Beberapa topik pemecahan masalah LC tidak pernah ketinggalan zaman, karena ada masalah dalam praktik LC, bahkan saat teknologi instrumen meningkat seiring waktu. Ada banyak cara di mana masalah dapat muncul dalam sistem LC dan berakhir pada bentuk puncak yang buruk. Ketika masalah yang terkait dengan bentuk puncak muncul, daftar singkat kemungkinan penyebab hasil ini membantu menyederhanakan pengalaman pemecahan masalah kita.
Sangat menyenangkan menulis kolom “LC Troubleshooting” ini dan memikirkan berbagai topik setiap bulan, karena beberapa topik tidak pernah ketinggalan zaman. Sementara di bidang penelitian kromatografi, topik atau ide tertentu menjadi usang karena digantikan oleh ide-ide yang lebih baru dan lebih baik, di bidang pemecahan masalah, sejak artikel pemecahan masalah pertama muncul di jurnal ini (Jurnal LC pada saat itu) karena beberapa topik masih relevan) pada tahun 1983 (1). Selama beberapa tahun terakhir, saya telah memfokuskan beberapa bagian Pemecahan Masalah LC pada tren kontemporer yang memengaruhi kromatografi cair (LC) (misalnya, perbandingan relatif pemahaman kita tentang efek tekanan pada retensi [2] Kemajuan Baru) Interpretasi kita tentang hasil LC dan cara memecahkan masalah dengan instrumen LC modern. Dalam angsuran bulan ini, saya melanjutkan seri saya (3), yang dimulai pada Desember 2021, yang berfokus pada beberapa topik “hidup dan mati” pemecahan masalah LC — elemen yang bagus untuk setiap pemecah masalah sangat penting, tidak peduli usia sistem kami menggunakan.Topik inti dari seri ini sangat relevan dengan bagan dinding "Panduan Pemecahan Masalah LC" (4) yang terkenal dari LCGC yang tergantung di banyak laboratorium.Untuk bagian ketiga dari seri ini, saya memilih untuk fokus pada isu-isu yang terkait dengan bentuk puncak atau karakteristik puncak.Hebatnya, bagan dinding mencantumkan 44 penyebab potensial yang berbeda dari bentuk puncak yang buruk!Kami tidak dapat mempertimbangkan semua masalah ini secara terperinci dalam satu artikel, jadi dalam angsuran pertama pada topik ini, saya akan fokus pada beberapa yang paling sering saya lihat.Saya berharap pengguna LC muda dan tua akan menemukan beberapa kiat dan pengingat bermanfaat pada topik penting ini.
Saya mendapati diri saya semakin sering menjawab pertanyaan pemecahan masalah dengan "apa pun mungkin". Respons ini mungkin tampak mudah ketika mempertimbangkan pengamatan yang sulit ditafsirkan, tetapi saya merasa sering kali tepat. Dengan banyaknya kemungkinan penyebab bentuk puncak yang buruk, penting untuk tetap berpikiran terbuka ketika mempertimbangkan apa yang mungkin menjadi masalahnya, dan untuk dapat memprioritaskan kemungkinan penyebab untuk memulai upaya pemecahan masalah kita, dengan berfokus pada kemungkinan yang paling umum, poin ini sangat penting.
Langkah kunci dalam setiap latihan pemecahan masalah — tetapi yang menurut saya diremehkan — adalah mengenali bahwa ada masalah yang perlu dipecahkan. Mengenali bahwa ada masalah sering kali berarti mengenali bahwa apa yang terjadi pada alat tersebut berbeda dari harapan kita, yang dibentuk oleh teori, pengetahuan empiris, dan pengalaman (5). "Bentuk puncak" yang dimaksud di sini sebenarnya tidak hanya mengacu pada bentuk puncak (simetris, asimetris, halus, mengembang, ujung depan, ujung ekor, dll.), tetapi juga lebarnya. Harapan kita untuk bentuk puncak yang sebenarnya sederhana. Teori (6) mendukung harapan buku teks bahwa, dalam kebanyakan kasus, puncak kromatografi harus simetris dan sesuai dengan bentuk distribusi Gaussian, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a. Apa yang kita harapkan dari lebar puncak adalah masalah yang lebih kompleks, dan kita akan membahas topik ini di artikel mendatang. Bentuk puncak lainnya pada Gambar 1 menunjukkan beberapa kemungkinan lain yang dapat diamati—dengan kata lain, beberapa cara hal-hal bisa menjadi salah. Di sisa angsuran ini, kita akan menghabiskan waktu membahas beberapa contoh situasi spesifik yang dapat mengarah pada tipe bentuk ini.
Terkadang puncak tidak teramati sama sekali dalam kromatogram tempat puncak tersebut diharapkan akan dielusi. Bagan dinding di atas menunjukkan bahwa tidak adanya puncak (dengan asumsi sampel benar-benar mengandung analit target pada konsentrasi yang seharusnya membuat respons detektor cukup untuk melihatnya di atas kebisingan) biasanya terkait dengan beberapa masalah instrumen atau kondisi fase bergerak yang tidak tepat (jika teramati sama sekali). puncak, biasanya terlalu "lemah"). Daftar singkat masalah dan solusi potensial dalam kategori ini dapat ditemukan di Tabel I.
Seperti yang disebutkan di atas, pertanyaan tentang seberapa besar pelebaran puncak yang harus ditoleransi sebelum memperhatikan dan mencoba memperbaikinya adalah topik rumit yang akan saya bahas di artikel mendatang. Pengalaman saya adalah bahwa pelebaran puncak yang signifikan sering kali disertai dengan perubahan bentuk puncak yang signifikan, dan puncak yang membuntuti lebih umum terjadi daripada pra-puncak atau pemisahan. Namun, puncak yang simetris nominal juga melebar, yang dapat disebabkan oleh beberapa alasan berbeda:
Setiap masalah ini telah dibahas secara terperinci dalam edisi Troubleshooting LC sebelumnya, dan pembaca yang tertarik dengan topik ini dapat merujuk ke artikel sebelumnya ini untuk mendapatkan informasi tentang akar penyebab dan solusi potensial untuk masalah ini. Keterangan lebih lanjut.
Puncak yang membuntuti, puncak yang muncul di depan, dan terbelah semuanya dapat disebabkan oleh fenomena kimia atau fisika, dan daftar solusi potensial untuk masalah ini sangat bervariasi, tergantung pada apakah kita berhadapan dengan masalah kimia atau fisika. Sering kali, dengan membandingkan puncak-puncak yang berbeda dalam kromatogram, Anda dapat menemukan petunjuk penting tentang mana yang menjadi penyebabnya. Jika semua puncak dalam kromatogram menunjukkan bentuk yang sama, penyebabnya kemungkinan besar bukan fisik. Jika hanya satu atau beberapa puncak yang terpengaruh, tetapi sisanya terlihat baik-baik saja, penyebabnya kemungkinan besar adalah kimia.
Penyebab kimiawi dari puncak tailing terlalu rumit untuk dibahas secara singkat di sini. Pembaca yang tertarik dapat membaca edisi terbaru “LC Troubleshooting” untuk pembahasan yang lebih mendalam (10). Namun, hal yang mudah untuk dicoba adalah mengurangi massa analit yang disuntikkan dan melihat apakah bentuk puncak membaik. Jika demikian, maka ini adalah petunjuk yang baik bahwa masalahnya adalah “kelebihan massa”. Dalam kasus ini, metode harus dibatasi untuk menyuntikkan massa analit kecil, atau kondisi kromatografi harus diubah sehingga bentuk puncak yang baik dapat diperoleh bahkan dengan massa yang lebih besar yang disuntikkan.
Ada juga banyak kemungkinan alasan fisik untuk tailing puncak. Pembaca yang tertarik dengan diskusi terperinci tentang kemungkinan tersebut dapat membaca edisi terbaru lainnya dari “LC Troubleshooting” (11). Salah satu penyebab fisik yang lebih umum dari tailing puncak adalah koneksi yang buruk pada suatu titik antara injektor dan detektor (12). Contoh ekstrem ditunjukkan pada Gambar 1d, yang diperoleh di lab saya beberapa minggu yang lalu. Dalam kasus ini, kami membangun sistem dengan katup injeksi baru yang belum pernah kami gunakan sebelumnya, dan memasang loop injeksi volume kecil dengan ferrule yang telah dicetak ke kapiler baja tahan karat. Setelah beberapa percobaan pemecahan masalah awal, kami menyadari bahwa kedalaman port di stator katup injeksi jauh lebih dalam dari yang biasa kami lihat, sehingga menghasilkan volume mati yang besar di bagian bawah port. Masalah ini mudah dipecahkan dengan mengganti loop injeksi dengan tabung lain, kami dapat menyesuaikan ferrule ke posisi yang tepat untuk menghilangkan volume mati di bagian bawah port.
Puncak muka seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1e juga dapat disebabkan oleh masalah fisik atau kimia. Penyebab fisik umum dari tepi terdepan adalah bahwa lapisan partikel kolom tidak terkemas dengan baik, atau bahwa partikel telah ditata ulang dari waktu ke waktu. Seperti halnya tailing puncak yang disebabkan oleh fenomena fisik ini, cara terbaik untuk memperbaikinya adalah dengan mengganti kolom dan terus berjalan. Pada dasarnya, bentuk puncak tepi terdepan dengan asal kimia sering muncul dari apa yang kita sebut kondisi retensi "non-linier". Dalam kondisi ideal (linier), jumlah analit yang ditahan oleh fase stasioner (oleh karena itu, faktor retensi) berhubungan secara linier dengan konsentrasi analit dalam kolom. Secara kromatografi, ini berarti bahwa ketika massa analit yang disuntikkan ke dalam kolom meningkat, puncak menjadi lebih tinggi, tetapi tidak lebih lebar. Hubungan ini terputus ketika perilaku retensi bersifat non-linier, dan puncak tidak hanya menjadi lebih tinggi tetapi juga lebih lebar karena lebih banyak massa yang disuntikkan. Selain itu, bentuk nonlinier menentukan bentuk puncak kromatografi, yang menghasilkan tepi terdepan atau tertinggal. Seperti halnya kelebihan massa yang menyebabkan puncak tailing (10), puncak leading yang disebabkan oleh retensi nonlinier juga dapat didiagnosis dengan mengurangi massa analit yang disuntikkan. Jika bentuk puncak membaik, metode harus dimodifikasi agar tidak melebihi kualitas injeksi yang menyebabkan leading edge, atau kondisi kromatografi harus diubah untuk meminimalkan perilaku ini.
Kadang-kadang kita mengamati apa yang tampak seperti puncak yang "terbelah", seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1f. Langkah pertama dalam memecahkan masalah ini adalah menentukan apakah bentuk puncak disebabkan oleh ko-elusi parsial (yaitu, adanya dua senyawa yang berbeda tetapi elusinya berdekatan). Jika sebenarnya ada dua analit berbeda yang elusinya berdekatan, maka ini adalah masalah peningkatan resolusinya (misalnya, dengan meningkatkan selektivitas, retensi, atau jumlah pelat), dan puncak "terbelah" yang tampak terkait dengan Kinerja fisik tidak ada hubungannya dengan kolom itu sendiri. Seringkali, petunjuk terpenting untuk keputusan ini adalah apakah semua puncak dalam kromatogram menunjukkan bentuk terbelah, atau hanya satu atau dua. Jika hanya satu atau dua, itu mungkin masalah ko-elusi; jika semua puncak terbelah, itu mungkin masalah fisik, kemungkinan besar terkait dengan kolom itu sendiri.
Puncak terbelah yang terkait dengan sifat fisik kolom itu sendiri biasanya disebabkan oleh frit saluran masuk atau keluar yang tersumbat sebagian, atau reorganisasi partikel dalam kolom, yang memungkinkan fase mobil mengalir lebih cepat daripada fase mobil di area tertentu dari pembentukan saluran kolom di wilayah lain (11). Frit yang tersumbat sebagian terkadang dapat dibersihkan dengan membalikkan aliran melalui kolom; namun, menurut pengalaman saya, ini biasanya merupakan solusi jangka pendek, bukan jangka panjang. Ini sering kali berakibat fatal pada kolom modern jika partikel bergabung kembali dalam kolom. Pada titik ini, yang terbaik adalah mengganti kolom dan melanjutkan.
Puncak pada Gambar 1g, juga dari contoh terbaru di lab saya sendiri, biasanya menunjukkan bahwa sinyalnya sangat tinggi sehingga telah mencapai ujung atas rentang respons. Untuk detektor absorbansi optik (UV-vis dalam kasus ini), ketika konsentrasi analit sangat tinggi, analit menyerap sebagian besar cahaya yang melewati sel aliran detektor, sehingga hanya menyisakan sedikit cahaya yang dapat dideteksi. Dalam kondisi ini, sinyal listrik dari fotodetektor sangat dipengaruhi oleh berbagai sumber derau, seperti cahaya liar dan "arus gelap", yang membuat sinyal tampak sangat "kabur" dan tidak bergantung pada konsentrasi analit. Ketika ini terjadi, masalah tersebut sering kali dapat dengan mudah diatasi dengan mengurangi volume injeksi analit—mengurangi volume injeksi, mengencerkan sampel, atau keduanya.
Di sekolah kromatografi, kami menggunakan sinyal detektor (yaitu, sumbu y dalam kromatogram) sebagai indikator konsentrasi analit dalam sampel. Jadi, aneh rasanya melihat kromatogram dengan sinyal di bawah nol, karena interpretasi sederhananya adalah hal ini menunjukkan konsentrasi analit negatif – yang tentu saja tidak mungkin secara fisik. Dalam pengalaman saya, puncak negatif paling sering diamati saat menggunakan detektor absorbansi optik (misalnya, UV-vis).
Dalam kasus ini, puncak negatif berarti bahwa molekul yang keluar dari kolom menyerap lebih sedikit cahaya daripada fase mobil itu sendiri tepat sebelum dan sesudah puncak. Ini dapat terjadi, misalnya, saat menggunakan panjang gelombang deteksi yang relatif rendah (<230 nm) dan aditif fase mobil yang menyerap sebagian besar cahaya pada panjang gelombang ini. Aditif tersebut dapat berupa komponen pelarut fase mobil seperti metanol atau komponen buffer seperti asetat atau format. Seseorang sebenarnya dapat menggunakan puncak negatif untuk menyiapkan kurva kalibrasi dan memperoleh informasi kuantitatif yang akurat, jadi tidak ada alasan mendasar untuk menghindarinya (metode ini kadang-kadang disebut sebagai "deteksi UV tidak langsung") (13). Namun, jika kita benar-benar ingin menghindari puncak negatif sama sekali, dalam kasus deteksi absorbansi, solusi terbaik adalah menggunakan panjang gelombang deteksi yang berbeda sehingga analit menyerap lebih banyak daripada fase mobil, atau mengubah komposisi fase mobil sehingga Mereka menyerap lebih sedikit cahaya daripada analit.
Puncak negatif juga dapat muncul saat menggunakan deteksi indeks bias (RI) ketika indeks bias komponen selain analit dalam sampel, seperti matriks pelarut, berbeda dari indeks bias fase gerak. Hal ini juga terjadi dengan deteksi UV-vis, tetapi efek ini cenderung dilemahkan relatif terhadap deteksi RI. Dalam kedua kasus, puncak negatif dapat diminimalkan dengan mencocokkan komposisi matriks sampel dengan fase gerak secara lebih cermat.
Pada bagian ketiga tentang topik dasar pemecahan masalah LC, saya membahas situasi di mana bentuk puncak yang diamati berbeda dari bentuk puncak yang diharapkan atau normal. Pemecahan masalah yang efektif untuk masalah tersebut dimulai dengan pengetahuan tentang bentuk puncak yang diharapkan (berdasarkan teori atau pengalaman sebelumnya dengan metode yang ada), sehingga penyimpangan dari harapan ini terlihat jelas. Masalah bentuk puncak memiliki banyak penyebab potensial yang berbeda (terlalu lebar, tailing, leading edge, dll.). Dalam angsuran ini, saya membahas secara rinci beberapa alasan yang paling sering saya lihat. Mengetahui detail ini memberikan tempat yang baik untuk memulai pemecahan masalah, tetapi tidak mencakup semua kemungkinan. Pembaca yang tertarik dengan daftar penyebab dan solusi yang lebih mendalam dapat merujuk ke bagan dinding "Panduan Pemecahan Masalah LC" LCGC.
(4) Bagan dinding “Panduan Pemecahan Masalah LC” LCGC.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisis Data dan Pengolahan Sinyal dalam Kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), hlm. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF dan Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.