Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Ada kebutuhan untuk sistem in vitro yang andal yang dapat secara akurat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung untuk pengujian obat.Terbatasnya ketersediaan sistem kultur jaringan jantung manusia telah menyebabkan interpretasi efek obat jantung yang tidak akurat.Di sini, kami telah mengembangkan model kultur jaringan jantung (CTCM) yang secara elektromekanis merangsang irisan jantung dan mengalami peregangan fisiologis selama fase sistolik dan diastolik dari siklus jantung.Setelah 12 hari kultur, pendekatan ini sebagian meningkatkan kelangsungan hidup bagian jantung, tetapi tidak sepenuhnya mempertahankan integritas strukturalnya.Oleh karena itu, setelah penyaringan molekul kecil, kami menemukan bahwa penambahan 100 nM triiodothyronine (T3) dan 1 μM dexamethasone (Dex) ke media kami mempertahankan struktur mikro bagian tersebut selama 12 hari.Dalam kombinasi dengan pengobatan T3/Dex, sistem CTCM mempertahankan profil transkripsional, viabilitas, aktivitas metabolisme, dan integritas struktural pada tingkat yang sama dengan jaringan jantung segar selama 12 hari.Selain itu, peregangan jaringan jantung yang berlebihan dalam kultur menginduksi pensinyalan jantung hipertrofik, memberikan bukti kemampuan CTCM untuk meniru kondisi hipertrofik yang disebabkan oleh peregangan jantung.Kesimpulannya, CTCM dapat memodelkan fisiologi dan patofisiologi jantung dalam kultur dalam jangka waktu yang lama, memungkinkan skrining obat yang andal.
Sebelum penelitian klinis, diperlukan sistem in vitro yang andal yang dapat secara akurat mereproduksi lingkungan fisiologis jantung manusia.Sistem seperti itu harus meniru perubahan regangan mekanis, detak jantung, dan sifat elektrofisiologis.Model hewan biasanya digunakan sebagai platform skrining untuk fisiologi jantung dengan keandalan terbatas dalam merefleksikan efek obat pada jantung manusia1,2.Pada akhirnya, Model Eksperimental Budaya Jaringan Jantung Ideal (CTCM) adalah model yang sangat sensitif dan spesifik untuk berbagai intervensi terapeutik dan farmakologis, secara akurat mereproduksi fisiologi dan patofisiologi jantung manusia3.Tidak adanya sistem seperti itu membatasi penemuan pengobatan baru untuk gagal jantung4,5 dan menyebabkan kardiotoksisitas obat sebagai alasan utama untuk keluar dari pasar6.
Selama dekade terakhir, delapan obat non-kardiovaskular telah ditarik dari penggunaan klinis karena menyebabkan pemanjangan interval QT yang menyebabkan aritmia ventrikel dan kematian mendadak7.Dengan demikian, ada kebutuhan yang meningkat untuk strategi skrining praklinis yang dapat diandalkan untuk menilai kemanjuran dan toksisitas kardiovaskular.Penggunaan baru-baru ini dari kardiomiosit turunan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia (hiPS-CM) dalam skrining obat dan pengujian toksisitas memberikan solusi parsial untuk masalah ini.Namun, sifat hiPS-CMs yang belum matang dan kurangnya kompleksitas multiseluler jaringan jantung merupakan keterbatasan utama dari metode ini.Studi terbaru menunjukkan bahwa keterbatasan ini sebagian dapat diatasi dengan menggunakan hiPS-CM awal untuk membentuk hidrogel jaringan jantung segera setelah timbulnya kontraksi spontan dan secara bertahap meningkatkan rangsangan listrik dari waktu ke waktu.Namun, jaringan mikro hiPS-CM ini tidak memiliki sifat elektrofisiologis dan kontraktil yang matang dari miokardium dewasa.Selain itu, jaringan jantung manusia memiliki struktur yang lebih kompleks, yang terdiri dari campuran heterogen dari berbagai jenis sel, termasuk sel endotel, neuron, dan fibroblas stroma, yang saling berhubungan oleh kumpulan protein matriks ekstraseluler spesifik.Heterogenitas populasi non-kardiomiosit11,12,13 pada jantung mamalia dewasa ini merupakan penghalang utama untuk memodelkan jaringan jantung menggunakan tipe sel individual.Keterbatasan utama ini menekankan pentingnya mengembangkan metode untuk membiakkan jaringan miokard utuh dalam kondisi fisiologis dan patologis.
Bagian jantung manusia yang tipis (300 µm) yang dikulturkan telah terbukti menjadi model yang menjanjikan dari miokardium manusia yang utuh.Metode ini memberikan akses ke sistem multiseluler 3D lengkap yang serupa dengan jaringan jantung manusia.Namun, hingga tahun 2019, penggunaan bagian jantung yang dibiakkan dibatasi oleh kelangsungan hidup biakan yang pendek (24 jam).Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain regangan fisik-mekanis yang kurang, interface air-liquid, dan penggunaan media sederhana yang tidak mendukung kebutuhan jaringan jantung.Pada tahun 2019, beberapa kelompok penelitian menunjukkan bahwa memasukkan faktor mekanis ke dalam sistem kultur jaringan jantung dapat memperpanjang umur kultur, meningkatkan ekspresi jantung, dan meniru patologi jantung.Dua studi elegan 17 dan 18 menunjukkan bahwa pemuatan mekanis uniaksial memiliki efek positif pada fenotip jantung selama kultur.Namun, penelitian ini tidak menggunakan pembebanan fisiko-mekanis tiga dimensi dinamis dari siklus jantung, karena bagian jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik 17 atau pemuatan auksotonik linier 18 .Metode peregangan jaringan ini menghasilkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebih dari gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal.Khususnya, Pitoulis et al.19 mengembangkan rendaman kultur irisan jantung dinamis untuk rekonstruksi siklus jantung menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan.Meskipun sistem ini memungkinkan pemodelan siklus jantung in vitro yang lebih akurat, kompleksitas dan hasil yang rendah dari metode ini membatasi penerapan sistem ini.Laboratorium kami baru-baru ini mengembangkan sistem kultur yang disederhanakan dengan menggunakan stimulasi listrik dan media yang dioptimalkan untuk mempertahankan viabilitas bagian jaringan jantung babi dan manusia hingga 6 hari20,21.
Dalam manuskrip saat ini, kami menggambarkan model kultur jaringan jantung (CTCM) menggunakan bagian jantung babi yang menggabungkan isyarat humoral untuk merekapitulasi fisiologi jantung tiga dimensi dan distensi patofisiologis selama siklus jantung.CTCM ini dapat meningkatkan akurasi prediksi obat pra-klinis ke tingkat yang belum pernah dicapai sebelumnya dengan menyediakan sistem jantung throughput menengah hemat biaya yang meniru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia untuk pengujian obat pra-klinis.
Sinyal mekanik hemodinamik memainkan peran penting dalam mempertahankan fungsi kardiomiosit in vitro 22,23,24.Dalam manuskrip saat ini, kami telah mengembangkan CTCM (Gambar 1a) yang dapat meniru lingkungan jantung orang dewasa dengan menginduksi stimulasi listrik dan mekanik pada frekuensi fisiologis (1,2 Hz, 72 denyut per menit).Untuk menghindari peregangan jaringan yang berlebihan selama diastole, perangkat pencetakan 3D digunakan untuk meningkatkan ukuran jaringan sebesar 25% (Gbr. 1b).Pemacuan listrik yang diinduksi oleh sistem C-PACE diatur waktunya untuk mulai 100 ms sebelum sistol menggunakan sistem akuisisi data untuk mereproduksi siklus jantung sepenuhnya.Sistem kultur jaringan menggunakan aktuator pneumatik yang dapat diprogram (LB Engineering, Jerman) untuk memperluas membran silikon fleksibel secara siklis untuk menyebabkan perluasan irisan jantung di ruang atas.Sistem dihubungkan ke saluran udara eksternal melalui transduser tekanan, yang memungkinkan untuk menyesuaikan tekanan (± 1 mmHg) dan waktu (± 1 ms) secara akurat (Gbr. 1c).
a Pasang bagian jaringan ke cincin penyangga 7 mm, ditunjukkan dengan warna biru, di dalam ruang kultur perangkat.Ruang kultur dipisahkan dari ruang udara oleh membran silikon tipis yang fleksibel.Tempatkan paking di antara setiap ruang untuk mencegah kebocoran.Tutup perangkat berisi elektroda grafit yang memberikan rangsangan listrik.b Representasi skematis dari perangkat jaringan besar, cincin pemandu, dan cincin pendukung.Bagian jaringan (coklat) ditempatkan pada perangkat besar dengan cincin pemandu ditempatkan di alur di tepi luar perangkat.Dengan menggunakan panduan, letakkan cincin penopang yang dilapisi dengan perekat akrilik jaringan dengan hati-hati di atas bagian jaringan jantung.c Grafik yang menunjukkan waktu stimulasi listrik sebagai fungsi tekanan ruang udara yang dikendalikan oleh aktuator pneumatik yang dapat diprogram (PPD).Perangkat akuisisi data digunakan untuk menyinkronkan stimulasi listrik menggunakan sensor tekanan.Saat tekanan di ruang kultur mencapai ambang yang ditetapkan, sinyal pulsa dikirim ke C-PACE-EM untuk memicu stimulasi listrik.d Gambar empat CTCM ditempatkan di rak inkubator.Empat perangkat terhubung ke satu PPD melalui sirkuit pneumatik, dan sensor tekanan dimasukkan ke dalam katup hemostatik untuk memantau tekanan di sirkuit pneumatik.Setiap perangkat berisi enam bagian jaringan.
Menggunakan aktuator pneumatik tunggal, kami dapat mengontrol 4 perangkat CTCM, yang masing-masing dapat menampung 6 bagian jaringan (Gbr. 1d).Dalam CTCM, tekanan udara di ruang udara diubah menjadi tekanan sinkron di ruang fluida dan menginduksi ekspansi fisiologis irisan jantung (Gambar 2a dan Film Tambahan 1).Evaluasi peregangan jaringan pada 80 mm Hg.Seni.menunjukkan peregangan bagian jaringan sebesar 25% (Gbr. 2b).Persentase peregangan ini telah terbukti sesuai dengan panjang sarkomer fisiologis 2,2-2,3 µm untuk kontraktilitas bagian jantung normal17,19,25.Pergerakan jaringan dinilai menggunakan pengaturan kamera khusus (Gambar Tambahan 1).Amplitudo dan kecepatan gerakan jaringan (Gbr. 2c, d) berhubungan dengan peregangan selama siklus jantung dan waktu selama sistol dan diastol (Gbr. 2b).Peregangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama 12 hari dalam kultur (Gbr. 2f).Untuk mengevaluasi efek stimulasi listrik pada kontraktilitas selama kultur, kami mengembangkan metode untuk menentukan deformitas aktif menggunakan algoritme peneduh (Gambar Tambahan 2a, b) dan mampu membedakan antara deformitas dengan dan tanpa stimulasi listrik.Bagian jantung yang sama (Gbr. 2f).Di daerah potongan yang dapat digerakkan (R6-9), tegangan selama stimulasi listrik 20% lebih tinggi daripada tanpa stimulasi listrik, yang menunjukkan kontribusi stimulasi listrik terhadap fungsi kontraktil.
Jejak representatif dari tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, dan pengukuran pergerakan jaringan mengkonfirmasi bahwa tekanan ruang mengubah tekanan ruang cairan, menyebabkan gerakan irisan jaringan yang sesuai.b Jejak representatif dari persen regangan (biru) bagian jaringan yang sesuai dengan persen regangan (oranye).c Gerakan yang diukur dari irisan jantung konsisten dengan kecepatan gerakan yang diukur.(d) Lintasan representatif dari gerakan siklik (garis biru) dan kecepatan (garis putus-putus oranye) dalam irisan jantung.e Kuantifikasi waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 19 irisan per kelompok), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), pergerakan jaringan (n = 25 ).irisan)/kelompok dari babi yang berbeda), kecepatan puncak sistolik (n = 24(D0), 25(D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda) dan tingkat relaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) irisan/kelompok dari babi yang berbeda).Uji-t Student dua sisi menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam parameter apa pun.f Jejak analisis regangan representatif dari bagian jaringan dengan (merah) dan tanpa (biru) stimulasi listrik, sepuluh area regional bagian jaringan dari bagian yang sama.Panel bawah menunjukkan kuantifikasi persentase perbedaan regangan pada bagian jaringan dengan dan tanpa stimulasi listrik di sepuluh area dari bagian yang berbeda. (n = 8 irisan / kelompok dari babi yang berbeda, uji-t Student dua sisi dilakukan; **** p <0, 0001, ** p < 0, 01, * p < 0, 05). (n = 8 irisan / kelompok dari babi yang berbeda, uji-t Student dua sisi dilakukan; **** p <0, 0001, ** p < 0, 01, * p < 0, 05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0 ,05). (n = 8 bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji-t Student dua sisi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagian/kelompok, dari babi yang berbeda, uji-t Student dua sisi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
Dalam sistem kultur irisan jantung biomimetik statis kami sebelumnya [20, 21], kami mempertahankan kelangsungan hidup, fungsi, dan integritas struktural irisan jantung selama 6 hari dengan menerapkan stimulasi listrik dan mengoptimalkan komposisi media.Namun, setelah 10 hari, angka tersebut turun tajam.Kami akan merujuk ke bagian yang dibudidayakan dalam sistem kultur biomimetik statis kami sebelumnya 20, 21 kondisi kontrol (Ctrl) dan kami akan menggunakan media kami yang sebelumnya dioptimalkan sebagai kondisi dan kultur MC di bawah stimulasi mekanik dan listrik simultan (CTCM).ditelepon .Pertama, kami menentukan bahwa stimulasi mekanis tanpa stimulasi listrik tidak cukup untuk mempertahankan viabilitas jaringan selama 6 hari (Gambar Tambahan 3a, b).Menariknya, dengan diperkenalkannya stimulasi fisio-mekanis dan listrik menggunakan STCM, kelangsungan hidup bagian jantung 12 hari tetap sama dengan bagian jantung segar dalam kondisi MS, tetapi tidak dalam kondisi Ctrl, seperti yang ditunjukkan oleh analisis MTT (Gbr. 1).3a).Ini menunjukkan bahwa stimulasi mekanis dan simulasi siklus jantung dapat membuat bagian jaringan tetap hidup dua kali lebih lama dari yang dilaporkan dalam sistem kultur statis kami sebelumnya.Namun, penilaian integritas struktural bagian jaringan dengan imunolabel troponin T jantung dan connexin 43 menunjukkan bahwa ekspresi connexin 43 secara signifikan lebih tinggi pada jaringan MC pada hari ke 12 dibandingkan kontrol pada hari yang sama.Namun, ekspresi connexin 43 yang seragam dan pembentukan Z-disc tidak sepenuhnya dipertahankan (Gbr. 3b).Kami menggunakan kerangka kerja kecerdasan buatan (AI) untuk mengukur integritas struktural jaringan26, saluran pembelajaran mendalam berbasis gambar berdasarkan pewarnaan troponin-T dan connexin43 untuk secara otomatis mengukur integritas struktural dan fluoresensi irisan jantung dalam hal kekuatan lokalisasi.Metode ini menggunakan Convolutional Neural Network (CNN) dan kerangka pembelajaran mendalam untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung secara andal secara otomatis dan tidak bias, seperti yang dijelaskan dalam referensi.26. Jaringan MC menunjukkan peningkatan kesamaan struktural pada hari ke 0 dibandingkan dengan bagian kontrol statis.Selain itu, pewarnaan trichrome Masson mengungkapkan persentase fibrosis yang jauh lebih rendah dalam kondisi MS dibandingkan dengan kondisi kontrol pada hari ke 12 kultur (Gbr. 3c).Sementara CTCM meningkatkan kelangsungan bagian jaringan jantung pada hari ke 12 ke tingkat yang sama dengan jaringan jantung segar, itu tidak secara signifikan meningkatkan integritas struktural dari bagian jantung.
grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT irisan jantung segar (D0) atau kultur irisan jantung selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p <0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT irisan jantung segar (D0) atau kultur irisan jantung selama 12 hari baik dalam kultur statis (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) irisan/grup dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p <0,01 dibandingkan ke D12 Ctrl).histogram menunjukkan kuantifikasi viabilitas bagian jantung segar MTT (D0) atau kultur bagian jantung selama 12 hari baik dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12). ) ), 12 (D12 MC) bagian/grup dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan **p <0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D1 2 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram menunjukkan kuantifikasi viabilitas MTT pada bagian jantung segar (D0) atau bagian jantung yang dikultur selama 12 hari dalam kultur statis (kontrol D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)) , 12 (D12 MC) bagian/grup dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl).b Troponin-T (hijau), connexin 43 (merah) dan DAPI (biru) di bagian jantung yang baru diisolasi (D0) atau bagian jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau kondisi CTCM (MC) selama 12 hari) dari gambar imunofluoresensi yang representatif (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan dari integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan / kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan dari integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan / kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Pembatasan Pembatasan Data Umum (n = 7 (D0), 7 (Ctrl D12), 5 (D1 2 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0 001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung dengan kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian / kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 vs. dengan D0 dan ****p <0,0001 dibandingkan dengan Ctrl D12).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0 .0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok masing-masing babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0 .0001 与D12 Ctrl 相比）。 Pembatasan yang diperlukan untuk membuka jendela baru adalah ткани (n = 7 (D0), 7 (Ctrl D12), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA;####p <0,0001 vs. 1 по сравнению с D12 Ctrl). Kecerdasan buatan untuk mengukur integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagian/grup masing-masing babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001 vs .D0 Untuk perbandingan ****p <0,0001 dibandingkan dengan Ctrl D12). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Skala telanjang = 500 µm) (n = 10 irisan / kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Skala telanjang = 500 µm) (n = 10 irisan / kelompok masing-masing dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) dan количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихро мным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполн яется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantifikasi (kanan) bagian jantung diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (skala tidak dilapisi = 500 µm) (n = 10 bagian / kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). C 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 （左） 和 量化 量化 （） （裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片/组 ， 每 来自 来自 不同 与 与 的 的 不同 不同 来自 来自 来自 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， l 相比）。 C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) dan количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихро мным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протест ировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнени ю с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiri) dan kuantisasi (kanan) bagian jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bagian/grup, masing-masing dari babi yang berbeda, diuji dengan analisis varians satu arah ;### # p <0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
Kami berhipotesis bahwa dengan menambahkan molekul kecil ke media kultur, integritas kardiomiosit dapat ditingkatkan dan perkembangan fibrosis berkurang selama kultur CTCM.Oleh karena itu kami menyaring molekul kecil menggunakan kultur kontrol statis kami20,21 karena sejumlah kecil faktor perancu.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), dan SB431542 (SB) dipilih untuk layar ini.Molekul kecil ini sebelumnya telah digunakan dalam kultur hiPSC-CM untuk menginduksi pematangan kardiomiosit dengan meningkatkan panjang sarkomer, tubulus T, dan kecepatan konduksi.Selain itu, baik Dex (sebuah glukokortikoid) dan SB diketahui dapat menekan inflamasi29,30.Oleh karena itu, kami menguji apakah memasukkan satu atau kombinasi molekul kecil ini akan meningkatkan integritas struktural bagian jantung.Untuk penyaringan awal, dosis masing-masing senyawa dipilih berdasarkan konsentrasi yang biasa digunakan dalam model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, dan 2,5 μM SB31).Setelah 12 hari kultur, kombinasi T3 dan Dex menghasilkan integritas struktural kardiomiosit yang optimal dan remodeling berserat minimal (Gambar Tambahan 4 dan 5).Selain itu, penggunaan menggandakan atau menggandakan konsentrasi T3 dan Dex ini menghasilkan efek buruk dibandingkan dengan konsentrasi normal (Gambar Tambahan 6a, b).
Setelah penyaringan awal, kami melakukan perbandingan head-to-head dari 4 kondisi kultur (Gambar 4a): Ctrl: bagian jantung yang dikultur dalam kultur statis yang kami jelaskan sebelumnya menggunakan media kami yang dioptimalkan;20.21 TD: T3 dan Ctrl s Menambahkan Dex pada hari Rabu;MC: bagian jantung dibudidayakan dalam CTCM menggunakan media kami yang telah dioptimalkan sebelumnya;dan MT: CTCM dengan T3 dan Dex ditambahkan ke media.Setelah 12 hari budidaya, viabilitas jaringan MS dan MT tetap sama seperti pada jaringan segar yang dinilai dengan uji MTT (Gbr. 4b).Menariknya, penambahan T3 dan Dex pada kultur transwell (TD) tidak menghasilkan peningkatan viabilitas yang signifikan dibandingkan dengan kondisi Ctrl, menunjukkan peran penting stimulasi mekanik dalam menjaga viabilitas bagian jantung.
diagram desain Eksperimental yang menggambarkan empat kondisi kultur yang digunakan untuk mengevaluasi efek stimulasi mekanis dan suplementasi T3/Dex pada media selama 12 hari. b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur di semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p <0,0 01 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas 12 hari pasca kultur di semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p < 0,0001, ###p <0,0 01 dibandingkan dengan D0 dan **p < 0,01 dibandingkan dengan D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования в о всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D 12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0 ,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik batang menunjukkan kuantifikasi viabilitas pada 12 hari pasca kultur di semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah; ####p < 0,0001, ###p <0,0 01 vs. D0 dan **p <0,01 dibandingkan dengan Ctrl D12). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими сре зами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), dari разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram menunjukkan semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC dan MT) dibandingkan dengan potongan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), dari babi yang berbeda 12 (D12 MC) bagian/grup, uji ANOVA satu arah; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D1 2). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur di semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p <0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Grafik batang menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur di semua 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan irisan jantung segar (D0) (n = 6 irisan/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ###p <0,001, dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/г руппу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнен atau dengan Ctrl D12). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari pasca kultur di bawah semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan bagian jantung segar (D0) (n = 6 bagian/kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan ; ###p <0,001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试； ###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней культивирован ия для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сре зов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa pada 12 hari pasca kultur untuk semua 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, dan MT) dibandingkan dengan bagian jantung segar (D0) (n = 6 bagian/kelompok, dari babi yang berbeda, unilateral Apakah tes ANOVA dilakukan, ###p <0,001 dibandingkan dengan D0, ***p <0,001 dibandingkan dengan D12 (kontrol).d Plot analisis regangan jaringan segar (biru), hari 12 MC (hijau), dan hari 12 MT (merah) pada sepuluh titik bagian jaringan regional (n = 4 irisan / kelompok, uji ANOVA satu arah; tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok).e Plot gunung berapi menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeda di bagian jantung segar (D0) dibandingkan dengan bagian jantung yang dikultur dalam kondisi statis (Ctrl) atau dalam kondisi MT (MT) selama 10-12 hari.f Peta panas gen sarkomer untuk bagian jantung yang dikultur di bawah masing-masing kondisi kultur.Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
Ketergantungan metabolik pada peralihan dari oksidasi asam lemak ke glikolisis adalah ciri khas dediferensiasi kardiomiosit.Kardiomiosit imatur terutama menggunakan glukosa untuk produksi ATP dan memiliki mitokondria hipoplastik dengan sedikit krista5,32.Analisis pemanfaatan glukosa menunjukkan bahwa dalam kondisi MC dan MT, pemanfaatan glukosa serupa dengan jaringan hari ke-0 (Gambar 4c).Namun, sampel Ctrl menunjukkan peningkatan penggunaan glukosa yang signifikan dibandingkan dengan jaringan segar.Ini menunjukkan bahwa kombinasi CTCM dan T3/Dex meningkatkan viabilitas jaringan dan mempertahankan fenotip metabolik dari bagian jantung yang dikultur selama 12 hari.Selain itu, analisis regangan menunjukkan bahwa tingkat regangan tetap sama seperti pada jaringan jantung segar selama 12 hari dalam kondisi MT dan MS (Gbr. 4d).
Untuk menganalisis dampak keseluruhan CTCM dan T3 / Dex pada lanskap transkripsi global jaringan irisan jantung, kami melakukan RNAseq pada irisan jantung dari keempat kondisi kultur yang berbeda (Data Tambahan 1).Menariknya, bagian MT menunjukkan kemiripan transkripsi yang tinggi dengan jaringan jantung segar, dengan hanya 16 gen yang diekspresikan secara berbeda dari 13.642 gen.Namun, seperti yang kami tunjukkan sebelumnya, irisan Ctrl menampilkan 1229 gen yang diekspresikan secara berbeda setelah 10-12 hari dalam kultur (Gbr. 4e).Data ini dikonfirmasi oleh qRT-PCR dari gen jantung dan fibroblast (Gambar Tambahan 7a-c).Menariknya, bagian Ctrl menunjukkan penurunan regulasi gen jantung dan siklus sel serta aktivasi program gen inflamasi.Data ini menunjukkan bahwa dedifferensiasi, yang biasanya terjadi setelah pembiakan jangka panjang, benar-benar dilemahkan dalam kondisi MT (Gambar Tambahan 8a, b).Studi yang cermat tentang gen sarkomer menunjukkan bahwa hanya dalam kondisi MT gen yang mengkodekan sarkomer (Gbr. 4f) dan saluran ion (Gambar Tambahan 9) dipertahankan, melindunginya dari penekanan dalam kondisi Ctrl, TD, dan MC.Data ini menunjukkan bahwa dengan kombinasi stimulasi mekanis dan humoral (T3/Dex), transkriptom irisan jantung dapat tetap serupa dengan irisan jantung segar setelah 12 hari dalam kultur.
Temuan transkripsi ini didukung oleh fakta bahwa integritas struktural kardiomiosit di bagian jantung paling baik dipertahankan dalam kondisi MT selama 12 hari, seperti yang ditunjukkan oleh koneksin 43 yang utuh dan terlokalisasi (Gbr. 5a).Selain itu, fibrosis pada bagian jantung dalam kondisi MT berkurang secara signifikan dibandingkan dengan Ctrl dan mirip dengan bagian jantung segar (Gbr. 5b).Data ini menunjukkan bahwa kombinasi stimulasi mekanis dan pengobatan T3/Dex secara efektif mempertahankan struktur jantung pada bagian jantung dalam kultur.
gambar imunofluoresensi representatif dari troponin-T (hijau), connexin 43 (merah), dan DAPI (biru) di bagian jantung yang baru saja diisolasi (D0) atau dikultur selama 12 hari di keempat kondisi kultur bagian jantung (bar skala = 100 µm).). Kuantifikasi kecerdasan buatan dari integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p <0,05, atau ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan dari integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p <0,05, atau ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравне нию с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian / kelompok dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; #### p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p <0,05 atau ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).对不同整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比） 。Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung menggunakan kecerdasan buatan pada babi yang berbeda (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bagian / kelompok) dengan uji ANOVA satu arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 dibandingkan dengan D0 dan *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl). b Gambar representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001, atau ****p <0. 0001 dibandingkan dengan Ctrl D12). b Gambar representatif dan kuantifikasi untuk irisan jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/grup dari babi yang berbeda, uji ANOVA satu arah dilakukan; ####p <0,0001 dibandingkan dengan D0 dan ***p <0,001, atau ****p <0. 0001 dibandingkan dengan Ctrl D12). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителе м Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar representatif dan kuantifikasi bagian jantung yang diwarnai dengan pewarnaan trichrome Masson (batang skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) bagian/grup dari babi yang berbeda, melakukan ANOVA satu arah; ####p <0,0001 vs. D0 dan ***p <0,001 atau ****p <0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D 12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 ，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td dan d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 ，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения dan количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (м асштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- спос об ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar representatif dan kuantifikasi bagian jantung yang diwarnai dengan trichrome Masson (bilah skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) bagian dari berbagai babi/grup, satu metode ANOVA; ####p < 0,0001 dibandingkan dengan D0, ***p <0,001 atau ****p <0,0001 dibandingkan dengan D12 Ctrl).Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
Terakhir, kemampuan CTCM untuk meniru hipertrofi jantung dinilai dengan meningkatkan peregangan jaringan jantung.Di CTCM, tekanan ruang udara puncak meningkat dari 80 mmHg menjadi 80 mmHg.Seni.(regangan normal) hingga 140 mmHg Art.(Gbr. 6a).Ini sesuai dengan peningkatan regangan sebesar 32% (Gbr. 6b), yang sebelumnya ditunjukkan sebagai persentase regangan yang sesuai yang diperlukan untuk bagian jantung untuk mencapai panjang sarkomer yang serupa dengan yang terlihat pada hipertrofi.Regangan dan kecepatan jaringan jantung selama kontraksi dan relaksasi tetap konstan selama enam hari kultur (Gbr. 6c).Jaringan jantung dari kondisi MT mengalami peregangan normal (MT (Normal)) atau kondisi overstretch (MT (OS)) selama enam hari.Sudah setelah empat hari dalam kultur, biomarker hipertrofik NT-ProBNP meningkat secara signifikan dalam medium dalam kondisi MT (OS) dibandingkan dengan kondisi MT (normal) (Gbr. 7a).Selain itu, setelah enam hari kultur, ukuran sel di MT (OS) (Gbr. 7b) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan bagian jantung MT (normal).Selain itu, translokasi nuklir NFATC4 meningkat secara signifikan pada jaringan yang terlalu banyak (Gbr. 7c).Hasil ini menunjukkan perkembangan progresif remodeling patologis setelah hiperdistensi dan mendukung konsep bahwa perangkat CTCM dapat digunakan sebagai platform untuk mempelajari pensinyalan hipertrofi jantung akibat peregangan.
Jejak representatif dari tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, dan pengukuran pergerakan jaringan mengkonfirmasi bahwa tekanan ruang mengubah tekanan ruang cairan, menyebabkan gerakan irisan jaringan yang sesuai.b Persentase regangan representatif dan kurva laju regangan untuk bagian jaringan yang diregangkan secara normal (oranye) dan berlebihan (biru).c Grafik batang menunjukkan waktu siklus (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu kontraksi (n = 18-19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda), waktu relaksasi (n = 19 irisan per kelompok, dari babi yang berbeda) ), amplitudo pergerakan jaringan (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda), kecepatan sistolik puncak (n = 14 irisan/kelompok, dari babi yang berbeda) dan tingkat relaksasi puncak (n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagian / kelompok) dari babi yang berbeda), uji-t Student dua sisi menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam parameter apa pun, menunjukkan bahwa parameter ini tetap konstan selama 6 hari kultur dengan tegangan berlebih.Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
kuantifikasi grafik batang konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi MT normal stretch (Norm) atau overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; ** p <0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). kuantifikasi grafik batang konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi MT normal stretch (Norm) atau overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, ANOVA dua arah dilakukan; ** p <0,01 dibandingkan dengan peregangan normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP dalam media kultur dari irisan jantung yang dikultur dalam kondisi MT stretch normal (norm) atau overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4).MTOS) irisan/grup dari babi yang berbeda, dilakukan analisis varians dua faktor;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01 ）。 a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dalam irisan jantung yang dibiakkan di bawah kondisi normal stretch (Norm) MT atau overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) dari 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **dibandingkan dengan peregangan normal, p <0,01).histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP dalam irisan jantung yang dikultur dalam kondisi regangan MT normal (norm) atau overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dan D4 MTOS) irisan/kelompok dari babi yang berbeda, analisis varians dua arah;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 dibandingkan dengan peregangan normal). b Gambar representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, uji- t Student dua sisi dilakukan; **** p <0, 0001 dibandingkan dengan peregangan normal). b Gambar representatif untuk irisan jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / kelompok dari 10 irisan berbeda dari babi yang berbeda, Uji- t Student dua sisi dilakukan; **** p <0, 0001 dibandingkan dengan peregangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных св иней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Gambar representatif dari bagian jantung yang diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel / kelompok dari 10 bagian berbeda dari babi yang berbeda, uji t Student dua sisi dilakukan; **** p <0, 0001 dibandingkan dengan regangan normal). b 用肌钙蛋白-T dan WGA（左） dan 胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Gambar representatif dari irisan jantung yang diwarnai dengan calcarein-T dan WGA (kiri) dan ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 dari 10 irisan berbeda (D6 MTNorm)) Tes sel/组，两方法有尾学生t；dibandingkan dengan peregangan normal，****p <0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dan 10 различных срезов от разных свиней Клетки/груп па, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Gambar representatif dari bagian jantung diwarnai dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi ukuran sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) dari 10 bagian berbeda dari babi yang berbeda) Sel/kelompok, kriteria dua sisi Siswa t;**** p <0,0001 dibandingkan dengan regangan normal). c Gambar representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke 0 dan hari ke 6 yang diberi imunolabel untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / kelompok dari babi yang berbeda, uji t Student dua sisi dilakukan; * p <0, 05). c Gambar representatif untuk irisan jantung MTOS hari ke 0 dan hari ke 6 yang diberi imunolabel untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 ke inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / kelompok dari babi yang berbeda , Uji t Student dua sisi dilakukan; * p <0, 05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 dan 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC 4, dan количественная оценка транслокации NFATC4 di ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разн ых свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar representatif untuk bagian jantung pada MTOS 0 dan 6 hari, diberi imunolabel untuk troponin-T dan NFATC4, dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam inti sel kavernosa (n = 4 (D0), irisan / kelompok 3 (D6 MTOS) dari babi yang berbeda) melakukan uji-t Student dua sisi;* p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T dan NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Gambar representatif dari irisan jantung calcanin-T dan NFATC4 第0天和第6天MTOS, dan NFATC4 dari NFATC4 berbeda 易位至CM inti sel的kuantitas化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвоста тый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar representatif dari irisan jantung MTOS pada hari ke 0 dan 6 untuk imunolabel troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus CM dari babi yang berbeda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan / kelompok, kriteria t dua sisi Siswa; * p <0, 05).Bilah kesalahan mewakili rata-rata ± standar deviasi.
Penelitian kardiovaskular translasi membutuhkan model seluler yang secara akurat mereproduksi lingkungan jantung.Dalam penelitian ini, perangkat CTCM dikembangkan dan dikarakterisasi yang dapat merangsang bagian jantung yang sangat tipis.Sistem CTCM mencakup stimulasi elektromekanis yang disinkronkan secara fisiologis dan pengayaan cairan T3 dan Dex.Ketika bagian jantung babi terpapar faktor-faktor ini, kelangsungan hidup, integritas struktural, aktivitas metabolisme, dan ekspresi transkripsinya tetap sama seperti pada jaringan jantung segar setelah 12 hari kultur.Selain itu, peregangan jaringan jantung yang berlebihan dapat menyebabkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi.Secara keseluruhan, hasil ini mendukung peran penting kondisi kultur fisiologis dalam mempertahankan fenotip jantung normal dan menyediakan platform untuk skrining obat.
Banyak faktor yang berkontribusi dalam menciptakan lingkungan yang optimal untuk fungsi dan kelangsungan hidup kardiomiosit.Faktor yang paling jelas terkait dengan (1) interaksi antar sel, (2) stimulasi elektromekanis, (3) faktor humoral, dan (4) substrat metabolik.Interaksi sel-ke-sel fisiologis membutuhkan jaringan tiga dimensi yang kompleks dari berbagai jenis sel yang didukung oleh matriks ekstraseluler.Interaksi seluler yang kompleks seperti itu sulit untuk direkonstruksi secara in vitro dengan kultur bersama dari tipe sel individu, tetapi dapat dengan mudah dicapai dengan menggunakan sifat organotipik dari bagian jantung.
Peregangan mekanis dan stimulasi listrik kardiomiosit sangat penting untuk mempertahankan fenotip jantung33,34,35.Sementara stimulasi mekanis telah banyak digunakan untuk pengkondisian dan pematangan hiPSC-CM, beberapa penelitian elegan baru-baru ini mencoba stimulasi mekanis irisan jantung dalam kultur menggunakan pemuatan uniaksial.Studi-studi ini menunjukkan bahwa pemuatan mekanis uniaksial 2D memiliki efek positif pada fenotipe jantung selama kultur.Dalam studi ini, bagian jantung dibebani dengan gaya tarik isometrik17, pemuatan auksotonik linier18, atau siklus jantung diciptakan kembali menggunakan umpan balik transduser gaya dan penggerak tegangan.Namun, metode ini menggunakan peregangan jaringan uniaksial tanpa pengoptimalan lingkungan, yang mengakibatkan penekanan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang terkait dengan respons peregangan abnormal.CTCM yang dijelaskan di sini memberikan stimulus elektromekanis 3D yang meniru siklus jantung alami dalam hal waktu siklus dan peregangan fisiologis (regangan 25%, sistol 40%, diastol 60%, dan 72 denyut per menit).Meskipun stimulasi mekanis tiga dimensi ini saja tidak cukup untuk menjaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral dan mekanik menggunakan T3/Dex diperlukan untuk mempertahankan viabilitas, fungsi, dan integritas jaringan secara memadai.
Faktor humoral memainkan peran penting dalam memodulasi fenotip jantung orang dewasa.Ini disorot dalam studi HiPS-CM di mana T3 dan Dex ditambahkan ke media kultur untuk mempercepat pematangan sel.T3 dapat mempengaruhi pengangkutan asam amino, gula dan kalsium melintasi membran sel36.Selain itu, T3 mempromosikan ekspresi MHC-α dan penurunan regulasi MHC-β, mempromosikan pembentukan miofibril kedutan cepat pada kardiomiosit dewasa dibandingkan dengan miofibril kedutan lambat pada CM janin.Defisiensi T3 pada pasien hipotiroid mengakibatkan hilangnya pita myofibrillar dan penurunan kecepatan perkembangan tonus37.Dex bekerja pada reseptor glukokortikoid dan telah terbukti meningkatkan kontraktilitas miokard pada jantung dengan perfusi terisolasi;38 perbaikan ini diduga terkait dengan efek kalsium deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Selain itu, Dex berikatan dengan reseptornya, menyebabkan respons intraseluler luas yang menekan fungsi kekebalan dan peradangan30.
Hasil kami menunjukkan bahwa stimulasi mekanik fisik (MS) meningkatkan kinerja kultur secara keseluruhan dibandingkan dengan Ctrl, tetapi gagal mempertahankan viabilitas, integritas struktural, dan ekspresi jantung selama 12 hari dalam kultur.Dibandingkan dengan Ctrl, penambahan kultur T3 dan Dex ke CTCM (MT) meningkatkan viabilitas dan mempertahankan profil transkripsi yang serupa, integritas struktural, dan aktivitas metabolik dengan jaringan jantung segar selama 12 hari.Selain itu, dengan mengontrol tingkat peregangan jaringan, model hipertrofi jantung yang diinduksi hiperekstensi dibuat menggunakan STCM, yang menggambarkan keserbagunaan sistem STCM.Perlu dicatat bahwa meskipun remodeling jantung dan fibrosis biasanya melibatkan organ utuh yang sel-selnya yang bersirkulasi dapat menyediakan sitokin yang sesuai serta fagositosis dan faktor remodeling lainnya, bagian jantung masih dapat meniru proses fibrotik sebagai respons terhadap stres dan trauma.menjadi myofibroblast.Ini sebelumnya telah dievaluasi dalam model irisan jantung ini.Perlu dicatat bahwa parameter CTCM dapat dimodulasi dengan mengubah tekanan/amplitudo listrik dan frekuensi untuk mensimulasikan banyak kondisi seperti takikardia, bradikardia, dan dukungan sirkulasi mekanis (jantung tanpa beban mekanis).Hal ini menjadikan sistem sebagai perantara untuk pengujian obat.Kemampuan CTCM untuk memodelkan hipertrofi jantung yang diinduksi oleh aktivitas berlebihan membuka jalan untuk menguji sistem ini untuk terapi yang dipersonalisasi.Kesimpulannya, penelitian ini menunjukkan bahwa peregangan mekanik dan stimulasi humoral sangat penting untuk mempertahankan kultur bagian jaringan jantung.
Meskipun data yang disajikan di sini menunjukkan bahwa CTCM merupakan platform yang sangat menjanjikan untuk memodelkan miokardium utuh, metode kultur ini memiliki beberapa keterbatasan.Keterbatasan utama kultur CTCM adalah memaksakan tekanan mekanis dinamis yang terus menerus pada irisan, yang menghalangi kemampuan untuk memantau kontraksi irisan jantung secara aktif selama setiap siklus.Selain itu, karena ukuran bagian jantung yang kecil (7 mm), kemampuan untuk mengevaluasi fungsi sistolik di luar sistem kultur menggunakan sensor tekanan tradisional menjadi terbatas.Dalam manuskrip saat ini, kami mengatasi sebagian batasan ini dengan mengevaluasi tegangan optik sebagai indikator fungsi kontraktil.Namun, keterbatasan ini akan membutuhkan kerja lebih lanjut dan dapat diatasi di masa mendatang dengan memperkenalkan metode pemantauan optik fungsi irisan jantung dalam kultur, seperti pemetaan optik menggunakan kalsium dan pewarna peka tegangan.Keterbatasan CTCM lainnya adalah model kerjanya tidak memanipulasi stres fisiologis (preload dan afterload).Dalam CTCM, tekanan diinduksi dalam arah yang berlawanan untuk mereproduksi 25% peregangan fisiologis dalam diastol (peregangan penuh) dan sistol (panjang kontraksi selama stimulasi listrik) pada jaringan yang sangat besar.Keterbatasan ini harus dihilangkan dalam desain CTCM masa depan dengan tekanan yang memadai pada jaringan jantung dari kedua sisi dan dengan menerapkan hubungan tekanan-volume yang tepat yang terjadi di bilik jantung.
Renovasi yang diinduksi overstretch yang dilaporkan dalam manuskrip ini terbatas pada meniru sinyal hyperstretch hipertrofik.Dengan demikian, model ini dapat membantu dalam studi pensinyalan hipertrofi yang diinduksi peregangan tanpa memerlukan faktor humoral atau saraf (yang tidak ada dalam sistem ini).Studi lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan multiplisitas CTCM, misalnya kultur bersama dengan sel imun, sirkulasi faktor humoral plasma, dan persarafan saat kultur bersama dengan sel saraf akan meningkatkan kemungkinan pemodelan penyakit dengan CTCM.
Tiga belas babi digunakan dalam penelitian ini.Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman institusional dan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusi Universitas Louisville.Lengkungan aorta diklem dan jantung dialiri dengan 1 L cardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hingga 7,4); jantung diawetkan dalam larutan kardioplegik sedingin es sampai diangkut ke laboratorium di atas es yang biasanya <10 menit. jantung diawetkan dalam larutan kardioplegik sedingin es sampai diangkut ke laboratorium di atas es yang biasanya <10 menit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обы чно занимает <10 мин. jantung disimpan dalam larutan kardioplegik sedingin es sampai dibawa ke laboratorium dengan es, yang biasanya memakan waktu <10 menit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Pertahankan jantung di atas es cardioplegia sampai diangkut ke laboratorium di atas es, biasanya <10 menit.
Perangkat CTCM dikembangkan dalam perangkat lunak computer-aided design (CAD) SolidWorks.Ruang kultur, pembagi, dan ruang udara terbuat dari plastik akrilik bening CNC.Ring back-up berdiameter 7mm terbuat dari high density polyethylene (HDPE) di bagian tengah dan memiliki alur o-ring untuk menampung o-ring silikon yang digunakan untuk menyegel media di bawahnya.Membran silika tipis memisahkan ruang kultur dari pelat pemisah.Selaput silikon dipotong laser dari lembaran silikon tebal 0,02″ dan memiliki kekerasan 35A.Gasket silikon bawah dan atas dipotong laser dari lembaran silikon tebal 1/16″ dan memiliki kekerasan 50A.Sekrup stainless steel 316L dan mur sayap digunakan untuk mengencangkan blok dan membuat segel kedap udara.
Papan sirkuit tercetak (PCB) khusus dirancang untuk diintegrasikan dengan sistem C-PACE-EM.Soket konektor mesin swiss pada PCB dihubungkan ke elektroda grafit dengan kabel tembaga berlapis perak dan sekrup perunggu 0-60 yang disekrup ke elektroda.Papan sirkuit tercetak ditempatkan di sampul printer 3D.
Perangkat CTCM dikendalikan oleh programmable pneumatic actuator (PPD) yang menciptakan tekanan peredaran darah terkontrol yang serupa dengan siklus jantung.Saat tekanan di dalam ruang udara meningkat, membran silikon fleksibel mengembang ke atas, memaksa media di bawah tempat jaringan.Area jaringan kemudian akan diregangkan oleh pengeluaran cairan ini, meniru ekspansi fisiologis jantung selama diastole.Pada puncak relaksasi, rangsangan listrik diterapkan melalui elektroda grafit, yang mengurangi tekanan di ruang udara dan menyebabkan kontraksi bagian jaringan.Di dalam pipa terdapat katup hemostatik dengan sensor tekanan untuk mendeteksi tekanan dalam sistem udara.Tekanan yang dirasakan oleh sensor tekanan diterapkan ke pengumpul data yang terhubung ke laptop.Hal ini memungkinkan pemantauan terus menerus terhadap tekanan di dalam kamar gas.Ketika tekanan ruang maksimum tercapai (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), perangkat akuisisi data diperintahkan untuk mengirim sinyal ke sistem C-PACE-EM untuk menghasilkan sinyal tegangan biphasic selama 2 ms, diatur ke 4 V.
Potongan jantung diperoleh dan kondisi kultur dalam 6 lubang dilakukan sebagai berikut: Pindahkan jantung yang dipanen dari bejana transfer ke nampan yang berisi kardioplegia dingin (4°C).Ventrikel kiri diisolasi dengan pisau steril dan dipotong-potong berukuran 1-2 cm3.Blok jaringan ini dilekatkan pada penyangga jaringan dengan perekat jaringan dan ditempatkan dalam rendaman jaringan mikrotom bergetar yang mengandung larutan Tyrode dan oksigenasi terus menerus (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml larutan 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml larutan 1 M), hingga 1 L ddH2O).Mikrotom getar diatur untuk memotong irisan setebal 300 µm pada frekuensi 80 Hz, amplitudo getaran horizontal 2 mm, dan laju gerak maju 0,03 mm/s.Wadah tisu dikelilingi oleh es untuk menjaga agar larutan tetap dingin dan suhu dipertahankan pada 4°C.Pindahkan bagian jaringan dari penangas mikrotom ke penangas inkubasi yang berisi larutan Tyrode yang teroksigenasi secara kontinyu di atas es sampai bagian yang cukup diperoleh untuk satu pelat kultur.Untuk kultur transwell, bagian jaringan dilekatkan pada penyangga poliuretan selebar 6 mm steril dan ditempatkan dalam 6 ml media yang dioptimalkan (199 media, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline dan 2X antibiotik-antijamur).Stimulasi listrik (10 V, frekuensi 1,2 Hz) diterapkan pada bagian jaringan melalui C-Pace.Untuk kondisi TD, T3 dan Dex segar ditambahkan pada 100 nM dan 1 μM pada setiap perubahan medium.Media jenuh dengan oksigen sebelum diganti 3 kali sehari.Bagian jaringan dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk kultur CTCM, potongan jaringan ditempatkan pada printer 3D yang dibuat khusus dalam cawan Petri yang berisi larutan Tyrode yang dimodifikasi.Perangkat ini dirancang untuk memperbesar ukuran irisan jantung sebesar 25% dari luas cincin penyangga.Ini dilakukan agar bagian jantung tidak meregang setelah dipindahkan dari larutan Tyrode ke media dan selama diastole.Menggunakan lem histoacrylic, bagian setebal 300 µm dipasang pada cincin penyangga berdiameter 7 mm.Setelah memasang bagian jaringan ke cincin penyangga, potong bagian jaringan yang berlebih dan tempatkan bagian jaringan yang terpasang kembali ke dalam larutan Tyrode di atas es (4°C) sampai bagian yang cukup telah disiapkan untuk satu perangkat.Total waktu pemrosesan untuk semua perangkat tidak boleh melebihi 2 jam.Setelah 6 bagian jaringan dipasang ke cincin pendukungnya, perangkat CTCM dirakit.Ruang kultur CTCM diisi sebelumnya dengan 21 ml media pra-oksigen.Pindahkan bagian jaringan ke ruang kultur dan hati-hati keluarkan gelembung udara dengan pipet.Bagian jaringan kemudian dipandu ke dalam lubang dan dengan lembut ditekan ke tempatnya.Terakhir, pasang tutup elektroda pada perangkat dan pindahkan perangkat ke inkubator.Kemudian sambungkan CTCM ke tabung udara dan sistem C-PACE-EM.Aktuator pneumatik terbuka dan katup udara membuka CTCM.Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi untuk menghasilkan 4 V pada 1,2 Hz selama pemacuan biphasic selama 2 ms.Media diganti dua kali sehari dan elektroda diganti sekali sehari untuk menghindari akumulasi grafit pada elektroda.Jika perlu, bagian jaringan dapat dikeluarkan dari sumur kulturnya untuk mengeluarkan gelembung udara yang mungkin jatuh di bawahnya.Untuk kondisi pengobatan MT, T3/Dex ditambahkan segar dengan setiap perubahan media dengan 100 nM T3 dan 1 μM Dex.Perangkat CTCM dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk mendapatkan lintasan irisan jantung yang membentang, sistem kamera khusus dikembangkan.Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) digunakan dengan lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Visualisasi dilakukan pada suhu kamar setelah media diganti dengan media baru.Kamera diposisikan pada sudut 51° dan video direkam pada 30 bingkai per detik.Pertama, perangkat lunak sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) digunakan dengan Image-J untuk mengukur gerakan irisan jantung.Topeng dibuat menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) untuk menentukan wilayah yang diminati untuk mengalahkan irisan jantung untuk menghindari kebisingan.Masker tersegmentasi secara manual diterapkan ke semua gambar dalam urutan bingkai dan kemudian diteruskan ke plug-in MUSCLEMOTION.Muscle Motion menggunakan intensitas rata-rata piksel di setiap frame untuk mengukur pergerakannya relatif terhadap frame referensi.Data dicatat, disaring dan digunakan untuk mengukur waktu siklus dan menilai peregangan jaringan selama siklus jantung.Video yang direkam diproses pasca menggunakan filter digital fase nol orde pertama.Untuk mengukur peregangan jaringan (puncak-ke-puncak), analisis puncak-ke-puncak dilakukan untuk membedakan antara puncak dan palung dalam sinyal yang direkam.Selain itu, detrending dilakukan menggunakan polinomial orde 6 untuk menghilangkan penyimpangan sinyal.Kode program dikembangkan di MATLAB untuk menentukan gerakan jaringan global, waktu siklus, waktu relaksasi, dan waktu kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Untuk analisis regangan, dengan menggunakan video yang sama yang dibuat untuk penilaian regangan mekanis, pertama-tama kami menelusuri dua gambar yang mewakili puncak gerakan (titik gerakan tertinggi (atas) dan terendah (bawah)) menurut perangkat lunak MUSCLEMOTION.Kami kemudian menyegmentasikan daerah jaringan dan menerapkan suatu bentuk algoritma naungan ke jaringan tersegmentasi (Gambar Tambahan 2a).Jaringan tersegmentasi kemudian dibagi menjadi sepuluh bagian bawah permukaan, dan tekanan pada setiap permukaan dihitung menggunakan persamaan berikut: Regangan = (Sup-Sdown)/Sdown, di mana Sup dan Sdown masing-masing adalah jarak bentuk dari bayangan atas dan bawah kain (Gambar Tambahan .2b).
Bagian jantung difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 48 jam.Jaringan tetap didehidrasi dalam sukrosa 10% dan 20% selama 1 jam, kemudian dalam sukrosa 30% semalaman.Bagian-bagian tersebut kemudian tertanam dalam senyawa suhu pemotongan optimal (senyawa OCT) dan secara bertahap dibekukan dalam penangas isopentana/es kering.Simpan blok penyematan OCT pada -80 °C hingga pemisahan.Slide disiapkan sebagai bagian dengan ketebalan 8 μm.
Untuk menghilangkan OCT dari bagian jantung, panaskan slide pada blok pemanas pada suhu 95 °C selama 5 menit.Tambahkan 1 ml PBS ke setiap slide dan inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, kemudian meresap bagian dengan menetapkan 0,1% Triton-X dalam PBS selama 15 menit pada suhu kamar.Untuk mencegah antibodi non-spesifik mengikat sampel, tambahkan 1 ml larutan BSA 3% ke slide dan inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.BSA kemudian dilepas dan slide dicuci dengan PBS.Tandai setiap sampel dengan pensil.Antibodi primer (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahkan selama 90 menit, kemudian antibodi sekunder (diencerkan 1:200 dalam 1% BSA) terhadap tikus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A1 6079), melawan kelinci Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) selama 90 menit tambahan Dicuci 3 kali dengan PBS Untuk membedakan pewarnaan target dari latar belakang, kami hanya menggunakan antibodi sekunder sebagai kontrol. Terakhir, pewarnaan nuklir DAPI ditambahkan dan slide ditempatkan di vectashield (Laboratorium Vektor) dan disegel dengan cat kuku. -x pembesaran) dan mikroskop Keyence dengan pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pada 5 μg/ml dalam PBS digunakan untuk pewarnaan WGA dan diaplikasikan pada bagian yang difiksasi selama 30 menit pada suhu kamar.Slide kemudian dicuci dengan PBS dan Sudan hitam ditambahkan ke setiap slide dan diinkubasi selama 30 menit.Slide kemudian dicuci dengan PBS dan ditambahkan media penyisipan vectashield.Slide divisualisasikan pada mikroskop Keyence dengan perbesaran 40x.
OCT telah dihapus dari sampel seperti dijelaskan di atas.Setelah melepas OCT, rendam slide dalam larutan Bouin semalaman.Slide kemudian dibilas dengan air suling selama 1 jam dan kemudian ditempatkan dalam larutan fuchsin asam aloe Bibrich selama 10 menit.Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan 5% fosfomolibdenum/5% asam fosfotungstat selama 10 menit.Tanpa membilas, pindahkan slide langsung ke dalam larutan biru anilin selama 15 menit.Kemudian slide dicuci dengan air suling dan ditempatkan dalam larutan asam asetat 1% selama 2 menit.Slide dikeringkan dalam etanol 200 N dan dipindahkan ke xilena.Slide bernoda divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan tujuan 10x.Persentase area fibrosis dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomor katalog V13154, menurut protokol pabrikan dengan beberapa modifikasi.Secara khusus, punch bedah dengan diameter 6 mm digunakan untuk memastikan ukuran jaringan yang seragam selama analisis MTT.Jaringan secara individual disepuh ke dalam sumur pelat 12-sumur yang berisi substrat MTT sesuai dengan protokol pabrikan.Bagian diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam dan jaringan hidup memetabolisme substrat MTT untuk membentuk senyawa formazan ungu.Ganti larutan MTT dengan 1 ml DMSO dan inkubasi pada suhu 37 °C selama 15 menit untuk mengekstrak formazan ungu dari bagian jantung.Sampel diencerkan 1:10 dalam DMSO dalam pelat dasar bening 96-sumur dan intensitas warna ungu diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek).Pembacaan dinormalisasi dengan berat masing-masing irisan jantung.
Media irisan jantung diganti dengan media yang mengandung 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) untuk uji pemanfaatan glukosa seperti yang dijelaskan sebelumnya.Setelah 4 jam inkubasi, tambahkan 100 µl medium ke dalam tabung microcentrifuge terbuka yang berisi 100 µl HCl 0,2 N.Kemudian tabung ditempatkan dalam tabung sintilasi yang berisi 500 μl dH2O untuk menguapkan [3H]2O selama 72 jam pada suhu 37°C.Kemudian lepaskan tabung microcentrifuge dari tabung sintilasi dan tambahkan 10 ml cairan sintilasi.Penghitungan sintilasi dilakukan dengan menggunakan penganalisa sintilasi cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Penggunaan glukosa kemudian dihitung dengan mempertimbangkan aktivitas spesifik [5-3H]-glukosa, kesetimbangan dan latar belakang yang tidak lengkap, pengenceran [5-3H]- menjadi glukosa yang tidak berlabel, dan efisiensi penghitung kilau.Data dinormalisasi ke massa bagian jantung.
Setelah homogenisasi jaringan dalam Trizol, RNA diisolasi dari bagian jantung menggunakan Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sesuai dengan protokol pabrikan.Persiapan perpustakaan RNAsec, pengurutan dan analisis data dilakukan sebagai berikut:
1 μg RNA per sampel digunakan sebagai bahan awal untuk persiapan perpustakaan RNA.Pustaka pengurutan dihasilkan menggunakan Kit Persiapan Perpustakaan NEBNext UltraTM RNA untuk Illumina (NEB, AS) mengikuti rekomendasi pabrikan, dan kode indeks ditambahkan ke urutan atribut untuk setiap sampel.Secara singkat, mRNA dimurnikan dari RNA total menggunakan manik-manik magnetik yang dilekatkan dengan oligonukleotida poli-T.Fragmentasi dilakukan menggunakan kation divalen pada suhu tinggi di NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).CDNA untai pertama disintesis menggunakan primer hexamer acak dan M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Untai cDNA kedua kemudian disintesis menggunakan DNA polimerase I dan RNase H. Overhang yang tersisa diubah menjadi ujung tumpul oleh aktivitas exonuclease/polimerase.Setelah adenilasi ujung 3′ dari fragmen DNA, Adaptor NEBNext dengan struktur loop jepit rambut dipasang padanya untuk mempersiapkannya untuk hibridisasi.Untuk pemilihan fragmen cDNA dengan panjang yang disukai 150-200 bp.fragmen perpustakaan dimurnikan menggunakan sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Kemudian, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) dengan cDNA pilihan ukuran yang diikat dengan adaptor digunakan selama 15 menit pada suhu 37°C dan kemudian selama 5 menit pada suhu 95°C sebelum PCR.PCR kemudian dilakukan menggunakan Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primer PCR universal, dan primer Index (X).Akhirnya, produk PCR dimurnikan (sistem AMPure XP) dan kualitas perpustakaan dinilai pada sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Pustaka cDNA kemudian diurutkan menggunakan sequencer Novaseq.File gambar mentah dari Illumina dikonversi menjadi bacaan mentah menggunakan CASAVA Base Calling.Data mentah disimpan dalam file format FASTQ(fq) yang berisi urutan baca dan kualitas dasar yang sesuai.Pilih HISAT2 untuk mencocokkan bacaan pengurutan terfilter dengan genom referensi Sscrofa11.1.Secara umum, HISAT2 mendukung genom dalam berbagai ukuran, termasuk genom yang lebih besar dari 4 miliar basis, dan nilai default ditetapkan untuk sebagian besar parameter.Pembacaan penyambungan dari data RNA Seq dapat diselaraskan secara efisien menggunakan HISAT2, sistem tercepat yang tersedia saat ini, dengan akurasi yang sama atau lebih baik daripada metode lainnya.
Kelimpahan transkrip secara langsung mencerminkan tingkat ekspresi gen.Tingkat ekspresi gen dinilai oleh banyaknya transkrip (sequencing count) yang terkait dengan genom atau ekson.Jumlah pembacaan sebanding dengan tingkat ekspresi gen, panjang gen, dan kedalaman pengurutan.FPKM (fragmen per seribu pasangan basa transkrip yang diurutkan per juta pasangan basa) dihitung dan nilai-P dari ekspresi diferensial ditentukan menggunakan paket DESeq2.Kami kemudian menghitung tingkat penemuan palsu (FDR) untuk setiap nilai P menggunakan metode Benjamini-Hochberg9 berdasarkan fungsi R bawaan "p.adjust".
RNA yang diisolasi dari bagian jantung diubah menjadi cDNA pada konsentrasi 200 ng/μl menggunakan campuran SuperScript IV Vilo Master dari Thermo (Thermo, kucing no. 11756050).RT-PCR kuantitatif dilakukan menggunakan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) dan perekat optik microamp (Thermo, cat. no. 4311971).Campuran reaksi terdiri dari 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat #4444557), 0,5 µl Taqman Primer dan 3,5 µl H2O dicampur per sumur.Siklus qPCR standar dijalankan dan nilai CT diukur menggunakan instrumen PCR real-time Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384 sumur; produk # A28135).Primer Taqman dibeli dari Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Nilai CT semua sampel dinormalisasi ke gen housekeeping GAPDH.
Rilis media NT-ProBNP dinilai menggunakan kit NT-ProBNP (babi) (Kat. No. MBS2086979, MyBioSource) sesuai dengan protokol pabrikan.Secara singkat, 250 µl dari setiap sampel dan standar ditambahkan dalam rangkap dua ke setiap sumur.Segera setelah menambahkan sampel, tambahkan 50 µl Assay Reagent A ke masing-masing sumur.Goyangkan piring dengan lembut dan tutup dengan sealant.Kemudian tablet diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam.Kemudian aspirasi larutan dan cuci sumuran 4 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X, inkubasi larutan pencuci selama 1-2 menit setiap kali.Kemudian tambahkan 100 µl Assay Reagent B per sumur dan tutup dengan plate sealant.Tablet dikocok perlahan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.Aspirasi larutan dan cuci sumuran 5 kali dengan 350 µl larutan pencuci 1X.Tambahkan 90 µl larutan substrat ke masing-masing sumur dan tutup pelat.Inkubasi cawan pada suhu 37°C selama 10-20 menit.Tambahkan 50 µl Stop Solution ke masing-masing well.Pelat segera diukur menggunakan pembaca pelat Cytation (BioTek) yang disetel pada 450 nm.
Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran grup yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan absolut 10% pada parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I 5%. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran grup yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi perubahan absolut 10% pada parameter dengan tingkat kesalahan Tipe I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обна ружения 10% абсолютного изменения араметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran grup yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi 10% perubahan parameter absolut dengan tingkat kesalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности дл я обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis daya dilakukan untuk memilih ukuran grup yang akan memberikan daya >80% untuk mendeteksi 10% perubahan parameter absolut dan tingkat kesalahan tipe I 5%.Bagian jaringan dipilih secara acak sebelum percobaan.Semua analisis buta kondisi dan sampel didekodekan hanya setelah semua data dianalisis.Perangkat lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) digunakan untuk melakukan semua analisis statistik. Untuk semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Untuk semua statistik, nilai p dianggap signifikan pada nilai <0,05.Uji-t Student dua sisi dilakukan pada data dengan hanya 2 perbandingan.ANOVA satu arah atau dua arah digunakan untuk menentukan signifikansi antara beberapa kelompok.Saat melakukan tes post hoc, koreksi Tukey diterapkan untuk menghitung beberapa perbandingan.Data RNAsec memiliki pertimbangan statistik khusus saat menghitung FDR dan p.adjust seperti yang dijelaskan di bagian Metode.
Untuk informasi lebih lanjut tentang desain penelitian, lihat abstrak Nature Research Report yang ditautkan ke artikel ini.