Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Biopsi cair (LB) adalah konsep yang dengan cepat mendapatkan popularitas di bidang biomedis.Konsep ini terutama didasarkan pada deteksi fragmen DNA ekstraseluler yang bersirkulasi (ccfDNA), yang sebagian besar dilepaskan sebagai fragmen kecil setelah kematian sel di berbagai jaringan.Sebagian kecil dari fragmen ini berasal dari jaringan atau organisme asing (asing).Dalam pekerjaan saat ini, kami telah menerapkan konsep ini pada kerang, spesies sentinel yang dikenal dengan kapasitas penyaringan air lautnya yang tinggi.Kami menggunakan kemampuan kerang untuk bertindak sebagai filter alami untuk menangkap fragmen DNA lingkungan dari berbagai sumber untuk memberikan informasi tentang keanekaragaman hayati ekosistem pesisir laut.Hasil kami menunjukkan bahwa kerang hemolimf mengandung fragmen DNA yang ukurannya sangat bervariasi, dari 1 hingga 5 kb.Pengurutan senapan menunjukkan bahwa sejumlah besar fragmen DNA berasal dari mikroba asing.Di antaranya, kami menemukan fragmen DNA dari bakteri, archaea, dan virus, termasuk virus yang diketahui menginfeksi berbagai inang yang biasa ditemukan di ekosistem laut pesisir.Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB yang diterapkan pada kerang mewakili sumber pengetahuan yang kaya tetapi belum dijelajahi tentang keanekaragaman mikroba di ekosistem pesisir laut.
Dampak perubahan iklim (CC) terhadap keanekaragaman hayati ekosistem laut merupakan bidang penelitian yang berkembang pesat.Pemanasan global tidak hanya menyebabkan tekanan fisiologis yang penting, tetapi juga mendorong batas evolusi stabilitas termal organisme laut, mempengaruhi habitat sejumlah spesies, mendorong mereka untuk mencari kondisi yang lebih menguntungkan [1, 2].Selain memengaruhi keanekaragaman hayati metazoa, CC mengganggu keseimbangan interaksi inang-mikroba.Disbiosis mikroba ini merupakan ancaman serius bagi ekosistem laut karena membuat organisme laut lebih rentan terhadap patogen infeksius [3, 4].Dipercayai bahwa SS memainkan peran penting dalam kematian massal, yang merupakan masalah serius bagi pengelolaan ekosistem laut global [5, 6].Ini adalah masalah penting mengingat dampak ekonomi, ekologi dan nutrisi dari banyak spesies laut.Ini terutama berlaku untuk bivalvia yang hidup di daerah kutub, di mana efek CK lebih cepat dan parah [6, 7].Bahkan, bivalvia seperti Mytilus spp.banyak digunakan untuk memantau efek CC pada ekosistem laut.Tidak mengherankan, sejumlah besar biomarker telah dikembangkan untuk memantau kesehatannya, seringkali menggunakan pendekatan dua tingkat yang melibatkan biomarker fungsional berdasarkan aktivitas enzimatik atau fungsi seluler seperti viabilitas sel dan aktivitas fagositik [8].Metode ini juga mencakup pengukuran konsentrasi indikator tekanan spesifik yang menumpuk di jaringan lunak setelah penyerapan air laut dalam jumlah besar.Namun, kapasitas filtrasi tinggi dan sistem sirkulasi bivalvia semi terbuka memberikan peluang untuk mengembangkan biomarker hemolimf baru menggunakan konsep biopsi cair (LB), pendekatan invasif sederhana dan minimal untuk manajemen pasien.sampel darah [9, 10].Meskipun beberapa jenis molekul yang bersirkulasi dapat ditemukan di LB manusia, konsep ini terutama didasarkan pada analisis pengurutan DNA dari fragmen DNA ekstraseluler (ccfDNA) yang bersirkulasi dalam plasma.Faktanya, keberadaan DNA yang bersirkulasi dalam plasma manusia telah diketahui sejak pertengahan abad ke-20 [11], tetapi baru dalam beberapa tahun terakhir munculnya metode pengurutan throughput tinggi telah mengarah pada diagnosis klinis berdasarkan ccfDNA.Kehadiran fragmen DNA yang bersirkulasi ini sebagian disebabkan oleh pelepasan pasif DNA genomik (nuklir dan mitokondria) setelah kematian sel. Pada individu sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai patologi atau mengalami stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan. Pada individu sehat, konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/mL) tetapi dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien yang menderita berbagai patologi atau mengalami stres, yang mengakibatkan kerusakan jaringan. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться dalam 5–10 halaman у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Pada orang sehat, konsentrasi cccDNA biasanya rendah (<10 ng/mL), tetapi dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau di bawah tekanan yang menyebabkan kerusakan jaringan.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены dalam 5-10 hari пациентов с различными патологиями стрессом, что приводит к повреждению тканей. konsentrasi ccfDNA biasanya rendah (<10 ng/ml) pada individu sehat, namun dapat meningkat 5-10 kali lipat pada pasien dengan berbagai patologi atau stres, mengakibatkan kerusakan jaringan.Ukuran fragmen ccfDNA sangat bervariasi, tetapi biasanya berkisar antara 150 hingga 200 bp.[12].Analisis ccfDNA yang diturunkan sendiri, yaitu ccfDNA dari sel inang normal atau yang diubah, dapat digunakan untuk mendeteksi perubahan genetik dan epigenetik yang ada dalam genom nuklir dan/atau mitokondria, sehingga membantu dokter memilih terapi bertarget molekul tertentu [13].Namun, ccfDNA dapat diperoleh dari sumber asing seperti ccfDNA dari sel janin selama kehamilan atau dari organ yang ditransplantasikan [14,15,16,17].ccfDNA juga merupakan sumber informasi penting untuk mendeteksi keberadaan asam nukleat dari agen infeksius (asing), yang memungkinkan deteksi non-invasif infeksi luas yang tidak teridentifikasi oleh kultur darah, menghindari biopsi invasif jaringan yang terinfeksi [18].Studi terbaru memang menunjukkan bahwa darah manusia mengandung sumber informasi yang kaya yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi virus dan bakteri patogen, dan sekitar 1% dari ccfDNA yang ditemukan dalam plasma manusia berasal dari luar [19].Studi-studi ini menunjukkan bahwa keanekaragaman hayati mikrobioma yang bersirkulasi organisme dapat dinilai menggunakan analisis ccfDNA.Namun, hingga saat ini, konsep ini digunakan secara eksklusif pada manusia dan, pada tingkat yang lebih rendah, pada vertebrata lainnya [20, 21].
Dalam makalah ini, kami menggunakan potensi LB untuk menganalisis ccfDNA Aulacomya atra, spesies selatan yang umumnya ditemukan di Kepulauan Kerguelen subantartika, sekelompok pulau di atas dataran besar yang terbentuk 35 juta tahun lalu.erupsi vulkanik.Menggunakan sistem eksperimental in vitro, kami menemukan bahwa fragmen DNA dalam air laut dengan cepat diambil oleh kerang dan memasuki kompartemen hemolimf.Pengurutan shotgun telah menunjukkan bahwa ccfDNA hemolymph mussel mengandung fragmen DNA yang berasal dari dirinya sendiri dan bukan dirinya sendiri, termasuk bakteri simbiotik dan fragmen DNA dari bioma khas ekosistem pantai laut vulkanik dingin.Hemolymph ccfDNA juga mengandung urutan virus yang berasal dari virus dengan rentang inang yang berbeda.Kami juga menemukan fragmen DNA dari hewan multisel seperti ikan bertulang, anemon laut, alga, dan serangga.Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB dapat berhasil diterapkan pada invertebrata laut untuk menghasilkan repertoar genomik yang kaya di ekosistem laut.
Dewasa (panjang 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) dan Aulacomya atra (A. atra) dikumpulkan dari pantai berbatu intertidal Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kepulauan Kerguelen pada Desember 2018. Kerang biru dewasa lainnya (Mytilus spp.) diperoleh dari pemasok komersial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) dan ditempatkan dalam tangki aerasi dengan suhu terkontrol (4°C) yang berisi 10–20 L air garam buatan 32‰.(garam laut buatan Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Untuk setiap percobaan, panjang dan berat cangkang individu diukur.
Protokol akses terbuka gratis untuk program ini tersedia online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Secara singkat, LB hemolymph dikumpulkan dari otot penculik seperti yang dijelaskan [22].Hemolimf dijernihkan dengan sentrifugasi pada 1200xg selama 3 menit, supernatan dibekukan (-20°C) sampai digunakan.Untuk isolasi dan pemurnian cfDNA, sampel (1,5-2,0 ml) dicairkan dan diproses menggunakan kit cfDNA NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sesuai dengan instruksi pabriknya.ccfDNA disimpan pada -80 ° C sampai analisis lebih lanjut.Dalam beberapa percobaan, ccfDNA diisolasi dan dimurnikan menggunakan QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).DNA yang dimurnikan dikuantifikasi menggunakan uji PicoGreen standar.Distribusi fragmen dari ccfDNA yang diisolasi dianalisis dengan elektroforesis kapiler menggunakan bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) menggunakan Kit DNA Sensitivitas Tinggi.Pengujian dilakukan dengan menggunakan 1 µl sampel ccfDNA sesuai dengan instruksi pabriknya.
Untuk pengurutan fragmen hemolymph ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) menyiapkan perpustakaan senapan menggunakan kit Illumina DNA Mix dari kit Illumina MiSeq PE75.Adaptor standar (BioO) digunakan.File data mentah tersedia dari NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 dan SRR8924809).Kualitas membaca dasar dinilai menggunakan FastQC [23].Trimmomatic [24] telah digunakan untuk clipping adapter dan kualitas pembacaan yang buruk.Bacaan senapan dengan ujung berpasangan adalah FLASH digabung menjadi bacaan tunggal yang lebih panjang dengan tumpang tindih minimum 20 bp untuk menghindari ketidaksesuaian [25]. Bacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e−3 dan 90% homologi), dan penyamaran urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Bacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi bivalve NCBI (nilai e <1e−3 dan 90% homologi), dan penyamaran urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии дву створчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), dan маскирование последовательностей низкой сложно сти было выполнено с использованием DUST [26]. Bacaan gabungan dianotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi kerang NCBI (nilai e <1e-3 dan 90% homologi), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。debu [26] 进行复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данны х двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), dan маскирование последовательностей низкой с ложности было выполнено с использованием DUST [26]. Bacaan yang terkumpul dianotasi dengan BLASTN menggunakan database taksonomi kerang NCBI (nilai e <1e-3 dan 90% homologi), dan masking urutan kompleksitas rendah dilakukan menggunakan DUST [26].Bacaan dibagi menjadi dua kelompok: terkait dengan urutan kerang (di sini disebut membaca sendiri) dan tidak terkait (tidak membaca sendiri).Dua kelompok dirakit secara terpisah menggunakan MEGAHIT untuk menghasilkan contigs [27].Sementara itu, distribusi taksonomi pembacaan microbiome alien diklasifikasikan menggunakan Kraken2 [28] dan secara grafis diwakili oleh diagram lingkaran Krona di Galaxy [29, 30].Kmers optimal ditentukan menjadi kmers-59 dari percobaan awal kami. Contigs mandiri kemudian diidentifikasi dengan penyelarasan dengan BLASTN (database bivalve NCBI, nilai e <1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Contigs mandiri kemudian diidentifikasi dengan penyelarasan dengan BLASTN (database bivalve NCBI, nilai e <1e−10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчаты х моллюсков NCBI, значение e <1e-10 dan гомология 60%) для окончательной аннотации. Self-contigs kemudian diidentifikasi dengan mencocokkannya dengan BLASTN (database kerang NCBI, nilai e <1e-10 dan 60% homologi) untuk anotasi akhir.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (база данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Self-contigs kemudian diidentifikasi untuk anotasi akhir dengan mencocokkannya dengan BLASTN (database kerang NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). Secara paralel, contig grup nonself dianotasi dengan BLASTN (database nt NCBI, nilai e <1e−10 dan homologi 60%). Secara paralel, contig grup nonself dianotasi dengan BLASTN (database nt NCBI, nilai e <1e−10 dan homologi 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значе kurang dari <1e-10 dan гомология 60%). Secara paralel, contig grup asing dianotasi dengan BLASTN (database NT NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся кобственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данн ых nt NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). Secara paralel, contig grup non-self dianotasi dengan BLASTN (database nt NCBI, nilai e <1e-10 dan homologi 60%). BLASTX juga dilakukan pada nonself contigs menggunakan database NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e <1e−10 dan homologi 60%). BLASTX juga dilakukan pada nonself contigs menggunakan database NCBI protein nr dan RefSeq (nilai e <1e−10 dan homologi 60%). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с пользованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (зн ачение e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada non-self contigs menggunakan database protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan homologi 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значе kurang dari <1e-10 dan гомология 60%). BLASTX juga dilakukan pada contig non-self menggunakan database protein nr dan RefSeq NCBI (nilai e <1e-10 dan homologi 60%).Kumpulan BLASTN dan BLASTX dari non-self-contig mewakili contig terakhir (lihat File tambahan).
Primer yang digunakan untuk PCR tercantum dalam Tabel S1.Taq DNA polimerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) digunakan untuk memperkuat gen target ccfDNA.Kondisi reaksi berikut digunakan: denaturasi pada 95°C selama 3 menit, 95°C selama 1 menit, pengaturan suhu annealing selama 1 menit, elongasi pada 72°C selama 1 menit, 35 siklus, dan akhirnya 72°C dalam waktu 10 menit..Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis dalam gel agarosa (1,5%) yang mengandung SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) pada 95 V.
Kerang (Mytilus spp.) diaklimatisasi dalam 500 ml air laut beroksigen (32 PSU) selama 24 jam pada suhu 4°C.DNA plasmid yang mengandung sisipan yang mengkode urutan cDNA galektin-7 manusia (nomor aksesi NCBI L07769) ditambahkan ke botol pada konsentrasi akhir 190 μg / μl.Kerang diinkubasi dalam kondisi yang sama tanpa penambahan DNA adalah kontrol.Tangki kontrol ketiga berisi DNA tanpa remis.Untuk memantau kualitas DNA dalam air laut, sampel air laut (20 μl; tiga kali pengulangan) diambil dari setiap tangki pada waktu yang ditentukan.Untuk keterlacakan DNA plasmid, kerang LB dipanen pada waktu yang ditentukan dan dianalisis dengan qPCR dan ddPCR.Karena kandungan garam air laut yang tinggi, alikuot diencerkan dalam air kualitas PCR (1:10) sebelum semua pengujian PCR.
PCR tetesan digital (ddPCR) dilakukan menggunakan protokol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).Gunakan profil suhu untuk menentukan suhu optimal (Tabel S1).Tetesan dihasilkan menggunakan generator jatuhan QX200 (BioRad).ddPCR dilakukan sebagai berikut: 95 ° C selama 5 menit, 50 siklus 95 ° C selama 30 detik dan suhu anil yang diberikan selama 1 menit dan 72 ° C selama 30 detik, 4 ° C selama 5 menit dan 90 ° C dalam waktu 5 menit.Jumlah tetes dan reaksi positif (jumlah salinan/µl) diukur menggunakan pembaca tetes QX200 (BioRad).Sampel dengan kurang dari 10.000 droplet ditolak.Kontrol pola tidak dilakukan setiap kali ddPCR dijalankan.
qPCR dilakukan menggunakan Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) dan primer spesifik LGALS7.Semua PCR kuantitatif dilakukan dalam 20 µl menggunakan QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR dimulai dengan inkubasi 15 menit pada 95°C diikuti dengan 40 siklus pada 95°C selama 10 detik dan pada 60°C selama 60 detik dengan satu pengumpulan data.Kurva peleburan dihasilkan menggunakan pengukuran berurutan pada 95°C selama 5 detik, 65°C selama 60 detik, dan 97°C pada akhir qPCR.Setiap qPCR dilakukan dalam rangkap tiga, kecuali untuk sampel kontrol.
Karena kerang dikenal dengan laju filtrasinya yang tinggi, kami pertama-tama menyelidiki apakah mereka dapat menyaring dan mempertahankan fragmen DNA yang ada di air laut.Kami juga tertarik pada apakah fragmen-fragmen ini terakumulasi dalam sistem limfatik semi-terbuka mereka.Kami menyelesaikan masalah ini secara eksperimental dengan menelusuri nasib fragmen DNA terlarut yang ditambahkan ke tangki kerang biru.Untuk memfasilitasi pelacakan fragmen DNA, kami menggunakan DNA plasmid asing (bukan diri sendiri) yang mengandung gen galektin-7 manusia.ddPCR melacak fragmen DNA plasmid di air laut dan kerang.Hasil kami menunjukkan bahwa jika jumlah fragmen DNA dalam air laut tetap relatif konstan dari waktu ke waktu (hingga 7 hari) tanpa adanya kerang, maka dengan adanya kerang, tingkat ini hampir hilang seluruhnya dalam waktu 8 jam (Gbr. 1a,b).Fragmen DNA eksogen mudah dideteksi dalam 15 menit dalam cairan intravalvular dan hemolimf (Gbr. 1c).Fragmen ini masih dapat dideteksi hingga 4 jam setelah paparan.Aktivitas penyaringan sehubungan dengan fragmen DNA ini sebanding dengan aktivitas penyaringan bakteri dan alga [31].Hasil ini menunjukkan bahwa kerang dapat menyaring dan menumpuk DNA asing di kompartemen cairannya.
Konsentrasi relatif DNA plasmid dalam air laut dengan ada (A) atau tidak ada (B) kerang, diukur dengan ddPCR.Di A, hasilnya dinyatakan sebagai persentase, dengan batas kotak mewakili persentil ke-75 dan ke-25.Kurva logaritmik yang dipasang ditunjukkan dengan warna merah, dan area yang diarsir abu-abu mewakili interval kepercayaan 95%.Di B, garis merah mewakili rata-rata dan garis biru mewakili interval kepercayaan 95% untuk konsentrasi.C Akumulasi DNA plasmid dalam cairan hemolymph dan katup kerang pada waktu yang berbeda setelah penambahan DNA plasmid.Hasil ditampilkan sebagai salinan mutlak terdeteksi/mL (±SE).
Selanjutnya, kami menyelidiki asal ccfDNA dalam kerang yang dikumpulkan dari lapisan kerang di Kepulauan Kerguelen, sekelompok pulau terpencil dengan pengaruh antropogenik terbatas.Untuk tujuan ini, cccDNA dari kerang hemolimf diisolasi dan dimurnikan dengan metode yang biasa digunakan untuk memurnikan cccDNA manusia [32, 33].Kami menemukan bahwa konsentrasi ccfDNA hemolymph rata-rata dalam kerang berada dalam kisaran mikrogram rendah per ml hemolymph (lihat Tabel S2, Informasi Tambahan).Kisaran konsentrasi ini jauh lebih besar daripada orang sehat (nanogram rendah per mililiter), tetapi dalam kasus yang jarang terjadi, pada pasien kanker, tingkat ccfDNA dapat mencapai beberapa mikrogram per mililiter [34, 35].Analisis distribusi ukuran ccfDNA hemolymph menunjukkan bahwa fragmen ini sangat bervariasi ukurannya, mulai dari 1000 bp hingga 1000 bp.hingga 5000 bp (Gbr. 2).Hasil serupa diperoleh dengan menggunakan QIAamp Investigator Kit berbasis silika, metode yang biasa digunakan dalam ilmu forensik untuk mengisolasi dan memurnikan DNA genom dengan cepat dari sampel DNA dengan konsentrasi rendah, termasuk ccfDNA [36].
Representatif ccfDNA electrophoregram dari kerang hemolymph.Diekstrak dengan NucleoSnap Plasma Kit (atas) dan QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin plot menunjukkan distribusi konsentrasi hemolymph ccfDNA (±SE) pada remis.Garis hitam dan merah masing-masing mewakili median dan kuartil pertama dan ketiga.
Sekitar 1% ccfDNA pada manusia dan primata memiliki sumber asing [21, 37].Mengingat sistem peredaran bivalvia semi terbuka, air laut yang kaya mikroba, dan distribusi ukuran ccfDNA kerang, kami berhipotesis bahwa ccfDNA hemolimf kerang mungkin mengandung kumpulan DNA mikroba yang kaya dan beragam.Untuk menguji hipotesis ini, kami mengurutkan ccfDNA hemolymph dari sampel Aulacomya atra yang dikumpulkan dari Kepulauan Kerguelen, menghasilkan lebih dari 10 juta bacaan, 97,6% di antaranya lolos kontrol kualitas.Bacaan kemudian diklasifikasikan menurut sumber mandiri dan non-mandiri menggunakan database kerang BLASTN dan NCBI (Gbr. S1, Informasi Tambahan).
Pada manusia, DNA inti dan mitokondria dapat dilepaskan ke dalam aliran darah [38].Namun, dalam penelitian ini, tidak mungkin untuk menggambarkan secara rinci DNA genom inti kerang, mengingat genom A. atra belum diurutkan atau dijelaskan.Namun, kami dapat mengidentifikasi sejumlah fragmen ccfDNA dari asal kami sendiri menggunakan perpustakaan kerang (Gbr. S2, Informasi Tambahan).Kami juga mengkonfirmasi keberadaan fragmen DNA dari asal kami sendiri dengan amplifikasi PCR terarah dari gen A. atra yang diurutkan (Gbr. 3).Demikian pula, mengingat genom mitokondria A. atra tersedia di database publik, orang dapat menemukan bukti keberadaan fragmen ccfDNA mitokondria di hemolimf A. atra.Kehadiran fragmen DNA mitokondria dikonfirmasi dengan amplifikasi PCR (Gbr. 3).
Berbagai gen mitokondria hadir dalam hemolymph A. atra (titik merah – nomor stok: SRX5705969) dan M. platensis (titik biru – nomor stok: SRX5705968) diamplifikasi oleh PCR.Gambar diadaptasi dari Breton et al., 2011 B Amplifikasi supernatan hemolymph dari A. atra Disimpan pada kertas FTA.Gunakan punch 3 mm untuk menambahkan langsung ke tabung PCR yang berisi campuran PCR.
Mengingat kandungan mikroba yang melimpah di air laut, kami awalnya berfokus pada karakterisasi sekuens DNA mikroba dalam hemolimf.Untuk melakukan ini, kami menggunakan dua strategi berbeda.Strategi pertama menggunakan Kraken2, program klasifikasi urutan berbasis algoritma yang dapat mengidentifikasi urutan mikroba dengan akurasi yang sebanding dengan BLAST dan alat lainnya [28].Lebih dari 6719 bacaan ditentukan berasal dari bakteri, sementara 124 dan 64 masing-masing berasal dari archaea dan virus (Gbr. 4).Fragmen DNA bakteri yang paling banyak adalah Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), dan Bacteroidetes (17%) (Gbr. 4a).Distribusi ini konsisten dengan penelitian sebelumnya tentang mikrobioma kerang biru laut [39, 40].Gammaproteobacteria adalah kelas utama Proteobacteria (44%), termasuk banyak Vibrionales (Gbr. 4b).Metode ddPCR mengonfirmasi keberadaan fragmen DNA Vibrio dalam ccfDNA A. atra hemolymph (Gbr. 4c) [41].Untuk mendapatkan lebih banyak informasi tentang asal bakteri ccfDNA, pendekatan tambahan diambil (Gbr. S2, Informasi Tambahan). Dalam hal ini, bacaan yang tumpang tindih dirangkai sebagai bacaan ujung berpasangan dan diklasifikasikan sebagai bacaan mandiri (bivalvia) atau bukan mandiri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan batas dengan homologi >90%. Dalam hal ini, bacaan yang tumpang tindih dirangkai sebagai bacaan ujung berpasangan dan diklasifikasikan sebagai bacaan mandiri (bivalvia) atau bukan mandiri menggunakan BLASTN dan nilai e 1e−3 dan batas dengan homologi >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифиц BLASTN и знач ения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Dalam hal ini, bacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai asli (kerang) atau tidak asli menggunakan BLASTN dan nilai e 1e-3 dan cutoff dengan homologi> 90%.90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90% В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицирован ы как собственные (двустворчатые моллюски) atau несобственные по происхождению с использованием значени й e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Dalam hal ini, bacaan yang tumpang tindih dikumpulkan sebagai bacaan berpasangan dan diklasifikasikan sebagai milik sendiri (kerang) atau tidak asli menggunakan nilai e BLASTN dan 1e-3 ​​dan ambang homologi> 90%.Karena genom A. atra belum diurutkan, kami menggunakan strategi perakitan de novo dari assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Sebanyak 147.188 contig telah diidentifikasi sebagai asal usul (bivalvia).Contig ini kemudian diledakkan dengan nilai-e 1e-10 menggunakan BLASTN dan BLASTX.Strategi ini memungkinkan kami untuk mengidentifikasi 482 fragmen non-kerang yang ada di A. atra ccfDNA.Lebih dari setengah (57%) fragmen DNA ini diperoleh dari bakteri, terutama dari simbion insang, termasuk simbion sulfotrofik, dan dari simbion insang Solemya velum (Gbr. 5).
Kelimpahan relatif pada tingkat jenis.B Keanekaragaman mikroba dari dua filum utama (Firmicutes dan Proteobacteria).Amplifikasi representatif dari ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmen gen 16S rRNA (biru) dalam tiga hemolimf atra.
Sebanyak 482 contig yang dikumpulkan dianalisis.Profil umum distribusi taksonomi dari anotasi contig metagenomik (prokariota dan eukariota).B Distribusi detail fragmen DNA bakteri yang diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX.
Analisis Kraken2 juga menunjukkan bahwa ccfDNA kerang mengandung fragmen DNA archaeal, termasuk fragmen DNA Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), dan Thaurmarcheota (11%) (Gbr. 6a).Kehadiran fragmen DNA yang berasal dari Euryarchaeota dan Crenarchaeota, yang sebelumnya ditemukan di komunitas mikroba kerang California, seharusnya tidak mengejutkan [42].Meskipun Euryarchaeota sering dikaitkan dengan kondisi ekstrim, sekarang diketahui bahwa baik Euryarchaeota dan Crenarcheota adalah prokariota yang paling umum di lingkungan cryogenic laut [43, 44].Kehadiran mikroorganisme metanogenik dalam kerang tidak mengherankan, mengingat laporan baru-baru ini tentang kebocoran metana yang luas dari kebocoran dasar di Dataran Tinggi Kerguelen [45] dan kemungkinan produksi metana mikroba yang diamati di lepas pantai Kepulauan Kerguelen [46].
Perhatian kami kemudian beralih ke bacaan dari virus DNA.Sepengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang tidak tepat sasaran tentang kandungan virus kerang.Seperti yang diharapkan, kami menemukan fragmen DNA bakteriofag (Caudovirales) (Gbr. 6b).Namun, DNA virus yang paling umum berasal dari filum nukleositovirus, juga dikenal sebagai virus DNA besar sitoplasma nuklir (NCLDV), yang memiliki genom terbesar dari semua virus.Dalam filum ini, sebagian besar sekuens DNA milik keluarga Mimimidoviridae (58%) dan Poxviridae (21%), yang inang alaminya meliputi vertebrata dan artropoda, sementara sebagian kecil dari sekuens DNA ini termasuk alga virologi yang diketahui.Menginfeksi alga eukariotik laut.Urutan juga diperoleh dari virus Pandora, virus raksasa dengan ukuran genom terbesar dari semua genera virus yang diketahui.Menariknya, kisaran inang yang diketahui terinfeksi virus, sebagaimana ditentukan oleh pengurutan ccfDNA hemolymph, relatif besar (Gambar S3, Informasi Tambahan).Ini termasuk virus yang menginfeksi serangga seperti Baculoviridae dan Iridoviridae, serta virus yang menginfeksi amuba, alga, dan vertebrata.Kami juga menemukan urutan yang cocok dengan genom Pithovirus sibericum.Pitovirus (juga dikenal sebagai "virus zombie") pertama kali diisolasi dari permafrost berusia 30.000 tahun di Siberia [47].Dengan demikian, hasil kami konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa tidak semua spesies modern dari virus ini punah [48] dan bahwa virus ini mungkin ada di ekosistem laut subarktik terpencil.
Terakhir, kami menguji untuk melihat apakah kami dapat menemukan fragmen DNA dari hewan multisel lainnya.Sebanyak 482 contig asing diidentifikasi oleh BLASTN dan BLASTX dengan perpustakaan nt, nr dan RefSeq (genomik dan protein).Hasil kami menunjukkan bahwa di antara fragmen asing ccfDNA hewan multiseluler, DNA tulang bertulang mendominasi (Gbr. 5).Fragmen DNA dari serangga dan spesies lain juga telah ditemukan.Bagian yang relatif besar dari fragmen DNA belum teridentifikasi, mungkin karena kurang terwakili dari sejumlah besar spesies laut dalam database genomik dibandingkan dengan spesies terestrial [49].
Dalam makalah ini, kami menerapkan konsep LB pada kerang, dengan alasan bahwa sekuensing tembakan hemolymph ccfDNA dapat memberikan wawasan tentang komposisi ekosistem pesisir laut.Secara khusus, kami menemukan bahwa 1) hemolymph kerang mengandung konsentrasi yang relatif tinggi (tingkat mikrogram) dari fragmen DNA yang bersirkulasi relatif besar (~ 1-5 kb);2) fragmen DNA ini independen dan non-independen 3) Di antara sumber asing dari fragmen DNA ini, kami menemukan DNA bakteri, archaeal dan virus, serta DNA hewan multisel lainnya;4) Akumulasi fragmen ccfDNA asing ini dalam hemolimf terjadi dengan cepat dan berkontribusi pada aktivitas penyaringan internal kerang.Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwa konsep LB, yang sejauh ini diterapkan terutama di bidang biomedis, mengkodekan sumber pengetahuan yang kaya namun belum dijelajahi yang dapat digunakan untuk lebih memahami interaksi antara spesies sentinel dan lingkungannya.
Selain primata, isolasi ccfDNA telah dilaporkan pada mamalia, termasuk tikus, anjing, kucing, dan kuda [50, 51, 52].Namun, sepengetahuan kami, penelitian kami adalah yang pertama melaporkan deteksi dan pengurutan ccfDNA pada spesies laut dengan sistem sirkulasi terbuka.Fitur anatomis dan kemampuan penyaringan remis mungkin, setidaknya sebagian, menjelaskan karakteristik ukuran yang berbeda dari fragmen DNA yang bersirkulasi dibandingkan dengan spesies lain.Pada manusia, sebagian besar fragmen DNA yang bersirkulasi dalam darah adalah fragmen kecil dengan ukuran mulai dari 150 hingga 200 bp.dengan puncak maksimum 167 bp [34, 53].Sebagian kecil tetapi signifikan dari fragmen DNA berukuran antara 300 dan 500 bp, dan sekitar 5% lebih panjang dari 900 bp.[54].Alasan untuk distribusi ukuran ini adalah bahwa sumber utama ccfDNA dalam plasma terjadi sebagai akibat dari kematian sel, baik karena kematian sel atau karena nekrosis sel hematopoietik yang bersirkulasi pada individu sehat atau karena apoptosis sel tumor pada pasien kanker (dikenal sebagai DNA tumor yang bersirkulasi)., ctDNA).Distribusi ukuran ccfDNA hemolymph yang kami temukan pada kerang berkisar antara 1000 hingga 5000 bp, menunjukkan bahwa ccfDNA kerang memiliki asal yang berbeda.Ini adalah hipotesis yang logis, karena remis memiliki sistem vaskular semi terbuka dan hidup di lingkungan perairan laut yang mengandung DNA genom mikroba konsentrasi tinggi.Faktanya, percobaan laboratorium kami menggunakan DNA eksogen telah menunjukkan bahwa kerang mengakumulasi fragmen DNA di air laut, setidaknya setelah beberapa jam terdegradasi setelah serapan seluler dan/atau dilepaskan dan/atau disimpan di berbagai organisasi.Mengingat kelangkaan sel (baik prokariotik dan eukariotik), penggunaan kompartemen intravalvular akan mengurangi jumlah ccfDNA dari sumber sendiri maupun dari sumber asing.Mempertimbangkan pentingnya kekebalan bawaan kerang dan sejumlah besar fagosit yang bersirkulasi, kami selanjutnya berhipotesis bahwa bahkan ccfDNA asing diperkaya dalam fagosit yang bersirkulasi yang mengakumulasi DNA asing setelah menelan mikroorganisme dan / atau puing seluler.Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa bivalve hemolymph ccfDNA adalah gudang informasi molekuler yang unik dan memperkuat status mereka sebagai spesies sentinel.
Data kami menunjukkan bahwa pengurutan dan analisis fragmen ccfDNA hemolymph yang diturunkan dari bakteri dapat memberikan informasi kunci tentang flora bakteri inang dan bakteri yang ada di ekosistem laut sekitarnya.Teknik pengurutan bidikan telah mengungkapkan urutan bakteri komensal A. atra insang yang akan terlewatkan jika metode identifikasi 16S rRNA konvensional telah digunakan, sebagian karena bias perpustakaan referensi.Faktanya, penggunaan data LB kami yang dikumpulkan dari M. platensis di lapisan kerang yang sama di Kerguelen menunjukkan bahwa komposisi simbion bakteri terkait insang adalah sama untuk kedua spesies kerang (Gbr. S4, Informasi Tambahan).Kemiripan dua remis yang berbeda secara genetik ini mungkin mencerminkan komposisi komunitas bakteri dalam endapan dingin, belerang, dan vulkanik Kerguelen [55, 56, 57, 58].Tingkat mikroorganisme pereduksi belerang yang lebih tinggi telah dijelaskan dengan baik saat memanen kerang dari daerah pesisir yang mengalami bioturbasi [59], seperti pantai Port-au-France.Kemungkinan lain adalah flora kerang komensal dapat dipengaruhi oleh transmisi horizontal [60, 61].Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui korelasi antara lingkungan laut, permukaan dasar laut, dan komposisi bakteri simbiotik pada kerang.Studi-studi ini saat ini sedang berlangsung.
Panjang dan konsentrasi ccfDNA hemolymph, kemudahan pemurniannya, dan kualitas tinggi untuk memungkinkan pengurutan senapan cepat adalah beberapa dari banyak keuntungan menggunakan ccfDNA kerang untuk menilai keanekaragaman hayati di ekosistem pesisir laut.Pendekatan ini sangat efektif untuk mengkarakterisasi komunitas virus (viroma) dalam ekosistem tertentu [62, 63].Tidak seperti bakteri, archaea, dan eukariota, genom virus tidak mengandung gen yang dilestarikan secara filogenetik seperti urutan 16S.Hasil kami menunjukkan bahwa biopsi cair dari spesies indikator seperti kerang dapat digunakan untuk mengidentifikasi sejumlah besar fragmen virus ccfDNA yang diketahui menginfeksi inang yang biasanya menghuni ekosistem laut pesisir.Ini termasuk virus yang diketahui menginfeksi protozoa, artropoda, serangga, tumbuhan, dan virus bakteri (misalnya, bakteriofag).Distribusi serupa ditemukan ketika kami memeriksa virome ccfDNA hemolymph dari kerang biru (M. platensis) yang dikumpulkan dalam lapisan kerang yang sama di Kerguelen (Tabel S2, Informasi Tambahan).Pengurutan senapan ccfDNA memang merupakan pendekatan baru yang mendapatkan momentum dalam studi virom manusia atau spesies lain [21, 37, 64].Pendekatan ini sangat berguna untuk mempelajari virus DNA beruntai ganda, karena tidak ada gen tunggal yang dilestarikan di antara semua virus DNA beruntai ganda, mewakili kelas virus yang paling beragam dan luas di Baltimore [65].Meskipun sebagian besar virus ini tetap tidak terklasifikasi dan mungkin termasuk virus dari bagian dunia virus yang sama sekali tidak diketahui [66], kami menemukan bahwa virom dan kisaran inang kerang A. atra dan M. platensis berada di antara dua spesies.sama (lihat gambar S3, informasi tambahan).Kesamaan ini tidak mengherankan, karena mungkin mencerminkan kurangnya selektivitas dalam pengambilan DNA yang ada di lingkungan.Studi masa depan menggunakan RNA murni saat ini diperlukan untuk mengkarakterisasi virom RNA.
Dalam penelitian kami, kami menggunakan pipa yang sangat ketat yang diadaptasi dari karya Kowarski dan rekan [37], yang menggunakan penghapusan dua langkah dari kumpulan bacaan dan contig sebelum dan sesudah perakitan ccfDNA asli, menghasilkan proporsi bacaan yang tidak dipetakan yang tinggi.Oleh karena itu, kami tidak dapat mengesampingkan bahwa beberapa bacaan yang tidak dipetakan ini mungkin masih memiliki asalnya sendiri, terutama karena kami tidak memiliki genom referensi untuk spesies kerang ini.Kami juga menggunakan jalur pipa ini karena kami khawatir tentang chimera antara pembacaan mandiri dan non-diri serta panjang baca yang dihasilkan oleh Illumina MiSeq PE75.Alasan lain untuk sebagian besar bacaan yang belum dipetakan adalah banyak mikroba laut, terutama di daerah terpencil seperti Kerguelen, belum dianotasi.Kami menggunakan Illumina MiSeq PE75, dengan asumsi panjang fragmen ccfDNA mirip dengan ccfDNA manusia.Untuk penelitian selanjutnya, mengingat hasil kami menunjukkan bahwa ccfDNA hemolymph memiliki pembacaan yang lebih lama daripada manusia dan/atau mamalia, kami merekomendasikan penggunaan platform pengurutan yang lebih cocok untuk fragmen ccfDNA yang lebih panjang.Praktek ini akan membuat lebih mudah untuk mengidentifikasi lebih banyak indikasi untuk analisis lebih dalam.Mendapatkan urutan genom nuklir A. atra lengkap yang saat ini tidak tersedia juga akan sangat memudahkan diskriminasi ccfDNA dari sumber mandiri dan bukan mandiri.Mengingat bahwa penelitian kami berfokus pada kemungkinan penerapan konsep biopsi cair pada kerang, kami berharap konsep ini digunakan dalam penelitian selanjutnya, alat dan saluran baru akan dikembangkan untuk meningkatkan potensi metode ini untuk mempelajari keanekaragaman mikroba kerang.ekosistem laut.
Sebagai biomarker klinis non-invasif, peningkatan kadar ccfDNA plasma manusia dikaitkan dengan berbagai penyakit, kerusakan jaringan, dan kondisi stres [67,68,69].Peningkatan ini dikaitkan dengan pelepasan fragmen DNA asalnya sendiri setelah kerusakan jaringan.Kami mengatasi masalah ini dengan menggunakan tekanan panas akut, di mana kerang dipaparkan sebentar ke suhu 30 °C.Kami melakukan analisis ini pada tiga jenis kerang yang berbeda dalam tiga percobaan independen.Namun, kami tidak menemukan perubahan level ccfDNA setelah tekanan panas akut (lihat Gambar S5, informasi tambahan).Penemuan ini dapat menjelaskan, setidaknya sebagian, fakta bahwa kerang memiliki sistem peredaran darah semi terbuka dan mengakumulasi DNA asing dalam jumlah besar karena aktivitas penyaringannya yang tinggi.Di sisi lain, kerang, seperti banyak invertebrata, mungkin lebih tahan terhadap kerusakan jaringan akibat stres, sehingga membatasi pelepasan ccfDNA di hemolymph mereka [70, 71].
Sampai saat ini, analisis DNA keanekaragaman hayati dalam ekosistem perairan terutama berfokus pada metabarcoding DNA lingkungan (eDNA).Namun, metode ini biasanya terbatas dalam analisis keanekaragaman hayati ketika primer digunakan.Penggunaan pengurutan shotgun menghindari keterbatasan PCR dan pemilihan set primer yang bias.Dengan demikian, dalam arti tertentu, metode kami lebih dekat dengan metode sekuensing Shotgun eDNA throughput tinggi yang baru-baru ini digunakan, yang mampu secara langsung mengurutkan DNA yang terfragmentasi dan menganalisis hampir semua organisme [72, 73].Namun, ada sejumlah masalah mendasar yang membedakan LB dari metode eDNA standar.Tentu saja, perbedaan utama antara eDNA dan LB adalah penggunaan inang filter alami.Penggunaan spesies laut seperti spons dan bivalvia (Dresseina spp.) sebagai filter alami untuk mempelajari eDNA telah dilaporkan [74, 75].Namun, penelitian Dreissena menggunakan biopsi jaringan tempat DNA diekstraksi.Analisis ccfDNA dari LB tidak memerlukan biopsi jaringan, peralatan khusus dan terkadang mahal serta logistik yang terkait dengan eDNA atau biopsi jaringan.Faktanya, kami baru-baru ini melaporkan bahwa ccfDNA dari LB dapat disimpan dan dianalisis dengan dukungan FTA tanpa mempertahankan rantai dingin, yang merupakan tantangan besar untuk penelitian di daerah terpencil [76].Ekstraksi ccfDNA dari biopsi cair juga sederhana dan memberikan DNA berkualitas tinggi untuk pengurutan senapan dan analisis PCR.Ini adalah keuntungan besar mengingat beberapa keterbatasan teknis yang terkait dengan analisis eDNA [77].Kesederhanaan dan biaya rendah dari metode pengambilan sampel juga sangat cocok untuk program pemantauan jangka panjang.Selain kemampuan penyaringannya yang tinggi, fitur bivalvia yang terkenal lainnya adalah komposisi mukopolisakarida kimia dari mukusnya, yang mendorong penyerapan virus [78, 79].Hal ini menjadikan kerang sebagai filter alami yang ideal untuk mengkarakterisasi keanekaragaman hayati dan dampak perubahan iklim pada ekosistem perairan tertentu.Meskipun keberadaan fragmen DNA yang diturunkan dari inang dapat dilihat sebagai keterbatasan metode dibandingkan dengan eDNA, biaya yang terkait dengan memiliki ccfDNA asli dibandingkan dengan eDNA secara bersamaan dapat dipahami karena banyaknya informasi yang tersedia untuk studi kesehatan.mengimbangi tuan rumah.Ini termasuk keberadaan sekuens virus yang terintegrasi ke dalam genom inang inang.Ini sangat penting untuk kerang, mengingat adanya retrovirus leukemia yang ditularkan secara horizontal pada bivalvia [80, 81].Keuntungan lain dari LB dibandingkan eDNA adalah ia mengeksploitasi aktivitas fagositik sel darah yang bersirkulasi di hemolimf, yang menelan mikroorganisme (dan genomnya).Fagositosis merupakan fungsi utama sel darah pada bivalvia [82].Terakhir, metode ini memanfaatkan kapasitas penyaringan remis yang tinggi (rata-rata 1,5 l/jam air laut) dan sirkulasi dua hari, yang meningkatkan pencampuran berbagai lapisan air laut, memungkinkan penangkapan eDNA heterolog.[83, 84].Dengan demikian, analisis ccfDNA kerang adalah jalan yang menarik mengingat dampak nutrisi, ekonomi, dan lingkungan dari kerang.Mirip dengan analisis LB yang dikumpulkan dari manusia, metode ini juga membuka kemungkinan untuk mengukur perubahan genetik dan epigenetik pada DNA inang sebagai respons terhadap zat eksogen.Misalnya, teknologi pengurutan generasi ketiga dapat dipertimbangkan untuk melakukan analisis metilasi seluruh genom dalam ccfDNA asli menggunakan pengurutan nanopori.Proses ini harus difasilitasi oleh fakta bahwa panjang fragmen ccfDNA mussel idealnya kompatibel dengan platform sekuensing yang dapat dibaca lama yang memungkinkan analisis metilasi DNA selebar genom dari satu sekuensing berjalan tanpa memerlukan transformasi kimia.85,86] Ini adalah kemungkinan yang menarik, karena telah ditunjukkan bahwa pola metilasi DNA mencerminkan respons terhadap tekanan lingkungan dan bertahan selama beberapa generasi.Oleh karena itu, ini dapat memberikan wawasan yang berharga ke dalam mekanisme dasar yang mengatur respons setelah terpapar perubahan iklim atau polutan [87].Namun, penggunaan LB bukan tanpa batasan.Tak perlu dikatakan, ini membutuhkan keberadaan spesies indikator dalam ekosistem.Seperti disebutkan di atas, menggunakan LB untuk menilai keanekaragaman hayati suatu ekosistem juga memerlukan saluran bioinformatika yang ketat yang memperhitungkan keberadaan fragmen DNA dari sumbernya.Masalah utama lainnya adalah ketersediaan genom referensi untuk spesies laut.Diharapkan inisiatif seperti Proyek Genom Mamalia Laut dan proyek Fish10k yang baru didirikan [88] akan memfasilitasi analisis semacam itu di masa depan.Penerapan konsep LB pada organisme pemakan filter laut juga kompatibel dengan kemajuan terbaru dalam teknologi pengurutan, membuatnya sangat cocok untuk pengembangan biomarker multi-ohm guna memberikan informasi penting tentang kesehatan habitat laut sebagai respons terhadap tekanan lingkungan.
Data pengurutan genom telah disimpan dalam Arsip Baca Urutan NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 di bawah Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dampak perubahan iklim terhadap kehidupan dan ekosistem laut.Cole Biologi.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, dkk.Pertimbangkan dampak gabungan dari perubahan iklim dan pemicu stres lokal lainnya pada lingkungan laut.lingkungan ilmiah umum.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, dkk.).Sains awal Maret.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Toleransi panas yang berkurang di bawah kondisi tekanan panas yang berulang menjelaskan kematian musim panas yang tinggi dari kerang biru.Laporan Ilmiah 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, dkk.Perubahan terbaru dalam frekuensi, penyebab dan tingkat kematian hewan.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, dkk.Beberapa patogen spesifik non-spesies mungkin telah menyebabkan kematian massal Pinna nobilis.Kehidupan.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensi dampak perubahan iklim pada penyakit zoonosis Arktik.Kesehatan Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. dkk.Kerang biru (Mytilus edulis spp.) sebagai organisme pensinyalan dalam pemantauan pencemaran pesisir: review.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrasi biopsi cair dalam pengobatan kanker.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, dkk.Pematangan biopsi cair: Memungkinkan DNA tumor bersirkulasi.Kanker Nat Rev.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Asam nukleat dalam plasma manusia.Risalah rapat anak perusahaan Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Peran baru DNA bebas sel sebagai penanda molekuler untuk pengobatan kanker.Kuantifikasi analisis biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Biopsi cairan memasuki klinik – masalah implementasi dan tantangan masa depan.Nat Rev Klinik Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW dan lainnya.DNA janin hadir dalam plasma dan serum ibu.Lanset.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studi perjalanan kehamilan dan komplikasinya menggunakan RNA ekstraseluler yang bersirkulasi dalam darah wanita selama kehamilan.Dopediatri.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, dkk.Biopsi cair: DNA bebas sel donor digunakan untuk mendeteksi lesi alogenik pada cangkok ginjal.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovasi dalam diagnostik prenatal: pengurutan genom plasma ibu.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, dkk.Deteksi patogen cepat dengan urutan metagenomik generasi berikutnya dari cairan tubuh yang terinfeksiObat Nat.2021;27:115-24.