Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Metode imunologi dan spektrometri massa baru untuk analisis kompleks oligosakarida persisten dalam tongkol jagung yang diolah terlebih dahulu dengan AFEX. Biomassa lignoselulosa merupakan alternatif berkelanjutan untuk bahan bakar fosil dan digunakan secara luas untuk mengembangkan bioteknologi untuk produksi produk seperti makanan, pakan, bahan bakar, dan bahan kimia. Kunci dari teknologi ini adalah pengembangan proses yang kompetitif dari segi biaya untuk mengubah karbohidrat kompleks yang terdapat dalam dinding sel tanaman menjadi gula sederhana seperti glukosa, xilosa, dan arabinosa. Karena biomassa lignoselulosa sangat keras kepala, biomassa tersebut harus mengalami perlakuan termokimia (misalnya, pengelupasan serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL)) dan perlakuan biologis (misalnya, hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba) dalam kombinasi untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Namun, ketika enzim jamur komersial digunakan dalam proses hidrolisis, hanya 75-85% dari gula larut yang terbentuk adalah monosakarida, dan 15-25% sisanya adalah oligosakarida yang larut dan keras, yang tidak selalu tersedia bagi mikroorganisme. Sebelumnya, kami telah berhasil mengisolasi dan memurnikan oligosakarida keras yang larut menggunakan kombinasi pemisahan karbon dan tanah diatom dan kromatografi pengecualian ukuran, dan juga menyelidiki sifat penghambat enzimnya. Kami telah menemukan bahwa oligosakarida yang mengandung substitusi asam uronat termetilasi dengan tingkat polimerisasi (DP) yang lebih tinggi lebih sulit diproses dengan campuran enzim komersial daripada oligosakarida netral dan DP rendah. Di sini kami melaporkan penggunaan beberapa metode tambahan, termasuk pembuatan profil glikana menggunakan antibodi monoklonal (mAb) yang khusus untuk glikana biomassa tanaman untuk mengkarakterisasi ikatan glikana di dinding sel tanaman dan hidrolisat enzimatik, ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks, spektrometri massa waktu terbang. MALDI-TOF-MS) menggunakan puncak diagnostik yang informatif terhadap struktur yang diperoleh melalui spektroskopi setelah peluruhan sekunder ion negatif, kromatografi gas, dan spektrometri massa (GC-MS) untuk mengkarakterisasi ikatan oligosakarida dengan dan tanpa derivatisasi. Karena ukuran oligosakarida yang kecil (DP 4–20), molekul-molekul ini sulit digunakan untuk pengikatan dan karakterisasi mAb. Untuk mengatasi masalah ini, kami menerapkan metode imobilisasi oligosakarida berbasis konjugasi biotin baru yang berhasil memberi label sebagian besar oligosakarida terlarut DP rendah pada permukaan pelat mikro, yang kemudian digunakan dalam sistem mAb throughput tinggi untuk analisis ligasi spesifik. Metode baru ini akan memfasilitasi pengembangan uji glikoma throughput tinggi yang lebih canggih di masa mendatang yang dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi oligosakarida yang ada dalam biomarker untuk tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, yang terdiri dari bahan-bahan pertanian, kehutanan, rumput dan kayu, merupakan bahan baku potensial untuk produksi produk-produk berbasis bio, termasuk makanan, pakan, bahan bakar dan prekursor kimia untuk menghasilkan produk-produk bernilai lebih tinggi1. Karbohidrat (seperti selulosa dan hemiselulosa) yang terdapat dalam dinding sel tanaman didepolimerisasi menjadi monosakarida melalui pemrosesan kimia dan biotransformasi (seperti hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba). Pra-perlakuan umum meliputi ekspansi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL), dan ledakan uap (SE), yang menggunakan kombinasi bahan kimia dan panas untuk mengurangi produksi lignoselulosa dengan membuka dinding sel tanaman3,4. sifat keras kepala materi, 5. Hidrolisis enzimatik dilakukan pada beban padatan tinggi menggunakan enzim-enzim yang mengandung karbohidrat aktif komersial (CAZymes) dan fermentasi mikroba menggunakan ragi atau bakteri transgenik untuk menghasilkan bahan bakar dan bahan kimia berbasis bio6.
CAZymes dalam enzim komersial tersusun dari campuran enzim kompleks yang secara sinergis memecah ikatan karbohidrat-gula kompleks untuk membentuk monosakarida2,7. Seperti yang kami laporkan sebelumnya, jaringan kompleks polimer aromatik lignin dengan karbohidrat membuatnya sangat sulit diatur, yang menyebabkan konversi gula tidak lengkap, mengakumulasi 15-25% oligosakarida seks yang tidak diproduksi selama hidrolisis enzimatik dari biomassa yang telah diolah terlebih dahulu. Ini adalah masalah umum dengan berbagai metode praperlakuan biomassa. Beberapa alasan untuk kemacetan ini meliputi penghambatan enzim selama hidrolisis, atau tidak adanya atau rendahnya kadar enzim esensial yang diperlukan untuk memecah ikatan gula dalam biomassa tanaman. Memahami komposisi dan karakteristik struktural gula, seperti ikatan gula dalam oligosakarida, akan membantu kita meningkatkan konversi gula selama hidrolisis, menjadikan proses bioteknologi kompetitif dari segi biaya dengan produk turunan minyak bumi.
Penentuan struktur karbohidrat merupakan hal yang menantang dan memerlukan kombinasi metode seperti kromatografi cair (LC)11,12, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR)13, elektroforesis kapiler (CE)14,15,16 dan spektrometri massa (MS)17. ,18. Metode MS seperti spektrometri massa time-of-flight dengan desorpsi dan ionisasi laser menggunakan matriks (MALDI-TOF-MS) merupakan metode serbaguna untuk mengidentifikasi struktur karbohidrat. Baru-baru ini, tandem MS Collision-Induced Dissociation (CID) dari aduk ion natrium telah banyak digunakan untuk mengidentifikasi sidik jari yang sesuai dengan posisi perlekatan oligosakarida, konfigurasi anomerik, sekuens, dan posisi percabangan 20, 21 .
Analisis glikana merupakan alat yang sangat baik untuk identifikasi mendalam ikatan karbohidrat22. Metode ini menggunakan antibodi monoklonal (mAb) yang diarahkan ke glikana dinding sel tanaman sebagai probe untuk memahami hubungan karbohidrat kompleks. Lebih dari 250 mAb tersedia di seluruh dunia, dirancang untuk melawan berbagai oligosakarida linier dan bercabang menggunakan berbagai sakarida24. Beberapa mAb telah banyak digunakan untuk mengkarakterisasi struktur, komposisi, dan modifikasi dinding sel tanaman, karena terdapat perbedaan yang signifikan tergantung pada jenis sel tanaman, organ, usia, tahap perkembangan, dan lingkungan pertumbuhan25,26. Baru-baru ini, metode ini telah digunakan untuk memahami populasi vesikel dalam sistem tanaman dan hewan serta perannya masing-masing dalam transportasi glikana sebagaimana ditentukan oleh penanda subseluler, tahap perkembangan, atau rangsangan lingkungan, dan untuk menentukan aktivitas enzimatik. Beberapa struktur glikana dan xilana berbeda yang telah diidentifikasi meliputi pektin (P), xilana (X), manan (M), xiloglukana (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoksilana (ArbX), galaktomanan (GalG), asam glukuronat-arabinoksilana (GArbX) dan arabino-galaktan (ArbG)29.
Akan tetapi, terlepas dari semua upaya penelitian ini, hanya sedikit penelitian yang berfokus pada sifat akumulasi oligosakarida selama hidrolisis beban padatan tinggi (HSL), termasuk pelepasan oligosakarida, perubahan panjang rantai oligomerik selama hidrolisis, berbagai polimer DP rendah, dan kurva distribusinya 30,31,32. Sementara itu, meskipun analisis glikana telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis komprehensif struktur glikana, sulit untuk mengevaluasi oligosakarida DP rendah yang larut dalam air menggunakan metode antibodi. Oligosakarida DP yang lebih kecil dengan berat molekul kurang dari 5-10 kDa tidak terikat pada pelat ELISA 33, 34 dan terhanyut sebelum penambahan antibodi.
Di sini, untuk pertama kalinya, kami menunjukkan uji ELISA pada pelat berlapis avidin menggunakan antibodi monoklonal, yang menggabungkan prosedur biotinilasi satu langkah untuk oligosakarida refraktori yang larut dengan analisis glikom. Pendekatan kami terhadap analisis glikom divalidasi oleh analisis berbasis MALDI-TOF-MS dan GC-MS dari hubungan oligosakarida komplementer menggunakan derivatisasi trimetilsilil (TMS) dari komposisi gula terhidrolisis. Pendekatan inovatif ini dapat dikembangkan sebagai metode dengan hasil tinggi di masa mendatang dan menemukan aplikasi yang lebih luas dalam penelitian biomedis35.
Modifikasi pascatranslasi enzim dan antibodi, seperti glikosilasi,36 memengaruhi aktivitas biologisnya. Misalnya, perubahan glikosilasi protein serum berperan penting dalam radang sendi, dan perubahan glikosilasi digunakan sebagai penanda diagnostik37. Berbagai glikana telah dilaporkan dalam literatur yang mudah muncul dalam berbagai penyakit, termasuk penyakit radang kronis pada saluran pencernaan dan hati, infeksi virus, kanker ovarium, payudara, dan prostat38,39,40. Memahami struktur glikana menggunakan metode ELISA glikana berbasis antibodi akan memberikan keyakinan tambahan dalam diagnosis penyakit tanpa menggunakan metode MS yang rumit.
Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa oligosakarida yang membandel tetap tidak terhidrolisis setelah praperlakuan dan hidrolisis enzimatik (Gambar 1). Dalam karya kami yang dipublikasikan sebelumnya, kami mengembangkan metode ekstraksi fase padat arang aktif untuk mengisolasi oligosakarida dari hidrolisat tongkol jagung praperlakuan AFEX (ACSH)8. Setelah ekstraksi dan pemisahan awal, oligosakarida selanjutnya difraksinasi dengan kromatografi pengecualian ukuran (SEC) dan dikumpulkan berdasarkan berat molekul. Monomer gula dan oligomer yang dilepaskan dari berbagai praperlakuan dianalisis dengan analisis komposisi gula. Ketika membandingkan kandungan oligomer gula yang diperoleh dengan berbagai metode praperlakuan, keberadaan oligosakarida yang membandel merupakan masalah umum dalam konversi biomassa menjadi monosakarida dan dapat menyebabkan penurunan hasil gula setidaknya 10-15% dan bahkan hingga 18%. AS. Metode ini digunakan untuk produksi fraksi oligosakarida skala besar lebih lanjut. ACH yang dihasilkan dan fraksi-fraksi berikutnya dengan berat molekul berbeda digunakan sebagai bahan percobaan untuk karakterisasi oligosakarida dalam penelitian ini.
Setelah praperlakuan dan hidrolisis enzimatik, oligosakarida persisten tetap tidak terhidrolisis. Berikut (A) adalah metode pemisahan oligosakarida di mana oligosakarida diisolasi dari hidrolisat jerami jagung praperlakuan AFEX (ACSH) menggunakan lapisan padat karbon aktif dan tanah diatom; (B) Metode untuk pemisahan oligosakarida. Oligosakarida selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi pengecualian ukuran (SEC); (C) Monomer dan oligomer sakarida dilepaskan dari berbagai praperlakuan (asam encer: DA, cairan ionik: IL dan AFEX). Kondisi hidrolisis enzimatik: pemuatan padatan tinggi sebesar 25% (b/b) (sekitar 8% pemuatan glukan), hidrolisis 96 jam, pemuatan enzim komersial 20 mg/g (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dan (D) Monomer gula dan oligomer glukosa, xilosa dan arabinosa yang dilepaskan dari tongkol jagung pra-perlakuan AFEX (ACS).
Analisis glikana telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis struktural glikana yang komprehensif dalam ekstrak yang diisolasi dari residu biomassa padat. Namun, sakarida yang larut dalam air kurang terwakili menggunakan metode tradisional ini41 karena oligosakarida dengan berat molekul rendah sulit diimobilisasi pada pelat ELISA dan dicuci sebelum penambahan antibodi. Oleh karena itu, untuk pengikatan dan karakterisasi antibodi, metode biotinilasi satu langkah digunakan untuk melapisi oligosakarida yang larut dan tidak patuh pada pelat ELISA berlapis avidin. Metode ini diuji menggunakan ACSH yang kami produksi sebelumnya dan fraksi berdasarkan berat molekulnya (atau derajat polimerisasi, DP). Biotinilasi satu langkah digunakan untuk meningkatkan afinitas pengikatan oligosakarida dengan menambahkan biotin-LC-hidrazida ke ujung pereduksi karbohidrat (Gbr. 2). Dalam larutan, gugus hemiasetal pada ujung pereduksi bereaksi dengan gugus hidrazida dari biotin-LC-hidrazida untuk membentuk ikatan hidrazon. Dengan adanya agen pereduksi NaCNBH3, ikatan hidrazon direduksi menjadi produk akhir biotinilasi yang stabil. Dengan modifikasi ujung pereduksi gula, pengikatan oligosakarida DP rendah ke pelat ELISA menjadi mungkin, dan dalam penelitian kami hal ini dilakukan pada pelat berlapis avidin menggunakan mAb yang ditargetkan pada glikana.
Penyaringan antibodi monoklonal berdasarkan ELISA untuk oligosakarida yang terbiotinilasi. Berikut (A) biotinilasi gabungan oligosakarida dan penyaringan ELISA berikutnya dengan mAb yang ditargetkan pada glikana pada pelat berlapis NeutrAvidin dan (B) menunjukkan prosedur satu langkah untuk biotinilasi produk reaksi.
Pelat berlapis avidin dengan antibodi terkonjugasi oligosakarida kemudian ditambahkan ke antibodi primer dan sekunder dan dicuci dalam media yang peka terhadap cahaya dan waktu. Setelah pengikatan antibodi selesai, tambahkan substrat TMB untuk menginkubasi pelat. Reaksi akhirnya dihentikan dengan asam sulfat. Pelat yang diinkubasi dianalisis menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan kekuatan pengikatan setiap antibodi guna mendeteksi ikatan silang spesifik antibodi. Untuk detail dan parameter percobaan, lihat bagian terkait “Bahan dan Metode”.
Kami menunjukkan kegunaan metode yang baru dikembangkan ini untuk aplikasi spesifik dengan mengkarakterisasi oligosakarida terlarut yang ada dalam ACSH serta dalam fraksi oligosakarida mentah dan murni yang diisolasi dari hidrolisat lignoselulosa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, xilan tersubstitusi epitop yang paling umum diidentifikasi dalam ACSH menggunakan metode uji glikom bioasilasi biasanya adalah uronik (U) atau metiluronat (MeU) dan arabinogalaktan pektik. Sebagian besar dari mereka juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya tentang analisis glikana padatan tak terhidrolisis (UHS)43.
Deteksi epitop oligosakarida yang membandel menggunakan antibodi monoklonal yang diarahkan ke glikana dinding sel. Fraksi "netral" adalah fraksi ACN dan fraksi "asam" adalah fraksi FA. Warna merah yang lebih terang pada peta panas menunjukkan kandungan epitop yang lebih tinggi, dan warna biru yang lebih terang menunjukkan latar belakang kosong. Nilai warna pada skala didasarkan pada nilai OD mentah untuk formulasi N=2. Epitop utama yang dikenali oleh antibodi ditunjukkan di sebelah kanan.
Struktur non-selulosa ini tidak dapat dibelah oleh selulase dan hemiselulase yang paling umum dalam campuran enzim komersial yang diuji, yang mencakup enzim komersial yang paling umum digunakan. Oleh karena itu, enzim tambahan baru diperlukan untuk hidrolisisnya. Tanpa enzim aksesori non-selulosa yang diperlukan, ikatan non-selulosa ini mencegah konversi lengkap menjadi monosakarida, bahkan jika polimer gula induknya dihidrolisis secara ekstensif menjadi fragmen yang lebih pendek dan dilarutkan menggunakan campuran enzim komersial.
Studi lebih lanjut tentang distribusi sinyal dan kekuatan pengikatannya menunjukkan bahwa epitop pengikat lebih rendah dalam fraksi gula DP tinggi (A, B, C, DP hingga 20+) daripada dalam fraksi DP rendah (D, E, F, DP) dalam dimer) (Gbr. 1). Fragmen asam lebih umum pada epitop non-selulosa daripada fragmen netral. Fenomena ini konsisten dengan pola yang diamati dalam penelitian kami sebelumnya, di mana DP tinggi dan gugus asam lebih tahan terhadap hidrolisis enzimatik. Oleh karena itu, keberadaan epitop glikana non-selulosa dan substitusi U dan MeU dapat berkontribusi besar pada stabilitas oligosakarida. Perlu dicatat bahwa efisiensi pengikatan dan deteksi dapat menjadi masalah bagi oligosakarida DP rendah, terutama jika epitopnya adalah oligosakarida dimerik atau trimerik. Ini dapat diuji menggunakan oligosakarida komersial dengan panjang yang berbeda, masing-masing hanya mengandung satu epitop yang mengikat mAb tertentu.
Dengan demikian, penggunaan antibodi spesifik struktur mengungkap beberapa jenis ikatan yang sulit dipisahkan. Bergantung pada jenis antibodi yang digunakan, pola ligasi yang tepat, dan kekuatan sinyal yang dihasilkannya (paling banyak dan paling sedikit), enzim baru dapat diidentifikasi dan ditambahkan secara semi-kuantitatif ke dalam campuran enzim untuk glikokonversi yang lebih lengkap. Dengan mengambil contoh analisis oligosakarida ACSH, kita dapat membuat basis data ikatan glikana untuk setiap bahan biomassa. Perlu dicatat di sini bahwa afinitas antibodi yang berbeda harus diperhitungkan, dan jika afinitasnya tidak diketahui, ini akan menimbulkan kesulitan tertentu saat membandingkan sinyal antibodi yang berbeda. Selain itu, perbandingan ikatan glikana dapat bekerja paling baik antara sampel untuk antibodi yang sama. Ikatan yang sulit dipisahkan ini kemudian dapat dihubungkan ke basis data CAZyme, yang darinya kita dapat mengidentifikasi enzim, memilih enzim kandidat dan menguji enzim pemutus ikatan, atau mengembangkan sistem mikroba untuk mengekspresikan enzim ini untuk digunakan dalam biorefineri44.
Untuk mengevaluasi bagaimana metode imunologi melengkapi metode alternatif untuk mengkarakterisasi oligosakarida dengan berat molekul rendah yang terdapat dalam hidrolisat lignoselulosa, kami melakukan MALDI (Gbr. 4, S1-S8) dan analisis sakarida turunan TMS berdasarkan GC-MS pada panel yang sama (Gbr. 5) bagian oligosakarida. MALDI digunakan untuk membandingkan apakah distribusi massa molekul oligosakarida sesuai dengan struktur yang dimaksudkan. Pada gbr. 4 menunjukkan MC dari komponen netral ACN-A dan ACN-B. Analisis ACN-A mengonfirmasi berbagai gula pentosa mulai dari DP 4–8 (Gbr. 4) hingga DP 22 (Gbr. S1), yang beratnya sesuai dengan oligosakarida MeU-xilan. Analisis ACN-B mengonfirmasi seri pentosa dan glukoksilan dengan DP 8-15. Dalam materi tambahan seperti Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C menunjukkan berbagai gula pentosa tersubstitusi (Me)U dengan DP 8-15 yang konsisten dengan xilan tersubstitusi yang ditemukan dalam skrining mAb berbasis ELISA. Epitopnya konsisten.
Spektrum MALDI-MS dari oligosakarida non-patuh yang larut yang terdapat dalam ACS. Berikut ini, (A) Fraksi rentang berat rendah ACN-A yang mengandung oligosakarida glukuroxilat yang disubstitusi oleh asam uronat termetilasi (DP 4-8) dan (B) xilan ACN-B dan oligosakarida asam uronat termetilasi yang disubstitusi oleh glukuroxilat (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glikana dari oligosakarida refraktori. Berikut (A) Komposisi sakarida TMS dari berbagai fraksi oligosakarida yang diperoleh menggunakan analisis GC-MS. (B) Struktur berbagai gula turunan TMS yang terdapat dalam oligosakarida. ACN – fraksi asetonitril yang mengandung oligosakarida netral dan FA – fraksi asam ferulat yang mengandung oligosakarida asam.
Kesimpulan menarik lainnya diambil dari analisis LC-MS dari fraksi oligosakarida, seperti yang ditunjukkan pada Gambar S9 (metode dapat dilihat pada materi suplemen elektronik). Fragmen gugus heksosa dan -OAc berulang kali diamati selama ligasi fraksi ACN-B. Temuan ini tidak hanya mengonfirmasi fragmentasi yang diamati dalam analisis glikom dan MALDI-TOF, tetapi juga memberikan informasi baru tentang potensi turunan karbohidrat dalam biomassa lignoselulosa yang telah diolah terlebih dahulu.
Kami juga menganalisis komposisi gula dari fraksi oligosakarida menggunakan derivatisasi gula TMS. Menggunakan GC-MS, kami menentukan komposisi gula neural (non-derivatif) dan gula asam (GluA dan GalA) dalam fraksi oligosakarida (Gbr. 5). Asam glukuronat ditemukan dalam komponen asam C dan D, sedangkan asam galakturonat ditemukan dalam komponen asam A dan B, yang keduanya merupakan komponen DP tinggi dari gula asam. Hasil ini tidak hanya mengonfirmasi data ELISA dan MALDI kami, tetapi juga konsisten dengan penelitian kami sebelumnya tentang akumulasi oligosakarida. Oleh karena itu, kami percaya bahwa metode imunologi modern menggunakan biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA berikutnya cukup untuk mendeteksi oligosakarida rekalsitran yang larut dalam berbagai sampel biologis.
Karena metode penyaringan mAb berbasis ELISA telah divalidasi oleh beberapa metode yang berbeda, kami ingin lebih jauh mengeksplorasi potensi metode kuantitatif baru ini. Dua oligosakarida komersial, xiloheksasakarida oligosakarida (XHE) dan 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), dibeli dan diuji menggunakan pendekatan mAb baru yang menargetkan glikana dinding sel. Gambar 6 menunjukkan korelasi linear antara sinyal pengikatan terbiotinilasi dan konsentrasi logaritma dari konsentrasi oligosakarida, yang menunjukkan kemungkinan model adsorpsi Langmuir. Di antara mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, dan CCRC-M151 berkorelasi dengan XHE, dan CCRC-M108, CCRC-M109, dan LM11 berkorelasi dengan A2XX pada rentang 1 nm hingga 100 nano. Karena terbatasnya ketersediaan antibodi selama percobaan, percobaan terbatas dilakukan dengan setiap konsentrasi oligosakarida. Perlu dicatat di sini bahwa beberapa antibodi bereaksi sangat berbeda terhadap oligosakarida yang sama sebagai substrat, mungkin karena mereka mengikat epitop yang sedikit berbeda dan dapat memiliki afinitas pengikatan yang sangat berbeda. Mekanisme dan implikasi identifikasi epitop yang akurat akan jauh lebih kompleks ketika pendekatan mAb baru diterapkan pada sampel nyata.
Dua oligosakarida komersial digunakan untuk menentukan rentang deteksi berbagai mAb yang menargetkan glikana. Di sini, korelasi linier dengan logaritma konsentrasi oligosakarida menunjukkan pola adsorpsi Langmuir untuk (A) XHE dengan mAb dan (B) A2XX dengan mAb. Epitop yang sesuai menunjukkan struktur oligosakarida komersial yang digunakan sebagai substrat dalam pengujian.
Penggunaan antibodi monoklonal yang ditargetkan pada glikana (analisis glikokomik atau penyaringan mAb berbasis ELISA) merupakan alat yang ampuh untuk karakterisasi mendalam sebagian besar glikana dinding sel utama yang membentuk biomassa tanaman. Namun, analisis glikana klasik hanya mengkarakterisasi glikana dinding sel yang lebih besar, karena sebagian besar oligosakarida tidak diimobilisasi secara efisien pada pelat ELISA. Dalam penelitian ini, tongkol jagung yang diolah terlebih dahulu dengan AFEX dihidrolisis secara enzimatis pada kandungan padatan yang tinggi. Analisis gula digunakan untuk menentukan komposisi karbohidrat dinding sel yang membandel dalam hidrolisat. Namun, analisis mAb oligosakarida yang lebih kecil dalam hidrolisat diremehkan, dan alat tambahan diperlukan untuk mengimobilisasi oligosakarida secara efektif pada pelat ELISA.
Di sini kami melaporkan metode imobilisasi oligosakarida yang baru dan efisien untuk penyaringan mAb dengan menggabungkan biotinilasi oligosakarida yang diikuti oleh penyaringan ELISA pada pelat berlapis NeutrAvidin™. Oligosakarida biotinilasi yang diimobilisasi menunjukkan afinitas yang cukup terhadap antibodi untuk memungkinkan deteksi oligosakarida yang membandel secara cepat dan efisien. Analisis komposisi oligosakarida yang membandel ini berdasarkan spektrometri massa mengonfirmasi hasil pendekatan baru untuk penyaringan imun ini. Dengan demikian, penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA dengan antibodi monoklonal yang ditargetkan pada glikana dapat digunakan untuk mendeteksi ikatan silang dalam oligosakarida dan dapat diterapkan secara luas dalam penelitian biokimia lainnya yang mengkarakterisasi struktur oligosakarida.
Metode pembuatan profil glikana berbasis biotin ini merupakan laporan pertama yang mampu menyelidiki ikatan karbohidrat yang membandel dari oligosakarida terlarut dalam biomassa tanaman. Hal ini membantu untuk memahami mengapa beberapa bagian biomassa sangat membandel dalam hal produksi biofuel. Metode ini mengisi celah penting dalam metode analisis glikoma dan memperluas penerapannya ke berbagai substrat yang lebih luas di luar oligosakarida tanaman. Di masa mendatang, kami dapat menggunakan robotika untuk biotinilasi dan menggunakan metode yang telah kami kembangkan untuk analisis sampel dengan hasil tinggi menggunakan ELISA.
Jerami jagung (CS) yang ditanam dari benih hibrida Pioneer 33A14 dipanen pada tahun 2010 dari Kramer Farms di Ray, Colorado. Dengan izin dari pemilik lahan, biomassa ini dapat digunakan untuk penelitian. Sampel disimpan dalam keadaan kering < 6% kadar air dalam kantong ziplock pada suhu ruangan. Sampel disimpan dalam keadaan kering < 6% kadar air dalam kantong ziplock pada suhu ruangan. Jumlah Pinjaman yang Dibayar untuk Pembayaran < 6% dalam Paket с застежкой-молнией при комнатной suhu. Sampel disimpan dalam keadaan kering pada kelembapan <6% dalam kantong yang dilengkapi ritsleting pada suhu ruangan.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。foto < 6% Tingkat bunga yang melebihi batas suhu < 6%. Sampel disimpan dalam kantong ritsleting pada suhu ruangan dengan kelembapan < 6%.Studi ini mematuhi pedoman lokal dan nasional. Analisis komposisi dilakukan menggunakan protokol NREL. Komposisi tersebut ditemukan mengandung 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protein dan 13,4% abu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) merupakan campuran kompleks selulase, β-glukosidase, dan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) dari Novozymes (Franklinton, NC, AS). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim pendegradasi pektin, disumbangkan oleh DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, AS). Konsentrasi protein enzim ditentukan dengan memperkirakan kandungan protein (dan mengurangi kontribusi nitrogen non-protein) menggunakan analisis nitrogen Kjeldahl (metode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, AS). Tanah diatom 545 dibeli dari EMD Millipore (Billerica, MA). Karbon aktif (DARCO, butiran 100 mesh), Avicel (PH-101), beech xilan, dan semua bahan kimia lainnya dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Praperlakuan AFEX dilakukan di GLBRC (Laboratorium Penelitian Konversi Biomassa, MSU, Lansing, MI, AS). Praperlakuan dilakukan pada suhu 140° C selama 15 menit. Waktu tinggal 46 menit pada rasio 1:1 amonia anhidrat terhadap biomassa pada beban 60% (b/b) dalam reaktor batch benchtop baja tahan karat (Parr Instruments Company). Proses ini memakan waktu 30 menit. Reaktor dipanaskan hingga mencapai suhu 140° C dan amonia dilepaskan dengan cepat, sehingga biomassa dapat kembali ke suhu ruangan dengan cepat. Komposisi jerami jagung praperlakuan AFEX (ACS) mirip dengan jerami jagung yang tidak diolah (UT-CS).
Padatan tinggi ACSH 25% (b/b) (sekitar 8% pemuatan dekstran) disiapkan sebagai bahan awal untuk produksi oligosakarida skala besar. Hidrolisis enzimatik ACS dilakukan dengan menggunakan campuran enzim komersial termasuk Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (dalam biomassa yang diolah terlebih dahulu), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan, dan Multifect Pectinase (Genencor Inc, AS). ). ), 5 mg protein/g dekstran. Hidrolisis enzimatik dilakukan dalam bioreaktor 5 liter dengan volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50°C dan 250 rpm. Setelah hidrolisis selama 96 jam, hidrolisat dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 menit dan kemudian pada 14000 rpm selama 30 menit untuk menghilangkan padatan yang tidak terhidrolisis. Hidrolisat kemudian disaring secara steril melalui gelas kimia penyaring 0,22 mm. Hidrolisat yang telah disaring disimpan dalam botol steril pada suhu 4° C dan kemudian difraksinasi dengan karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa berbasis ekstrak menurut prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel untuk analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) dan penentuan karbohidrat struktural dan lignin dalam biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida dari aliran hidrolisat dilakukan pada skala 2 ml menggunakan metode hidrolisis asam berbasis autoklaf. Campurkan sampel hidrolisat dengan 69,7 µl asam sulfat 72% dalam tabung kultur tutup ulir 10 ml dan inkubasi selama 1 jam di atas meja kerja pada suhu 121 °C, dinginkan di atas es dan saring ke dalam vial kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Konsentrasi oligosakarida ditentukan dengan mengurangi konsentrasi monosakarida dalam sampel yang tidak terhidrolisis dari konsentrasi gula total dalam sampel yang terhidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, dan arabinosa dalam biomassa yang dihidrolisis asam dianalisis menggunakan sistem HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan autosampler, pemanas kolom, pompa isokratik, dan detektor indeks bias pada kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolom dipertahankan pada suhu 50°C dan dielusi dengan 0,6 ml/menit 5 mM H2SO4 dalam air.
Supernatan hidrolisat diencerkan dan dianalisis untuk kandungan monomer dan oligosakarida. Gula monomerik yang diperoleh setelah hidrolisis enzimatik dianalisis dengan HPLC yang dilengkapi dengan kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dan kolom pelindung abu. Suhu kolom dipertahankan pada 80°C, air digunakan sebagai fase gerak dengan laju alir 0,6 ml/menit. Oligosakarida ditentukan dengan hidrolisis dalam asam encer pada suhu 121°C menurut metode yang dijelaskan dalam ref. 41, 48, 49.
Analisis sakarida dilakukan pada biomassa residu mentah, pra-perlakuan AFEX dan semua residu non-hidrolisis (termasuk produksi ekstrak dinding sel serial dan skrining mAb mereka) menggunakan prosedur yang dijelaskan sebelumnya 27, 43, 50, 51 . Untuk analisis glikom, residu bahan dinding sel tanaman yang tidak larut dalam alkohol disiapkan dari residu biomassa dan dikenakan ekstraksi serial dengan reagen yang semakin agresif seperti amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM dan 0,5% b/v), CON. (1M dan 4M, keduanya dengan 1% b/v natrium borohidrida) dan klorit asam seperti yang dijelaskan sebelumnya52,53. Ekstrak kemudian dikenakan ELISA terhadap panel kompleks mAb50 yang diarahkan ke glikana dinding sel, dan reaksi pengikatan mAb disajikan sebagai peta panas. mAb yang menargetkan glikana dinding sel tanaman dibeli dari stok laboratorium (seri CCRC, JIM dan MAC).
Biotinilasi satu tahap oligosakarida. Konjugasi karbohidrat dengan biotin-LC-hidrazida dilakukan menggunakan prosedur berikut. Biotin-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) dengan pengadukan kuat dan pemanasan pada suhu 65°C selama 1 menit. Asam asetat glasial (30 µl) ditambahkan dan campuran dituangkan ke natrium sianoborohidrida (6,4 mg/100 µmol) dan larut sepenuhnya setelah pemanasan pada suhu 65°C selama sekitar 1 menit. Kemudian, 5 hingga 8 μl campuran reaksi ditambahkan ke oligosakarida kering (1-100 nmol) untuk memperoleh kelebihan molar label 10 kali lipat atau lebih di atas ujung pereduksi. Reaksi dilakukan pada suhu 65°C selama 2 jam, setelah itu sampel segera dimurnikan. Tidak ada natrium sianoborohidrida yang digunakan dalam percobaan pelabelan tanpa reduksi, dan sampel direaksikan pada suhu 65° C selama 2,5 jam.
Pelapisan dan pencucian ELISA pada sampel oligosakarida terbiotinilasi. Sebanyak 25 μl sampel terbiotinilasi (100 μl dari setiap sampel pekat yang diencerkan dalam 5 ml larutan penyangga Tris (TBS) 0,1 M) ditambahkan ke setiap sumur pelat berlapis avidin. Sumur kontrol dilapisi dengan 50 μl biotin pada konsentrasi 10 μg/ml dalam TBS 0,1 M. Air deionisasi digunakan sebagai pelapis untuk pengukuran blanko. Tablet diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruangan dalam gelap. Cuci pelat sebanyak 3 kali dengan susu skim 0,1% dalam TBS 0,1 M menggunakan program no. 11 untuk Grenier flat 3A.
Penambahan dan pencucian antibodi primer. Tambahkan 40 µl antibodi primer ke setiap sumur. Inkubasi mikroplat selama 1 jam pada suhu ruangan dalam keadaan gelap. Plat kemudian dicuci 3 kali dengan susu 0,1% dalam TBS 0,1M menggunakan program pencucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambahkan antibodi sekunder dan cuci. Tambahkan 50 µl antibodi sekunder tikus (diencerkan 1:5000 dalam susu 0,1% dalam TBS 0,1 M) ke setiap sumur. Inkubasi pelat mikro selama 1 jam pada suhu ruangan dalam keadaan gelap. Pelat mikro kemudian dicuci 5 kali dengan susu 0,1% dalam TBS 0,1 M menggunakan program pencucian pelat Grenier Flat 5A #12.
Menambahkan substrat. Tambahkan 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ke substrat dasar (dengan menambahkan 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogen peroksida ke dalam 15 ml air deionisasi). Siapkan substrat TMB. dan aduk sebelum digunakan). Inkubasi pelat mikro pada suhu ruangan selama 30 menit. Dalam gelap.
Selesaikan langkah ini dan baca tabletnya. Tambahkan 50 µl asam sulfat 1 N ke setiap sumur dan catat absorbansi dari 450 hingga 655 nm menggunakan pembaca ELISA.
Siapkan larutan 1 mg/ml analit berikut dalam air deionisasi: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmanosamin (manNAc), N-asetilglukosamin (glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inositol (standar internal). Dua standar disiapkan dengan menambahkan larutan gula 1 mg/mL yang ditunjukkan pada Tabel 1. Sampel dibekukan dan dikeringkan dalam suhu beku pada -80° C hingga semua air hilang (biasanya sekitar 12-18 jam).
Tambahkan 100–500 µg sampel ke tabung bertutup ulir pada neraca analitik. Catat jumlah yang ditambahkan. Cara terbaik adalah melarutkan sampel dalam konsentrasi pelarut tertentu dan menambahkannya ke tabung sebagai alikuot cair. Gunakan 20 µl inositol 1 mg/ml sebagai standar internal untuk setiap tabung sampel. Jumlah standar internal yang ditambahkan ke sampel harus sama dengan jumlah standar internal yang ditambahkan ke tabung standar.
Tambahkan 8 ml metanol anhidrat ke dalam botol bertutup ulir. Kemudian tambahkan 4 ml larutan HCl metanol 3 N, tutup dan kocok. Proses ini tidak menggunakan air.
Tambahkan 500 µl larutan metanol HCl 1 M ke sampel oligosakarida dan tabung TMS standar. Sampel diinkubasi semalaman (168 jam) pada suhu 80° C dalam blok termal. Keringkan produk metanolisis pada suhu kamar menggunakan manifold pengering. Tambahkan 200 µl MeOH dan keringkan lagi. Proses ini diulang dua kali. Tambahkan 200 µl metanol, 100 µl piridina, dan 100 µl anhidrida asetat ke sampel dan aduk rata. Sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, lalu dikeringkan. Tambahkan 200 µl metanol dan keringkan lagi.
Tambahkan 200 µl Tri-Sil dan panaskan tabung tertutup selama 20 menit. 80°C, lalu dinginkan hingga suhu ruangan. Gunakan manifold pengering untuk mengeringkan sampel lebih lanjut hingga volume sekitar 50 µl. Penting untuk dicatat bahwa kami tidak membiarkan sampel mengering sepenuhnya.
Tambahkan 2 ml heksana dan aduk rata dengan cara dipusarkan. Isi ujung pipet Pasteur (5-8 mm) dengan sepotong wol kaca dengan cara memasukkan wol kaca tersebut di atas pipet berdiameter 5-3/4 inci. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 3000 g selama 2 menit. Residu yang tidak larut diendapkan. Keringkan sampel hingga mencapai 100-150 µl. Volume sekitar 1 μl disuntikkan ke dalam GC-MS pada suhu awal 80 °C dan waktu awal 2,0 menit (Tabel 2).