Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan rangkaian tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus.
Partikel silika berpori disiapkan dengan metode sol-gel dengan beberapa modifikasi untuk memperoleh partikel berpori lebar. Partikel-partikel ini diderivatisasi dengan N-fenilmaleimida-metilvinil isocyanate (PMI) dan stirena melalui polimerisasi reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) untuk menghasilkan poliamida tersisipkan N-fenilmaleimida. Fase stasioner stirena (PMP). Kolom baja tahan karat lubang sempit (diameter dalam 100 × 1,8 mm) dikemas dengan pengepakan bubur. Kinerja kromatografi kolom PMP dievaluasi untuk memisahkan campuran peptida sintetis yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, asam amino Leu enkephalin) dan triptik hidrolisat serum albumin manusia (HAS). Dalam kondisi elusi yang optimal, jumlah teoritis pelat dengan campuran peptida mencapai 280.000 pelat/m2. Dengan membandingkan kinerja pemisahan kolom yang dikembangkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide komersial, diamati bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP lebih unggul daripada kolom komersial dalam hal efisiensi pemisahan dan resolusi.
Industri biofarmasi telah menjadi pasar global yang berkembang dengan peningkatan pangsa pasar yang signifikan dalam beberapa tahun terakhir. Dengan pertumbuhan industri biofarmasi yang eksplosif1,2,3 terdapat kebutuhan yang besar untuk analisis peptida dan protein. Selain peptida target, berbagai pengotor terbentuk selama sintesis peptida, sehingga pemurnian kromatografi diperlukan untuk mendapatkan kemurnian peptida yang diinginkan. Analisis dan karakterisasi protein dalam cairan tubuh, jaringan, dan sel merupakan tugas yang sangat menantang karena banyaknya spesies yang berpotensi terdeteksi yang ada dalam satu sampel. Meskipun spektrometri massa merupakan alat yang efektif untuk mengurutkan peptida dan protein, jika sampel tersebut langsung dimasukkan ke dalam spektrometer massa, pemisahannya tidak akan memuaskan. Masalah ini dapat dipecahkan dengan melakukan kromatografi cair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangi jumlah analit yang memasuki spektrometer massa pada waktu tertentu4,5,6. Selain itu, analit dapat terkonsentrasi di wilayah yang sempit selama pemisahan fase cair, sehingga analit tersebut terkonsentrasi dan sensitivitas deteksi MS meningkat. Kromatografi cair (LC) telah berkembang pesat selama dekade terakhir dan telah menjadi metode yang banyak digunakan untuk analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) digunakan secara luas untuk memurnikan dan memisahkan campuran peptida menggunakan silika yang dimodifikasi oktadesil (ODS) sebagai fase stasioner11,12,13. Namun, karena strukturnya yang kompleks dan sifat amfoteriknya,14,15 fase stasioner RP tidak dapat memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan. Oleh karena itu, analisis peptida dan protein dengan fragmen polar dan non-polar memerlukan fase stasioner yang dirancang khusus untuk berinteraksi dan menahan analit ini16. Kromatografi campuran, yang menawarkan interaksi multimoda, dapat menjadi alternatif RP-LC untuk memisahkan peptida, protein, dan campuran kompleks lainnya. Beberapa fase stasioner tipe campuran disiapkan dan kolom yang diisi dengan fase stasioner ini digunakan untuk memisahkan peptida dan protein17,18,19,20,21. Karena adanya gugus polar dan non-polar, fase stasioner mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocok untuk pemisahan peptida dan protein22,23,24,25,26,27,28. Fase stasioner interkalasi polar dengan gugus polar yang terikat secara kovalen menunjukkan kemampuan pemisahan yang baik dan selektivitas unik untuk analit polar dan non-polar karena pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fase stasioner Interaksi multimoda 29,30,31,32. Baru-baru ini, Zhang et al. 30 memperoleh fase stasioner berujung behenil dari poliamina dan berhasil memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, dan beberapa analit lainnya. Bahan stasioner tertanam polar memiliki gugus polar dan non-polar, sehingga dapat digunakan untuk memisahkan peptida dan protein menjadi bagian hidrofobik dan hidrofilik. Kolom polar inline (misalnya, kolom C18 dengan amida inline) tersedia dengan nama dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tetapi kolom ini hanya digunakan untuk analisis amina 33.
Dalam penelitian saat ini, fase stasioner penanaman polar (N-fenilmaleimida, penanaman polistirena) disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan peptida dan pembelahan tripsin HSA. Strategi berikut digunakan untuk menyiapkan fase stasioner. Partikel silika berpori disiapkan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan dalam publikasi kami sebelumnya, dengan beberapa perubahan dalam skema persiapan 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS dan asam asetat berair disesuaikan untuk mendapatkan partikel silika dengan ukuran pori yang besar. Kedua, ligan fenilmaleimida-metilvinil isocyanate baru disintesis dan partikel silika derivatnya digunakan untuk menyiapkan fase stasioner penanaman polar. Fase stasioner yang diperoleh dikemas ke dalam kolom baja tahan karat (diameter dalam 100 × 1,8 mm) sesuai dengan skema pengemasan yang dioptimalkan. Pengemasan kolom dibantu oleh getaran mekanis untuk memastikan lapisan yang seragam di dalam kolom. Kolom yang dikemas dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptida leusin-enkephalin) dan hidrolisat triptik dari albumin serum manusia (HSA). Diamati bahwa campuran peptida dan pencernaan triptik HSA dipisahkan dengan resolusi dan efisiensi yang baik. Efisiensi pemisahan kolom PMP dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Diamati bahwa peptida dan protein memiliki resolusi yang baik dan efisiensi pemisahan yang tinggi pada kolom PMP, dan efisiensi pemisahan kolom PMP lebih tinggi daripada kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), urea, asam asetat, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilana (TMCS), tripsin, albumin serum manusia (HSA), amonium klorida, urea, heksametilmetakriloildisilazana (HMDS), metakriloil klorida (MC), stirena, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksida (BPO), asetonitril (ACN) untuk HPLC, metanol, 2-propanol, dan aseton. Perusahaan Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, AS).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g) dan 8 ml asam asetat 0,01 N diaduk selama 10 menit, dan 24 ml TMOS ditambahkan ke dalamnya dengan pendinginan es. Campuran reaksi dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam dan kemudian pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf baja tahan karat. Air dituang dan residu dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Blok lunak yang kering digiling halus dan dikalsinasi dalam oven pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga kelompok disiapkan dan dikarakterisasi untuk menguji reproduktifitas ukuran partikel, ukuran pori, dan luas permukaan.
Kelompok polar dan fase stasioner untuk rantai polistirena. Prosedur persiapan dijelaskan di bawah ini.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutkan dalam toluena anhidrat, kemudian 0,1 ml 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkan ke dalam labu reaksi untuk memperoleh kopolimer fenilmaleimida dan metil vinil isosianat (PMCP). Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40°C selama 3 jam.
Partikel silika kering (2 g) didispersikan dalam toluena kering (100 ml), diaduk, dan disonikasi selama 10 menit dalam labu alas bulat 500 ml. PMCP (10 mg) dilarutkan dalam toluena dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu reaksi melalui corong adisi. Campuran tersebut direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, disaring, dicuci dengan aseton, dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, partikel silika yang diasosiasikan dengan PMCP (100 g) dilarutkan dalam toluena (200 ml), dan 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) ditambahkan ke dalamnya dengan adanya 100 μl dibutiltin dilaurat sebagai katalis. Campuran tersebut diaduk pada suhu 50°C selama 8 jam, disaring, dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 ml), benzoil peroksida BPO (0,5 ml) dan partikel silika yang melekat pada TEMPO-PMCP (1,5 g) didispersikan dalam toluena dan dibersihkan dengan nitrogen. Polimerisasi stirena dilakukan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang dihasilkan dicuci dengan metanol dan dikeringkan semalaman pada suhu 60°C. Skema umum reaksi ditunjukkan pada gambar satu.
Sampel didegaskan pada 393 K selama 1 jam hingga tekanan sisa kurang dari 10–3 Torr diperoleh. Jumlah N2 yang diserap pada tekanan relatif P/P0 = 0,99 digunakan untuk menentukan volume pori total. Morfologi partikel silika murni dan terikat ligan diperiksa menggunakan mikroskop elektron pemindaian (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel kering (partikel silika murni dan silika terikat ligan) ditempatkan pada batang aluminium menggunakan pita karbon. Emas diendapkan pada sampel menggunakan perangkat sputtering Q150T, dan lapisan Au setebal 5 nm diendapkan pada sampel. Ini meningkatkan efisiensi proses tegangan rendah dan memberikan penyemprotan dingin yang halus. Analisis unsur dilakukan menggunakan penganalisis komposisi unsur Thermo Electron (Waltham, MA, AS) Flash EA1112. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, Inggris) Mastersizer 2000 digunakan untuk mendapatkan distribusi ukuran partikel. Partikel silika yang tidak dilapisi dan partikel silika yang terikat ligan (masing-masing 5 mg) didispersikan dalam 5 ml isopropanol, disonikasi selama 10 menit, diaduk selama 5 menit, dan diletakkan pada meja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilakukan pada kecepatan 5 °C per menit dalam kisaran suhu dari 30 hingga 800 °C.
Kolom baja tahan karat lubang sempit berlapis serat kaca dengan dimensi (ID 100 × 1,8 mm) dikemas dengan metode pengisian bubur mengikuti prosedur yang sama seperti pada referensi 31. Kolom baja tahan karat (berlapis kaca, ID 100 × 1,8 mm) dan saluran keluar yang berisi frit 1 µm dihubungkan ke mesin pengemas bubur (Alltech Deerfield, IL, AS). Siapkan suspensi fase stasioner dengan menangguhkan 150 mg fase stasioner dalam 1,2 ml metanol dan memasukkannya ke dalam kolom reservoir. Metanol digunakan sebagai pelarut bubur dan pelarut kontrol. Kemas kolom dengan menerapkan urutan tekanan 100 MP selama 10 menit, 80 MP selama 15 menit, dan 60 MP selama 30 menit. Proses pengemasan menggunakan dua vibrator kolom kromatografi gas (Alltech, Deerfield, IL, AS) untuk getaran mekanis guna memastikan pengemasan kolom yang seragam. Tutup pengemas bubur dan lepaskan tekanan secara perlahan untuk mencegah kerusakan pada tali. Kolom dilepaskan dari nosel bubur dan alat penyambung lainnya dipasang ke saluran masuk dan dihubungkan ke sistem LC untuk menguji operasinya.
MLC kustom dibuat menggunakan pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), sampler dengan loop injeksi 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), degasser membran (Shimadzu DGU-14A), dan jendela kapiler UV-VIS. Perangkat detektor (UV-2075) dan mikrokolom berenamel. Gunakan tabung penghubung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimalkan efek ekspansi kolom tambahan. Setelah mengisi kolom, pasang kapiler (50 µm id 365) di outlet sambungan reduksi 1/16″ dan pasang kapiler (50 µm) dari sambungan reduksi. Pengumpulan data dan pemrosesan kromatogram dilakukan menggunakan perangkat lunak Multichro 2000. Pada 254 nm, absorbansi UV dari analit subjek dipantau pada 0. Data kromatografi dianalisis menggunakan OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin serum manusia, bubuk beku-kering, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) dan 0,2 M amonium bikarbonat (1 ml). Larutan diaduk selama 10 menit dan disimpan dalam penangas air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian didinginkan dengan 1 ml TFA 0,1%. Saring larutan dan simpan di bawah suhu 4°C.
Pemisahan campuran peptida dan HSA pencernaan tripsin pada kolom PMP dievaluasi secara terpisah. Periksa hidrolisis tripsin dari campuran peptida dan HSA yang dipisahkan oleh kolom PMP dan bandingkan hasilnya dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Jumlah pelat teoritis dihitung menggunakan persamaan berikut:
Gambar SEM partikel silika murni dan partikel silika yang terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar SEM partikel silika murni (A, B) menunjukkan bentuk bola di mana partikel memanjang atau memiliki simetri tidak teratur dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Permukaan partikel silika yang terikat oleh ligan (C, D) lebih halus daripada partikel silika murni, yang mungkin disebabkan oleh rantai polistirena yang menutupi permukaan partikel silika.
Pemindaian mikrograf elektron dari partikel silika murni (A, B) dan partikel silika terikat ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 2.3(A). Kurva distribusi ukuran partikel volumetrik menunjukkan bahwa ukuran partikel silika meningkat setelah modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel silika dari penelitian saat ini dan penelitian sebelumnya dibandingkan dalam Tabel 1(A). Ukuran partikel volumetrik d(0,5) dari PMP adalah 3,36 µm, dibandingkan dengan nilai ad(0,5) sebesar 3,05 µm dalam penelitian kami sebelumnya (partikel silika terikat polistirena)34. Karena perubahan rasio PEG, urea, TMOS dan asam asetat dalam campuran reaksi, distribusi ukuran partikel batch ini lebih sempit dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Ukuran partikel fase PMP sedikit lebih besar daripada fase partikel silika terikat polistirena yang kami pelajari sebelumnya. Artinya, fungsionalisasi permukaan partikel silika dengan stirena hanya menyimpan lapisan polistirena (0,97 µm) pada permukaan silika, sedangkan pada fase PMP ketebalan lapisannya adalah 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) dan distribusi ukuran pori (B) partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan.
Ukuran pori, volume pori, dan luas permukaan partikel silika yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1 (B). Profil PSD partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(B). Hasilnya sebanding dengan penelitian kami sebelumnya34. Ukuran pori partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan masing-masing adalah 310 Å dan 241 Å, yang menunjukkan bahwa setelah modifikasi kimia, ukuran pori berkurang sebesar 69 Å, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 (B), dan kurva pergeseran ditunjukkan pada Gambar 3(B). Luas permukaan spesifik partikel silika dalam penelitian saat ini adalah 116 m2/g, yang sebanding dengan penelitian kami sebelumnya (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika setelah modifikasi kimia juga menurun dari 116 m2/g menjadi 105 m2/g.
Hasil analisis unsur fase stasioner disajikan dalam Tabel. 2. Kandungan karbon fase stasioner saat ini adalah 6,35%, yang lebih rendah daripada penelitian kami sebelumnya (partikel silika yang terkait dengan polistirena, masing-masing 7,93%35 dan 10,21%)42. Kandungan karbon fase stasioner saat ini di bawah ini, karena beberapa ligan polar seperti fenilmaleimida metil vinil isosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO telah digunakan sebagai tambahan stirena dalam pembuatan SP. Persentase berat nitrogen dalam fase stasioner saat ini adalah 2,21% dibandingkan dengan 0,1735 dan 0,85% dalam penelitian sebelumnya42. Ini berarti bahwa fase stasioner saat ini memiliki persentase berat nitrogen yang tinggi karena fenilmaleimida. Demikian pula, produk (4) dan (5) memiliki kandungan karbon masing-masing sebesar 2,7% dan 2,9%, sedangkan produk akhir (6) memiliki kandungan karbon sebesar 6,35%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Analisis termogravimetri (TGA) digunakan pada fase stasioner PMP untuk menguji kehilangan berat, dan kurva TGA ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva TGA menunjukkan kehilangan berat sebesar 8,6%, yang sesuai dengan kandungan karbon (6,35%), karena ligan tidak hanya mengandung C, tetapi juga N, O dan H.
Ligand fenilmaleimida-metilvinil isocyanate dipilih untuk memodifikasi permukaan partikel silika karena gugus fenilmaleimida dan vinilisosianatnya bersifat polar. Gugus vinil isocyanate selanjutnya dapat bereaksi dengan stirena melalui polimerisasi radikal hidup. Alasan kedua adalah untuk menyisipkan gugus yang memiliki interaksi sedang dengan analit dan tidak ada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fase stasioner, karena gugus fenilmaleimida tidak memiliki muatan virtual pada pH normal. Polaritas fase stasioner dapat dikontrol oleh jumlah stirena yang optimal dan waktu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah terakhir reaksi (polimerisasi radikal bebas) sangat penting karena mengubah polaritas fase stasioner. Analisis unsur dilakukan untuk memeriksa kandungan karbon dalam fase stasioner ini. Telah diamati bahwa peningkatan jumlah stirena dan waktu reaksi meningkatkan kandungan karbon fase stasioner dan sebaliknya. SP yang disiapkan dengan konsentrasi stirena yang berbeda memiliki beban karbon yang berbeda. Demikian pula, fase stasioner ini ditempatkan pada kolom baja tahan karat dan karakteristik kromatografinya (selektivitas, resolusi, nilai N, dll.) diperiksa. Berdasarkan percobaan ini, komposisi yang dioptimalkan untuk persiapan fase stasioner PMP dipilih untuk memberikan polaritas yang terkendali dan retensi analit yang baik.
Kolom PMP juga dievaluasi untuk analisis lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) menggunakan kapasitas fase gerak 60/40 (v/v) ACN/air (0,1% TFA) pada laju alir 80 µl/menit. Dalam kondisi elusi optimal (200.000 pelat/m), jumlah pelat teoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm) adalah 20.000 ± 100. Nilai N untuk tiga kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 3 dan kromatogram ditunjukkan pada Gambar 5A. Analisis cepat pada laju alir tinggi (700 µl/menit) pada kolom PMP, lima peptida dielusi dalam waktu satu menit, nilai N yang sangat baik sebesar 13.500 ± 330 per kolom (diameter 100 x 1,8 mm), setara dengan 135.000 pelat/m (Gbr. 5B). Tiga kolom dengan ukuran yang sama (diameter dalam 100 x 1,8 mm) diisi dengan tiga kelompok fase stasioner PMP yang berbeda untuk menguji reproduktifitas. Analit dicatat untuk setiap kolom dengan memisahkan campuran uji yang sama pada setiap kolom menggunakan kondisi elusi yang optimal, jumlah pelat teoritis N, dan waktu retensi. Data reproduktifitas untuk kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 4. Reproduktifitas kolom PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Pemisahan campuran peptida pada kolom PMP (B) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (A), fase mobil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (id 100 x 1,8 mm), analisis Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (asam leukat enkefalin).
Kolom PMP (diameter dalam 100 x 1,8 mm) dievaluasi untuk pemisahan hidrolisat tripsin dari albumin serum manusia dengan HPLC. Kromatogram pada Gambar 6 menunjukkan bahwa sampel dipisahkan dengan baik dengan resolusi yang sangat baik. Larutan HSA dianalisis menggunakan laju alir 100 μl/menit, fase gerak 70/30 asetonitril/air dan 0,1% TFA. Pembelahan HSA dibagi menjadi 17 puncak, seperti yang ditunjukkan pada kromatogram (Gbr. 6), yang sesuai dengan 17 peptida. Efisiensi pemisahan masing-masing puncak dari hidrolisat HSA dihitung dan nilainya ditunjukkan pada Tabel 5.
Hidrolisat tripsin HSA dipisahkan pada kolom PMP (diameter dalam 100 x 1,8 mm), laju alir (100 μl/menit), fase gerak 60/40 asetonitril/air, dan 0,1% TFA.
di mana L adalah panjang kolom, η adalah viskositas fase mobil, ΔP adalah tekanan balik kolom, dan u adalah kecepatan linier fase mobil. Permeabilitas kolom PMP adalah 2,5 × 10–14 m2, laju alir adalah 25 µl/menit, digunakan 60/40 v/v. ACN/air. Permeabilitas kolom PMP (ID 100 × 1,8 mm) mirip dengan studi Ref.34 kami sebelumnya. Permeabilitas kolom yang diisi dengan partikel berpori superfisial adalah 1,7×10 ,6 µm, 2,5×10-14 m2 untuk partikel 5 µm43. Oleh karena itu, permeabilitas fase PMP mirip dengan permeabilitas partikel inti-kulit dengan ukuran 5 μm.
di mana Wx adalah massa kolom yang diisi dengan kloroform, Wy adalah massa kolom yang diisi dengan metanol, dan ρ adalah densitas pelarut. Densitas metanol (ρ = 0,7866) dan kloroform (ρ = 1,484). Total porositas kolom partikel silika-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 dan kolom C18-urea31 yang kami pelajari sebelumnya masing-masing adalah 0,63 dan 0,55. Ini berarti bahwa keberadaan ligan urea mengurangi permeabilitas fase stasioner. Di sisi lain, total porositas kolom PMP (diameter dalam 100 × 1,8 mm) adalah 0,60. Kolom PMP kurang permeabel dibandingkan kolom yang diisi dengan partikel silika terikat C18 karena pada fase stasioner tipe C18, ligan C18 terikat pada partikel silika dalam rantai linier, sedangkan pada fase stasioner tipe polistirena, polimer yang relatif tebal terbentuk di sekitar partikel. lapisan A. Dalam percobaan umum, porositas kolom dihitung sebagai berikut:
Pada gambar 7A, B menunjukkan plot Van Deemter untuk kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dalam kondisi elusi yang sama, 60/40 ACN/H2O dan 0,1% TFA 20 µl/menit hingga 800 µl/menit pada kedua kolom. Nilai HETP minimum pada laju alir optimal (80 µl/menit) masing-masing adalah 2,6 µm dan 3,9 µm untuk kolom PMP dan kolom Ascentis Express RP-Amide. Nilai HETP menunjukkan bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) jauh lebih tinggi daripada kolom Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (id 100 x 1,8 mm). Grafik van Deemter pada Gambar 7(A) menunjukkan bahwa penurunan nilai N tidak lebih tinggi secara signifikan dengan peningkatan aliran dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Efisiensi pemisahan kolom PMP yang lebih tinggi (id 100 × 1,8 mm) dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide didasarkan pada bentuk dan ukuran partikel yang lebih baik dan prosedur pengemasan kolom yang canggih yang digunakan dalam penelitian saat ini34.
(A) Plot Van Deemter (HETP vs. kecepatan linier fase gerak) diperoleh pada kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA. (B) Plot Van Deemter (HETP vs. kecepatan linier fase gerak) diperoleh pada kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.
Fase stasioner polar dari polistirena yang disisipkan disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida sintetis dan hidrolisat triptik dari albumin serum manusia (HSA) dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP untuk campuran peptida sangat baik dalam hal efisiensi dan resolusi pemisahan. Peningkatan efisiensi pemisahan kolom PMP disebabkan oleh beberapa alasan seperti ukuran partikel silika dan ukuran pori, sintesis fase stasioner yang terkontrol, dan bahan pengemas kolom yang kompleks. Selain efisiensi pemisahan yang tinggi, keuntungan lain dari fase stasioner ini adalah tekanan balik kolom yang rendah pada laju aliran yang tinggi. Kolom PMP sangat dapat direproduksi dan dapat digunakan untuk menganalisis campuran peptida dan pencernaan triptik berbagai protein. Kami bermaksud menggunakan kolom ini untuk pemisahan senyawa bioaktif dari produk alami, ekstrak tanaman obat dan jamur dalam kromatografi cair. Di masa mendatang, kolom PMP juga akan dievaluasi untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakterisasi kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakterisasi kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Investigasi Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fasa Terbalik, Bagian I: Mengembangkan Protokol untuk Karakterisasi Kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakteristik kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakteristik kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Investigasi Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fasa Terbalik, Bagian I: Mengembangkan Protokol untuk Karakterisasi Kolom.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. dkk. Metode untuk menciptakan peptida aktif yang lebih baik untuk pengobatan penyakit menular. Bioteknologi. Prestasi 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: Sains dan pasar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: Sains dan pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Chreschatyski M. Peptida terapeutik sintetik: sains dan pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Khreschatsky M. Peptida terapeutik sintetis: sains dan pasar. penemuan obat. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair proteomik canggih. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair proteomik canggih.Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Komposisi protein tingkat lanjut 液相色谱。Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut.Jurnal Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. dkk. Kromatografi cair-spektrometri massa tingkat lanjut mampu menggabungkan metabolomik dan proteomik berbasis luas. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan obat. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat. Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat.Wu, N. dan Clausen, AM Aspek mendasar dan praktis kromatografi cair tekanan tinggi untuk pemisahan cepat. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspek dasar dan praktis kromatografi cair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat.Wu, N. dan Clausen, AM Aspek mendasar dan praktis kromatografi cair tekanan tinggi untuk pemisahan cepat.Jurnal Sains September. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cair kinerja ultra dalam pengembangan farmasi. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cair kinerja ultra dalam pengembangan farmasi.Ren, SA dan Chelischeff, P. Penggunaan kromatografi cair kinerja ultra tinggi dalam pengembangan farmasi. Gelatik, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA dan Tchelitcheff, P.Ren, SA dan Chelischeff, P. Aplikasi kromatografi cair kinerja ultra dalam pengembangan obat.Jurnal Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. dkk. Hidrogel makropori monolitik yang berasal dari emulsi minyak dalam air dengan fase internal tinggi untuk pemurnian enterovirus 71 yang efisien. Proyek kimia. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik.Jurnal Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S. dan Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik dari peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik dari peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Teknik-teknik lain dalam bidang kesehatan dan komunikasi dengan orang-orang yang bertanggung jawab хроматографии с обращенной фазой: teori dan reproduksi. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik dengan kromatografi cair fase terbalik: teori dan aplikasi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.dan Guillarmé, D. Tren baru dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik dengan kromatografi cair fase terbalik: teori dan aplikasi.Jurnal Farmasi dan Ilmu Biomedis. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan dua dimensi peptida menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan dua dimensi peptida menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan dua dimensi peptida menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan nilai pH yang berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua menggunakan sistem RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. dkk. Investigasi perpindahan massa dan karakteristik kinetik kolom kromatografi kinerja tinggi yang diisi dengan partikel C18 berpori penuh dan berpori dangkal yang lebih kecil dari 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. dkk. Tren terkini dan tantangan analitis dalam isolasi, identifikasi, dan validasi peptida bioaktif tanaman. anus. Makhluk anal. Kimia. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB dkk. Lanskap proteomik kerajaan kehidupan. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Pasca-perlakuan peptida terapeutik dengan kromatografi cair preparatif. Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer.Yang, Yu. dan Geng, X. Kromatografi mode campuran dan penerapannya pada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan penerapannya dalam biopolimer.Yang, Yu. dan Gene, X. Kromatografi mode campuran dan penerapannya pada biopolimer.Jurnal Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).