Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah tanaman polongan yang digunakan untuk produksi makanan dan perbaikan tanah.Ekspansi global NLL sebagai tanaman telah menarik banyak jamur patogen, termasuk antraknosa lupin, yang menyebabkan penyakit antraknosa yang menghancurkan.Dua alel, Lanr1 dan AnMan, yang memberikan peningkatan resistensi, telah digunakan dalam pemuliaan NLL, tetapi mekanisme molekuler yang mendasarinya masih belum diketahui.Dalam penelitian ini, penanda Lanr1 dan AnMan digunakan untuk menyaring sampel NLL Eropa.Pengujian vaksin di lingkungan yang terkendali mengkonfirmasi kemanjuran kedua donor yang resisten.Pembuatan profil ekspresi gen diferensial dilakukan pada galur resisten dan rentan yang representatif.Resistensi antraknosa dikaitkan dengan ekspresi berlebih dari istilah ontologi gen "GO: 0006952 Respons Pertahanan", "GO: 0055114 Proses Redoks", dan "GO: 0015979 Fotosintesis".Selain itu, jalur Lanr1(83A:476) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan dengan cepat setelah inokulasi, sementara jalur lainnya menunjukkan penundaan respons ini sekitar 42 jam.Respons pertahanan dikaitkan dengan gen TIR-NBS, CC-NBS-LRR dan NBS-LRR, 10 protein yang terlibat dalam patogenesis, protein transfer lipid, endoglucan-1,3-β-glukosidase, protein dinding sel yang kaya glisin, dan gen dari jalur reaktif oksigen.Tanggapan awal terhadap 83A:476, termasuk penekanan hati-hati gen yang terkait dengan fotosintesis, bertepatan dengan perlindungan sukses selama fase pertumbuhan vegetatif biologi jamur, menunjukkan bahwa efektor memicu kekebalan.Reaksi Mandeloop diperlambat, seperti hambatan horizontal keseluruhan.
Lupin berdaun sempit (NLL, Lupinus angustifolius L.) adalah sereal protein tinggi yang berasal dari wilayah Mediterania barat1,2.Saat ini ditanam sebagai tanaman pangan untuk hewan dan manusia.Ini juga dianggap pupuk hijau dalam sistem rotasi tanaman karena fiksasi nitrogen oleh bakteri pengikat nitrogen simbiosis dan perbaikan struktur tanah secara keseluruhan.NLL telah mengalami proses domestikasi yang cepat dalam satu abad terakhir dan masih berada di bawah tekanan pemuliaan yang tinggi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Dengan meluasnya penanaman NLL, suksesi jamur patogen mengembangkan ceruk pertanian baru dan menyebabkan penyakit perusak tanaman baru. Yang paling luar biasa bagi petani dan peternak lupin adalah munculnya antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling luar biasa bagi petani dan peternak lupin adalah munculnya antraknosa, yang disebabkan oleh jamur patogen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling menonjol bagi petani dan peternak lupin adalah munculnya antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg , Feiler & Hagedorn13 引起的。Colletotrichum lupini (Bondar)嵵Berambut。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызывае мого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Yang paling mencolok bagi petani dan peternak lupin adalah munculnya antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Laporan penyakit paling awal datang dari Brasil dan Amerika Serikat, dengan gejala khas muncul masing-masing pada tahun 1912 dan 1929.Namun, setelah sekitar 30 tahun, patogen ditetapkan sebagai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., telefon Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph dari Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld dalam Morfologi Target. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .dan H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。dan H. Schlenk, .Fenotipe penyakit awal yang dilakukan pada pertengahan abad ke-20 menunjukkan beberapa resistensi pada aksesi NLL dan lupin kuning (L. luteus L.), tetapi semua aksesi lupin putih (L. albus L.) yang diuji sangat rentan15,16.Studi telah menunjukkan bahwa perkembangan antraknosa dikaitkan dengan peningkatan curah hujan (kelembaban udara) dan suhu (dalam kisaran 12-28°C), yang mengarah ke pelanggaran resistensi pada suhu yang lebih tinggi17, 18. Faktanya, waktu yang dibutuhkan konidia untuk berkecambah dan penyakit mulai muncul adalah empat kali lebih pendek pada suhu 24°C (4 jam) dibandingkan pada suhu 12°C (16 jam) dalam kondisi kelembaban tinggi19.Dengan demikian, pemanasan global yang sedang berlangsung telah menyebabkan penyebaran penyakit antraknosa.Namun, penyakit ini diamati di Prancis (1982) dan Ukraina (1983) sebagai pertanda ancaman yang akan datang, tetapi tampaknya diabaikan oleh industri lupin pada saat itu20,21.Beberapa tahun kemudian, penyakit mematikan ini menyebar ke seluruh dunia dan juga menyerang negara-negara penghasil lupin utama seperti Australia, Polandia, dan Jerman22,23,24.Menyusul wabah antraknosa pada pertengahan 1990-an, skrining ekstensif menghasilkan identifikasi beberapa donor yang resisten dalam sampel NLL19.Resistensi NLL terhadap antraknosa dikendalikan oleh dua alel dominan terpisah yang ditemukan pada sumber plasma nutfah yang berbeda: Lanr1 pada kultivar Tanjil dan Wonga dan AnMan pada kultivar.Mandalay 25, 26. Alel-alel ini melengkapi penanda molekuler yang mendukung seleksi plasma nutfah yang resisten dalam program pemuliaan25,26,27,28,29,30.Galur pemuliaan resisten 83A:476 yang membawa alel Lanr1 disilangkan dengan galur liar yang rentan P27255 untuk mendapatkan populasi RIL yang terpisah untuk resistensi antraknosa, yang memungkinkan untuk menetapkan lokus Lanr1 ke kromosom NLL-1131, 32, 33. Penjajaran penanda peta keterkaitan dari mengapit lokus resistensi ke antraknosa dengan kerangka genomik, NLL mengungkapkan lokasi ketiga alel pada kromosom yang sama (NLL-11), tetapi dalam posisi yang berbeda29,34,35.Namun, karena jumlah RIL yang kecil dan jarak genetik yang besar antara penanda dan alel yang sesuai, tidak ada kesimpulan yang dapat ditarik tentang gen yang mendasarinya.Di sisi lain, penggunaan genetika terbalik pada lupin sulit dilakukan karena potensi regenerasinya yang sangat rendah, yang membuat manipulasi genetik tidak praktis37.
Perkembangan plasma nutfah domestikasi yang membawa alel yang diinginkan dalam keadaan homozigot, seperti 83A:476 (Lanr1) dan Mandelup (AnMan), telah membuka pintu untuk mempelajari resistensi antraknosa dalam menghadapi kehadiran kombinasi alel yang berlawanan dalam populasi liar.Kemungkinan mekanisme molekuler.Bandingkan respons pertahanan yang dihasilkan oleh genotipe tertentu.Studi ini mengevaluasi respon transkriptom awal NLL terhadap vaksinasi C. lupini.Pertama, panel plasma nutfah NLL Eropa yang berisi 215 garis disaring menggunakan penanda molekuler yang menandai alel Lanr1 dan AnMan.Fenotip antraknosa kemudian dilakukan pada 50 garis NLL, yang sebelumnya dipilih untuk penanda molekuler, dalam kondisi yang terkendali.Berdasarkan percobaan ini, empat baris berbeda dalam resistensi antraknosa dan komposisi alel Lanr1 / AnMan dipilih untuk profil ekspresi gen pertahanan diferensial menggunakan dua pendekatan pelengkap: sekuensing RNA throughput tinggi dan kuantifikasi PCR waktu nyata.
Skrining satu set plasma nutfah NLL (N = 215) dengan penanda Lanr1 (Anseq3 dan Anseq4) dan AnMan (Anseq4) dan AnMan (AnManM1) menunjukkan bahwa hanya satu garis (95726, dekat Salamanca-b) yang memperkuat alel “resistensi” untuk semua penanda, sementara “Keberadaan alel 'rentan'” menemukan proporsi semua penanda pada 158 (~73. 5%) baris.Tiga belas baris menghasilkan dua alel "tahan" dari penanda Lanr1, dan 8 baris menghasilkan alel "tahan" Lanr1.penanda.Alel "perlawanan" dari penanda AnMan (Tabel Tambahan S1).Dua garis heterozigot untuk penanda Anseq3 dan satu garis heterozigot untuk penanda AnManM1.42 baris (19,5%) membawa fase berlawanan dari alel Anseq3 dan Anseq4, menunjukkan frekuensi rekombinasi yang tinggi antara kedua lokus ini.Fenotip antraknosa dalam kondisi terkontrol (Tabel Tambahan S2) mengungkapkan variabilitas dalam ketahanan genotipe yang diuji, yang tercermin dalam tingkat keparahan antraknosa.Perbedaan skor rata-rata berkisar antara 1,8 (agak tahan) hingga 6,9 (rentan) dan selisih bobot tanaman berkisar antara 0,62 (rentan) hingga 4,45 g (tahan). Ada korelasi yang signifikan antara nilai yang diamati dalam dua ulangan percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P <0,0001) serta antara kedua parameter ini (− 0,59 dan − 0,77, P <0,0001). Ada korelasi yang signifikan antara nilai yang diamati dalam dua ulangan percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P <0,0001) serta antara kedua parameter ini (− 0,59 dan − 0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях экспериме нта (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Korelasi yang signifikan ditemukan antara nilai yang diamati dalam dua pengulangan percobaan (0,51 untuk skor keparahan penyakit, P = 0,00017 dan 0,61 untuk berat tanaman, P <0,0001), serta antara kedua parameter ini (-0,59 dan -0,77, P <0,0001) 0,0001).dari物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。0,5 1 ， p = 0.00017 ， 植物 为 为 0.61 ， p <0.0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（- 0.59 和– 0.59 和– 0.59和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。 Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оце нка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 dan масса растения 0,61, P <0,0001), dan между этими двумя параметрами (- 0,59 и -0,0001) 0,77, P<0,0001. Ada korelasi yang signifikan antara nilai-nilai yang diamati dalam rangkap (skor keparahan penyakit 0,51, P = 0,00017 dan berat tanaman 0,61, P <0,0001) dan antara kedua parameter ini (-0,59 dan -0 ,0001) 0,77, P<0,0001. ).Gejala khas yang terlihat pada tanaman yang rentan termasuk kinking dan puntiran batang yang menyerupai struktur "busur gembala", diikuti oleh lesi oval dengan sporozoit oranye/merah muda (Tambahan Gambar. 1).Aksesi Australia yang membawa gen Lanr1 (83A:476 dan Tanjil) dan AnMan (Mandelup) cukup tahan, 0,0331 dan 0,0036).Beberapa galur yang juga membawa alel Lanr1 dan/atau AnMan yang “resisten” menunjukkan gejala penyakit.
Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda “tahan” mengungkapkan resistensi antraknosa tingkat tinggi (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P <0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P <0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P <0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Menariknya, beberapa galur NLL yang tidak memiliki alel penanda “tahan” mengungkapkan resistensi antraknosa tingkat tinggi (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P <0,0001 untuk kedua parameter), Bojar (nilai P <0,0001 untuk skor dan 0,001 untuk berat tanaman) dan Populasi B-549/79b (nilai P <0,0001 untuk skor dan tidak signifikan untuk berat). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, показали высоки й уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 atau AnMan), таких ка к Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Menariknya, beberapa garis NLL yang tidak memiliki alel penanda 'tahan' menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi terhadap antraknosa (sebanding atau lebih tinggi daripada genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P <0,0001 untuk kedua parameter ), Bojar (nilai P <0,0001 untuk evaluasi dan 0,001 untuk bobot tanaman) dan populasi B-549/79b (nilai P <0,0001 untuk evaluasi dan tidak signifikan untuk bobot ).NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001 ）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Sangat menarik bahwa beberapa sistem NLL yang tidak memiliki penanda “antigenik” menunjukkan resistensi horizontal yang tinggi (setara dengan gen Lanr1 atau AnMan atau lebih tinggi), seperti Boregine (kedua parameter P <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, bobot tanaman 0,001) dan strain B-549/79b (nilai P <0,0001, bobot tidak signifikan). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 atau AnMan), такие как Boregine (значение P для о боих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) dan популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,00 01, масса незначительна). Menariknya, beberapa garis NLL yang tidak memiliki alel penanda 'ketahanan' menunjukkan tingkat resistensi antraknosa yang tinggi (sebanding dengan atau lebih tinggi dari genotipe Lanr1 atau AnMan), seperti Boregine (nilai P untuk kedua parameter <0,0001), Bojar (nilai P <0,0001, berat tanaman 0,001) dan populasi B-549/79b (nilai P <0,0001, berat tidak signifikan).Fenomena ini menunjukkan kemungkinan sumber resistensi genetik baru, menjelaskan kurangnya korelasi yang diamati antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit (nilai P dari ~0,42 hingga ~0,98).Dengan demikian, uji Kolmogorov-Smirnov menunjukkan bahwa data resistensi antraknosa kira-kira terdistribusi secara normal untuk skor (nilai-P 0,25 dan 0,11) dan massa tanaman (nilai-P 0,47 dan 0,55), menyarankan saya berhipotesis bahwa lebih banyak alel daripada Lanr1 dan AnMan yang terlibat.
Berdasarkan hasil skrining resistensi antraknosa, dipilih 4 galur untuk analisis transkriptom: 83A:476, Boregine, Mandelup, dan Populasi 22660. Galur-galur ini diuji ulang untuk ketahanan antraks dalam percobaan inokulasi dengan pengurutan RNA, asalkan sama dengan pengujian sebelumnya.Nilai skor adalah sebagai berikut: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) dan populasi 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 mencapai rata-rata 40,5 pasangan Mread per sampel (29,7 hingga 54,4 Mread) (Tabel Tambahan S3).Skor keselarasan dalam urutan referensi berkisar antara 75,5% hingga 88,6%.Korelasi rata-rata data jumlah baca antara varian eksperimental antara ulangan biologis berkisar antara 0,812 hingga 0,997 (rata-rata 0,959). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak mengungkapkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak mengungkapkan ekspresi, dan 4785 gen lainnya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировалис ь на незначительном уровне (базовое среднее <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak menunjukkan ekspresi, dan 4785 gen sisanya diekspresikan pada tingkat yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽略不计（基本平均值<5）。35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имели незначительну ю экспрессию (базовое среднее значение <5). Dari 35.170 gen yang dianalisis, 2917 tidak diekspresikan dan 4785 gen yang tersisa memiliki ekspresi yang dapat diabaikan (rata-rata dasar <5).Dengan demikian, jumlah gen yang dianggap diekspresikan (rata-rata dasar ≥ 5) selama percobaan adalah 27.468 (78,1%) (Tabel Tambahan S4).
Dari titik waktu pertama, semua garis NLL menanggapi inokulasi C. lupini (strain Col-08) dengan memprogram ulang transkriptom (Tabel 1), namun, perbedaan yang signifikan diamati antara garis.Dengan demikian, garis resistensi 83A: 476 (membawa gen Lanr1) menunjukkan pemrograman ulang transkriptom yang signifikan pada titik waktu pertama (6 hpi) dengan peningkatan 31-69 kali lipat dalam jumlah gen naik dan turun yang terisolasi dibandingkan dengan titik waktu lain pada titik waktu ini.Selain itu, puncak ini berumur pendek, karena ekspresi hanya beberapa gen tetap berubah secara signifikan pada titik waktu kedua (12 hpi).Menariknya, Boregine, yang juga menunjukkan tingkat resistensi yang tinggi dalam uji cangkok, tidak mengalami pemrograman ulang transkripsional yang masif selama percobaan.Namun, jumlah gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) adalah sama untuk Boregine dan 83A:476 pada 12 HPI.Baik Mandelup dan populasi 22660 menunjukkan puncak DEG pada titik waktu terakhir (48 l/dtk), menunjukkan penundaan relatif dalam respons pertahanan.
Karena 83A:476 menjalani pemrograman ulang transkriptom besar-besaran sebagai respons terhadap C. lupini pada 6 HPI dibandingkan dengan semua lini lainnya, ~91% dari DEG yang diamati pada titik waktu ini spesifik garis keturunan (Gbr. 1).Namun, ada beberapa tumpang tindih dalam tanggapan awal antara garis studi, seperti 68,5%, 50,9%, dan 52,6% DEG di Boregine, Mandelup, dan populasi 22660, masing-masing, tumpang tindih dengan yang ditemukan di 83A:476 pada titik waktu tertentu.Namun, DEG ini hanya menyumbang sebagian kecil (0,97–1,70%) dari semua DEG yang saat ini terdeteksi menggunakan 83A:476.Selain itu, 11 DEG dari semua lini koheren saat ini (Tabel Tambahan S4-S6), termasuk komponen umum respons pertahanan tanaman: protein transfer lipid (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glukosida (TanjilG_23384), dua protein yang dapat diinduksi stres seperti SAM22 (TanjilG_31528 dan TanjilG_31531), protein lateks dasar ( TanjilG_32352), dan dua protein dinding sel struktural kaya glisin (TanjilG_19701 dan TanjilG_19702).Ada juga tumpang tindih yang relatif tinggi dalam respons transkriptom antara 83A:476 dan Boregine pada 24 HPI (total 16-38% DEG) dan antara Mandelup dan Populasi 22660 pada 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagram Venn menunjukkan jumlah gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG) dalam garis lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan Colletotrichum lupini (strain Col-08 diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, 1999).Garis NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan) dan populasi 22660 (sangat rentan).Singkatan hpi berarti berjam-jam setelah vaksinasi.Nilai nol telah dihilangkan untuk menyederhanakan grafik.
Kumpulan gen yang diekspresikan berlebih pada 6 hpi dianalisis untuk keberadaan domain gen R kanonik (Tambahan Tabel S7).Studi ini mengungkapkan induksi transkriptome gen resistensi penyakit klasik dengan domain NBS-LRR hanya pada 83A:476.Set ini terdiri dari satu gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), lima gen CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, dan tanjilg_16162), dan Empat NBS-LR, Tanjilg_16162), dan Empat NBS-LRRE (tanjilg_16162) sebagai serta Empat NBS-Lrr (tanjilg_16162) dan Empat NBS-LRR (TANJILG_16162).Semua gen ini memiliki domain kanonik yang diatur dalam urutan yang dilestarikan.Selain gen domain NBS-LRR, beberapa kinase RLL diaktifkan pada 6 hpi, yaitu satu di Boregine (TanjilG_19877), dua di Mandelup (TanjilG_07141 dan TanjilG_19877) dan di populasi 22660 (TanjilG_09014 dan TanjilG_10361) dan dua di 83A 27:476.
Gen dengan ekspresi yang berubah secara signifikan sebagai respons terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) menjadi sasaran analisis pengayaan Gene Ontology (GO) (Tambahan Tabel S8). Istilah proses biologis yang paling sering terwakili adalah "respons pertahanan GO: 0006952" yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (garis waktu ×) dengan signifikansi tinggi (nilai P <0,001) (Gbr. 2). Istilah proses biologis yang paling sering terwakili adalah "respons pertahanan GO: 0006952" yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (garis waktu ×) dengan signifikansi tinggi (nilai P <0,001) (Gbr. 2). Anda harus membuka tab ini untuk membuka tab «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся dalam 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) ( рис.2). Istilah proses biologis yang paling sering direpresentasikan adalah 'GO:0006952 respon pertahanan', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (waktu × garis keturunan) dengan signifikansi tinggi (nilai P <0,001) (Gbr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Istilah proses biologis yang paling representatif adalah "respon pertahanan GO:0006952", yang muncul dalam 6 dari 16 (时间×线) kombinasi, dengan signifikansi tinggi (nilai P <0,001) (图2) . Anda dapat membuka tab umum dengan kotak «GO: 0006952 Respons Pertahanan», seperti появлялся dalam 6 из 16 комбинаций (время × линия) dengan высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Istilah proses biologis yang paling sering direpresentasikan adalah 'GO:0006952 Respons Pertahanan', yang muncul dalam 6 dari 16 kombinasi (garis waktu ×) dengan signifikansi tinggi (nilai P <0,001) (Gbr. 2).Istilah ini terwakili secara berlebihan pada dua titik waktu di 83A: 476 dan Boregine (6 dan 24 hpi) dan pada satu titik waktu di Mandelup dan Population 22660 (masing-masing 12 dan 6 hpi).Ini adalah hasil yang diharapkan, menyoroti respon antijamur dari galur yang resisten.Selain itu, 83A:476 merespons C. lupini dengan menginduksi gen secara cepat terkait dengan ledakan oksidatif yang diwakili oleh istilah "proses redoks GO:0055114", yang menunjukkan respons pertahanan spesifik, sementara Boregine mengungkapkan respons pertahanan spesifik, terkait dengan istilah 'GO'.: 0006950 Tanggapan stres”.Populasi 22660 mengaktifkan respons resistansi horizontal yang melibatkan metabolit sekunder, menyoroti terlalu banyak istilah "GO: 0016104 Proses biosintesis triterpen" dan "GO: 0006722 Proses metabolisme triterpen" (kedua istilah termasuk dalam kumpulan gen yang sama ), dengan mempertimbangkan hasil analisis pengayaan istilah GO, stabilitas reaksi Mandelup adalah antara Boregine dan Populasi 22660. Selain itu, reaksi awal 83A:47 6 (6 hpi) dan reaksi tertunda Mandelup and Population 22660 menyertakan istilah GO:0015979 'fotosintesis' dan proses biologis terkait lainnya.
Istilah ontologi gen bioproses yang dipilih dalam anotasi gen yang diekspresikan secara berbeda selama respons transkriptom dari lupin berdaun sempit (NLL) yang diinokulasi dengan antraks lupin (strain Col-08 diperoleh dari bidang lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) sangat dibesar-besarkan.Garis NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (resisten, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (resisten, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot) dan populasi 22660 (rentan).
Karena penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi gen yang berkontribusi terhadap resistensi antraknosa, gen yang ditugaskan untuk istilah GO "GO: 0006952 Respon defensif" dan "proses redoks GO: 0055114" dianalisis dengan cut-off karena baseline berarti ≥ 30 dengan setidaknya satu garis.× titik waktu menggabungkan nilai log2 yang signifikan secara statistik (perubahan lipat).Jumlah gen yang memenuhi kriteria ini adalah 65 untuk GO:0006952 dan 524 untuk GO:0055114.
83A: 476 mengungkapkan dua puncak DEG yang dianotasi dengan istilah GO: 0006952, yang pertama pada 6 gen per inci (64 gen, regulasi naik dan turun) dan yang kedua pada 24 gen per inci (15 gen, hanya regulasi naik).Boregine juga menunjukkan bahwa GO:0006952 memuncak pada titik waktu yang sama, tetapi dengan DEG yang lebih rendah (11 dan 8) dan aktivasi preferensial.Mandeloop menunjukkan dua puncak GO:0006952 pada 12 dan 48 HPI, keduanya membawa 12 gen (yang pertama dengan gen pengaktif, dan yang kedua hanya dengan gen penekan), sedangkan populasi 22660 pada 6 HPI (13 gen) memiliki dominasi peningkatan puncak yang lebih besar.peraturan.Perlu dicatat bahwa 96,4% GO:0006952 DEG di puncak ini memiliki jenis respons yang sama (naik atau turun), menunjukkan tumpang tindih yang signifikan dalam respons pertahanan meskipun ada perbedaan dalam jumlah gen yang terlibat.Kelompok sekuens terbesar yang terkait dengan istilah GO: 0006952 mengkodekan Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (mirip SAM22), yang termasuk dalam protein terkait patogenesis kelas 10 (PR-10) protein clade dan lateks protein inti.protein serupa (mirip MLP)) protein (Gbr. 3).Kedua kelompok berbeda dalam sifat ekspresi dan arah respon.Gen yang mengkode protein mirip SAM22 menunjukkan induksi yang konsisten dan signifikan pada titik waktu awal (6 atau 12 hpi) dan umumnya tidak responsif pada akhir percobaan (48 hpi), sedangkan protein mirip MLP menunjukkan koordinasi pada 6 hpi.hpi.83A:476 dan Mandelup pada 48 hp/in, hampir semua titik data lainnya tidak responsif.Selain itu, perbedaan dalam profil ekspresi gen protein mirip SAM22 mengikuti variabilitas yang diamati dalam resistensi antraknosa, karena lebih banyak garis resisten memiliki lebih banyak titik waktu yang secara signifikan menginduksi gen ini daripada gen yang lebih rentan.Gen PR-10 mirip LlR18A/B lainnya menunjukkan pola ekspresi yang sangat mirip dengan gen protein mirip SAM22.
Komponen utama dari istilah proses biologis "GO: 0006952 Respons Pertahanan" dan pola ekspresi gen kandidat alel Lanr1 dan AnMan diidentifikasi.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi palsu) pada titik waktu yang sama.Garis lupin daun sempit berikut dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Selain itu, profil ekspresi gen kandidat RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) dan AnMan (TanjilG_12861) dievaluasi (Gbr. 3).Gen TanjilG_05042 menunjukkan respons (aktivasi) yang signifikan pada 83A:476 hanya pada titik waktu pertama (6 hpi), sedangkan TanjilG_12861 signifikan pada Mandeloop hanya pada dua titik waktu: 6 hpi (regulasi turun) dan 24 hpi (6 hpi).Dengan.).disesuaikan) ).
Gen yang paling banyak diekspresikan dalam istilah "proses redoks" GO:0055114 adalah gen yang mengkode protein sitokrom P450 dan peroksidase (Gbr. 4).Untuk sampel yang diisolasi dari 83A:476 pada 6 HPI, nilai maksimum atau minimum log2 (perubahan lipat) (untuk 86,6% gen) umumnya diamati antara tanaman yang diinokulasi dan tanaman kontrol, menyoroti respons tinggi genotipe ini terhadap inokulasi seks.83A:476 menunjukkan GO paling signifikan: 0055114 DEG pada 6 hpi (503 gen), sedangkan baris lainnya pada 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; dan Populasi 22660, 78 gen)).Di sebagian besar gen keluarga GO:0055114, dua jenis respons terhadap vaksinasi (aktivasi dan penghambatan) diamati.Menariknya, hingga 97,6% dari DEG yang diidentifikasi untuk istilah GO: 0055114 di Mandelupe pada 48 hp Pengamatan ini menunjukkan bahwa, meskipun skalanya jauh lebih kecil (yaitu, jumlah gen redoks yang bermutasi, 85 berbanding 503), pola respons transkriptom yang tertunda dari mandeloup ke antraknosa serupa dengan respons awal 83A:476.Di Boregine dan Populasi 22660, konvergensi ini lebih rendah masing-masing sebesar 51,6% dan 75,6%.
Pola ekspresi komponen utama istilah proses biologis "GO:0055114 Proses redoks" terungkap.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi palsu) pada titik waktu yang sama.Garis lupin daun sempit berikut dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
83A:476 Tanggapan transkriptomik terhadap inokulasi dengan C. lupini (strain Col-08) juga termasuk pembungkaman gen terkoordinasi yang dikaitkan dengan istilah GO:0015979 "fotosintesis" dan proses biologis terkait lainnya (Gbr. 5).Set GO:0015979 DEG ini berisi 105 gen yang ditekan secara signifikan pada 6 hpi pada 83A:476.Dalam subset ini, 37 gen juga diturunkan dalam Mandelup pada 48 HPI dan 35 pada titik waktu yang sama pada populasi 22660, termasuk 19 DEG yang umum untuk kedua genotipe.Tidak ada DEG yang terkait dengan istilah GO: 0015979 yang diaktifkan secara signifikan dalam kombinasi apa pun (baris x waktu).
Pola ekspresi komponen utama istilah proses biologis “GO:0015979 Fotosintesis” terungkap.Skala Log2 mewakili nilai log2 (perubahan lipat) antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin, Wizhenica, Polandia, 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi palsu) pada titik waktu yang sama.Garis lupin daun sempit berikut dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), Mandelup (resisten sedang, membawa alel AnMan homozigot), dan Populasi 22660 (rentan).
Berdasarkan hasil analisis ekspresi diferensial dan mungkin terlibat dalam respons pertahanan terhadap jamur patogen, kumpulan tujuh gen ini dipilih untuk kuantifikasi profil ekspresi dengan PCR waktu-nyata (Tambahan Tabel S9).
Gen protein diduga TanjilG_10657 diinduksi secara signifikan di semua jalur dan titik waktu yang dipelajari dibandingkan dengan tanaman kontrol (meniru) (Tabel Tambahan S10, S11).Selain itu, profil ekspresi TanjilG_10657 menunjukkan tren peningkatan selama percobaan untuk semua lini.Populasi 22660 menunjukkan sensitivitas TanjilG_10657 tertinggi terhadap inokulasi dengan aktivasi 114 kali lipat dan tingkat ekspresi relatif tertinggi (4,4 ± 0,4) pada 24 HPI (Gbr. 6a).Gen protein PR10 LlR18A TanjilG_27015 juga menunjukkan aktivasi di semua lini dan titik waktu, dengan signifikansi statistik di sebagian besar titik data (Gbr. 6b).Mirip dengan TanjilG_10657, tingkat ekspresi relatif TanjilG_27015 tertinggi diamati pada 22660 populasi yang diinokulasi pada 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen asam endochitinase TanjilG_04706 diregulasi secara signifikan di semua lini dan di semua titik waktu kecuali untuk Boregine 6 hpi (Gbr. 6c).Itu sangat diinduksi pada titik waktu pertama (6 HPI) di 83A:476 (sebesar 10,5 kali) dan cukup meningkat di jalur lain (sebesar 6,6-7,5 kali).Selama percobaan, ekspresi TanjilG_04706 tetap pada level yang sama pada 83A:476 dan Boregine, sedangkan pada Mandelup dan Populasi 22660 meningkat secara signifikan, mencapai nilai yang relatif tinggi (masing-masing 5,9 ± 1,5 dan 6,2 ± 1,5).Gen seperti endoglukan-1,3-β-glukosidase TanjilG_23384 menunjukkan aktivasi tinggi pada dua titik waktu pertama (6 dan 12 hpi) di semua lini kecuali populasi 22660 (Gbr. 6d).Level ekspresi relatif tertinggi TanjilG_23384 diamati pada titik waktu kedua (12 hpi) di Mandelup (2,7 ± 0,3) dan 83A:476 (1,5 ± 0,1).Pada 24 HPI, ekspresi TanjilG_23384 relatif rendah di semua galur yang diteliti (dari 0,04 ± 0,009 menjadi 0,44 ± 0,12).
Profil ekspresi gen terpilih (ag) diungkapkan oleh PCR kuantitatif.Angka 6, 12 dan 24 mewakili jam setelah vaksinasi.Gen LanDExH7 dan LanTUB6 digunakan untuk normalisasi dan LanTUB6 digunakan untuk kalibrasi antar seri.Bilah kesalahan mewakili standar deviasi berdasarkan tiga ulangan biologis, yang masing-masing merupakan rata-rata dari tiga ulangan teknis. Signifikansi statistik dari perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari bidang lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi tiruan) ditandai di atas titik data (* Nilai P < 0, 05, ** nilai P ≤ 0, 01, nilai *** P ≤ 0, 001). Signifikansi statistik dari perbedaan tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari bidang lupin di Wierzenica, Polandia) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi tiruan) ditandai di atas titik data (* Nilai P < 0, 05, ** nilai P ≤ 0, 01, nilai *** P ≤ 0, 001). Статистическая значимость различий di уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, получен в 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениям и отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Perbedaan yang signifikan secara statistik dalam tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh pada tahun 1999 dari bidang lupin di Wierzhenice, Polandia) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi palsu) dicatat di atas titik data (* nilai P <0,05, ** nilai P ≤ 0,01, *** nilai P ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， warna-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 （接种 植物 之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, по лученный с полей люпина в Верженице, Польша, pada 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растени ями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Perbedaan yang signifikan secara statistik dalam tingkat ekspresi antara tanaman yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin di Verzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan tanaman kontrol (yang diinokulasi palsu) dicatat di atas titik data (* Nilai P < 0,05 , ** Nilai P ≤ 0,01, *** Nilai P ≤ 0,001).Garis NLL yang dianalisis adalah: 83A:476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui) dan populasi 22660 (rentan).
Kandidat gen TanjilG_05042 di lokus Lanr1 menunjukkan pola ekspresi yang sangat berbeda dari profil yang diperoleh dari studi RNA-seq (Gbr. 6e).Aktivasi yang signifikan dari gen ini diamati pada Mandelup dan populasi 22660 (masing-masing hingga 39,7 dan 11,7 kali), menghasilkan tingkat ekspresi yang relatif tinggi (masing-masing hingga 1,4 ± 0,14 dan 7,2 ± 1,3).83A:476 juga mengungkapkan beberapa peningkatan regulasi gen TanjilG_05042 (hingga 3,8 kali lipat), namun, tingkat ekspresi relatif yang dicapai (0,044 ± 0,002) lebih dari 30 kali lipat lebih rendah daripada yang diamati pada populasi Mandelup dan 22660.dianalisis oleh qPCR menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam tingkat ekspresi antara genotipe dalam varian tiruan (kontrol), mencapai perbedaan 58 kali lipat antara populasi 22660 dan 83A:476, serta antara populasi 22660 dan 22660. Perbedaan dua kali lipat dicapai antara Boregine dan Mandalup.
Gen kandidat di lokus AnMan, TanjilG_12861, diaktifkan sebagai respons terhadap vaksinasi pada 83A:476 dan Mandelup, netral pada populasi 22660, dan diregulasi ke bawah dalam Boregine (Gbr. 6f).Ekspresi relatif gen TanjilG_12861 paling tinggi pada inokulasi 83A:476 (0,14±0,01).Gen protein kejut panas kelas I 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 menunjukkan tingkat ekspresi relatif yang lebih rendah pada semua galur dan titik waktu yang dipelajari (Gbr. 6g).Nilai tertinggi diamati pada 24 HPI pada 22660 populasi (0,14 ± 0,02, peningkatan delapan kali lipat dalam menanggapi vaksinasi).
Perbandingan profil ekspresi gen (Gbr. 7) mengungkapkan korelasi tinggi antara TanjilG_10657 dan empat gen lainnya: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80), dan TanjilG_04706 (r = 0,79).Hasil tersebut dapat menunjukkan pengaturan bersama gen-gen ini selama respons pertahanan.Gen TanjilG_12861 dan TanjilG_23384 menunjukkan profil ekspresi yang berbeda dengan nilai koefisien korelasi Pearson yang lebih rendah (masing-masing dari 0,08 menjadi 0,43 dan -0,19 menjadi 0,28) dibandingkan dengan gen lainnya.
Korelasi antara profil ekspresi gen dideteksi menggunakan PCR kuantitatif.Garis lupin daun sempit berikut dianalisis: 83A: 476 (tahan, membawa alel Lanr1 homozigot), Mandelup (cukup tahan, membawa alel AnMan homozigot), Boregine (tahan, latar belakang genetik tidak diketahui), dan Populasi 22660 (rentan).Tiga titik waktu dihitung (6, 12 dan 24 jam setelah inokulasi), termasuk yang diinokulasi (Colletotrichum lupini, strain Col-08, diperoleh dari ladang lupin di Wierzhenice, Polandia, pada tahun 1999) dan tanaman kontrol (diinokulasi palsu).Skala menunjukkan nilai koefisien korelasi Pearson.
Berdasarkan data yang diperoleh pada 6 tenaga kuda per inci, WGCNA dilakukan pada 9981 DEG yang diidentifikasi dengan membandingkan tanaman yang diinokulasi dan kontrol untuk fokus pada respons pertahanan awal (Tambahan Tabel S12).Dua puluh dua modul gen (cluster) ditemukan dengan profil ekspresi berkorelasi (positif atau negatif) antara genotipe dan varian eksperimental. Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (в обоих вариантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun dalam urutan 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populasi 22660 的 顺序 下降 （， 在 种 中 ， 这 种 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однако в обоих вариантах эта т енденция была сильнее у контрольных растений). Rata-rata, tingkat ekspresi gen menurun pada seri 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populasi 22660 (namun, pada kedua varian, tren ini lebih kuat pada tanaman kontrol).Vaksinasi menghasilkan upregulasi ekspresi gen, terutama pada modul 18, 19, 14, 6 dan 1 (dalam urutan efek menurun), regulasi negatif (misalnya modul 9 dan 20) atau dengan efek netral (misalnya modul 11, 22, 8 dan 13).Analisis pengayaan istilah GO (Tambahan Tabel S13) mengungkapkan "GO: 0006952 Respons pelindung" untuk modul yang diinokulasi (18) dengan aktivasi maksimum, termasuk gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015), serta banyak Inokulasi modul fotosintesis yang paling ditekan (9).Konsentrator modul 18 (Gbr. 8) diidentifikasi sebagai gen TanjilG_26536 yang mengkode protein LlR18B mirip PR-10, dan konsentrator modul 9 diidentifikasi sebagai gen TanjilG_28955 yang mengkode protein fotosistem II PsbQ.Kandidat gen resistensi antraknosa Lanr1, TanjilG_05042, ditemukan dalam modul 22 (Gbr. 9) dan dikaitkan dengan istilah "GO:0044260 proses metabolisme makromolekul seluler" dan "GO:0006355 Regulasi transkripsi, templating DNA" yang membawa hub TanjilG_01212.gen mengkode faktor transkripsi stres panas A-4a (HSFA4a).
Analisis jaringan berbobot dari koekspresi gen modul dengan istilah proses biologis yang terlalu terwakili "GO: 0006952 Respons pertahanan".Ligasi disederhanakan untuk menyoroti empat gen yang dianalisis oleh qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 dan TanjilG_27015).
Analisis jaringan tertimbang dari koekspresi gen modul dengan istilah proses biologis yang terlalu terwakili "GO: 0006355: Regulasi transkripsional, templating DNA" dan membawa kandidat gen resistensi antraknosa Lanr1 TanjilG_05042.Ligasi disederhanakan untuk mengisolasi gen TanjilG_05042 dan gen TanjilG_01212 pusat.
Penapisan resistensi antraknosa yang dikumpulkan di Australia menunjukkan bahwa sebagian besar kultivar yang dirilis awal rentan;Kalya, Coromup dan Mandelup digambarkan cukup tahan, sementara Wonga, Tanjil dan 83A:476 digambarkan sangat tahan26,27,31.memiliki alel resistansi yang sama, yang disebut Lanr1, dan Coromup dan Mandelup memiliki alel yang berbeda, yang disebut AnMan10, 26, 39, sementara Kalya meneruskan alel yang berbeda., Lanr2.Skrining untuk resistensi antraknosa di Jerman menghasilkan identifikasi garis resisten Bo7212 dengan kandidat alel selain Lanr1, yang ditunjuk LanrBo36.
Studi kami mengungkapkan frekuensi yang sangat rendah (sekitar 6%) dari alel Lanr1 dalam plasma nutfah yang diuji.Pengamatan ini konsisten dengan hasil skrining plasma nutfah Eropa Timur menggunakan marka Anseq3 dan Anseq4, yang menunjukkan bahwa alel Lanr1 hanya terdapat pada dua galur Belarusia.Hal ini menunjukkan bahwa alel Lanr1 belum banyak digunakan oleh program pemuliaan lokal, tidak seperti di Australia, di mana alel tersebut merupakan salah satu alel kunci untuk pemuliaan berbantuan penanda.Ini mungkin karena tingkat resistensi yang lebih rendah yang diberikan oleh alel Lanr1 dalam kondisi lapangan Eropa dibandingkan dengan laporan Australia.Selain itu, studi tentang antraknosa di daerah dengan curah hujan tinggi di Australia telah menunjukkan bahwa respons resistensi yang dimediasi oleh alel Lanr1 mungkin tidak efektif dalam kondisi cuaca yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan cepat dari patogen19,42.Faktanya, dalam penelitian ini, beberapa gejala antraknosa juga diamati pada genotipe yang membawa alel Lanr1, yang menunjukkan bahwa resistensi dapat hilang dalam kondisi optimal untuk perkembangan C. lupini.Selain itu, interpretasi positif palsu dari keberadaan penanda Anseq3 dan Anseq4, yang berjarak sekitar 1 cM dari lokus Lanr1, dimungkinkan 28,30,43 .
Studi kami menunjukkan bahwa 83A:476, yang membawa alel Lanr1, menanggapi inokulasi C. lupini dengan pemrograman ulang transkriptom skala besar pada titik waktu analisis pertama (6 hpi), sedangkan di Mandelup, yang membawa alel AnMan, respons transkriptomik diamati lama kemudian.(dari 24 hingga 48 hp).Variasi temporal dalam respons pertahanan ini dikaitkan dengan perbedaan gejala penyakit, menyoroti pentingnya pengenalan patogen dini untuk respons yang sukses terhadap resistensi.Untuk menginfeksi jaringan tanaman, spora antraks harus melalui beberapa tahap perkembangan pada permukaan inang, termasuk perkecambahan, pembelahan sel, dan pembentukan apresorium.Pelengkap adalah struktur infektif yang melekat pada permukaan inang dan memfasilitasi penetrasi ke dalam jaringan inang.Dengan demikian, spora C. gloeosporioides dalam ekstrak kacang menunjukkan pembelahan inti pertama setelah inkubasi 75-90 menit, pembentukan tabung kuman setelah 90-120 menit, dan penekanan setelah 4 jam 45 .Mangga C. gloeosporioides menunjukkan lebih dari 40% perkecambahan konidia setelah 3 jam inkubasi dan sekitar 20% pembentukan apresor setelah 4 jam.Gen CAP20 terkait virulensi dari C. gloeosporioides menunjukkan aktivitas transkripsi dalam konidia pembentuk epifit setelah 3,5 jam inkubasi dalam lilin permukaan alpukat dengan konsentrasi tinggi protein CAP20 setelah 4 jam 46 menit.Demikian pula, aktivitas gen biosintesis melanin pada C. trifolii diinduksi selama 2 jam inkubasi diikuti dengan pembentukan apresorium setelah 1 jam.Studi jaringan daun menunjukkan bahwa stroberi yang diinokulasi dengan C. acutatum mengalami penekanan pertama pada 8 hpi, sedangkan tomat yang diinokulasi dengan C. coccodes mengalami penekanan pertama pada 4 hpi48,49.sebagian besar konsisten dengan skala waktu Colletotrichum spp.proses menular.Respons pertahanan yang cepat terhadap 83A:476 menunjukkan keterlibatan gen resistansi tanaman dan imunitas yang dipicu efektor (ETI) dalam garis ini, sementara respons tertunda Mandelup mendukung hipotesis 50 yang dipicu pola molekuler terkait molekul (MTI). Respons awal terhadap 83A: 476 dan Mandelup.Tumpang tindih sebagian antara gen yang diregulasi naik atau turun dalam respons tertunda juga mendukung konsep ini, karena ETI sering dianggap sebagai respons MTI yang dipercepat dan ditingkatkan yang berpuncak pada kematian sel terprogram di tempat infeksi, yang dikenal sebagai syok anafilaktik 51,52 .
Sebagian besar gen yang dikaitkan dengan istilah Gene Ontology GO: 0006952 "Respon Pertahanan" adalah 11 homolog dari pesan puasa 22 protein yang diinduksi stres (mirip dengan SAM22) dan tujuh protein lateks utama (MLP).-seperti protein 31, 34, 43 dan 423 menunjukkan kesamaan urutan.Gen mirip SAM22 menunjukkan aktivasi signifikan yang bertahan lebih lama, menunjukkan peningkatan tingkat resistensi antraknosa (83A:476 dan Boregine).Namun, gen mirip MLP diturunkan regulasinya hanya pada garis yang membawa kandidat alel resistensi (83A:476/Lanr1 pada 6 hpi dan Mandelup/AnMan pada 24 hpi).Perlu dicatat bahwa semua homolog mirip SAM22 yang teridentifikasi berasal dari kluster gen yang membentang sekitar 105 kb, sedangkan gen mirip MLP berasal dari daerah genom yang terpisah.Aktivasi terkoordinasi dari gen mirip SAM22 juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya tentang resistensi NLL terhadap inokulasi Diaporthetoxica, menunjukkan bahwa mereka terlibat dalam komponen horizontal dari respons pertahanan.Kesimpulan ini juga didukung oleh laporan respon positif gen mirip SAM22 terhadap cedera atau pengobatan dengan asam salisilat, penginduksi jamur, atau hidrogen peroksida.
Gen mirip MLP telah terbukti merespons berbagai cekaman abiotik dan biotik, termasuk infeksi bakteri, virus, dan jamur patogen pada banyak spesies tanaman55.Arah respon terhadap interaksi tertentu antara tanaman dan patogen berkisar dari peningkatan yang kuat (yaitu, selama infestasi kapas dengan Verticillium dahliae) hingga penurunan yang signifikan (yaitu, setelah infeksi pohon apel dengan Alternaria spp.)56,57.Downregulasi yang signifikan dari gen 423 seperti MLP telah diamati selama pertahanan alpukat terhadap infeksi F. niger dan selama infeksi pohon apel Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola dan Alternaria alternata adalah patotipe apel58,59.Selain itu, kalus apel yang mengekspresi gen 423 mirip MLP memiliki ekspresi gen terkait resistensi yang lebih rendah dan lebih rentan terhadap infeksi jamur59.Mengikuti Fusarium oxysporum f, gen 423 mirip MLP juga ditekan dalam plasma nutfah kacang biasa yang resisten.cn.Infeksi kacang 60.
Anggota lain dari keluarga PR-10 yang diidentifikasi dalam studi RNA-seq kami adalah gen LlR18A dan LlR18B sebagai respons terhadap peningkatan regulasi, serta gen yang diregulasi (1 gen) atau diturunkan (3 gen) untuk protein transfer lipid DIR1..Selain itu, WGCNA menyoroti gen LlR18B sebagai hub dalam modul ini, yang sangat rentan terhadap vaksinasi dan membawa beberapa gen respons protektif.Gen LlR18A dan LlR18B diinduksi pada daun lupin kuning sebagai respons terhadap bakteri patogen, serta pada batang NLL setelah inokulasi D. toxica, sedangkan homolog beras dari gen ini, RSOsPR10, dengan cepat diinduksi oleh infeksi jamur yang mungkin terlibat dalam jalur pensinyalan asam jasmonat53,61, 62. Gen DIR1 mengkodekan protein transpor lipid nonspesifik yang diperlukan untuk timbulnya resistensi yang didapat secara sistemik (SAR).Dengan berkembangnya reaksi protektif, protein DIR1 diangkut dari fokus infeksi melalui floem untuk menginduksi SAR pada organ jauh.Menariknya, gen TanjilG_02313 DIR1 diinduksi secara signifikan pada titik waktu pertama pada baris 84A:476 dan Populasi 22660, tetapi resistensi antraknosa berhasil dikembangkan hanya pada baris 84A:476.Ini mungkin menunjukkan beberapa subfungsionalisasi gen DIR1 di NLL, karena tiga homolog yang tersisa menanggapi inokulasi hanya pada garis 83A:476 pada 6 hpi, dan tanggapan ini diarahkan ke bawah.
Dalam penelitian kami, komponen paling umum yang berhubungan dengan proses biologis yang disebut "GO:0055114 proses redoks" adalah protein sitokrom P450, peroksidase, asam linoleat 9S-/13S-lipoksigenase, dan asam oksidase 1-aminosiklopropana-1-karboksilat.Selain itu, WGCNA kami mendefinisikan homolog HSFA4a sebagai hub yang membawa modul seperti kandidat gen resistensi Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a adalah komponen dari regulasi transkripsi nuklir yang bergantung pada redoks pada tumbuhan.
Protein sitokrom P450 adalah oksidoreduktase yang mengkatalisasi NADPH dan/atau reaksi hidroksilasi yang bergantung pada O2 dalam metabolisme primer dan sekunder, termasuk metabolisme xenobiotik, serta hormon, asam lemak, sterol, komponen dinding sel, biopolimer, dan biosintesis senyawa pelindung. 7 karena sejumlah besar homolog yang berubah (37) dan perbedaan pola respons antara gen tertentu, yang mencerminkan revisi ke atas..Menggunakan hanya data RNA-seq untuk menjelaskan fungsi biologis yang diduga dari gen NLL dalam superfamili protein sebesar itu akan sangat spekulatif.Namun, perlu dicatat bahwa beberapa gen sitokrom P450 dikaitkan dengan peningkatan resistensi terhadap jamur atau bakteri patogen, termasuk kontribusi terhadap reaksi alergi69,70,71.
Peroksidase Kelas III adalah enzim tanaman multifungsi yang terlibat dalam berbagai proses metabolisme selama pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta sebagai respons terhadap cekaman lingkungan seperti salinitas, kekeringan, intensitas cahaya tinggi, dan serangan patogen72.Peroksidase terlibat dalam interaksi beberapa spesies tumbuhan dengan Anthracis, termasuk Stylosanthes humilis dan C. gloeosporioides, Lens culinaris dan C. truncatum, Phaseolus vulgaris dan C. lindemuthianum, Cucumis sativus dan C. lagenarium73,74,75,76.Responnya sangat cepat, kadang-kadang bahkan pada 4 HPI, sebelum jamur menembus jaringan tanaman73.Gen peroksidase juga merespon inokulasi D. toxica NLL.Selain fungsinya yang khas untuk mengatur ledakan oksidatif atau menghilangkan stres oksidatif, peroksidase dapat mengganggu pertumbuhan patogen dengan menciptakan penghalang fisik berdasarkan penguatan dinding sel selama lignifikasi, subunit atau ikatan silang senyawa tertentu.Fungsi ini dapat dikaitkan secara in silico dengan gen TanjilG_03329 yang mengkode anion peroksidase pembentuk lignin yang diduga diregulasi secara signifikan dalam penelitian kami pada garis resisten 83A:476 pada 6 HPI, tetapi tidak pada galur lain dan titik waktu yang tidak merespons.
9S-/13S-lipoksigenase dari asam linoleat merupakan langkah pertama dalam jalur oksidatif biosintesis lipid78.Produk dari jalur ini memiliki banyak fungsi dalam pertahanan tanaman, termasuk penguatan dinding sel melalui pembentukan endapan kalus dan pektin, dan pengaturan stres oksidatif melalui produksi spesies oksigen reaktif79,80,81,82,83.Dalam penelitian ini, ekspresi asam linoleat 9S-/13S-lipoksigenase diubah pada semua galur, tetapi pada populasi yang rentan 22660, upregulasi berlaku pada titik waktu yang berbeda, sementara pada galur yang membawa alel Lanr1 dan AnMan yang resisten, ini menekankan diversifikasi lapisan oksilipin dalam reaksi antraks pelindung antara genotipe ini.
Homolog 1-aminosiklopropana-1-karboksilat oksidase (ACO) secara signifikan diregulasi (9 gen) atau diturunkan (2 gen) ketika diinokulasi dengan lupin.Dengan dua pengecualian, semua respons ini terjadi pada 6 hp.pada 83A:476.Reaksi enzimatik yang dimediasi oleh protein ACO merupakan langkah pembatas laju dalam produksi etilen dan karena itu sangat diatur84.Ethylene adalah hormon tanaman yang memainkan berbagai peran dalam mengatur perkembangan tanaman dan respon terhadap kondisi cekaman abiotik dan biotik.Induksi transkripsi ACO dan aktivasi jalur pensinyalan etilen terlibat dalam peningkatan ketahanan beras terhadap jamur hemibiotropik oryzae oryzae dengan mengatur produksi spesies oksigen reaktif dan fitoaleksin.Proses infeksi daun yang sangat mirip ditemukan antara M. oryzae dan C. lupini88,89, dengan latar belakang peningkatan signifikan homolog ACO dalam garis 83A: 476 yang dilaporkan dalam penelitian ini, menggeser kemungkinan memberikan resistensi terhadap NLL anthracnose Ethylene langkah sentral pensinyalan dalam jalur molekuler .
Dalam penelitian ini, penekanan skala besar dari banyak gen yang terkait dengan fotosintesis diamati pada 6 hpi pada 83A:476 dan pada 48 hpi pada populasi Mandeloop dan 22660.Tingkat dan perkembangan perubahan ini sebanding dengan levelnya.Resistensi antraknosa diamati dalam percobaan ini.Baru-baru ini, represi yang kuat dan awal dari transkrip terkait fotosintesis telah dilaporkan dalam beberapa model interaksi tanaman-patogen, termasuk bakteri dan jamur patogen.Tergesa-gesa (dari 2 HPI dalam beberapa interaksi) dan penekanan global gen yang terkait dengan fotosintesis sebagai respons terhadap infeksi dapat memicu kekebalan tanaman berdasarkan penyebaran spesies oksigen reaktif dan interaksinya dengan jalur asam salisilat untuk memediasi reaksi alergi 90,94.
Kesimpulannya, mekanisme respons pertahanan yang diusulkan untuk garis keturunan yang paling resisten (83A:476) mencakup pengenalan patogen secara cepat oleh gen R (mungkin TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) dan pensinyalan etilen dan asam salisilat yang dimediasi oleh respons alergi, diikuti oleh pembentukan SAR jarak jauh.tindakan didukung oleh protein DIR-1.Perlu dicatat bahwa periode biotropik infeksi C. lupini sangat singkat (sekitar 2 hari), diikuti oleh pertumbuhan nekrotik95.Transisi antara tahap-tahap ini dapat dikaitkan dengan nekrosis dan ekspresi protein yang diinduksi etilen yang bertindak sebagai pemicu reaksi hipersensitivitas pada tanaman inang.Oleh karena itu, rentang waktu keberhasilan penangkapan C. lupini pada tahap biotrofik sangat sempit.Pemrograman ulang gen yang terkait dengan redoks dan fotosintesis yang diamati pada 83A:476 pada 6 hpi konsisten dengan perkembangan hifa jamur dan menandakan perkembangan respons perlindungan yang berhasil pada tahap biotrofik.Respons transkriptomik Mandelup dan populasi 22660 mungkin terlalu lambat untuk menangkap jamur sebelum beralih ke pertumbuhan nekrotik, namun, Mandelup mungkin lebih efektif daripada populasi 22660 karena regulasi protein PR-10 yang relatif cepat mendorong resistensi horizontal.
ETI, didorong oleh gen R kanonik, tampaknya menjadi mekanisme umum resistensi kacang terhadap antraknosa.Dengan demikian, dalam model legum Medicago truncatula, ketahanan terhadap antraknosa diberikan oleh gen RCT1, anggota kelas gen tanaman R TIR-NBS-LRR97.Gen ini juga memberikan resistensi antraknosa spektrum luas pada alfalfa ketika dipindahkan ke tanaman yang rentan.Pada buncis biasa (P. vulgaris), lebih dari dua lusin gen resistensi antraknosa telah diidentifikasi hingga saat ini.Beberapa dari gen ini ditemukan di daerah yang tidak memiliki gen R kanonik, namun banyak lainnya terletak di tepi kromosom yang membawa kluster gen NBS-LRR, termasuk TIR-NBS-LRRs99.Studi SSR seluruh genom juga mengkonfirmasi hubungan gen NBS-LRR dengan resistensi antraknosa pada kacang biasa.Gen R kanonik juga ditemukan di wilayah genom yang membawa lokus resistensi antraknosa utama pada lupin putih 101.
Pekerjaan kami menunjukkan bahwa reaksi resistensi langsung, diaktifkan pada tahap awal infeksi tanaman (sebaiknya tidak lebih dari 12 hpi), secara efektif melindungi lupin berdaun sempit dari antraknosa yang disebabkan oleh jamur patogen Collelotrichum lupini.Menggunakan pengurutan throughput tinggi, kami mendemonstrasikan profil ekspresi diferensial dari gen resistensi antraknosa pada tanaman NLL yang dimediasi oleh gen resistensi Lanr1 dan AnMan.Pertahanan yang sukses melibatkan perancangan gen yang hati-hati untuk protein yang terlibat dalam redoks, fotosintesis, dan patogenesis dalam beberapa jam setelah kontak pertama tanaman dengan patogen.Reaksi perlindungan serupa, tetapi tertunda dalam waktu, jauh kurang efektif dalam melindungi tanaman dari penyakit.Resistensi antraks yang dimediasi oleh gen Lanr1 menyerupai respons cepat khas gen R (kekebalan yang dipicu oleh efektor), sedangkan gen AnMan kemungkinan besar memberikan respons horizontal (kekebalan yang dipicu oleh pola molekul terkait mikroba), memberikan tingkat keberlanjutan yang moderat.
Sebanyak 215 galur NLL yang digunakan untuk menapis marka antraknosa terdiri dari 74 galur, 60 galur hasil persilangan atau pembiakan, 5 galur mutan, dan 76 galur liar atau plasma nutfah asli.Garis datang dari 17 negara, terutama dari Polandia (58), Spanyol (47), Jerman (27), Australia (26), Rusia (19), Belarus (7), Italia (5) dan garis lainnya.dari 10 negara.Set ini juga mencakup garis resisten referensi: 83A:476, Tanjil, Wonga yang membawa alel Lanr1, dan Mandelup yang membawa alel AnMan.Garis-garis tersebut diperoleh dari Database Sumber Daya Genetik Lupin Eropa yang dikelola oleh Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polandia (Tabel Tambahan S1).
Tanaman ditanam dalam kondisi terkontrol (fotoperiode 16 jam, suhu 25°C pada siang hari dan 18°C ​​pada malam hari).Dua ulangan biologis dianalisis.DNA diisolasi dari daun berumur tiga minggu menggunakan DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) sesuai protokol.Kualitas dan konsentrasi DNA yang diisolasi dinilai dengan metode spektrofotometri (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Marka AnManM1 yang menandai gen ketahanan antraknosa AnMan (berasal dari cv. Mandelup) dan marka Anseq3 dan Anseq4 yang mengapit gen Lanr1 (berasal dari cv. Tanjil) dianalisis 11,26,28.Homozigot untuk alel resisten dinilai sebagai "1", rentan - sebagai "0", dan heterozigot - sebagai 0,5.
Berdasarkan hasil skrining penanda AnManM1, AnSeq3 dan AnSeq4 dan ketersediaan benih untuk percobaan tindak lanjut akhir, dipilih 50 galur NLL untuk fenotipe resistensi antraknosa.Analisis dilakukan dalam rangkap dua di rumah kaca yang dikendalikan komputer dengan fotoperiode 14 jam dengan kisaran suhu 22°C pada siang hari dan 19°C pada malam hari.Benih digaruk (memotong kulit benih di sisi berlawanan dari embrio dengan pisau tajam) sebelum disemai untuk mencegah dormansi benih karena kulit benih terlalu keras dan untuk memastikan perkecambahan yang seragam.Tanaman ditanam dalam pot (11 × 11 × 21 cm) dengan tanah steril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warsawa, Polandia).Inokulasi dilakukan dengan strain Colletotrichum lupini Col-08, tumbuh pada tahun 1999 dari batang tanaman lupin berdaun sempit yang tumbuh di lapangan di Verzhenitsa, Polandia Besar (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Dapatkan daerah.Isolat dikultur dalam media SNA pada suhu 20°C di bawah cahaya hitam selama 21 hari untuk menginduksi sporulasi.Empat minggu setelah tanam, ketika tanaman telah mencapai tahap 4-6 daun, inokulasi dilakukan dengan penyemprotan suspensi konidia dengan konsentrasi 0,5 x 106 konidia per ml.Setelah inokulasi, tanaman disimpan di tempat gelap selama 24 jam dengan kelembaban sekitar 98% dan suhu 25°C untuk memudahkan perkecambahan konidia dan proses infeksi.Tanaman kemudian ditanam di bawah penyinaran 14 jam pada suhu 22°C siang/19°C malam dan kelembapan 70%.Skor penyakit dibuat 22 hari setelah inokulasi dan berkisar dari 0 (kebal) sampai 9 (sangat rentan) tergantung pada ada tidaknya lesi nekrotik pada batang dan daun.Selain itu, setelah dilakukan skoring, dilakukan penimbangan bobot tanaman.Hubungan antara genotipe penanda dan fenotipe penyakit dihitung sebagai korelasi titik dua urutan (tidak adanya penanda heterozigot dalam rangkaian garis untuk analisis fenotipe resistensi antraknosa).