Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Kesuburan burung tergantung pada kemampuan mereka untuk menyimpan cukup sperma yang layak untuk jangka waktu yang lama di dalam tubulus penyimpanan sperma (SST).Mekanisme pasti dimana spermatozoa masuk, tinggal, dan meninggalkan SST masih kontroversial.Sperma ayam sharkasi menunjukkan kecenderungan aglutinasi yang tinggi, membentuk bundel filamen bergerak yang mengandung banyak sel.Karena sulitnya mengamati motilitas dan perilaku spermatozoa dalam tuba falopi yang buram, kami menggunakan perangkat mikrofluida dengan penampang saluran mikro yang mirip dengan spermatozoa untuk mempelajari aglutinasi dan motilitas spermatozoa.Studi ini membahas bagaimana ikatan sperma terbentuk, bagaimana mereka bergerak, dan kemungkinan perannya dalam memperpanjang residensi sperma di SST.Kami menyelidiki kecepatan sperma dan perilaku reologi ketika aliran fluida dihasilkan dalam saluran mikofluida dengan tekanan hidrostatik (laju aliran = 33 µm/s).Spermatozoa cenderung berenang melawan arus (reologi positif) dan kecepatan ikatan spermatozoa berkurang secara signifikan dibandingkan dengan spermatozoa tunggal.Bundel sperma telah diamati bergerak dalam bentuk spiral dan bertambah panjang dan tebal karena lebih banyak sperma tunggal yang direkrut. Bundel sperma diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikofluida agar tidak tersapu dengan kecepatan aliran fluida > 33 µm/s. Bundel sperma diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikofluida agar tidak tersapu dengan kecepatan aliran fluida > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюид ных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Bundel sperma telah diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikofluida untuk menghindari hanyut pada laju aliran cairan >33 µm/s.33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкос тного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Bundel sperma telah diamati mendekati dan menempel pada dinding samping saluran mikofluida untuk menghindari tersapu oleh aliran fluida pada >33 µm/s.Pemindaian dan mikroskop elektron transmisi mengungkapkan bahwa bundel sperma didukung oleh bahan padat yang melimpah.Data yang diperoleh menunjukkan mobilitas unik spermatozoa ayam Sharkazi, serta kemampuan spermatozoa untuk mengaglutinasi dan membentuk bundel seluler, yang berkontribusi pada pemahaman yang lebih baik tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SMT.
Untuk mencapai pembuahan pada manusia dan sebagian besar hewan, sperma dan sel telur harus tiba di tempat pembuahan pada waktu yang tepat.Oleh karena itu, perkawinan harus terjadi sebelum atau pada saat ovulasi.Di sisi lain, beberapa mamalia, seperti anjing, serta spesies non-mamalia, seperti serangga, ikan, reptil, dan burung, menyimpan sperma di organ reproduksinya untuk waktu yang lama hingga sel telurnya siap untuk pembuahan (fertilisasi asinkron 1 ).Unggas mampu mempertahankan viabilitas spermatozoa yang mampu membuahi sel telur selama 2-10 minggu2.
Ini adalah fitur unik yang membedakan burung dari hewan lain, karena memberikan kemungkinan pembuahan yang tinggi setelah inseminasi tunggal selama beberapa minggu tanpa kawin dan ovulasi secara bersamaan.Organ penyimpanan sperma utama, yang disebut tubulus penyimpanan sperma (SST), terletak di lipatan mukosa internal di persimpangan uterovaginal.Sampai saat ini, mekanisme sperma masuk, tinggal, dan keluar dari bank sperma belum sepenuhnya dipahami.Berdasarkan studi sebelumnya, banyak hipotesis telah diajukan, tetapi tidak satupun yang dikonfirmasi.
Forman4 berhipotesis bahwa spermatozoa mempertahankan tempat tinggalnya di rongga SST melalui gerakan osilasi yang terus menerus melawan arah aliran fluida melalui saluran protein yang terletak pada sel epitel SST (rheologi).ATP habis karena aktivitas flagellar konstan diperlukan untuk menjaga sperma dalam lumen SST dan motilitas akhirnya menurun sampai sperma dibawa keluar dari bank sperma oleh aliran cairan dan memulai perjalanan baru menuruni tuba falopi menaik untuk membuahi sperma.Telur (Forman4).Model penyimpanan sperma ini didukung oleh deteksi dengan imunositokimia aquaporin 2, 3 dan 9 yang ada dalam sel epitel SST.Sampai saat ini, penelitian tentang reologi semen ayam dan perannya dalam penyimpanan SPL, seleksi sperma pervaginam, dan persaingan sperma masih kurang.Pada ayam, sperma memasuki vagina setelah kawin alami, tetapi lebih dari 80% spermatozoa dikeluarkan dari vagina segera setelah kawin.Ini menunjukkan bahwa vagina adalah tempat utama untuk pemilihan sperma pada burung.Selain itu, dilaporkan bahwa kurang dari 1% spermatozoa yang dibuahi di vagina berakhir dengan SSTs2.Pada inseminasi buatan anak ayam di vagina, jumlah spermatozoa yang mencapai SST cenderung meningkat 24 jam setelah inseminasi.Sejauh ini, mekanisme pemilihan sperma selama proses ini tidak jelas, dan motilitas sperma mungkin memainkan peran penting dalam pengambilan sperma SST.Karena dinding saluran tuba yang tebal dan buram, sulit untuk memantau secara langsung motilitas sperma di saluran tuba burung.Oleh karena itu, kami kekurangan pengetahuan dasar tentang bagaimana transisi spermatozoa ke SST setelah pembuahan.
Reologi baru-baru ini diakui sebagai faktor penting yang mengendalikan transportasi sperma di alat kelamin mamalia.Berdasarkan kemampuan spermatozoa motil untuk bermigrasi berlawanan arah, Zaferani et al8 menggunakan sistem corra microfluidic untuk secara pasif mengisolasi spermatozoa motil dari sampel semen yang dikandangkan.Jenis penyortiran semen ini sangat penting untuk pengobatan infertilitas medis dan penelitian klinis, dan lebih disukai daripada metode tradisional yang memakan waktu dan tenaga serta dapat membahayakan morfologi sperma dan integritas struktural.Namun hingga saat ini belum ada penelitian yang dilakukan mengenai pengaruh sekresi dari organ genital ayam terhadap motilitas spermatozoa.
Terlepas dari mekanisme yang mempertahankan sperma yang disimpan di SST, banyak peneliti telah mengamati bahwa spermatozoa residen menggumpal secara head-to-head di SST ayam 9, 10, burung puyuh 2, dan kalkun 11 untuk membentuk bundel sperma yang diaglutinasi.Penulis menyarankan bahwa ada hubungan antara aglutinasi ini dan penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SST.
Tingari dan Lake12 melaporkan hubungan yang kuat antara spermatozoa dalam kelenjar penerima sperma ayam dan mempertanyakan apakah spermatozoa unggas beraglutinasi dengan cara yang sama seperti spermatozoa mamalia.Mereka percaya bahwa hubungan yang dalam antara sperma di vas deferens mungkin disebabkan oleh stres yang disebabkan oleh adanya sejumlah besar sperma di ruang yang kecil.
Saat mengevaluasi perilaku spermatozoa pada slide kaca yang baru digantung, tanda-tanda aglutinasi sementara dapat terlihat, terutama di tepi tetesan semen.Namun, aglutinasi sering diganggu oleh aksi rotasi yang terkait dengan gerakan terus menerus, yang menjelaskan sifat transien dari fenomena ini.Para peneliti juga memperhatikan bahwa ketika pengencer ditambahkan ke air mani, agregat sel "seperti benang" yang memanjang muncul.
Upaya awal untuk meniru sperma dilakukan dengan melepaskan kawat tipis dari tetesan yang menggantung, yang menghasilkan vesikel seperti sperma yang memanjang yang menonjol dari tetesan air mani.Spermatozoa segera berbaris secara paralel di dalam vesikel, tetapi seluruh unit dengan cepat menghilang karena batasan 3D.Oleh karena itu, untuk mempelajari aglutinasi spermatozoa, motilitas dan perilaku spermatozoa perlu diamati secara langsung di dalam tubulus penyimpanan sperma yang terisolasi, yang sulit dicapai.Oleh karena itu, perlu dikembangkan instrumen yang meniru spermatozoa untuk mendukung studi motilitas dan perilaku aglutinasi sperma.Brillard et al13 melaporkan bahwa rata-rata panjang tubulus penyimpanan sperma pada anak ayam dewasa adalah 400-600 µm, tetapi beberapa SST dapat sepanjang 2000 µm.Mero dan Ogasawara14 membagi kelenjar seminiferus menjadi tubulus penyimpanan sperma yang membesar dan tidak membesar, keduanya memiliki panjang yang sama (~500 µm) dan lebar leher (~38 µm), tetapi diameter lumen rata-rata tubulus adalah 56,6 dan 56,6 µm.., masing-masing 11,2 μm.Dalam studi saat ini, kami menggunakan perangkat mikofluida dengan ukuran saluran 200 µm × 20 µm (W × H), yang penampangnya agak mirip dengan SST yang diamplifikasi.Selain itu, kami memeriksa motilitas sperma dan perilaku aglutinasi dalam cairan yang mengalir, yang konsisten dengan hipotesis Foreman bahwa cairan yang diproduksi oleh sel epitel SST menjaga sperma dalam lumen dalam arah arus balik (rheologis).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah pengamatan motilitas spermatozoa di tuba falopi dan untuk menghindari kesulitan dalam mempelajari reologi dan perilaku spermatozoa dalam lingkungan yang dinamis.Perangkat mikrofluida digunakan yang menciptakan tekanan hidrostatik untuk mensimulasikan motilitas sperma di alat kelamin ayam.
Ketika setetes sampel sperma yang diencerkan (1:40) dimasukkan ke dalam perangkat saluran mikro, dua jenis motilitas sperma dapat diidentifikasi (sperma yang diisolasi dan sperma yang terikat).Selain itu, spermatozoa cenderung berenang melawan arus (rheologi positif; video 1, 2). Meskipun bundel sperma memiliki kecepatan yang lebih rendah daripada sperma tunggal (p <0,001), mereka meningkatkan persentase sperma yang menunjukkan reotaksis positif (p <0,001; Tabel 2). Meskipun bundel sperma memiliki kecepatan yang lebih rendah daripada sperma tunggal (p <0,001), mereka meningkatkan persentase sperma yang menunjukkan reotaksis positif (p <0,001; Tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), он dan увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Meskipun bundel spermatozoa memiliki kecepatan yang lebih rendah daripada spermatozoa tunggal (p <0,001), mereka meningkatkan persentase spermatozoa yang menunjukkan reotaksis positif (p <0,001; Tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелич ивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Meskipun kecepatan kumpulan sperma lebih rendah dari spermatozoa tunggal (p <0,001), mereka meningkatkan persentase spermatozoa dengan reologi positif (p <0,001; Tabel 2).Reologi positif untuk spermatozoa tunggal dan jumbai diperkirakan masing-masing sekitar 53% dan 85%.
Telah diamati bahwa spermatozoa ayam sharkasi segera setelah ejakulasi membentuk bundel linier yang terdiri dari puluhan individu.Jumbai ini bertambah panjang dan tebal dari waktu ke waktu dan dapat tetap in vitro selama beberapa jam sebelum menghilang (video 3).Ikatan berserabut ini berbentuk seperti ekidna spermatozoa yang terbentuk di ujung epididimis.Semen ayam Sharkashi telah ditemukan memiliki kecenderungan tinggi untuk menggumpal dan membentuk bundel retikulat dalam waktu kurang dari satu menit setelah pengumpulan.Balok ini dinamis dan dapat menempel pada dinding terdekat atau benda statis.Meskipun bundel sperma mengurangi kecepatan sel sperma, jelas bahwa secara makroskopik mereka meningkatkan linearitasnya.Panjang bundel bervariasi tergantung pada jumlah sperma yang dikumpulkan dalam bundel.Dua bagian bundel diisolasi: bagian awal, termasuk kepala bebas sperma yang diaglutinasi, dan bagian terminal, termasuk ekor dan seluruh ujung distal sperma.Menggunakan kamera berkecepatan tinggi (950 fps), kepala bebas spermatozoa yang diaglutinasi diamati di bagian awal bundel, yang bertanggung jawab atas pergerakan bundel karena gerakan osilasinya, menyeret yang tersisa ke dalam bundel dengan gerakan heliks (Video 4).Namun, pada jumbai yang panjang, telah diamati bahwa beberapa kepala sperma bebas melekat pada tubuh dan bagian terminal dari jumbai bertindak sebagai baling-baling untuk membantu mendorong jumbai.
Saat berada dalam aliran cairan yang lambat, bundel sperma bergerak sejajar satu sama lain, namun mulai tumpang tindih dan menempel pada segala sesuatu yang diam, agar tidak hanyut oleh aliran arus saat kecepatan aliran meningkat.Bundel terbentuk ketika beberapa sel sperma saling mendekat, mereka mulai bergerak secara sinkron dan saling membungkus, lalu menempel pada zat yang lengket.Gambar 1 dan 2 menunjukkan bagaimana sperma mendekati satu sama lain, membentuk persimpangan saat ekor saling melilit.
Para peneliti menerapkan tekanan hidrostatik untuk menciptakan aliran cairan dalam microchannel untuk mempelajari reologi sperma.Saluran mikro dengan ukuran 200 µm × 20 µm (W × H) dan panjang 3,6 µm digunakan.Gunakan saluran mikro di antara wadah dengan jarum suntik yang dipasang di ujungnya.Pewarna makanan digunakan untuk membuat saluran lebih terlihat.
Ikat kabel interkoneksi dan aksesori ke dinding.Video diambil dengan mikroskop fase kontras.Dengan setiap gambar, mikroskop kontras fase dan gambar pemetaan disajikan.(A) Sambungan antara dua aliran menolak aliran karena gerakan heliks (panah merah).(B) Sambungan antara bundel tabung dan dinding saluran (panah merah), pada saat yang sama terhubung ke dua bundel lainnya (panah kuning).(C) Bundel sperma di saluran mikrofluida mulai terhubung satu sama lain (panah merah), membentuk jaring bundel sperma.(D) Pembentukan jaringan bundel sperma.
Ketika setetes sperma encer dimasukkan ke dalam perangkat mikrofluida dan aliran dibuat, pancaran sperma diamati bergerak melawan arah aliran.Bundel pas dengan dinding saluran mikro, dan kepala bebas di bagian awal bundel pas dengan mereka (video 5).Mereka juga menempel pada partikel stasioner di jalurnya, seperti puing-puing, agar tidak tersapu oleh arus.Seiring waktu, jumbai ini menjadi filamen panjang yang menjebak spermatozoa tunggal lainnya dan jumbai yang lebih pendek (Video 6).Saat aliran mulai melambat, garis panjang sperma mulai membentuk jaringan garis sperma (Video 7; Gambar 2).
Pada kecepatan aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan spiral benang meningkat sebagai upaya untuk menangkap banyak sperma yang membentuk bundel yang lebih baik menahan gaya arus yang melayang. Pada kecepatan aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan spiral benang meningkat sebagai upaya untuk menangkap banyak sperma yang membentuk bundel yang lebih baik menahan gaya arus yang melayang. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пыта ются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят д рейфующей силе потока. Pada laju aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan heliks untaian meningkat saat mereka mencoba menangkap banyak bundel pembentuk spermatozoa individu yang lebih mampu menahan gaya arus yang melayang.在高流速(V > 33 µm/s)好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается di попытке захватит ь множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрей фа потока. Pada laju aliran tinggi (V > 33 µm/s), gerakan heliks filamen meningkat dalam upaya untuk menangkap banyak bundel pembentuk spermatozoa individu untuk lebih menahan gaya arus aliran.Mereka juga mencoba memasang saluran mikro ke dinding samping.
Bundel sperma diidentifikasi sebagai kelompok kepala sperma dan ekor keriting menggunakan mikroskop cahaya (LM).Bundel sperma dengan berbagai agregat juga telah diidentifikasi sebagai kepala yang bengkok dan agregat flagellar, beberapa ekor sperma yang menyatu, kepala sperma yang melekat pada ekor, dan kepala sperma dengan inti yang bengkok sebagai banyak inti yang menyatu.mikroskop elektron transmisi (TEM).Pemindaian mikroskop elektron (SEM) menunjukkan bahwa bundel sperma adalah kumpulan kepala sperma yang terbungkus dan agregat sperma menunjukkan jaringan ekor yang terbungkus.
Morfologi dan ultrastruktur spermatozoa, pembentukan bundel spermatozoa dipelajari menggunakan mikroskop cahaya (half section), scanning electron microscopy (SEM) dan transmission electron microscopy (TEM), apusan sperma diwarnai dengan acridine orange dan diperiksa menggunakan mikroskop epifluorescence.
Pewarnaan apusan sperma dengan acridine orange (Gbr. 3B) menunjukkan bahwa kepala sperma saling menempel dan ditutupi dengan bahan sekretori, yang menyebabkan pembentukan jumbai besar (Gbr. 3D).Bundel sperma terdiri dari agregat sperma dengan jaringan ekor yang menempel (Gbr. 4A-C).Bundel sperma terdiri dari ekor banyak spermatozoa yang saling menempel (Gbr. 4D).Rahasia (Gbr. 4E, F) menutupi kepala bundel spermatozoa.
Pembentukan bundel spermatozoa Menggunakan mikroskop kontras fase dan apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange, menunjukkan bahwa kepala spermatozoa saling menempel.(A) Awal pembentukan jumbai sperma dimulai dengan satu sperma (lingkaran putih) dan tiga sperma (lingkaran kuning), dengan spiral mulai dari ekor dan berakhir di kepala.(B) Fotomikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange menunjukkan kepala sperma yang melekat (panah).Debit menutupi kepala.Pembesaran × 1000. (C) Pengembangan sinar besar yang diangkut oleh aliran dalam saluran mikrofluida (menggunakan kamera kecepatan tinggi pada 950 fps).(D) Mikrograf apusan sperma diwarnai dengan acridine orange menunjukkan jumbai besar (panah).Pembesaran: ×200.
Memindai mikrograf elektron dari pancaran sperma dan apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange.(A, B, D, E) adalah mikrograf elektron pemindaian warna digital dari spermatozoa, dan C dan F adalah mikrograf apusan sperma berwarna oranye acridine yang menunjukkan perlekatan beberapa spermatozoa yang membungkus jaringan ekor.(AC) Agregat sperma ditampilkan sebagai jaringan ekor yang terpasang (panah).(D) Adhesi beberapa spermatozoa (dengan zat perekat, garis merah muda, panah) melingkari ekor.(E dan F) Agregat kepala sperma (penunjuk) ditutupi dengan bahan perekat (penunjuk).Spermatozoa membentuk bundel dengan beberapa struktur seperti pusaran (F).(C) ×400 dan (F) ×200 perbesaran.
Dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi, kami menemukan bahwa kumpulan sperma memiliki ekor yang menempel (Gbr. 6A, C), kepala yang menempel pada ekor (Gbr. 6B), atau kepala yang menempel pada ekor (Gbr. 6D).Kepala spermatozoa dalam bundel itu melengkung, muncul di bagian dua wilayah nuklir (Gbr. 6D).Dalam bundel sayatan, spermatozoa memiliki kepala bengkok dengan dua daerah inti dan beberapa daerah flagela (Gbr. 5A).
Mikrograf elektron warna digital menunjukkan ekor penghubung dalam bundel sperma dan bahan aglutinasi yang menghubungkan kepala sperma.(A) Ekor menempel sejumlah besar spermatozoa.Perhatikan bagaimana tampilan ekor dalam proyeksi potret (panah) dan lanskap (panah).(B) Kepala (panah) sperma terhubung ke ekor (panah).(C) Beberapa ekor sperma (panah) menempel.(D) Bahan aglutinasi (AS, biru) menghubungkan empat kepala sperma (ungu).
Pemindaian mikroskop elektron digunakan untuk mendeteksi kepala sperma dalam bundel sperma yang ditutupi dengan sekresi atau membran (Gambar 6B), yang menunjukkan bahwa bundel sperma ditambatkan oleh bahan ekstraseluler.Bahan yang diaglutinasi terkonsentrasi di kepala sperma (kumpulan seperti kepala ubur-ubur; Gambar 5B) dan melebar ke arah distal, memberikan penampilan kuning cemerlang di bawah mikroskop fluoresensi ketika diwarnai dengan acridine orange (Gbr. 6C).Zat ini terlihat jelas di bawah mikroskop pemindaian dan dianggap sebagai pengikat.Bagian semi-tipis (Gbr. 5C) dan apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange menunjukkan kumpulan sperma yang berisi kepala yang padat dan ekor yang melengkung (Gbr. 5D).
Berbagai fotomikrograf menunjukkan agregasi kepala sperma dan ekor terlipat menggunakan berbagai metode.(A) Mikrograf elektron transmisi warna digital cross-sectional dari bundel sperma menunjukkan kepala sperma melingkar dengan inti dua bagian (biru) dan beberapa bagian flagellar (hijau).(B) Mikrograf elektron pemindaian warna digital menunjukkan sekelompok kepala sperma seperti ubur-ubur (panah) yang tampak tertutup.(C) Potongan semi-tipis yang menunjukkan kumpulan kepala sperma (panah) dan ekor melengkung (panah).(D) Mikrograf apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange menunjukkan agregat kepala sperma (panah) dan ekor yang melekat (panah).Perhatikan bahwa zat lengket (S) menutupi kepala spermatozoon.(D) × 1000 perbesaran.
Menggunakan mikroskop elektron transmisi (Gbr. 7A), juga dicatat bahwa kepala sperma terpelintir dan nukleus memiliki bentuk spiral, sebagaimana dikonfirmasi oleh apusan sperma yang diwarnai dengan acridine orange dan diperiksa menggunakan mikroskop fluoresensi (Gbr. 7B).
(A) Mikrograf elektron transmisi warna digital dan (B) apusan sperma bernoda oranye Acridine menunjukkan kepala melingkar dan perlekatan kepala dan ekor sperma (panah).(B) × 1000 perbesaran.
Temuan yang menarik adalah agregat sperma Sharkazi membentuk kumpulan filamen bergerak.Sifat-sifat bundel ini memungkinkan kita untuk memahami kemungkinan perannya dalam penyerapan dan penyimpanan spermatozoa di SST.
Setelah kawin, sperma masuk ke dalam vagina dan mengalami proses seleksi yang intens sehingga hanya sedikit sperma yang masuk ke SST15,16.Sampai saat ini, mekanisme sperma masuk dan keluar SST masih belum jelas.Pada unggas, spermatozoa disimpan di SST untuk jangka waktu 2 hingga 10 minggu, tergantung pada spesiesnya6.Kontroversi tetap tentang kondisi semen selama penyimpanan di SST.Apakah mereka bergerak atau diam?Dengan kata lain, bagaimana sel sperma mempertahankan posisinya di SPL begitu lama?
Forman4 menyarankan bahwa tempat tinggal dan ejeksi SST dapat dijelaskan dalam hal motilitas sperma.Penulis berhipotesis bahwa sperma mempertahankan posisinya dengan berenang melawan aliran cairan yang diciptakan oleh epitel SST dan sperma dikeluarkan dari SST ketika kecepatannya turun di bawah titik di mana mereka mulai bergerak mundur karena kekurangan energi.Zaniboni5 mengonfirmasi keberadaan aquaporin 2, 3, dan 9 di bagian apikal sel epitel SST, yang mungkin secara tidak langsung mendukung model penyimpanan sperma Foreman.Dalam studi saat ini, kami menemukan bahwa hampir setengah dari spermatozoa Sharkashi menunjukkan reologi positif dalam cairan yang mengalir, dan kumpulan sperma yang diaglutinasi meningkatkan jumlah spermatozoa yang menunjukkan reologi positif, meskipun aglutinasi memperlambatnya.Bagaimana sel sperma melakukan perjalanan ke tuba falopi burung ke tempat pembuahan tidak sepenuhnya dipahami.Pada mamalia, cairan folikel kemoattracts spermatozoa.Namun, chemoattractants diyakini mengarahkan spermatozoa untuk mendekati jarak jauh7.Oleh karena itu, mekanisme lain bertanggung jawab untuk transportasi sperma.Kemampuan sperma untuk mengorientasikan dan mengalir melawan cairan tuba falopi yang dikeluarkan setelah kawin telah dilaporkan menjadi faktor utama penargetan sperma pada tikus.Parker 17 menyarankan bahwa spermatozoa melintasi saluran telur dengan berenang melawan arus silia pada burung dan reptil.Meskipun belum dibuktikan secara eksperimental pada burung, Adolphi18 adalah orang pertama yang menemukan bahwa sperma unggas memberikan hasil positif ketika lapisan tipis cairan antara kaca penutup dan slide dibuat dengan selembar kertas saring.Kajian perubahan bentuk.Hino dan Yanagimachi [19] menempatkan kompleks ovarium-tuba-rahim tikus dalam cincin perfusi dan menyuntikkan 1 µl tinta ke tanah genting untuk memvisualisasikan aliran cairan di saluran tuba.Mereka melihat gerakan kontraksi dan relaksasi yang sangat aktif di tuba falopi, di mana semua bola tinta terus bergerak menuju ampulla tuba falopi.Penulis menekankan pentingnya aliran cairan tuba dari tuba falopi bawah ke tuba atas untuk pengangkatan dan pembuahan sperma.Brillard20 melaporkan bahwa pada ayam dan kalkun, spermatozoa bermigrasi dengan gerakan aktif dari pintu masuk vagina, di mana mereka disimpan, ke persimpangan utero-vagina, di mana mereka disimpan.Namun, pergerakan ini tidak diperlukan antara uterovaginal junction dan infundibulum karena spermatozoa ditransportasikan secara pasif.Mengetahui rekomendasi sebelumnya dan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, dapat diasumsikan bahwa kemampuan spermatozoa untuk bergerak ke hulu (rheologi) adalah salah satu sifat yang mendasari proses seleksi.Ini menentukan perjalanan spermatozoa melalui vagina dan masuknya mereka ke dalam CCT untuk disimpan.Seperti yang dikemukakan Forman4, ini juga dapat memfasilitasi proses sperma memasuki SST dan habitatnya untuk jangka waktu tertentu dan kemudian keluar ketika kecepatannya mulai melambat.
Di sisi lain, Matsuzaki dan Sasanami 21 mengemukakan bahwa spermatozoa unggas mengalami perubahan motilitas dari dormansi menjadi motilitas pada saluran reproduksi jantan dan betina.Penghambatan motilitas sperma residen di SST telah diusulkan untuk menjelaskan lamanya waktu penyimpanan sperma dan kemudian peremajaan setelah keluar dari SST.Dalam kondisi hipoksia, Matsuzaki et al.1 melaporkan produksi dan pelepasan laktat yang tinggi di SST, yang dapat menyebabkan penghambatan motilitas sperma residen.Dalam hal ini, pentingnya reologi sperma tercermin dalam pemilihan dan penyerapan spermatozoa, dan bukan dalam penyimpanannya.
Pola aglutinasi sperma dianggap sebagai penjelasan yang masuk akal untuk periode penyimpanan sperma yang lama di SST, karena ini merupakan pola umum retensi sperma pada unggas2,22,23.Bakst et al.2 mengamati bahwa sebagian besar spermatozoa melekat satu sama lain, membentuk agregat fasikular, dan spermatozoa tunggal jarang ditemukan pada CCM puyuh.Di sisi lain, Wen et al.24 mengamati lebih banyak spermatozoa yang tersebar dan lebih sedikit jumbai spermatozoa di lumen SST pada ayam.Berdasarkan pengamatan tersebut, dapat diasumsikan bahwa kecenderungan aglutinasi sperma berbeda antara burung dan antara spermatozoa dalam ejakulasi yang sama.Selain itu, Van Krey et al.9 menyarankan bahwa disosiasi acak spermatozoa yang diaglutinasi bertanggung jawab atas penetrasi spermatozoa secara bertahap ke dalam lumen tuba falopi.Menurut hipotesis ini, spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi lebih rendah harus dikeluarkan dari SST terlebih dahulu.Dalam konteks ini, kemampuan aglutinasi spermatozoa dapat menjadi faktor yang mempengaruhi hasil kompetisi sperma pada unggas yang kotor.Selain itu, semakin lama sperma yang diaglutinasi berdisosiasi, semakin lama kesuburan dipertahankan.
Meskipun agregasi dan agregasi spermatozoa menjadi bundel telah diamati dalam beberapa penelitian2,22,24, mereka belum dijelaskan secara rinci karena kompleksitas pengamatan kinematik mereka dalam SST.Beberapa upaya telah dilakukan untuk mempelajari aglutinasi sperma secara in vitro.Agregasi yang luas tetapi sementara diamati ketika kawat tipis dihilangkan dari tetesan benih yang menggantung.Ini mengarah pada fakta bahwa gelembung memanjang menonjol dari tetesan, meniru kelenjar mani.Karena keterbatasan 3D dan waktu pengeringan tetes yang singkat, seluruh blok dengan cepat rusak9.Dalam studi saat ini, dengan menggunakan ayam Sharkashi dan chip mikrofluida, kami dapat menjelaskan bagaimana jumbai ini terbentuk dan bagaimana mereka bergerak.Bundel sperma terbentuk segera setelah pengumpulan semen dan ditemukan bergerak dalam bentuk spiral, menunjukkan reologi positif saat ada dalam aliran.Selanjutnya, jika dilihat secara makroskopis, kumpulan sperma telah diamati untuk meningkatkan linearitas motilitas dibandingkan dengan spermatozoa yang diisolasi.Hal ini menunjukkan bahwa aglutinasi sperma dapat terjadi sebelum penetrasi SST dan bahwa produksi sperma tidak terbatas pada area kecil akibat stres seperti yang disarankan sebelumnya (Tingari dan Lake12).Selama pembentukan jumbai, spermatozoa berenang secara sinkron hingga membentuk persimpangan, kemudian ekornya saling melilit dan kepala spermatozoa tetap bebas, tetapi ekor dan bagian distal spermatozoa menempel dengan zat lengket.Oleh karena itu, kepala ligamen yang bebas bertanggung jawab atas pergerakan, menyeret sisa ligamen.Pemindaian mikroskop elektron dari bundel sperma menunjukkan kepala sperma yang menempel ditutupi dengan banyak bahan lengket, menunjukkan bahwa kepala sperma melekat pada bundel istirahat, yang mungkin terjadi setelah mencapai tempat penyimpanan (SST).
Ketika apusan sperma diwarnai dengan acridine orange, bahan perekat ekstraseluler di sekitar sel sperma dapat dilihat di bawah mikroskop fluoresen.Zat ini memungkinkan kumpulan sperma untuk menempel dan menempel pada permukaan atau partikel di sekitarnya sehingga tidak hanyut mengikuti arus di sekitarnya.Dengan demikian, pengamatan kami menunjukkan peran adhesi spermatozoa dalam bentuk bundel bergerak.Kemampuan mereka untuk berenang melawan arus dan menempel pada permukaan terdekat memungkinkan sperma bertahan lebih lama di SST.
Rothschild25 menggunakan kamera hemositometri untuk mempelajari distribusi mengambang semen sapi dalam setetes suspensi, mengambil fotomikrograf melalui kamera dengan sumbu optik mikroskop vertikal dan horizontal.Hasil penelitian menunjukkan bahwa spermatozoa tertarik ke permukaan bilik.Para penulis menyarankan bahwa mungkin ada interaksi hidrodinamik antara sperma dan permukaan.Mempertimbangkan hal ini, bersama dengan kemampuan semen anak ayam Sharkashi untuk membentuk jumbai yang lengket, hal itu dapat meningkatkan kemungkinan semen akan menempel pada dinding SST dan disimpan dalam jangka waktu yang lama.
Bccetti dan Afzeliu26 melaporkan bahwa glikokaliks sperma diperlukan untuk pengenalan dan aglutinasi gamet.Forman10 mengamati bahwa hidrolisis ikatan α-glikosidik pada pelapis glikoprotein-glikolipid dengan memperlakukan semen unggas dengan neuraminidase menghasilkan penurunan kesuburan tanpa mempengaruhi motilitas sperma.Para penulis berpendapat bahwa efek neuraminidase pada glikokaliks mengganggu sekuestrasi sperma di persimpangan utero-vagina, sehingga mengurangi kesuburan.Pengamatan mereka tidak dapat mengabaikan kemungkinan bahwa pengobatan neuraminidase dapat mengurangi pengenalan sperma dan oosit.Forman dan Engel10 menemukan bahwa fertilitas berkurang ketika ayam diinseminasi secara intravaginal dengan semen yang diberi neuraminidase.Namun, IVF dengan sperma yang diberi perlakuan neuraminidase tidak mempengaruhi kesuburan dibandingkan dengan ayam kontrol.Para penulis menyimpulkan bahwa perubahan pada lapisan glikoprotein-glikolipid di sekitar membran sperma mengurangi kemampuan sperma untuk membuahi dengan merusak sekuestrasi sperma di persimpangan utero-vaginal, yang pada gilirannya meningkatkan hilangnya sperma karena kecepatan persimpangan utero-vagina, tetapi tidak mempengaruhi pengenalan sperma dan sel telur.
Pada kalkun Bakst dan Bauchan 11 menemukan vesikel kecil dan fragmen membran di lumen SST dan mengamati bahwa beberapa butiran ini telah menyatu dengan membran sperma.Para penulis menyarankan bahwa hubungan ini dapat berkontribusi pada penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SST.Namun, para peneliti tidak merinci sumber partikel tersebut, apakah disekresikan oleh sel epitel CCT, diproduksi dan disekresikan oleh sistem reproduksi pria, atau diproduksi oleh sperma itu sendiri.Juga, partikel-partikel ini bertanggung jawab atas aglutinasi.Grützner et al27 melaporkan bahwa sel epitel epididimis memproduksi dan mengeluarkan protein spesifik yang diperlukan untuk pembentukan saluran mani berpori tunggal.Para penulis juga melaporkan bahwa penyebaran berkas ini bergantung pada interaksi protein epididimis.Nixon et al28 menemukan bahwa adneksa mensekresi protein, osteonektin kaya sistein yang bersifat asam;SPARC terlibat dalam pembentukan jumbai sperma pada echidna berparuh pendek dan platipus.Hamburan sinar ini dikaitkan dengan hilangnya protein ini.
Dalam studi saat ini, analisis ultrastruktur menggunakan mikroskop elektron menunjukkan bahwa spermatozoa menempel pada sejumlah besar bahan padat.Zat-zat ini dianggap bertanggung jawab atas aglutinasi yang mengembun di antara dan di sekitar kepala yang melekat, tetapi pada konsentrasi yang lebih rendah di daerah ekor.Kami berasumsi bahwa zat aglutinasi ini dikeluarkan dari sistem reproduksi pria (epididimis atau vas deferens) bersama dengan air mani, karena kami sering mengamati air mani yang terpisah dari getah bening dan plasma mani selama ejakulasi.Telah dilaporkan bahwa ketika spermatozoa unggas melewati epididimis dan vas deferens, mereka mengalami perubahan terkait pematangan yang mendukung kemampuan mereka untuk mengikat protein dan memperoleh glikoprotein terkait lemma plasma.Kegigihan protein ini pada membran sperma residen di SST menunjukkan bahwa protein ini dapat mempengaruhi perolehan stabilitas membran sperma 30 dan menentukan kesuburannya 31 .Ahammad et al32 melaporkan bahwa spermatozoa yang diperoleh dari berbagai bagian sistem reproduksi jantan (dari testis hingga vas deferens distal) menunjukkan peningkatan viabilitas yang progresif pada kondisi penyimpanan cairan, terlepas dari suhu penyimpanan, dan viabilitas pada ayam juga meningkat pada tuba falopi setelah inseminasi buatan.
Jumbai sperma ayam Sharkashi memiliki karakteristik dan fungsi yang berbeda dengan spesies lain seperti ekidna, platipus, tikus kayu, tikus rusa, dan marmut.Pada ayam sharkasi, pembentukan bundel spermatozoa menurunkan kecepatan renangnya dibandingkan dengan spermatozoa tunggal.Namun, bundel ini meningkatkan persentase spermatozoa yang positif secara reologi dan meningkatkan kemampuan spermatozoa untuk menstabilkan diri dalam lingkungan yang dinamis.Dengan demikian, hasil kami mengkonfirmasi dugaan sebelumnya bahwa aglutinasi sperma pada SST dikaitkan dengan penyimpanan sperma jangka panjang.Kami juga berhipotesis bahwa kecenderungan sperma untuk membentuk jumbai dapat mengontrol laju kehilangan sperma pada SST, yang dapat mengubah hasil kompetisi sperma.Menurut asumsi ini, spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi rendah melepaskan SST terlebih dahulu, sedangkan spermatozoa dengan kapasitas aglutinasi tinggi menghasilkan sebagian besar keturunan.Pembentukan bundel sperma berpori tunggal bermanfaat dan memengaruhi rasio orangtua-anak, tetapi menggunakan mekanisme yang berbeda.Pada echidna dan platipus, spermatozoa disusun sejajar satu sama lain untuk meningkatkan kecepatan sinar ke depan.Kumpulan ekidna bergerak sekitar tiga kali lebih cepat daripada spermatozoa tunggal.Dipercayai bahwa pembentukan jumbai sperma seperti itu pada echidna merupakan adaptasi evolusioner untuk mempertahankan dominasi, karena betina tidak memilih-milih dan biasanya kawin dengan beberapa jantan.Oleh karena itu, spermatozoa dari berbagai ejakulasi bersaing sengit untuk membuahi sel telur.
Aglutinasi spermatozoa ayam sharkasi mudah divisualisasikan menggunakan mikroskop kontras fase, yang dianggap menguntungkan karena memungkinkan studi perilaku spermatozoa in vitro dengan mudah.Mekanisme pembentukan jumbai sperma mendorong reproduksi pada ayam sharkasi juga berbeda dari yang terlihat pada beberapa mamalia plasenta yang mewakili perilaku sperma kooperatif seperti tikus kayu, di mana beberapa spermatozoa mencapai telur, membantu individu terkait lainnya mencapai dan merusak telurnya.untuk membuktikan diri.perilaku altruistik.Pembuahan sendiri 34. Contoh lain dari perilaku kooperatif pada spermatozoa ditemukan pada mencit rusa, dimana spermatozoa mampu mengidentifikasi dan bergabung dengan spermatozoa yang paling berkerabat secara genetik dan membentuk kelompok kooperatif untuk meningkatkan kecepatannya dibandingkan dengan spermatozoa yang tidak berkerabat35.
Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini tidak bertentangan dengan teori Foman tentang penyimpanan spermatozoa jangka panjang di SWS.Para peneliti melaporkan bahwa sel sperma terus bergerak dalam aliran sel epitel yang melapisi SST untuk jangka waktu yang lama, dan setelah jangka waktu tertentu, simpanan energi sel sperma habis, mengakibatkan penurunan kecepatan, yang memungkinkan pengusiran zat berbobot molekul kecil.energi spermatozoa dengan aliran cairan dari lumen SST Rongga tuba falopi.Dalam studi saat ini, kami mengamati bahwa setengah dari satu sperma menunjukkan kemampuan untuk berenang melawan cairan yang mengalir, dan adhesi mereka dalam bundel meningkatkan kemampuan mereka untuk menunjukkan reologi positif.Selain itu, data kami konsisten dengan data Matsuzaki et al.1 yang melaporkan bahwa peningkatan sekresi laktat pada SST dapat menghambat motilitas sperma residen.Namun, hasil kami menggambarkan pembentukan ligamen motil sperma dan perilaku reologinya di hadapan lingkungan yang dinamis dalam saluran mikro dalam upaya untuk menjelaskan perilakunya di SST.Penelitian di masa depan mungkin berfokus pada penentuan komposisi kimia dan asal agen aglutinasi, yang tidak diragukan lagi akan membantu para peneliti mengembangkan cara baru untuk menyimpan semen cair dan meningkatkan durasi kesuburan.
Lima belas sharkasi jantan berleher telanjang berusia 30 minggu (dominan homozigot; Na Na) dipilih sebagai donor sperma dalam penelitian ini.Burung-burung itu dipelihara di Research Poultry Farm Fakultas Pertanian, Universitas Ashit, Kegubernuran Ashit, Mesir.Burung ditempatkan di kandang individu (30 x 40 x 40 cm), menjalani program cahaya (16 jam terang dan 8 jam gelap) dan diberi makan yang mengandung 160 g protein kasar, 2800 kkal energi metabolis, masing-masing 35 g kalsium.5 gram fosfor yang tersedia per kilogram diet.
Menurut data 36, ​​​​37, semen dikumpulkan dari laki-laki dengan cara pijat perut.Sebanyak 45 sampel semen dikumpulkan dari 15 pria selama 3 hari.Semen (n = 15/hari) segera diencerkan 1:1 (v:v) dengan Belsville Poultry Semen Diluent, yang mengandung kalium difosfat (1,27 g), mononatrium glutamat monohidrat (0,867 g), fruktosa (0,5 hari) natrium anhidrat.asetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometana (0,195 g), kalium sitrat monohidrat (0,064 g), kalium monofosfat (0,065 g), magnesium klorida (0,034 g) dan H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritas 333 mOsm/kg38.Sampel semen yang telah diencerkan terlebih dahulu diperiksa di bawah mikroskop cahaya untuk memastikan kualitas semen yang baik (kelembaban) dan kemudian disimpan dalam penangas air pada suhu 37°C sampai digunakan dalam waktu setengah jam setelah pengumpulan.
Kinematika dan reologi spermatozoa dijelaskan menggunakan sistem perangkat mikrofluida.Sampel semen selanjutnya diencerkan menjadi 1:40 di Beltsville Avian Semen Diluent, dimasukkan ke dalam perangkat mikrofluida (lihat di bawah), dan parameter kinetik ditentukan menggunakan sistem Computerized Semen Analysis (CASA) yang sebelumnya dikembangkan untuk karakterisasi mikrofluida.tentang mobilitas spermatozoa dalam media cair (Jurusan Teknik Mesin, Fakultas Teknik, Universitas Assiut, Mesir).Plugin dapat diunduh di: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Kecepatan kurva (VCL, μm/s), kecepatan linier (VSL, μm/s) dan kecepatan lintasan rata-rata (VAP, μm/s) diukur.Video spermatozoa diambil menggunakan mikroskop kontras fase Optika XDS-3 terbalik (dengan tujuan 40x) yang terhubung ke kamera Tucson ISH1000 pada 30 fps selama 3 detik.Gunakan perangkat lunak CASA untuk mempelajari setidaknya tiga area dan 500 lintasan sperma per sampel.Rekaman video diolah menggunakan CASA bikinan sendiri.Definisi motilitas dalam plug-in CASA didasarkan pada kecepatan berenang sperma dibandingkan dengan laju aliran, dan tidak termasuk parameter lain seperti gerakan sisi ke sisi, karena hal ini ditemukan lebih andal dalam aliran fluida.Gerak reologi digambarkan sebagai pergerakan sel sperma melawan arah aliran fluida.Spermatozoa dengan sifat reologi dibagi dengan jumlah spermatozoa yang motil;spermatozoa yang diam dan spermatozoa yang bergerak konvektif dikeluarkan dari hitungan.
Semua bahan kimia yang digunakan diperoleh dari Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Mesir) kecuali dinyatakan lain.Perangkat ini diproduksi seperti yang dijelaskan oleh El-sherry et al.40 dengan beberapa modifikasi.Bahan yang digunakan untuk membuat saluran mikro termasuk pelat kaca (Howard Glass, Worcester, MA), penahan negatif SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alkohol diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Jerman), dan poliaseton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Saluran mikro dibuat menggunakan litografi lunak.Pertama, masker wajah pelindung bening dengan desain microchannel yang diinginkan dicetak pada printer resolusi tinggi (Prismatic, Kairo, Mesir dan Pacific Arts and Design, Markham, ON).Master dibuat menggunakan pelat kaca sebagai substrat.Pelat dibersihkan dalam aseton, isopropanol dan air deionisasi dan kemudian dilapisi dengan lapisan SU8-25 20 µm dengan pelapisan spin (3000 rpm, 1 menit).Lapisan SU-8 kemudian dikeringkan dengan hati-hati (65°C, 2 menit dan 95°C, 10 menit) dan terpapar radiasi UV selama 50 detik.Pemanggangan pasca paparan pada suhu 65°C dan 95°C selama 1 menit dan 4 menit untuk mengikat silang lapisan SU-8 yang terpapar, diikuti dengan pengembangan dalam alkohol diaseton selama 6,5 ​​menit.Panggang wafel dengan keras (200°C selama 15 menit) untuk lebih mengeraskan lapisan SU-8.
PDMS dibuat dengan mencampurkan monomer dan hardener dengan perbandingan berat 10:1, kemudian didegassing dalam desikator vakum dan dituangkan ke rangka utama SU-8.PDMS disembuhkan dalam oven (120 ° C, 30 menit), kemudian saluran dipotong, dipisahkan dari master, dan dilubangi untuk memungkinkan tabung dipasang di saluran masuk dan keluar saluran mikro.Akhirnya, saluran mikro PDMS dipasang secara permanen ke slide mikroskop menggunakan prosesor korona portabel (Electro-Technic Products, Chicago, IL) seperti yang dijelaskan di tempat lain.Microchannel yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 200 µm × 20 µm (W × H) dan panjang 3,6 cm.
Aliran fluida yang diinduksi oleh tekanan hidrostatik di dalam microchannel dicapai dengan mempertahankan level fluida di reservoir inlet di atas perbedaan ketinggian Δh39 di reservoir outlet (Gbr. 1).
di mana f adalah koefisien gesekan, didefinisikan sebagai f = C/Re untuk aliran laminar dalam saluran persegi panjang, di mana C adalah konstanta tergantung pada rasio aspek saluran, L adalah panjang saluran mikro, Vav adalah kecepatan rata-rata di dalam saluran mikro, Dh adalah diameter hidrolik saluran, g – percepatan gravitasi.Dengan menggunakan persamaan ini, kecepatan saluran rata-rata dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut: