Beberapa topik pemecahan masalah LC tidak pernah ketinggalan zaman, karena ada masalah dalam praktik LC, bahkan saat teknologi instrumen meningkat dari waktu ke waktu. Ada banyak cara di mana masalah dapat muncul dalam sistem LC dan berakhir dengan bentuk puncak yang buruk. Ketika masalah yang terkait dengan bentuk puncak muncul, daftar singkat kemungkinan penyebab hasil ini membantu menyederhanakan pengalaman pemecahan masalah kami.
Sangat menyenangkan menulis kolom “Pemecahan Masalah LC” ini dan memikirkan topik setiap bulan, karena beberapa topik tidak pernah ketinggalan zaman. Sementara di bidang penelitian kromatografi, topik atau ide tertentu menjadi usang karena digantikan oleh ide yang lebih baru dan lebih baik, di bidang pemecahan masalah, sejak artikel pemecahan masalah pertama kali muncul di jurnal ini (Jurnal LC saat itu) karena beberapa topik masih relevan) pada tahun 1983(1). Selama beberapa tahun terakhir, saya telah memfokuskan beberapa LC Trou bagian bleshooting tentang tren kontemporer yang memengaruhi kromatografi cair (LC) (misalnya, perbandingan relatif dari pemahaman kita tentang efek tekanan pada retensi [2] Kemajuan Baru) Interpretasi kami tentang hasil LC dan cara memecahkan masalah dengan instrumen LC modern. Dalam angsuran bulan ini, saya melanjutkan seri saya (3), yang dimulai pada Desember 2021, yang berfokus pada beberapa topik "hidup dan mati" dari pemecahan masalah LC — elemen yang bagus untuk setiap pemecah masalah sangat penting, terlepas dari usia sistem yang kami gunakan .Topik inti dari seri ini sangat relevan dengan bagan dinding "Panduan Pemecahan Masalah LC" LCGC yang terkenal (4) yang tergantung di banyak laboratorium. Untuk bagian ketiga dari seri ini, saya memilih untuk fokus pada masalah yang berkaitan dengan bentuk puncak atau karakteristik puncak. Hebatnya, bagan dinding mencantumkan 44 potensi penyebab yang berbeda dari bentuk puncak yang buruk! Kita tidak dapat mempertimbangkan semua masalah ini secara mendetail dalam satu artikel, jadi dalam edisi pertama tentang topik ini, saya akan fokus pada beberapa yang paling sering saya lihat. Semoga muda dan tua Pengguna LC akan menemukan beberapa tips dan pengingat bermanfaat tentang topik penting ini.
Saya menemukan diri saya semakin banyak menjawab pertanyaan pemecahan masalah dengan "segalanya mungkin". Tanggapan ini mungkin tampak mudah ketika mempertimbangkan pengamatan yang sulit untuk ditafsirkan, tetapi saya merasa sering tepat. Dengan banyak kemungkinan penyebab bentuk puncak yang buruk, penting untuk tetap berpikiran terbuka ketika mempertimbangkan apa masalahnya, dan untuk dapat memprioritaskan penyebab potensial untuk memulai upaya pemecahan masalah kita, berfokus pada kemungkinan yang paling umum itu, poin ini sangat penting.mungkin.
Langkah kunci dalam setiap latihan pemecahan masalah — tetapi yang menurut saya diremehkan — adalah mengakui bahwa ada masalah yang perlu dipecahkan. Menyadari bahwa ada masalah sering kali berarti mengakui bahwa apa yang terjadi pada alat itu berbeda dari ekspektasi kita, yang dibentuk oleh teori, pengetahuan empiris, dan pengalaman (5). “Bentuk puncak” yang dimaksud di sini sebenarnya tidak hanya mengacu pada bentuk puncak (simetris, asimetris, halus, halus, tepi depan, tailing, dll.), tetapi juga lebarnya. Harapan kita untuk bentuk puncak yang sebenarnya adalah sederhana. Teori (6) sangat mendukung harapan buku teks bahwa, dalam kebanyakan kasus, puncak kromatografi harus simetris dan sesuai dengan bentuk distribusi Gaussian, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a. Apa yang kita harapkan dari lebar puncak adalah masalah yang lebih kompleks, dan kita akan membahas topik ini di artikel mendatang. Bentuk puncak lainnya pada Gambar 1 menunjukkan beberapa kemungkinan lain yang dapat diamati—dengan kata lain, beberapa cara terjadinya kesalahan. yang dapat menyebabkan jenis bentuk ini.
Kadang-kadang puncak tidak diamati sama sekali dalam kromatogram di mana mereka diharapkan untuk dielusi. Bagan dinding di atas menunjukkan bahwa tidak adanya puncak (dengan asumsi sampel benar-benar mengandung analit target pada konsentrasi yang seharusnya membuat respons detektor cukup untuk melihatnya di atas kebisingan) biasanya terkait dengan beberapa masalah instrumen atau kondisi fase gerak yang salah (jika diamati sama sekali).puncak, biasanya terlalu “lemah”). Daftar singkat potensi masalah dan solusi dalam kategori ini dapat ditemukan pada Tabel I.
Seperti disebutkan di atas, pertanyaan tentang berapa banyak pelebaran puncak yang harus ditoleransi sebelum memperhatikan dan mencoba memperbaikinya adalah topik kompleks yang akan saya bahas di artikel mendatang. Pengalaman saya adalah bahwa pelebaran puncak yang signifikan sering kali disertai dengan perubahan signifikan dalam bentuk puncak, dan tailing puncak lebih umum daripada pra-puncak atau pemisahan. Namun, puncak simetris nominal juga diperluas, yang dapat disebabkan oleh beberapa alasan berbeda:
Masing-masing masalah ini telah dibahas secara mendetail dalam edisi Pemecahan Masalah LC sebelumnya, dan pembaca yang tertarik dengan topik ini dapat merujuk ke artikel sebelumnya untuk informasi tentang akar penyebab dan solusi potensial untuk masalah ini.Keterangan lebih lanjut.
Peak tailing, peak fronting, dan splitting semua dapat disebabkan oleh fenomena kimia atau fisik, dan daftar solusi potensial untuk masalah ini sangat bervariasi, tergantung pada apakah kita berurusan dengan masalah kimia atau fisik. Sering kali, dengan membandingkan puncak yang berbeda dalam kromatogram, Anda dapat menemukan petunjuk penting tentang penyebab utamanya. Jika semua puncak dalam kromatogram menunjukkan bentuk yang sama, penyebabnya kemungkinan besar bukan fisik. Jika hanya satu atau beberapa puncak yang terpengaruh, tetapi sisanya terlihat baik-baik saja, penyebabnya kemungkinan besar adalah bahan kimia.
Penyebab kimiawi dari tailing puncak terlalu kompleks untuk dibahas secara singkat di sini. Pembaca yang tertarik dirujuk ke edisi terbaru "Pemecahan Masalah LC" untuk diskusi yang lebih mendalam (10). Namun, hal yang mudah untuk dicoba adalah mengurangi massa analit yang disuntikkan dan melihat apakah bentuk puncak membaik. Jika demikian, maka ini adalah petunjuk yang baik bahwa masalahnya adalah "mass overload". bentuk dapat diperoleh bahkan dengan massa yang lebih besar disuntikkan.
Ada juga banyak alasan fisik potensial untuk tailing puncak. Pembaca yang tertarik dengan diskusi terperinci tentang kemungkinan dirujuk ke edisi terbaru "Pemecahan Masalah LC" (11). Salah satu penyebab fisik yang lebih umum dari tailing puncak adalah koneksi yang buruk pada titik antara injektor dan detektor (12). Contoh ekstrem ditunjukkan pada Gambar 1d, diperoleh di lab saya beberapa minggu yang lalu. Dalam kasus ini, kami membangun sistem dengan katup injeksi baru yang belum pernah kami gunakan sebelumnya, dan memasang loop injeksi volume kecil dengan ferrule yang memiliki telah dicetak ke kapiler stainless steel. Setelah beberapa percobaan pemecahan masalah awal, kami menyadari bahwa kedalaman port di stator katup injeksi jauh lebih dalam daripada biasanya, menghasilkan volume mati yang besar di bagian bawah port. Masalah ini mudah dipecahkan dengan mengganti loop injeksi dengan tabung lain, kami dapat menyesuaikan ferrule ke posisi yang tepat untuk menghilangkan volume mati di bagian bawah port.
Bagian depan puncak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1e juga dapat disebabkan oleh masalah fisik atau kimia. Penyebab fisik yang umum dari leading edge adalah lapisan partikel kolom tidak dikemas dengan baik, atau bahwa partikel telah diatur ulang dari waktu ke waktu. Seperti puncak tailing yang disebabkan oleh fenomena fisik ini, cara terbaik untuk memperbaikinya adalah dengan mengganti kolom dan terus berjalan. Pada dasarnya, bentuk puncak tepi depan yang berasal dari bahan kimia sering muncul dari apa yang kita sebut kondisi retensi "non-linier". Di bawah kondisi ideal (linier), jumlah analit yang tertahan oleh fasa diam (karenanya, faktor retensi) secara linier terkait dengan konsentrasi analit dalam kolom. Secara kromatografi, ini berarti bahwa ketika massa analit yang disuntikkan ke dalam kolom meningkat, puncaknya menjadi lebih tinggi, tetapi tidak lebih lebar. Hubungan ini terputus ketika perilaku retensi tidak linier, dan puncak tidak hanya menjadi lebih tinggi tetapi juga lebih lebar karena lebih banyak massa yang disuntikkan. Selain itu, bentuk nonlinier menentukan bentuk puncak kromatografi, menghasilkan tepi depan atau belakang. yang menyebabkan tailing puncak (10), puncak puncak yang disebabkan oleh retensi nonlinier juga dapat didiagnosis dengan mengurangi massa analit yang disuntikkan. Jika bentuk puncak membaik, metode harus dimodifikasi agar tidak melebihi kualitas injeksi yang menyebabkan tepi depan, atau kondisi kromatografi harus diubah untuk meminimalkan perilaku ini.
Kadang-kadang kita mengamati apa yang tampak sebagai puncak "terpisah", seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1f. Langkah pertama dalam memecahkan masalah ini adalah untuk menentukan apakah bentuk puncak disebabkan oleh ko-elusi parsial (yaitu, adanya dua senyawa yang berbeda tetapi terelusi dekat). Jika sebenarnya ada dua analit berbeda yang dielusi berdekatan, maka itu masalah meningkatkan resolusinya (misalnya, dengan meningkatkan selektivitas, retensi, atau jumlah pelat), dan puncak "terpisah" yang tampak terkait dengan Kinerja fisik tidak ada hubungannya dengan kolom itu sendiri. Sering kali, petunjuk yang paling penting untuk keputusan ini adalah apakah semua puncak dalam kromatogram memperlihatkan bentuk terbelah, atau hanya satu atau dua. Jika hanya satu atau dua, mungkin merupakan masalah elusi bersama;jika semua puncak terbelah, itu mungkin masalah fisik, kemungkinan besar terkait dengan kolom itu sendiri.
Puncak belah yang berhubungan dengan sifat fisik kolom itu sendiri biasanya disebabkan oleh frit inlet atau outlet yang tersumbat sebagian, atau reorganisasi partikel dalam kolom, yang memungkinkan fase gerak mengalir lebih cepat daripada fase gerak di area tertentu dari pembentukan saluran kolom. di daerah lain (11). Frit yang tersumbat sebagian kadang-kadang dapat dibersihkan dengan membalikkan aliran melalui kolom;namun, menurut pengalaman saya, ini biasanya merupakan solusi jangka pendek daripada solusi jangka panjang. Hal ini sering berakibat fatal pada kolom modern jika partikel bergabung kembali di dalam kolom. Pada titik ini, yang terbaik adalah mengganti kolom dan melanjutkan.
Puncak pada Gambar 1g, juga dari contoh baru-baru ini di lab saya sendiri, biasanya menunjukkan bahwa sinyal sangat tinggi sehingga telah mencapai ujung atas rentang respons. Untuk detektor serapan optik (UV-vis dalam kasus ini), ketika konsentrasi analit sangat tinggi, analit menyerap sebagian besar cahaya yang melewati sel aliran detektor, meninggalkan sangat sedikit cahaya untuk dideteksi. Dalam kondisi ini, sinyal listrik dari fotodetektor sangat dipengaruhi oleh berbagai sumber kebisingan, seperti cahaya liar dan "arus gelap", membuat sinyal sangat "kabur" dalam penampilan dan tidak bergantung pada konsentrasi analit.Ketika ini terjadi, masalah seringkali dapat dengan mudah diselesaikan dengan mengurangi volume injeksi analit—mengurangi volume injeksi, mengencerkan sampel, atau keduanya.
Di sekolah kromatografi, kami menggunakan sinyal detektor (yaitu, sumbu y dalam kromatogram) sebagai indikator konsentrasi analit dalam sampel. Jadi, tampak aneh melihat kromatogram dengan sinyal di bawah nol, karena interpretasi sederhananya adalah bahwa ini menunjukkan konsentrasi analit negatif – yang tentu saja tidak mungkin secara fisik. Dalam pengalaman saya, puncak negatif paling sering diamati ketika menggunakan detektor serapan optik (misalnya, UV-vis).
Dalam hal ini, puncak negatif berarti bahwa molekul yang terelusi dari kolom menyerap lebih sedikit cahaya daripada fase gerak itu sendiri segera sebelum dan sesudah puncak. Hal ini dapat terjadi, misalnya, ketika menggunakan panjang gelombang deteksi yang relatif rendah (<230 nm) dan aditif fase gerak yang menyerap sebagian besar cahaya pada panjang gelombang ini. Aditif tersebut dapat berupa komponen pelarut fase gerak seperti metanol atau komponen penyangga seperti asetat atau format. Seseorang sebenarnya dapat menggunakan puncak negatif untuk menyiapkan kurva kalibrasi dan mendapatkan informasi kuantitatif yang akurat, jadi tidak ada alasan mendasar untuk menghindarinya sendiri (metode ini kadang-kadang disebut sebagai "deteksi UV tidak langsung") (13). Namun, jika kita benar-benar ingin menghindari puncak negatif sama sekali, dalam kasus deteksi absorbansi, solusi terbaik adalah menggunakan panjang gelombang deteksi yang berbeda sehingga analit menyerap lebih banyak daripada fase gerak, atau mengubah komposisi fase gerak sehingga menyerap lebih sedikit cahaya daripada analit.
Puncak negatif juga dapat muncul saat menggunakan deteksi indeks bias (RI) ketika indeks bias komponen selain analit dalam sampel, seperti matriks pelarut, berbeda dari indeks bias fase gerak. Hal ini juga terjadi dengan deteksi UV-vis, tetapi efek ini cenderung dilemahkan relatif terhadap deteksi RI. Dalam kedua kasus, puncak negatif dapat diminimalkan dengan mencocokkan komposisi matriks sampel dengan fase gerak.
Pada bagian ketiga tentang topik dasar pemecahan masalah LC, saya membahas situasi di mana bentuk puncak yang diamati berbeda dari bentuk puncak yang diharapkan atau normal. Pemecahan masalah yang efektif untuk masalah tersebut dimulai dengan pengetahuan tentang bentuk puncak yang diharapkan (berdasarkan teori atau pengalaman sebelumnya dengan metode yang ada), sehingga penyimpangan dari ekspektasi ini terlihat jelas. Masalah bentuk puncak memiliki banyak penyebab potensial yang berbeda (terlalu lebar, tailing, leading edge, dll.). menembak, tetapi tidak menangkap semua kemungkinan. Pembaca yang tertarik dengan daftar penyebab dan solusi yang lebih mendalam dapat merujuk ke bagan dinding "Panduan Pemecahan Masalah LC" LCGC.
(4) Bagan dinding “Panduan Pemecahan Masalah LC” LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data dan Pemrosesan Sinyal dalam Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), hlm. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF and Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.