Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Pendarahan yang tidak terkontrol adalah salah satu penyebab utama kematian.Mencapai hemostasis cepat memastikan kelangsungan hidup subjek sebagai pertolongan pertama selama pertempuran, kecelakaan lalu lintas, dan operasi pengurangan kematian.Perancah komposit yang diperkuat serat nanopori (NFRCS) yang berasal dari komposisi pembentuk film hemostatik sederhana (HFFC) sebagai fase berkelanjutan dapat memicu dan meningkatkan hemostasis.Pengembangan NFRCS didasarkan pada desain sayap capung.Struktur sayap capung terdiri dari sayap melintang dan memanjang, dan membran sayap terhubung satu sama lain untuk menjaga keutuhan struktur mikro.HFFC secara seragam melapisi permukaan serat dengan film setebal nanometer dan menghubungkan ketebalan kapas yang didistribusikan secara acak (Ct) (fase terdispersi) untuk membentuk struktur nanopori.Kombinasi fase kontinyu dan terdispersi mengurangi biaya produk sepuluh kali lipat dibandingkan dengan produk yang tersedia secara komersial.NFRCS yang dimodifikasi (tampon atau gelang) dapat digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis.Studi in vivo telah menyimpulkan bahwa Cp NFRCS yang dikembangkan memicu dan meningkatkan proses koagulasi di lokasi aplikasi.NFRCS dapat memodulasi lingkungan mikro dan bertindak pada tingkat sel karena struktur nanoporinya menghasilkan penyembuhan luka yang lebih baik pada model luka eksisi.
Pendarahan yang tidak terkendali selama pertempuran, situasi intraoperatif dan darurat dapat menimbulkan ancaman serius bagi nyawa yang terluka1.Kondisi ini selanjutnya menyebabkan peningkatan keseluruhan resistensi pembuluh darah perifer, yang menyebabkan syok hemoragik.Tindakan yang tepat untuk mengontrol perdarahan selama dan setelah operasi dianggap berpotensi mengancam nyawa2,3.Kerusakan pada pembuluh darah besar menyebabkan kehilangan banyak darah, mengakibatkan tingkat kematian ≤ 50% dalam pertempuran dan 31% selama operasi1.Kehilangan darah yang masif menyebabkan penurunan volume tubuh, yang mengurangi curah jantung.Peningkatan resistensi vaskular perifer total dan gangguan mikrosirkulasi progresif menyebabkan hipoksia pada organ pendukung kehidupan.Syok hemoragik dapat terjadi jika kondisi berlanjut tanpa intervensi yang efektif1,4,5.Komplikasi lain termasuk perkembangan hipotermia dan asidosis metabolik, serta gangguan koagulasi yang menghambat proses koagulasi.Syok hemoragik berat dikaitkan dengan risiko kematian yang lebih tinggi6,7,8.Pada syok grade III (progresif), transfusi darah sangat penting untuk kelangsungan hidup pasien selama morbiditas dan mortalitas intraoperatif dan pascaoperasi.Untuk mengatasi semua situasi yang mengancam jiwa di atas, kami telah mengembangkan scaffold komposit yang diperkuat serat nanopori (NFRCS) yang menggunakan konsentrasi polimer minimal (0,5%) menggunakan kombinasi polimer hemostatik yang larut dalam air.
Dengan penggunaan penguat serat, produk hemat biaya dapat dikembangkan.Serat-serat yang tersusun secara acak menyerupai struktur sayap capung, diimbangi oleh garis-garis horizontal dan vertikal pada sayap.Vena transversal dan longitudinal sayap berkomunikasi dengan membran sayap (Gbr. 1).NFRCS terdiri dari Ct yang diperkuat sebagai sistem perancah dengan kekuatan fisik dan mekanik yang lebih baik (Gambar 1).Karena keterjangkauan dan keahlian, ahli bedah lebih suka menggunakan pengukur benang kapas (Ct) selama operasi dan pembalutan. Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk > 90% selulosa kristal (memberikan peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, di том числе > 90% кристаллической целлюлозы (barang ini berada di dalam kotak centang), Ct masukkan kode ke kode NFRCS9,10. Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk >90% kristal selulosa (terlibat dalam peningkatan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai sistem kerangka NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9 ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Oleh karena itu, mengingat banyak manfaatnya, termasuk selulosa kristal lebih dari 90% (membantu meningkatkan aktivitas hemostatik), Ct digunakan sebagai scaffold untuk NFRCS9,10.Ct dilapisi secara superfisial (pembentukan film setebal nano diamati) dan saling berhubungan dengan komposisi pembentuk film hemostatik (HFFC).HFFC bertindak seperti matrigel, menyatukan Ct yang ditempatkan secara acak.Desain yang dikembangkan mentransmisikan tegangan dalam fase terdispersi (serat penguat).Sulit untuk mendapatkan struktur nanopori dengan kekuatan mekanik yang baik menggunakan konsentrasi polimer yang minimal.Selain itu, tidak mudah menyesuaikan cetakan yang berbeda untuk aplikasi biomedis yang berbeda.
Gambar menunjukkan diagram desain NFRCS berdasarkan struktur sayap capung (A).Gambar ini menunjukkan analogi komparatif dari struktur sayap capung (urat sayap yang berpotongan dan membujur saling berhubungan) dan fotomikrograf penampang Cp NFRCS (B).Representasi skematis dari NFRCS.
NFRC dikembangkan menggunakan HFFC sebagai fase berkelanjutan untuk mengatasi keterbatasan di atas.HFFC terdiri dari berbagai polimer hemostatik pembentuk film termasuk kitosan (sebagai polimer hemostatik utama) dengan metilselulosa (MC), hidroksipropil metilselulosa (HPMC 50 cp) dan polivinil alkohol (PVA)) (125 kDa) sebagai polimer pendukung yang mendorong pembentukan trombus.pembentukan.Penambahan polivinilpirolidin K30 (PVP K30) meningkatkan kapasitas penyerapan kelembapan NFRCS.Polietilen glikol 400 (PEG 400) ditambahkan untuk meningkatkan pengikatan silang polimer dalam campuran polimer berikat.Tiga komposisi hemostatik HFFC yang berbeda (Cm HFFC, Ch HFFC dan Cp HFFC), yaitu kitosan dengan MC (Cm), kitosan dengan HPMC (Ch), dan kitosan dengan PVA (Cp), diaplikasikan pada Ct.Berbagai studi karakterisasi in vitro dan in vivo telah mengkonfirmasi aktivitas hemostatik dan penyembuhan luka NFRCS.Bahan komposit yang ditawarkan oleh NFRCS dapat digunakan untuk menyesuaikan berbagai bentuk perancah untuk memenuhi kebutuhan khusus.
Selain itu, NFRCS dapat dimodifikasi sebagai perban atau gulungan untuk menutupi seluruh area cedera ekstremitas bawah dan bagian tubuh lainnya.Khusus untuk cedera ekstremitas tempur, desain NFRCS yang dirancang dapat diubah menjadi setengah lengan atau kaki penuh (Gambar Tambahan S11).NFRCS dapat dibuat menjadi gelang dengan lem jaringan, yang dapat digunakan untuk menghentikan pendarahan akibat cedera pergelangan tangan bunuh diri yang parah.Tujuan utama kami adalah mengembangkan NFRCS dengan polimer sesedikit mungkin yang dapat dikirim ke populasi besar (di bawah garis kemiskinan) dan dapat ditempatkan di kotak P3K.Sederhana, efisien, dan ekonomis dalam desain, NFRCS bermanfaat bagi komunitas lokal dan dapat berdampak global.
Kitosan (berat molekul 80 kDa) dan bayam dibeli dari Merck, India.Hidroksipropil metilselulosa 50 Cp, polietilen glikol 400 dan metilselulosa dibeli dari Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polivinil alkohol (berat molekul 125 kDa) (87-90% terhidrolisis) dibeli dari National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidine K30 dibeli dari Molychem, Mumbai, penyeka steril dibeli dari Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, dengan air Milli Q (sistem pemurnian air Direct-Q3, Merck, India) sebagai pembawa.
NFRCS dikembangkan menggunakan metode liofilisasi11,12.Semua komposisi HFFC (Tabel 1) disiapkan menggunakan pengaduk mekanis.Siapkan larutan kitosan 0,5% menggunakan asam asetat 1% dalam air dengan pengadukan terus menerus dengan kecepatan 800 rpm di atas pengaduk mekanis.Berat pasti dari polimer yang dimuat ditunjukkan pada Tabel 1 ditambahkan ke larutan kitosan dan diaduk sampai diperoleh larutan polimer yang jernih.PVP K30 dan PEG 400 ditambahkan ke campuran yang dihasilkan dalam jumlah yang ditunjukkan pada Tabel 1, dan pengadukan dilanjutkan sampai diperoleh larutan polimer kental yang jernih.Bak larutan polimer yang dihasilkan disonikasi selama 60 menit untuk menghilangkan gelembung udara yang terperangkap dari campuran polimer.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan S1 (b), Ct didistribusikan secara merata di setiap sumur dari pelat (cetakan) 6-sumur yang dilengkapi dengan 5 ml HFFC.
Pelat enam sumur disonikasi selama 60 menit untuk mencapai pembasahan yang seragam dan distribusi HFFC di jaringan Ct.Kemudian bekukan pelat enam sumur pada suhu -20°C selama 8-12 jam.Pelat beku diliofilisasi selama 48 jam untuk mendapatkan berbagai formulasi NFRCS.Prosedur yang sama digunakan untuk menghasilkan bentuk dan struktur yang berbeda, seperti tampon atau tampon silinder, atau bentuk lainnya untuk aplikasi yang berbeda.
Kitosan (80 kDa) (3%) yang telah ditimbang saksama dilarutkan dalam asam asetat 1% menggunakan pengaduk magnet.Ke dalam larutan kitosan yang dihasilkan ditambahkan 1% PEG 400 dan diaduk selama 30 menit.Tuang larutan yang dihasilkan ke dalam wadah persegi atau persegi panjang dan bekukan pada suhu -80°C selama 12 jam.Sampel beku diliofilisasi selama 48 jam untuk mendapatkan Cs13 berpori.
NFRCS yang dikembangkan menjadi sasaran eksperimen menggunakan Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Jepang) untuk memastikan kompatibilitas kimia kitosan dengan polimer lain14,15.Spektra FTIR (lebar rentang spektral dari 400 hingga 4000 cm-1) dari semua sampel yang diuji diperoleh dengan melakukan 32 pemindaian.
Tingkat penyerapan darah (BAR) untuk semua formulasi dievaluasi menggunakan metode yang dijelaskan oleh Chen et al.16 dengan sedikit modifikasi.NFRK yang dikembangkan dari semua komposisi dikeringkan dalam oven vakum pada suhu 105°C semalam untuk menghilangkan sisa pelarut.30 mg NFRCS (berat sampel awal - W0) dan 30 mg Ct (kontrol positif) ditempatkan di cawan terpisah yang mengandung premix natrium sitrat 3,8%.Pada interval waktu yang telah ditentukan, yaitu 5, 10, 20, 30, 40 dan 60 detik, NFRCS dihilangkan dan permukaannya dibersihkan dari darah yang tidak terserap dengan menempatkan sampel pada Ct selama 30 detik.Berat akhir darah yang diserap oleh NFRCS 16 dianggap (W1) pada setiap titik waktu.Hitung persentase BAR menggunakan rumus berikut:
Waktu pembekuan darah (BCT) ditentukan seperti yang dilaporkan oleh Wang et al.17 .Waktu yang diperlukan untuk seluruh darah (darah tikus dicampur dengan 3,8% natrium sitrat) untuk menggumpal di hadapan NFRCS dihitung sebagai BCT dari sampel uji.Berbagai komponen NFRCS (30 mg) ditempatkan dalam botol bertutup ulir 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C.Darah (0,5 ml) ditambahkan ke vial dan 0,3 ml CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan untuk mengaktifkan pembekuan darah.Terakhir, balikkan vial setiap 15 detik (hingga 180°) hingga gumpalan padat terbentuk.BCT sampel diperkirakan dengan jumlah flips vails17,18.Berdasarkan BCT, dua komposisi optimal dari NFRCS Cm, Ch dan Cp dipilih untuk studi karakterisasi lebih lanjut.
Komposisi BCT Ch NFRCS dan Cp NFRCS ditentukan dengan menerapkan metode yang dijelaskan oleh Li et al.19 .Tempatkan 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, dan Cs (kontrol positif) ke dalam cawan Petri terpisah (37 °C).Darah yang mengandung 3,8% natrium sitrat dicampur dengan 0,2 M CaCl2 dengan perbandingan volume 10:1 untuk memulai proses pembekuan darah.20 µl campuran darah tikus CaCl2 0,2 ​​M dioleskan ke permukaan sampel dan ditempatkan dalam cawan Petri kosong.Kontrolnya adalah darah dituangkan ke dalam cawan Petri kosong tanpa Ct.Pada interval tetap 0, 3, dan 5 menit, hentikan pembekuan dengan menambahkan 10 ml air deionisasi (DI) ke sampel yang berisi cawan tanpa mengganggu gumpalan.Eritrosit yang tidak terkoagulasi (eritrosit) mengalami hemolisis dengan adanya air deionisasi dan melepaskan hemoglobin.Hemoglobin pada titik waktu yang berbeda (HA(t)) diukur pada 540 nm (λmax hemoglobin) menggunakan spektrofotometer UV-Vis.Penyerapan absolut hemoglobin (AH(0)) dalam 0 menit dari 20 µl darah dalam 10 ml air deionisasi diambil sebagai standar referensi.Penyerapan hemoglobin relatif (RHA) dari darah yang dikoagulasi dihitung dari rasio HA(t)/HA(0) menggunakan kumpulan darah yang sama.
Menggunakan penganalisa tekstur (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sifat perekat NFRK pada jaringan yang rusak ditentukan.Tekan piring silinder dengan alas terbuka ke bagian dalam kulit babi (tanpa lapisan lemak).Sampel (Ch NFRCS dan Cp NFRCS) diaplikasikan melalui kanula ke dalam cetakan silinder untuk membuat adhesi pada kulit babi.Setelah 3 menit inkubasi pada suhu kamar (RT) (25°C), kekuatan perekat NFRCS dicatat pada kecepatan konstan 0,5 mm/detik.
Fitur utama sealant bedah adalah meningkatkan pembekuan darah sekaligus mengurangi kehilangan darah.Koagulasi lossless pada NFRCS dievaluasi menggunakan metode yang dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi 19 .Buat tabung mikrosentrifus (2 ml) (diameter dalam 10 mm) dengan lubang berukuran 8 × 5 mm2 pada salah satu sisi tabung sentrifus (mewakili luka terbuka).NFRCS digunakan untuk menutup bukaan dan selotip digunakan untuk menutup tepi luar.Tambahkan 20 µl 0,2 M CaCl2 ke dalam tabung mikrosentrifus yang berisi premix natrium sitrat 3,8%.Setelah 10 menit, tabung microcentrifuge dikeluarkan dari cawan dan peningkatan massa cawan ditentukan karena aliran keluar darah dari NFRK (n = 3).Kehilangan darah Ch NFRCS dan Cp NFRCS dibandingkan dengan Cs.
Integritas basah NFRCS ditentukan berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Mishra dan Chaudhary21 dengan sedikit modifikasi.Tempatkan NFRCS dalam labu Erlenmeyer 100 ml dengan 50 ml air dan aduk selama 60 detik tanpa membentuk tutup.Inspeksi visual dan penentuan prioritas sampel untuk integritas fisik berdasarkan pengumpulan.
Kekuatan pengikatan HFFC ke Ct dipelajari menggunakan metode yang diterbitkan sebelumnya dengan sedikit modifikasi.Integritas lapisan permukaan dinilai dengan memaparkan NFRK ke gelombang akustik (stimulus eksternal) di hadapan air miliQ (Ct).NFRCS Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang dikembangkan ditempatkan dalam gelas kimia berisi air dan disonikasi masing-masing selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 30 menit.Setelah pengeringan, perbedaan persentase antara berat awal dan akhir NFRCS digunakan untuk menghitung persen kehilangan bahan (HFFC).BCT in vitro selanjutnya mendukung kekuatan pengikatan atau hilangnya bahan permukaan.Efisiensi pengikatan HFFC ke Ct memberikan pembekuan darah dan lapisan elastis pada permukaan Ct22.
Homogenitas NFRCS yang dikembangkan ditentukan oleh sampel BCT (30 mg) yang diambil dari lokasi umum NFRCS yang dipilih secara acak.Ikuti prosedur BCT yang disebutkan sebelumnya untuk menentukan kepatuhan NFRCS.Kedekatan antara kelima sampel memastikan cakupan permukaan yang seragam dan pengendapan HFFC di mesh Ct.
Area kontak darah nominal (NBCA) ditentukan seperti yang dilaporkan sebelumnya dengan beberapa modifikasi.Menggumpalkan darah dengan menjepit 20 µl darah di antara dua permukaan Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs.Setelah 1 jam, kedua bagian stent dipisahkan dan diukur secara manual luas bekuan.Nilai rata-rata dari tiga pengulangan dianggap NBCA NFRCS19.
Analisis Dynamic Vapour Sorption (DVS) digunakan untuk mengevaluasi keefektifan NFRCS untuk menyerap air dari lingkungan eksternal atau dari tempat cedera yang bertanggung jawab untuk memulai koagulasi.DVS mengevaluasi atau mencatat serapan dan kehilangan uap dalam sampel secara gravimetri menggunakan neraca ultrasensitif dengan resolusi massa ±0,1 µg.Tekanan uap parsial (kelembaban relatif) dihasilkan oleh pengontrol aliran massa elektronik di sekitar sampel dengan mencampurkan gas pembawa jenuh dan kering. Sesuai pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dikategorikan ke dalam 4 kategori (0–0,012% b/b− non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23. Sesuai pedoman Farmakope Eropa, berdasarkan persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dikategorikan ke dalam 4 kategori (0–0,012% b/b− non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2–15% cukup higroskopis, dan > 15% sangat higroskopis)23.Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, tergantung pada persentase penyerapan air oleh sampel, sampel dibagi menjadi 4 kategori (0–0,012% b/b – non-higroskopis, 0,2–2% b/b sedikit higroskopis, 2– lima belas %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % cukup higroskopis dan > 15% sangat higroskopis)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。Sesuai dengan rekomendasi Farmakope Eropa, sampel dibagi menjadi 4 kelas tergantung pada persentase kelembaban yang diserap oleh sampel (0-0,012% berat – non-higroskopis, 0,2-2% berat sedikit higroskopis, 2-15% berat).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % cukup higroskopis, > 15% sangat higroskopis) 23.Efisiensi higroskopis NFCS X NFCS dan TsN NFCS ditentukan pada penganalisis DVS TA TGA Q5000 SA.Selama proses ini, run time, kelembaban relatif (RH), dan berat sampel real-time pada 25°C24 diperoleh.Kadar air dihitung dengan analisis massa NFRCS yang akurat menggunakan persamaan berikut:
MC adalah kelembaban NFRCS.m1 - berat kering NSAID.m2 adalah massa NFRCS real-time pada RH tertentu.
Total luas permukaan diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada 25 ° C selama 10 jam (<7 × 10–3 Torr). Total luas permukaan diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah mengosongkan sampel pada 25 ° C selama 10 jam (<7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азото м после опорожнения образцов при 25 °С dalam suhu 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Luas permukaan total diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan pada suhu 25°C selama 10 jam (<7 × 10–3 Torr).25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积。untuk 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом после опорожнения образцов течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Total luas permukaan diperkirakan menggunakan percobaan adsorpsi nitrogen dengan nitrogen cair setelah sampel dikosongkan selama 10 jam pada suhu 25°C (<7 x 10-3 torr).Luas permukaan total, volume pori, dan ukuran pori NFRCS ditentukan dengan Quantachrome dari NOVA 1000e, Austria menggunakan perangkat lunak RS 232.
Siapkan 5% sel darah merah (garam sebagai pengencer) dari darah lengkap.Kemudian pindahkan alikuot HFFC (0,25 ml) ke piring 96 sumur dan 5% massa sel darah merah (0,1 ml).Inkubasikan campuran tersebut pada suhu 37°C selama 40 menit.Campuran sel darah merah dan serum dianggap sebagai kontrol positif, dan campuran garam dan sel darah merah sebagai kontrol negatif.Hemaglutinasi ditentukan menurut skala Stajitzky.Timbangan yang diusulkan adalah sebagai berikut: + + + + agregat granular padat;+++ bantalan bawah halus dengan tepi melengkung;++ bantalan bawah halus dengan tepi sobek;+ cincin merah sempit di sekitar tepi bantalan halus;– (negatif) tombol merah diskrit 12 di tengah sumur bawah.
Hemocompatibility NFRCS dipelajari menurut metode International Organization for Standardization (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Metode gravimetri dijelaskan oleh Singh et al.Modifikasi kecil dilakukan untuk menilai pembentukan trombus dengan adanya atau pada permukaan NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS diinkubasi dalam phosphate buffered saline (PBS) selama 24 jam pada suhu 37°C.Setelah 24 jam, PBS dihilangkan dan NFRCS diobati dengan 2 ml darah yang mengandung natrium sitrat 3,8%.Pada permukaan NFRCS, tambahkan 0,04 ml CaCl2 0,1 M ke sampel yang diinkubasi.Setelah 45 menit, 5 ml air suling ditambahkan untuk menghentikan koagulasi.Darah yang menggumpal di permukaan NFRK diobati dengan larutan formaldehida 36-38%.Gumpalan yang difiksasi dengan formaldehida dikeringkan dan ditimbang.Persentase trombosis diperkirakan dengan menghitung berat gelas tanpa darah dan sampel (kontrol negatif) dan gelas dengan darah (kontrol positif).
Sebagai konfirmasi awal, sampel divisualisasikan di bawah mikroskop optik untuk mengetahui kemampuan lapisan permukaan HFFC, Ct saling berhubungan, dan jaringan Ct membentuk pori.Bagian tipis Ch dan Cp dari NFRCS dipotong dengan pisau bedah.Bagian yang dihasilkan ditempatkan pada slide kaca, ditutup dengan kaca penutup, dan ujung-ujungnya direkatkan dengan lem.Slide yang disiapkan dilihat di bawah mikroskop optik dan foto diambil pada perbesaran yang berbeda.
Deposisi polimer dalam jaringan Ct divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Rice et al.29. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (bayam), dan NFRCS (Ch & Cp) dibuat sesuai dengan metode yang disebutkan sebelumnya. Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (bayam), dan NFRCS (Ch & Cp) dibuat sesuai dengan metode yang disebutkan sebelumnya.Komposisi HFFC yang digunakan untuk formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (bayam) dan NFRCS (Ch dan Cp) diperoleh sesuai dengan metode yang disebutkan sebelumnya.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。Komposisi HFFC yang digunakan dalam formulasi dicampur dengan pewarna fluoresen (Amaranth) dan menerima NFRCS (Ch dan Cp), seperti disebutkan sebelumnya.Bagian tipis NFRK dipotong dari sampel yang diperoleh, ditempatkan pada slide kaca, dan ditutup dengan kaca penutup.Amati slide yang disiapkan di bawah mikroskop fluoresen menggunakan filter hijau (310-380 nm).Gambar diambil dengan perbesaran 4x untuk memahami hubungan Ct dan kelebihan pengendapan polimer dalam jaringan Ct.
Topografi permukaan NFRCS Ch dan Cp ditentukan menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM) dengan kantilever TESP ultra-tajam dalam mode ketukan: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Kekasaran permukaan ditentukan dengan root mean square (RMS) menggunakan perangkat lunak (Scanning Probe Image Processor).Berbagai lokasi NFRCS ditampilkan pada gambar 3D untuk memeriksa keseragaman permukaan.Standar deviasi skor untuk area tertentu didefinisikan sebagai kekasaran permukaan.Persamaan RMS digunakan untuk mengukur kekasaran permukaan NFRCS31.
Studi berbasis FESEM dilakukan menggunakan FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, untuk memahami morfologi permukaan Ch NFRCS dan Cp NFRCS, yang menunjukkan BCT lebih baik daripada Cm NFRCS.Studi FESEM dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Zhao et al.32 dengan sedikit modifikasi.NFRCS 20 hingga 30 mg Ch NFRCS dan Cp NFRCS dicampur terlebih dahulu dengan 20 µl natrium sitrat 3,8% yang dicampur dengan darah tikus.20 μl 0,2 M CaCl2 ditambahkan ke sampel yang diberi perlakuan darah untuk memulai koagulasi dan sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.Selain itu, kelebihan eritrosit dikeluarkan dari permukaan NFRCS dengan membilasnya dengan saline.
Sampel selanjutnya diberi perlakuan dengan glutaraldehid 0,1% dan kemudian dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 37°C untuk menghilangkan kelembapan.Sampel kering dilapisi dan dianalisis 32 .Gambar lain yang diperoleh selama analisis adalah pembentukan bekuan pada permukaan serat kapas individu, deposisi polimer antara Ct, morfologi (bentuk) eritrosit, integritas bekuan, dan morfologi eritrosit dengan adanya NFRCS.Area NFRCS yang tidak dirawat dan area NFRCS yang dirawat Ch dan Cp yang diinkubasi dengan darah dipindai untuk ion unsur (natrium, kalium, nitrogen, kalsium, magnesium, seng, tembaga, dan selenium)33.Bandingkan persentase ion unsur antara sampel yang diberi perlakuan dan yang tidak diberi perlakuan untuk memahami akumulasi ion unsur selama pembentukan bekuan dan homogenitas bekuan.
Ketebalan lapisan permukaan Cp HFFC pada permukaan Ct ditentukan menggunakan FESEM.Penampang Cp NFRCS dipotong dari kerangka dan dilapisi dengan percikan.Sampel lapisan percikan yang dihasilkan diamati dengan FESEM dan ketebalan lapisan permukaan diukur 34 , 35 , 36 .
Mikro-CT sinar-X memberikan pencitraan non-destruktif 3D beresolusi tinggi dan memungkinkan Anda mempelajari susunan struktural internal NFRK.Mikro-CT menggunakan berkas sinar-X yang melewati sampel untuk merekam koefisien atenuasi linier lokal dari sinar-X dalam sampel, yang membantu memperoleh informasi morfologis.Lokasi internal Ct di Cp NFRCS dan Cp NFRCS yang diobati dengan darah diperiksa oleh mikro-CT untuk memahami efisiensi penyerapan dan pembekuan darah di hadapan NFRCS37,38,39.Struktur 3D dari sampel Cp NFRCS yang diolah dengan darah dan tidak diolah direkonstruksi menggunakan micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Jerman).Menggunakan perangkat lunak VG STUDIO-MAX versi 2.2, beberapa gambar sinar-X diambil dari berbagai sudut (idealnya cakupan 360°) untuk mengembangkan gambar 3D untuk NFRCS.Data proyeksi yang dikumpulkan direkonstruksi menjadi gambar volumetrik 3D menggunakan perangkat lunak 3D ScanIP Academic sederhana yang sesuai.
Selain itu, untuk memahami distribusi bekuan, 20 µl darah sitrat yang sudah dicampur sebelumnya dan 20 µl CaCl2 0,2 ​​M ditambahkan ke NFRCS untuk memulai pembekuan darah.Sampel yang sudah disiapkan dibiarkan mengeras.Permukaan NFRK diberi perlakuan dengan glutaraldehida 0,5% dan dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 30–40°C selama 30 menit.Bekuan darah yang terbentuk pada NFRCS dipindai, direkonstruksi, dan gambar 3D dari bekuan darah divisualisasikan.
Tes antibakteri dilakukan pada Cp NFRCS (terbaik dibandingkan dengan Ch NFRCS) menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi.Aktivitas antibakteri Cp NFRCS dan Cp HFFC ditentukan dengan menggunakan tiga mikroorganisme uji yang berbeda [S.aureus (bakteri gram positif), E.coli (bakteri gram negatif) dan Candida putih (C.albicans)] yang tumbuh pada agar dalam cawan Petri dalam inkubator.Inokulasikan secara merata 50 ml suspensi biakan bakteri yang telah diencerkan pada konsentrasi 105-106 CFU ml-1 ke dalam media agar.Tuang media ke dalam cawan Petri dan biarkan mengeras.Sumur dibuat pada permukaan pelat agar untuk diisi dengan HFFC (3 sumur untuk HFFC dan 1 untuk kontrol negatif).Tambahkan 200 µl HFFC ke dalam 3 sumur dan 200 µl pH 7,4 PBS ke dalam sumur ke-4.Di sisi lain cawan petri, tempatkan cakram NFRCS 12 mm Cp pada agar yang telah mengeras dan basahi dengan PBS (pH 7,4).Ciprofloxacin, ampisilin dan tablet flukonazol dianggap standar referensi untuk Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Candida albicans.Ukur zona hambatan secara manual dan ambil citra digital dari zona hambatan tersebut.
Setelah mendapat persetujuan etik institusional, penelitian dilakukan di Kasturba Medical College of Education and Research di Manipal, Karnataka, di India selatan.Protokol eksperimental TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etika Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subjek direkrut dari donor darah sukarela (berusia 18 hingga 55) dari bank darah rumah sakit.Selain itu, formulir informed consent diperoleh dari para sukarelawan untuk pengambilan sampel darah.Native TEG (N-TEG) ​​​​digunakan untuk mempelajari efek formulasi Cp HFFC pada seluruh darah yang dicampur dengan natrium sitrat.N-TEG diakui secara luas untuk perannya dalam resusitasi di tempat perawatan, yang menimbulkan masalah bagi dokter karena potensi keterlambatan hasil yang signifikan secara klinis (tes koagulasi rutin).Analisis N-TEG dilakukan dengan menggunakan darah lengkap.Informed consent dan riwayat medis rinci diperoleh dari semua peserta.Studi ini tidak melibatkan peserta dengan komplikasi hemostatik atau trombotik seperti kehamilan/persalinan atau penyakit hati.Subjek yang mengonsumsi obat yang memengaruhi kaskade koagulasi juga dikeluarkan dari penelitian.Tes laboratorium dasar (hemoglobin, waktu protrombin, tromboplastin teraktivasi, dan jumlah trombosit) dilakukan pada semua peserta sesuai dengan prosedur standar.N-TEG menentukan viskoelastisitas bekuan darah, struktur bekuan awal, interaksi partikel, penguatan bekuan, dan lisis bekuan.Analisis N-TEG memberikan data grafis dan numerik tentang efek kolektif beberapa elemen seluler dan plasma.Analisis N-TEG dilakukan pada dua volume Cp HFFC yang berbeda (10 µl dan 50 µl).Hasilnya, 1 ml darah utuh dengan asam sitrat ditambahkan ke 10 μl Cp HFFC.Tambahkan 1 ml (Cp HFFC + darah sitrat), 340 µl campuran darah ke dalam 20 µl 0,2 M CaCl2 yang berisi cawan TEG.Setelah itu, piringan TEG dimasukkan ke dalam TEG® 5000, US untuk mengukur R, K, sudut alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% sampel darah dengan adanya Cp HFFC41.
Protokol studi in vivo ditinjau dan disetujui oleh Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan rekomendasi Komite Kontrol dan Pengawasan Eksperimen Hewan (CPCSEA).Semua studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) dilakukan pada tikus Wistar betina (dengan berat 200 hingga 250 g).Semua hewan diaklimatisasi pada suhu 24-26°C, hewan memiliki akses bebas terhadap makanan dan air standar ad libitum.Semua hewan secara acak dibagi menjadi kelompok yang berbeda, masing-masing kelompok terdiri dari tiga hewan.Semua studi dilakukan sesuai dengan Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Sebelum penelitian, hewan dibius dengan pemberian intraperitoneal (ip) campuran 20-50 mg ketamin (per 1 kg berat badan) dan 2-10 mg xylazine (per 1 kg berat badan).Setelah penelitian, volume perdarahan dihitung dengan mengevaluasi perbedaan antara berat sampel awal dan akhir, nilai rata-rata yang diperoleh dari ketiga tes diambil sebagai volume perdarahan sampel.
Model amputasi ekor tikus diimplementasikan untuk memahami potensi NFRCS untuk memodulasi perdarahan pada trauma, pertempuran, atau kecelakaan lalu lintas (model cedera).Potong 50% ekor dengan pisau bedah dan letakkan di udara selama 15 detik untuk memastikan pendarahan normal.Selain itu, sampel uji ditempatkan pada ekor tikus dengan memberikan tekanan (Ct, Cs, Ch NFRCS dan Cp NFRCS).Perdarahan dan PCT dilaporkan untuk spesimen uji (n = 3)17,45.
Efektivitas kontrol tekanan NFRCS dalam pertempuran diselidiki pada model arteri femoralis superfisial.Arteri femoralis terbuka, ditusuk dengan trocar 24G, dan berdarah dalam waktu 15 detik.Setelah perdarahan yang tidak terkendali diamati, spesimen uji ditempatkan di lokasi tusukan dengan tekanan diterapkan.Segera setelah penerapan sampel uji, waktu pembekuan dicatat dan efisiensi hemostatik diamati selama 5 menit berikutnya.Prosedur yang sama diulangi dengan Cs dan Ct46.
Dowling dkk.47 mengusulkan model cedera hati untuk menilai potensi hemostatik bahan hemostatik dalam konteks perdarahan intraoperatif.BCT direkam untuk sampel Ct (kontrol negatif), kerangka Cs (kontrol positif), sampel Ch NFRCS, dan sampel Cp NFRCS.Vena kava suprahepatik tikus diekspos dengan melakukan laparotomi median.Setelah itu bagian distal lobus kiri dipotong dengan gunting.Buat sayatan di hati dengan pisau bedah dan biarkan berdarah selama beberapa detik.Sampel uji Ch NFRCS dan Cp NFRCS yang ditimbang secara akurat ditempatkan pada permukaan yang rusak tanpa tekanan positif dan BCT dicatat.Kelompok kontrol (Ct) kemudian memberikan tekanan diikuti dengan Cs 30 s47 tanpa merusak luka.
Tes penyembuhan luka in vivo dilakukan dengan menggunakan model luka eksisi untuk mengevaluasi sifat penyembuhan luka dari NFRCS berbasis polimer yang dikembangkan.Model luka eksisi dipilih dan dilakukan sesuai dengan metode yang telah dipublikasikan sebelumnya dengan sedikit modifikasi19,32,48.Semua hewan dibius seperti yang dijelaskan sebelumnya.Gunakan pukulan biopsi (12 mm) untuk membuat sayatan dalam melingkar di kulit punggung.Lokasi luka yang telah disiapkan dibalut dengan Cs (kontrol positif), Ct (menyadari bahwa bantalan kapas mengganggu penyembuhan), Ch NFRCS dan Cp NFRCS (kelompok eksperimen) dan kontrol negatif tanpa pengobatan apapun.Pada setiap hari penelitian, luas luka diukur pada semua tikus.Gunakan kamera digital untuk mengambil gambar area luka dan kenakan balutan baru.Persentase penutupan luka diukur dengan rumus berikut:
Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik dieksisi ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan Trichrome Masson. Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik dieksisi ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dan dipelajari dengan pewarnaan H&E dan pewarnaan Trichrome Masson.Berdasarkan persentase penutupan luka pada hari ke-12 penelitian, kulit tikus kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dieksisi dan diperiksa dengan pewarnaan hematoksilin-eosin dan trikrom Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)dan和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色 dan Mas son三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)dan和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Tikus pada kelompok terbaik ((Cp NFRCS) dan kelompok kontrol) dipotong untuk pewarnaan hematoxylin-eosin dan pewarnaan trichrome Masson berdasarkan persen penutupan luka pada hari ke 12 penelitian.Prosedur pewarnaan yang diterapkan dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya49,50.Secara singkat, setelah fiksasi dalam formalin 10%, sampel didehidrasi menggunakan serangkaian alkohol bertingkat.Gunakan mikrotom untuk mendapatkan bagian tipis (tebal 5 µm) dari jaringan yang dipotong.Bagian kontrol serial tipis dan Cp NFRCS diobati dengan hematoxylin dan eosin untuk mempelajari perubahan histopatologis.Pewarnaan trichrome Masson digunakan untuk mendeteksi pembentukan fibril kolagen.Hasil yang diperoleh dipelajari secara membabi buta oleh ahli patologi.
Stabilitas sampel Cp NFRCS dipelajari pada suhu kamar (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) selama 12 bulan51.Cp NFRCS (perubahan warna permukaan dan pertumbuhan mikroba) secara visual diperiksa dan diuji untuk ketahanan aus lipat dan BCT menurut metode di atas yang diuraikan dalam bagian Bahan dan Metode.
Skalabilitas dan reproduktifitas Cp NFRCS diperiksa dengan menyiapkan Cp NFRCS dengan ukuran 15×15 cm2.Selain itu, 30 mg sampel (n = 5) dikeluarkan dari berbagai fraksi NFRCS Cp dan BCT dari sampel yang dipelajari dievaluasi seperti yang dijelaskan sebelumnya di bagian Metode.
Kami telah berusaha mengembangkan berbagai bentuk dan struktur menggunakan komposisi Cp NFRCS untuk berbagai aplikasi biomedis.Bentuk atau konfigurasi seperti itu termasuk penyeka berbentuk kerucut untuk mimisan, prosedur gigi, dan penyeka silinder untuk pendarahan vagina.
Semua set data dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi dan dianalisis dengan ANOVA menggunakan Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) diikuti dengan uji perbandingan berganda Bonferroni (*p<0,05).
Semua prosedur yang dilakukan dalam studi manusia sesuai dengan standar Institut dan Dewan Riset Nasional, serta Deklarasi Helsinki 1964 dan amandemen selanjutnya, atau standar etika serupa.Semua peserta diberitahu tentang fitur penelitian dan sifat sukarela.Data peserta tetap rahasia setelah dikumpulkan.Protokol eksperimental TEG in vitro telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Etika Institusional Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Relawan menandatangani persetujuan untuk mengumpulkan sampel darah.
Semua prosedur yang dilakukan pada studi hewan dilakukan sesuai dengan Fakultas Kedokteran Kastuba, Institut Pendidikan Tinggi Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Semua percobaan hewan yang dirancang dilakukan sesuai dengan pedoman Komite Kontrol dan Pengawasan Eksperimen Hewan (CPCSEA).Semua penulis mengikuti pedoman TIBA.
Spektra FTIR dari semua NFRCS dianalisis dan dibandingkan dengan spektrum kitosan yang ditunjukkan pada Gambar 2A.Puncak spektral karakteristik kitosan (tercatat) pada 3437 cm-1 (regangan OH dan NH, overlap), 2945 dan 2897 cm-1 (uluran CH), 1660 cm-1 (regangan NH2), 1589 cm-1 (regangan N–H), 1157 cm-1 (jembatan regang O-), 1067 cm-1 (ulur C–O, hidroksil sekunder), 993 cm-1 (ulur tch CO, Bo-OH) 52.53.54.Tabel Tambahan S1 menunjukkan nilai spektrum serapan NFRCS FTIR untuk kitosan (reporter), kitosan murni, Cm, Ch, dan Cp.Spektra FTIR dari semua NFRCS (Cm, Ch dan Cp) menunjukkan pita serapan karakteristik yang sama dengan kitosan murni tanpa perubahan signifikan (Gbr. 2A).Hasil FTIR mengkonfirmasi tidak adanya interaksi kimia atau fisik antara polimer yang digunakan untuk mengembangkan NFRCS, menunjukkan bahwa polimer yang digunakan bersifat inert.
Karakterisasi in vitro Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS dan Cs.( A ) mewakili spektrum FTIR gabungan dari komposisi kitosan dan Cm NFRCS, Ch NFRCS dan Cp NFRCS di bawah kompresi.(B) a) Tingkat serapan darah utuh NFRCS Cm, Ch, Cp, dan Cg (n = 3);Sampel Ct menunjukkan BAR yang lebih tinggi karena kapas memiliki efisiensi penyerapan yang lebih tinggi;b) Darah setelah penyerapan darah Ilustrasi sampel yang diserap.Representasi grafis dari BCT sampel uji C (Cp NFRCS memiliki BCT terbaik (15 detik, n = 3)). Data dalam C, D, E, dan G ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, dan bilah kesalahan mewakili SD, *** p <0,0001. Data dalam C, D, E, dan G ditampilkan sebagai rata-rata ± SD, dan bilah kesalahan mewakili SD, *** p <0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляют ста ндартное отклонение, ***p <0,0001. Data dalam C, D, E, dan G disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi, dan error bar mewakili standar deviasi, ***p<0,0001. C、D、E dan G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E dan G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей представляю тандартное отклонение, ***p <0,0001. Data dalam C, D, E, dan G ditampilkan sebagai rata-rata ± standar deviasi, bar kesalahan mewakili standar deviasi, ***p<0,0001.