larik dua dimensi yang berisi semua kemunculan tripeptida (motif) dan nilainya masing-masing, yang merupakan jumlah bacaan sekuensing yang menghasilkan motif yang sesuai saat bacaan disaring, dikelompokkan, dan diterjemahkan.Metrik seperti yang dijelaskan secara detail di atas.
Normalisasi jumlah motif dan sebaran yang sesuai: Jumlah motif untuk setiap sampel dinormalisasi menggunakan
dimana ni adalah jumlah bacaan yang mengandung topik i.Jadi, vi mewakili frekuensi persentase pembacaan (atau peptida) yang mengandung motif i dalam sampel.Nilai-P untuk jumlah motif yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher.Mengenai korelasi dari jumlah motif, korelasi Spearman dihitung menggunakan jumlah motif yang dinormalisasi dengan R.
Untuk memvisualisasikan kandungan asam amino pada setiap posisi di perpustakaan peptida, dibuat logogram web 32, 33 (//weblogo.threeplusone.com).Pertama, kandungan asam amino pada setiap posisi peptida 12-mer disimpan dalam matriks berukuran 20x12.Kemudian, satu set 1000 peptida yang mengandung kandungan asam amino relatif yang sama pada setiap posisi dihasilkan dalam format fasta-sequence dan diberikan sebagai input ke web-logo 3, yang menghasilkan representasi grafis dari kandungan asam amino relatif pada setiap posisi.untuk perpustakaan peptida tertentu.Untuk memvisualisasikan kumpulan data multidimensi, peta panas dibuat menggunakan alat yang dikembangkan secara internal di R (biosHeatmap, paket R yang belum dirilis).Dendrogram yang disajikan dalam peta panas dihitung menggunakan metode pengelompokan hierarki Ward dengan metrik jarak Euclidean.Untuk analisis statistik data skoring motif, nilai P untuk skoring yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher.Nilai-P untuk kumpulan data lain dihitung dalam R menggunakan uji-t Student atau ANOVA.
Klon fag yang dipilih dan fag tanpa sisipan disuntikkan secara intravena melalui vena ekor (2 × 1010 fag / hewan dalam 300 μl PBS).Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, hewan yang sama disuntikkan secara intravena dengan 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 menit setelah injeksi fag, tikus dialiri melalui jantung dengan 50 ml PBS diikuti dengan 50 ml 4% PFA/PBS.Sampel otak juga difiksasi semalaman dalam 4% PFA/PBS dan direndam dalam sukrosa 30% semalaman pada suhu 4°C.Sampel dibekukan dalam campuran OCT.Analisis imunohistokimia sampel beku dilakukan pada suhu kamar pada cryosection 30 µm yang diblokir dengan 1% BSA dan diinkubasi dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap fag T7 (Novus NB 600-376A) pada suhu 4 °C.Inkubasi semalaman.Akhirnya, bagian dicuci 3 kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Semua peptida dengan kemurnian minimum 98% disintesis oleh GenScript USA, biotinilasi dan liofilisasi.Biotin terikat melalui spacer triple glisin tambahan di N-terminus.Periksa semua peptida menggunakan spektrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur dengan peptida biotinilasi 5 kali lipat equimolar berlebih, peptida penghambat BACE1 biotinilasi, atau kombinasi (rasio 3: 1) peptida penghambat BACE1 biotinilasi dan peptida penghambat BACE1 dalam 5–10% DMSO / diinkubasi dalam PBS.1 jam pada suhu kamar sebelum injeksi.Peptida terkonjugasi Streptavidin disuntikkan secara intravena dengan dosis 10 mg / kg ke salah satu vena ekor tikus dengan rongga otak.
Konsentrasi kompleks streptavidin-peptida dinilai dengan ELISA.Pelat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) dilapisi semalam pada suhu 4 ° C dengan 1,5 μg / ml antibodi anti-streptavidin tikus (Thermo, MA1-20011).Setelah pemblokiran (buffer pemblokiran: 140 nm NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) pada suhu kamar selama 2 jam, cuci pelat dengan 0,05% Tween-20/pbs (buffer cuci) untuk 3 detik, sampel CSF dan plasma ditambahkan ke dalam sumur (cuci buffer) untuk 3 detik, csf dan sampel plasma diterapkan pada sumur 1,000.Pelat tersebut kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi pendeteksi (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Setelah tiga langkah pencucian, streptavidin dideteksi dengan inkubasi dalam larutan substrat TMB (Roche) hingga 20 menit.Setelah menghentikan pengembangan warna dengan 1M H2SO4, ukur absorbansi pada 450 nm.
Fungsi kompleks penghambat streptavidin-peptida-BACE1 dinilai dengan Aβ(1-40) ELISA menurut protokol pabrikan (Wako, 294-64701).Secara singkat, sampel CSF diencerkan dalam pengencer standar (1:23) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dalam pelat 96 sumur yang dilapisi dengan antibodi penangkap BNT77.Setelah lima tahap pencucian, antibodi BA27 terkonjugasi-HRP ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4°C, diikuti dengan lima tahap pencucian.Aβ (1–40) terdeteksi dengan inkubasi dalam larutan TMB selama 30 menit pada suhu kamar.Setelah pengembangan warna dihentikan dengan stop solution, ukur absorbansi pada 450 nm.Sampel plasma menjadi sasaran ekstraksi fase padat sebelum Aβ (1–40) ELISA.Plasma ditambahkan ke 0,2% DEA (Sigma) di piring 96-sumur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.Setelah berturut-turut mencuci pelat SPE (Oasis, 186000679) dengan air dan metanol 100%, sampel plasma ditambahkan ke pelat SPE dan semua cairan dihilangkan.Sampel dicuci (pertama dengan 5% metanol kemudian 30% metanol) dan dielusi dengan 2% NH4OH/90% metanol.Setelah mengeringkan eluat pada 55°C selama 99 menit pada arus N2 konstan, sampel direduksi dalam pengencer standar dan Aβ(1–40) diukur seperti dijelaskan di atas.
Cara mengutip artikel ini: Urich, E. et al.Pengiriman kargo ke otak menggunakan peptida transit yang diidentifikasi secara in vivo.ilmu.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dan Moos T. Pengiriman obat makromolekul ke otak menggunakan terapi bertarget.Jurnal Neurokimia 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dan Martinez-Martinez, P. Pengiriman obat peptida dan protein melintasi penghalang darah-otak.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobiol.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Penghalang darah-otak: hambatan dalam pengembangan obat otak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dan Byrd, A. Prospek untuk pengiriman obat yang lebih baik dan penargetan ke otak melalui jalur choroid plexus-CSF.Penelitian Farmasi 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi dengan kuda Troya molekuler untuk pengiriman otak.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transportasi peptida yang dimediasi reseptor WM melintasi penghalang darah-otak.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Tingkatkan penetrasi otak dan kemanjuran antibodi terapeutik menggunakan angkutan molekul monovalen.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transpor transferin reseptor (TfR) menentukan serapan otak terhadap varian afinitas antibodi TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).