Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Partikel silika berpori dibuat dengan metode sol-gel dengan beberapa modifikasi untuk mendapatkan partikel makropori. Partikel-partikel ini diturunkan dengan polimerisasi transfer rantai fragmentasi tambahan (RAFT) penambahan reversibel dengan fase diam N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) dan stirena untuk menyiapkan interkalasi N-phenylmaleimide dari fase diam polistiren (PMP). pengepakan. Pemisahan kolom PMP yang dievaluasi dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) kinerja kromatografi) dan pencernaan trypsin dari albumin serum manusia (HAS). Di bawah kondisi elusi optimal, jumlah lempeng teoritis dari campuran peptida setinggi 280.000 lempeng/m². Membandingkan kinerja pemisahan kolom yang dikembangkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amida komersial, diamati bahwa kinerja pemisahan kolom PMP lebih unggul daripada kolom komersial dalam hal efisiensi dan resolusi pemisahan.
Dalam beberapa tahun terakhir, industri biofarmasi telah menjadi pasar global yang berkembang dengan peningkatan pangsa pasar yang substansial. Dengan ledakan pertumbuhan industri biofarmasi1,2,3, analisis peptida dan protein sangat diinginkan. Selain peptida target, beberapa pengotor dihasilkan selama sintesis peptida, sehingga membutuhkan pemurnian kromatografi untuk mendapatkan peptida dengan kemurnian yang diinginkan. Analisis dan karakterisasi protein dalam cairan tubuh, jaringan, dan sel adalah tugas yang sangat menantang karena banyaknya spesies yang berpotensi terdeteksi dalam satu sampel .Meskipun spektrometri massa adalah alat yang efektif untuk sequencing peptida dan protein, jika sampel tersebut disuntikkan ke dalam spektrometer massa dalam satu lintasan, pemisahan tidak akan ideal. Masalah ini dapat dikurangi dengan menerapkan pemisahan kromatografi cair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangi jumlah analit yang memasuki spektrometer massa pada waktu tertentu4,5,6. kromatografi quid (LC) telah maju secara signifikan selama dekade terakhir dan telah menjadi teknik populer dalam analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) banyak digunakan untuk pemurnian dan pemisahan campuran peptida menggunakan silika termodifikasi oktadesil (ODS) sebagai fase diam11,12,13. Namun, fase diam RP tidak memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan karena strukturnya yang kompleks dan sifat amfifiliknya14,15. Oleh karena itu, fase diam yang dirancang khusus diperlukan untuk menganalisis peptida dan protein dengan gugus polar dan non-polar untuk berinteraksi dengan dan mempertahankan analit ini16. Kromatografi mode campuran, yang menyediakan interaksi multimodal, dapat menjadi alternatif untuk RP-LC untuk pemisahan peptida, protein, dan campuran kompleks lainnya. Beberapa fase diam mode campuran telah disiapkan, dan kolom yang dikemas dengan fase ini telah digunakan untuk pemisahan peptida dan protein17,18,19,20,21. Fase diam mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RP LC) cocok untuk pemisahan peptida dan protein karena adanya gugus polar dan non-polar22,23,24,25,26,27,28 . Demikian pula, fase diam interkalasi polar dengan gugus polar berikatan kovalen menunjukkan daya pemisahan yang baik dan selektivitas unik untuk analit polar dan non-polar, karena pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fase diam.Interaksi multimodal 29, 30, 31, 32.Baru-baru ini, Zhang et al.30 menyiapkan fase diam poliamina yang diakhiri dodesil dan berhasil memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, dan beberapa analit lainnya. Interkalator polar memiliki gugus polar dan non-polar, sehingga dapat digunakan untuk memisahkan peptida dan protein yang memiliki gugus hidrofobik dan hidrofilik. Kolom tertanam polar (misalnya, kolom C18 tertanam amida) tersedia secara komersial dengan nama dagang Ascentis Express RP-Amide kolom, tetapi kolom ini digunakan untuk analisis amina 33 saja.
Dalam studi saat ini, fase diam tertanam polar (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan peptida dan trypsin digest dari HSA. Fase diam disiapkan menggunakan strategi berikut. Partikel silika berpori disiapkan sesuai dengan prosedur yang diberikan dalam publikasi kami sebelumnya dengan beberapa modifikasi pada protokol persiapan. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, asam asetat air disesuaikan untuk menyiapkan partikel silika dengan ukuran pori besar. d, ligan baru, fenilmaleimida-metil vinil isosianat, disintesis dan digunakan untuk menurunkan partikel silika untuk menyiapkan fase diam tertanam polar. Fase diam yang dihasilkan dikemas ke dalam kolom baja tahan karat (100 × 1,8 mm id) menggunakan skema pengepakan yang dioptimalkan. Pengemasan kolom dibantu dengan getaran mekanis untuk memastikan lapisan homogen terbentuk di dalam kolom. Evaluasi pemisahan kolom yang dikemas dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) dan trypsin digest dari human serum albumin (HAS). Campuran peptida dan trypsin digest dari HSA diamati terpisah dengan resolusi dan efisiensi yang baik. Performa pemisahan kolom PMP dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Kedua peptida dan protein diamati untuk diselesaikan dengan baik dan efisien pada kolom PMP, yang lebih efisien daripada kolom RP-Amida Ascentis Express.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Asam Asetat, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Human Serum Albumin (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Metanol , 2-Propanol, dan Aseton Dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g), dan 8 mL asam asetat 0,01 N diaduk selama 10 menit, kemudian 24 mL TMOS ditambahkan ke dalamnya pada kondisi dingin. Campuran reaksi dipanaskan pada 40°C selama 6 jam dan kemudian pada 120°C selama 8 jam dalam autoklaf stainless steel. massa lunak ditumbuk halus dalam oven dan dikalsinasi pada 550 ° C selama 12 jam. Tiga batch disiapkan dan dikarakterisasi untuk memeriksa reproduktifitas dalam ukuran partikel, ukuran pori dan luas permukaan.
Dengan modifikasi permukaan partikel silika dengan ligan pra-sintesis phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) diikuti dengan polimerisasi radial dengan stirena, senyawa yang mengandung gugus polar disiapkan.Fase diam untuk agregat dan rantai polistiren. Proses persiapan dijelaskan di bawah ini.
N-phenylmaleimide (200 mg) dan methyl vinyl isocyanate (100 mg) dilarutkan dalam toluena kering, dan 0,1 mL 2,2 ′-azoisobutyrile (AIBN) selama 6 tahun. IED dalam oven pada suhu 40 ° C selama 3 jam.
Partikel silika kering (2 g) didispersikan dalam toluena kering (100 mL), diaduk dan disonikasi dalam labu alas bulat 500 mL selama 10 menit. PMCP (10 mg) dilarutkan dalam toluena dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu reaksi melalui corong tetes. Campuran direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, disaring dan dicuci dengan aseton dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. g) dilarutkan dalam toluena (200 ml) dan 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ditambahkan dengan adanya 100 µL dibutiltimah dilaurat sebagai katalis. Campuran diaduk pada suhu 50°C selama 8 jam, disaring dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Styrene (1 mL), benzoil peroksida BPO (0,5 mL), dan partikel silika yang menempel pada TEMPO-PMCP (1,5 g) didispersikan dalam toluena dan dibersihkan dengan nitrogen. Polimerisasi stirena dilakukan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang dihasilkan dicuci dengan metanol dan dikeringkan pada suhu 60°C semalaman. Skema reaksi keseluruhan ditunjukkan pada Gambar 1.
Sampel dihilangkan gasnya pada 393 K selama 1 jam untuk mendapatkan tekanan sisa kurang dari 10-3 Torr. Jumlah N2 yang teradsorpsi pada tekanan relatif P/P0 = 0,99 digunakan untuk menentukan volume pori total. Morfologi partikel silika telanjang dan ikatan ligan diperiksa dengan pemindaian mikroskop elektron (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel kering (partikel silika telanjang dan partikel silika ikatan ligan) ditempatkan pada kolom aluminium menggunakan pita perekat karbon.Emas disepuh pada sampel menggunakan Q150T sputter coater, dan lapisan Au 5 nm diendapkan pada sampel.Hal ini meningkatkan efisiensi proses menggunakan voltase rendah dan memberikan butiran halus, sputtering dingin.A Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental analyzer digunakan untuk analisis unsur.A Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 particle size analyzer digunakan untuk mendapatkan partikel distribusi ukuran. Partikel silika telanjang dan partikel silika terikat ligan (masing-masing 5 mg) didispersikan dalam 5 mL isopropanol, disonikasi selama 10 menit, divorteks selama 5 menit, dan ditempatkan di meja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilakukan pada laju 5 °C per menit pada kisaran suhu 30 hingga 800 °C.
Kolom berdimensi sempit berlapis kaca stainless steel (100 × 1,8 mm id) dikemas menggunakan metode pengepakan bubur, menerapkan prosedur yang sama yang digunakan dalam Ref.31. Kolom baja tahan karat (berlapis kaca, 100 × 1,8 mm id) dengan fitting outlet yang mengandung frit 1 µm dihubungkan ke pengemas bubur (Alltech Deerfield, IL, USA). Siapkan bubur fase diam dengan menangguhkan 150 mg fase diam dalam 1,2 mL metanol dan mengirimkannya ke kolom penyimpanan. Metanol digunakan sebagai pelarut bubur serta pelarut pendorong. Isi kolom secara berurutan dengan menerapkan tekanan 100 MP selama 10 menit, 80 MP selama 15 menit, dan 60 MP selama 30 menit. Selama pengepakan, getaran mekanis diterapkan dengan dua pengocok kolom GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) untuk memastikan pengepakan kolom yang seragam. Tutup pengemas bubur dan lepaskan tekanan secara perlahan untuk mencegah kerusakan di dalam kolom. Putuskan sambungan kolom dari unit pengepakan bubur dan sambungkan fitting lain ke saluran masuk dan ke sistem LC untuk memeriksa kinerjanya.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), injektor (Valco (USA) C14 W.05) dengan loop injeksi 50nL, degasser membran (Shimadzu DGU-14A), jendela kapiler UV-VIS dibangun Detektor perangkat µLC khusus (UV-2075) dan mikrokolom berlapis kaca. Gunakan pipa penghubung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimalkan efek pelebaran pita kolom ekstra. Setelah pengemasan, kapiler (50 μm id 365 dan kapiler serikat pereduksi (50 μm) dipasang pada outlet 1/16″ serikat pereduksi. Pengumpulan data dan pemrosesan kromatografi dilakukan menggunakan perangkat lunak Multichro 2000. Pemantauan pada 254 nm Analit diuji untuk absorbansi UV. Data kromatografi dianalisis dengan OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin dari serum manusia, bubuk terliofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur tripsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 mL), dan 0,2 M ammonium bikarbonat (1 mL). °C.
Pemisahan campuran peptida dan pencernaan trypsin HSA dievaluasi secara terpisah pada kolom PMP. Periksa pemisahan campuran peptida dan pencerna trypsin HSA dengan kolom PMP dan bandingkan hasilnya dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Nomor plat teoritis dihitung sebagai berikut:
Gambar SEM partikel silika telanjang dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar.Gambar SEM partikel silika telanjang (A, B) menunjukkan bahwa, berbeda dengan penelitian kami sebelumnya, partikel ini berbentuk bulat di mana partikelnya memanjang atau memiliki simetri tidak beraturan. Permukaan partikel silika yang terikat ligan (C, D) lebih halus daripada partikel silika telanjang, yang mungkin disebabkan oleh lapisan rantai polistiren pada permukaan partikel silika.
Memindai gambar mikroskop elektron dari partikel silika telanjang (A, B) dan partikel silika yang terikat ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika telanjang dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel berbasis volume menunjukkan bahwa ukuran partikel silika meningkat setelah modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel partikel silika dari penelitian ini dan penelitian sebelumnya dibandingkan pada Tabel 1(A). Ukuran partikel berbasis volume, d(0,5), dari PMP adalah 3,36 μm, dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya dengan nilai iklan(0,5) dari 3,05 μm (partikel silika terikat polistiren)34. Batch ini memiliki distribusi ukuran partikel yang lebih sempit dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya karena berbagai rasio PEG, urea, TMOS, dan asam asetat dalam campuran reaksi. Ukuran partikel fase PMP sedikit lebih besar daripada fase partikel silika terikat polistirena yang kami pelajari sebelumnya. permukaan silika, sedangkan pada fase PMP ketebalan lapisan adalah 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) dan distribusi ukuran pori (B) dari partikel silika telanjang dan partikel silika yang terikat ligan.
Ukuran pori, volume pori, dan luas permukaan partikel silika dari penelitian ini diberikan pada Tabel 1(B).Profil PSD partikel silika telanjang dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(B).Hasilnya sebanding dengan penelitian kami sebelumnya.Ukuran pori partikel silika telanjang dan terikat ligan masing-masing adalah 310 dan 241, yang menunjukkan bahwa ukuran pori berkurang sebesar 69 setelah modifikasi kimia, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), dan perubahan kurva adalah ditunjukkan pada Gambar 3(B). Demikian pula, volume pori partikel silika menurun dari 0,67 menjadi 0,58 cm3/g setelah modifikasi kimia. Luas permukaan spesifik partikel silika yang dipelajari saat ini adalah 116 m2/g, yang sebanding dengan penelitian kami sebelumnya (124 m2/g). g setelah modifikasi kimia.
Hasil analisis unsur fasa diam ditunjukkan pada Tabel 2. Muatan karbon fasa diam saat ini adalah 6,35%, lebih rendah dari muatan karbon pada penelitian kami sebelumnya (partikel silika terikat polistirena, masing-masing 7,93%35 dan 10,21%) methylvinylisocyanate (PCMP) dan 4-hydroxy-TEMPO digunakan. Persen berat nitrogen dari fase diam saat ini adalah 2,21%, dibandingkan dengan masing-masing 0,1735 dan 0,85% berat nitrogen dalam penelitian sebelumnya. Ini berarti bahwa% berat nitrogen lebih tinggi pada fase diam saat ini karena phenylmaleimide. Demikian pula, muatan karbon produk (4) dan (5) adalah 2,7% dan 2,9% , masing-masing, sedangkan pemuatan karbon dari produk akhir (6) adalah 6,35%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Penurunan berat diperiksa dengan fase diam PMP, dan kurva TGA ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva TGA menunjukkan penurunan berat sebesar 8,6%, yang sesuai dengan pemuatan karbon (6,35%) karena ligan tidak hanya mengandung C tetapi juga N, O, dan H.
Ligan fenilmaleimida-metilvinilisosianat dipilih untuk modifikasi permukaan partikel silika karena memiliki gugus fenilmaleimida polar dan gugus vinilisosianat. Gugus vinil isosianat selanjutnya dapat bereaksi dengan stirena melalui polimerisasi radikal hidup. Alasan kedua adalah untuk memasukkan gugus yang memiliki interaksi moderat dengan analit dan tidak ada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fase diam, karena gugus fenilmaleimida tidak memiliki muatan virtual pada pH normal. Polar Kecepatan fase diam dapat dikendalikan oleh jumlah optimal stirena dan waktu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah terakhir dari reaksi (polimerisasi radikal bebas) sangat penting dan dapat mengubah polaritas fase diam. Analisis unsur dilakukan untuk memeriksa muatan karbon fase diam ini. Diamati bahwa peningkatan jumlah stirena dan waktu reaksi meningkatkan muatan karbon fase diam dan sebaliknya. SP yang disiapkan dengan konsentrasi stirena yang berbeda memiliki muatan karbon yang berbeda. Sekali lagi , masukkan fase diam ini ke dalam kolom baja tahan karat dan periksa kinerja kromatografinya (selektivitas, resolusi, nilai N, dll.). Berdasarkan percobaan ini, formulasi yang dioptimalkan dipilih untuk menyiapkan fase diam PMP untuk memastikan polaritas terkontrol dan retensi analit yang baik.
Lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) juga dievaluasi menggunakan kolom PMP menggunakan fase gerak;60/40 (v/v) asetonitril/air (0,1% TFA) pada laju alir 80 μL/menit. Dalam kondisi elusi optimal, nomor pelat teoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) adalah 20.000 ± 100 (200.000 pelat/m²). Tabel 3 memberikan nilai N untuk tiga kolom PMP dan kromatogram ditunjukkan pada Gambar 5 A. Analisis cepat pada kolom PMP pada laju alir tinggi (700 μL/menit), lima peptida dielusi dalam satu menit, nilai N sangat baik, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), Sesuai dengan 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tiga kolom berukuran identik (100 × 1,8 mm id) dikemas dengan tiga lot fase diam PMP yang berbeda untuk periksa reproduktifitas. Konsentrasi analit untuk setiap kolom dicatat menggunakan kondisi elusi optimal dan jumlah pelat teoritis N dan waktu retensi untuk memisahkan campuran uji yang sama pada setiap kolom. Data reproduktifitas untuk kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 4. Reproduksibilitas kolom PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Pemisahan campuran peptida pada kolom PMP (B) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (A);fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (100 × 1,8 mm id);analitik Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (leucine) asam enkephalin)).
Kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dievaluasi untuk pemisahan tryptic digest albumin serum manusia dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatogram pada Gambar 6 menunjukkan bahwa sampel dipisahkan dengan baik dan resolusinya sangat baik. Digest HSA dianalisis menggunakan laju aliran 100 µL/menit, fase gerak 70/30 asetonitril/air dan 0,1% TFA. Seperti ditunjukkan pada kromatogram (Gambar 6), H Pencernaan SA telah dipecah menjadi 17 puncak yang sesuai dengan 17 peptida. Efisiensi pemisahan setiap puncak dalam pencernaan HSA dihitung dan nilainya diberikan pada Tabel 5.
Intisari tryptic dari HSA (100 × 1,8 mm id) dipisahkan pada kolom PMP;laju alir (100 µL/menit), fase gerak 60/40 asetonitril/air dengan TFA 0,1%.
di mana L adalah panjang kolom, η adalah viskositas fase gerak, ΔP adalah tekanan balik kolom, dan u adalah kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP adalah 2,5 × 10-14 m2, laju alir 25 μL/menit, dan 60/40 v/v ACN/air digunakan. Permeabilitas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) serupa dengan penelitian kami sebelumnya Ref.34. Permeabilitas kolom yang dikemas dengan partikel berpori superfisial adalah: 1,7 × 10-15 untuk partikel 1,3 μm, 3,1 × 10-15 untuk partikel 1,7 μm, 5,2 × 10-15 dan 2,5 × 10-14 m2 untuk partikel 2,6 μm Untuk partikel 5 μm 43.Oleh karena itu, permeabilitas fase PMP mirip dengan partikel inti-cangkang 5 μm.
dimana Wx adalah berat kolom yang dikemas dengan kloroform, Wy adalah berat kolom yang dikemas dengan metanol, dan ρ adalah densitas pelarut. Densitas metanol (ρ = 0,7866) dan kloroform (ρ = 1,484). Porositas total kolom SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 dan kolom C18-Urea 31 yang sebelumnya kita pelajari adalah 0 0,63 dan 0,55, masing-masing. Ini berarti bahwa keberadaan ligan urea mengurangi permeabilitas fase diam. Di sisi lain, porositas total kolom PMP (100 × 1,8 mm id) adalah 0,60. Permeabilitas kolom PMP lebih rendah daripada kolom yang dikemas dengan partikel silika terikat C18 karena pada fase diam tipe C18 ligan C18 melekat pada partikel silika sebagai rantai linier, sedangkan dalam polistilat fase diam tipe rene, lapisan polimer A yang relatif tebal terbentuk di sekitarnya. Dalam percobaan tipikal, porositas kolom dihitung sebagai:
Gambar 7A,B menunjukkan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) menggunakan kondisi elusi yang sama (yaitu, 60/40 ACN/H2O dan 0,1% TFA).) dari plot van Deemter.Campuran peptida terpilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) disiapkan dalam 20 µL/ Laju aliran minimum untuk kedua kolom adalah 800 µL/mnt. Nilai HETP minimum pada laju aliran optimal (80 µL/mnt) untuk kolom PMP dan Ascentis Express RP- Kolom amida masing-masing adalah 2,6 µm dan 3,9 µm. Nilai HETP menunjukkan bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) jauh lebih baik daripada kolom RP-Amide Ascentis Express yang tersedia secara komersial (100 × 1,8 mm id). Plot van Deemter pada Gambar. 7 (A) menunjukkan bahwa penurunan nilai N dengan peningkatan aliran tidak signifikan dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Kolom MP (100 × 1,8 mm id) dibandingkan dengan kolom RP-Amida Ascentis Express didasarkan pada peningkatan bentuk partikel, ukuran, dan prosedur pengepakan kolom kompleks yang digunakan dalam pekerjaan saat ini34.
(A) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) diperoleh dengan menggunakan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.(B) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) diperoleh dengan menggunakan kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.
Fase diam polistiren tertanam polar disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida sintetik dan trypsin digest albumin serum manusia (HAS) dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP untuk campuran peptida sangat baik dalam efisiensi dan resolusi pemisahan. Peningkatan kinerja pemisahan kolom PMP disebabkan oleh berbagai alasan, seperti ukuran partikel dan ukuran pori partikel silika, sintesis terkontrol dari fase diam, dan pengepakan kolom kompleks. Selain efisiensi pemisahan yang tinggi, kolom yang rendah tekanan balik pada laju aliran tinggi adalah keuntungan lain dari fase diam ini. Kolom PMP menunjukkan reproduktifitas yang baik dan dapat digunakan untuk analisis campuran peptida dan pencernaan trypsin dari berbagai protein. Kami bermaksud menggunakan kolom ini untuk pemisahan produk alami, senyawa bioaktif dari tanaman obat dan ekstrak jamur dalam kromatografi cair. Ke depan, kolom PMP juga akan dievaluasi untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penelitian tentang Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fase Terbalik Bagian I: Pengembangan Protokol Karakterisasi Kolom.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peningkatan peptida aktif yang dirancang untuk pengobatan penyakit menular. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: sains dan pasar.penemuan obat.15 (1-2) hari ini, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cair Proteomik Tingkat Lanjut.J.Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Spektrometri massa kromatografi cair tingkat lanjut memungkinkan penggabungan metabolomik dan proteomik bertarget luas.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan obat.J.September Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis dari kromatografi cair tekanan sangat tinggi untuk pemisahan cepat.J.September Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penerapan kromatografi cair kinerja sangat tinggi dalam pengembangan obat.J.Kromatografi.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik dibuat dari emulsi fase internal tinggi minyak dalam air untuk pemurnian enterovirus yang efisien. Kimia.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik.J.Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Tren yang muncul dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik dari peptida dan protein terapeutik: teori dan aplikasi.J.Farmasi.Ilmu Biomedis.anus.69, 27-9 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC menggunakan nilai pH yang berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.J.September Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Karakteristik perpindahan massa dan kinerja kinetik kolom kromatografi efisiensi tinggi yang dikemas dengan C18 sub-2 μm partikel berpori penuh dan superfisial diselidiki. J.September Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tren terbaru dan tantangan analitik dalam isolasi, identifikasi, dan validasi peptida bioaktif tanaman.anus.biologis anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Lanskap proteomik kerajaan kehidupan. Alam 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Pemrosesan hilir peptida terapeutik dengan kromatografi cair preparatif.Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan penerapannya pada biopolimer.J.Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligan untuk kromatografi protein mode campuran: prinsip, karakterisasi, dan desain.J.Bioteknologi.144(1), 3-11 (2009).