Daalụ maka ileta Nature.com.Ụdị ihe nchọgharị ị na-eji nwere nkwado CSS nwere oke.Maka ahụmịhe kachasị mma, anyị na-akwado ka ị jiri ihe nchọgharị emelitere (ma ọ bụ gbanyụọ ọnọdụ ndakọrịta na Internet Explorer).Ka ọ dị ugbu a, iji hụ na nkwado na-aga n'ihu, anyị ga-enye saịtị ahụ na-enweghị ụdị na Javascript.
Liquid biopsy (LB) bụ echiche nke na-enweta ngwa ngwa ewu ewu na ngalaba biomedical.Echiche a dabere na nchọpụta nke iberibe DNA na-ekesa extracellular (ccfDNA), nke a na-ewepụtakarị dị ka obere iberibe mgbe mkpụrụ ndụ nwụsịrị n'anụ ahụ dị iche iche.Obere akụkụ nke mpekere ndị a sitere na anụ ahụ ma ọ bụ ihe dị ndụ nke mba ọzọ (ndị mba ọzọ).N'ime ọrụ ugbu a, anyị etinyewo echiche a na mọsel, ụdị sentinel mara maka ikike nzacha mmiri dị elu.Anyị na-eji ike mọsel mee ihe dị ka ihe nzacha okike iji weghara iberibe DNA gburugburu ebe obibi sitere n'ebe dị iche iche iji nye ozi gbasara ụdị dị iche iche nke gburugburu ebe obibi dị n'ụsọ oké osimiri.Nsonaazụ anyị gosiri na hemolymph mussel nwere iberibe DNA dị iche iche na nha, site na 1 ruo 5 kb.Usoro nke égbè gosiri na ọnụ ọgụgụ buru ibu nke iberibe DNA sitere na microbial mba ọzọ.N'ime ha, anyị chọtara iberibe DNA sitere na nje bacteria, archaea, na nje, gụnyere nje ndị a maara na-ebute ụdị ndị agha dị iche iche a na-ahụkarị na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ oké osimiri.N'ikpeazụ, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na echiche nke LB a na-etinye na mọsel na-anọchi anya isi iyi nke ihe ọmụma bara ụba mana nke a na-achọpụtabeghị banyere ụdị dị iche iche nke microbial dị na gburugburu ebe obibi dị n'ụsọ oké osimiri.
Mmetụta nke mgbanwe ihu igwe (CC) na ihe dị iche iche nke gburugburu ebe obibi mmiri bụ mpaghara nyocha na-eto ngwa ngwa.Okpomọkụ zuru ụwa ọnụ ọ bụghị nanị na-akpata nrụgide physiological dị mkpa, kamakwa ọ na-akwalite njedebe evolushọn nke nkwụsi ike nke ihe ndị dị ndụ n'oké osimiri, na-emetụta ebe obibi nke ọtụtụ ụdị, na-akpali ha ịchọ ọnọdụ ndị ka mma [1, 2].Na mgbakwunye na imetụta ụdị ndụ metazoan dị iche iche, CC na-akpaghasị nguzozi siri ike nke mmekọrịta ndị ọbịa-microbial.Nke a microbial dysbacteriosis na-etinye ihe egwu dị egwu na gburugburu ebe obibi mmiri ka ọ na-eme ka ihe ndị dị n'ime mmiri na-ebute ọrịa na-efe efe [3, 4].A kwenyere na SS na-ekere òkè dị mkpa n'ịnwụ ọnwụ, nke bụ nsogbu siri ike maka njikwa gburugburu ebe obibi mmiri zuru ụwa ọnụ [5, 6].Nke a bụ okwu dị mkpa nyere mmetụta akụ na ụba, gburugburu ebe obibi na nri nke ọtụtụ ụdị mmiri.Nke a bụ eziokwu karịsịa maka bivalves bi na mpaghara pola, ebe mmetụta CK na-adị ngwa ngwa ma dị njọ [6, 7].N'ezie, bivalves dị ka Mytilus spp.A na-eji ọtụtụ ebe iji nyochaa mmetụta CC na gburugburu ebe obibi mmiri.Ọ bụghị ihe mgbagwoju anya, e mepụtala ọnụ ọgụgụ dị ukwuu nke biomarkers iji nyochaa ahụike ha, na-ejikarị usoro abụọ na-agụnye ihe ndị na-emepụta ihe na-arụ ọrụ nke dabeere na ọrụ enzymatic ma ọ bụ ọrụ cellular dị ka ndụ cell na ọrụ phagocytic [8].Ụzọ ndị a na-agụnyekwa nleba anya nke ndị na-egosi nrụgide kpọmkwem nke na-agbakọta na anụ ahụ dị nro mgbe a na-enweta nnukwu mmiri mmiri.Otú ọ dị, ikike nzacha dị elu na usoro mgbasa ozi nke ọkara-emeghe nke bivalves na-enye ohere ịmepụta ihe ọhụrụ hemolymph biomarkers site na iji echiche nke mmiri mmiri biopsy (LB), ụzọ dị mfe na nke dị ntakịrị na-emerụ ahụ maka nlekọta ndị ọrịa.nlele ọbara [9, 10].Ọ bụ ezie na enwere ike ịhụ ụdị mkpụrụ ndụ dị iche iche na-ekesa na LB mmadụ, echiche a dabere na nyocha usoro DNA nke na-ekesa extracellular DNA (ccfDNA) na plasma.N'ezie, ọnụnọ nke DNA na-ekesa na plasma mmadụ ka amaara kemgbe etiti narị afọ nke 20 [11], mana ọ bụ naanị n'afọ ndị na-adịbeghị anya ka ọbịbịa nke usoro usoro usoro dị elu mere ka nchoputa ụlọ ọgwụ dabere na ccfDNA.Ọnụnọ nke iberibe DNA ndị a na-ekesa bụ akụkụ nke ntọhapụ nke DNA genomic (nuuclear na mitochondrial) mgbe mkpụrụ ndụ nwụsịrị. N'ime ndị nwere ahụike, ntinye nke ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL) mana enwere ike ịbawanye ya ugboro 5-10 na ndị ọrịa na-arịa ọrịa dị iche iche ma ọ bụ nwee nrụgide, na-ebute mmebi anụ ahụ. N'ime ndị nwere ahụike, ntinye nke ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL) mana enwere ike ịbawanye ya ugboro 5-10 na ndị ọrịa na-arịa ọrịa dị iche iche ma ọ bụ nwee nrụgide, na-ebute mmebi anụ ahụ. У здоровых людей концентрасия ологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. N'ime ndị ahụ siri ike, ntinye nke cccDNA na-adịkarị ala (<10 ng/mL), mana ọ nwere ike ịbawanye site na 5-10 ugboro na ndị ọrịa nwere ọrịa dị iche iche ma ọ bụ n'okpuru nrụgide nke na-eduga ná mmebi anụ ahụ..从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 低 （<10 ng/ml） 在 各 种5-10 从而 组织。 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) тологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ntinye uche ccfDNA na-adịkarị ala (<10 ng/ml) na ndị nwere ahụike, mana enwere ike ịbawanye ugboro 5-10 na ndị ọrịa nwere ọrịa dị iche iche ma ọ bụ nrụgide, na-ebute mmebi anụ ahụ.Ogo nke iberibe ccfDNA dịgasị iche iche, mana na-adịkarị site na 150 ruo 200 bp.[12].Nyocha nke ccfDNA enwetara onwe ya, ya bụ, ccfDNA sitere na sel nkịtị ma ọ bụ gbanwee, enwere ike iji chọpụta mkpụrụ ndụ ihe nketa na mgbanwe epigenetic dị na genome nuklia na / ma ọ bụ mitochondrial, si otú a na-enyere ndị dọkịta aka ịhọrọ usoro ọgwụgwọ ezubere iche nke molecular [13].Agbanyeghị, enwere ike nweta ccfDNA site na isi mmalite ndị mba ọzọ dị ka ccfDNA sitere na mkpụrụ ndụ nwa ebu n'afọ n'oge ime ime ma ọ bụ site na akụkụ ahụ a tụgharịrị [14,15,16,17].ccfDNA bụkwa isi mmalite nke ozi maka ịchọpụta ọnụnọ nke nucleic acids nke nje na-efe efe (mba ọzọ), nke na-enye ohere ịchọpụta ọrịa na-efe efe nke na-abụghị omenala ọbara, na-ezere biopsy invasive nke anụ ahụ butere [18].Nnyocha e mere n'oge na-adịbeghị anya egosiwo n'ezie na ọbara mmadụ nwere nnukwu ihe ọmụma nke enwere ike iji chọpụta nje nje na nje bacteria, na ihe dịka 1% nke ccfDNA dị na plasma mmadụ sitere na mba ọzọ [19].Ọmụmụ ihe ndị a na-egosi na enwere ike ịlele ụdị dị iche iche nke microbiome na-ekesa n'ime ihe site na iji nyocha ccfDNA.Otú ọ dị, ruo n'oge na-adịbeghị anya, a na-eji echiche a nanị n'ime mmadụ na, n'ókè dị nta, na vertebrates ndị ọzọ [20, 21].
N'akwụkwọ dị ugbu a, anyị na-eji ikike LB nyochaa ccfDNA nke Aulacomya atra, ụdị ndịda nke a na-ahụkarị na agwaetiti Kerguelen subantarctic, otu agwaetiti dị n'elu nnukwu ala dị larịị nke hiwere afọ 35 gara aga.mgbawa ugwu.N'iji usoro nnwale in vitro, anyị chọpụtara na a na-ebuli iberibe DNA ndị dị na mmiri mmiri ngwa ngwa site na mọsel wee banye n'ime oghere hemolymph.Usoro nke Shotgun egosila na mussel hemolymph ccfDNA nwere iberibe DNA nke ya na nke na-abụghị nke onwe ya, gụnyere nje bacteria symbiotic na iberibe DNA sitere na biomes nke na-ahụkarị ugwu mgbawa ugwu oke osimiri.Hemolymph ccfDNA nwekwara usoro nje malitere site na nje nwere oke nnabata dị iche iche.Anyị hụkwara iberibe DNA sitere na anụmanụ dị iche iche dị ka azụ ọkpụkpụ, anemone mmiri, algae na ụmụ ahụhụ.N'ikpeazụ, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na enwere ike itinye echiche LB n'ọrụ na invertebrates mmiri iji mepụta nnukwu mkpụrụ ndụ ihe nketa na gburugburu ebe obibi mmiri.
Ndị okenye (55-70 mm ogologo) Mytilus platensis (M. platensis) na Aulacomya atra (A. atra) na-anakọta site na intertidal nkume ụsọ oké osimiri nke Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E .).Kerguelen Islands na December 2018. A na-enweta ndị ọzọ na-acha anụnụ anụnụ na-acha anụnụ anụnụ (Mytilus spp.) site n'aka onye na-azụ ahịa azụmahịa (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ma tinye ya na okpomọkụ nke a na-achịkwa (4 ° C) nke nwere 10-20 L nke 32 ‰ brine artificial.(nnukwu oké osimiri artificial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Maka nnwale nke ọ bụla, a tụrụ ogologo na ịdị arọ nke shea onye ọ bụla.
Usoro ohere imeghe n'efu maka mmemme a dị na ntanetị (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Na nkenke, a nakọtara hemolymph LB site na akwara ndị na-ewe ihe dịka akọwara [22].A kọwapụtara hemolymph site na centrifugation na 1200 × g maka nkeji 3, a na-ekpo ọkụ nke ukwuu (-20 Celsius C) ruo mgbe ejiri ya.Maka ikewapụ na ịdị ọcha nke cfDNA, a gbazere ma hazie ihe nlele (1.5-2.0 ml) site na iji ngwa NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Betlehen, PA) dịka ntuziaka onye nrụpụta siri dị.echekwara ccfDNA na -80 Celsius ruo mgbe nyocha ọzọ.N'ime nnwale ụfọdụ, ccfDNA kewapụrụ wee sachaa site na iji ngwa nyocha DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Achọpụtara DNA dị ọcha site na iji nyocha PicoGreen ọkọlọtọ.E nyochara nkesa nkesa nke ccfDNA dịpụrụ adịpụ site na capillary electrophoresis site na iji Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) site na iji ngwa DNA Sensitivity dị elu.Emere nyocha ahụ site na iji 1 µl nke nlele ccfDNA dịka ntuziaka onye nrụpụta siri dị.
Maka usoro nke hemolymph ccfDNA iberibe, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) kwadoro ọba akwụkwọ egbe egbe site na iji Illumina DNA Mix kit nke Illumina MiSeq PE75 kit.Eji ọkọlọtọ ọkọlọtọ (BioO) mee ihe.Faịlụ data raw dị site na NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 na SRR8924809).A na-enyocha ogo ọgụgụ isi site na iji FastQC [23].A na-eji trimmomatic [24] mee ihe maka ịkpụ ihe nkwụnye ọkụ na ọgụgụ adịghị mma.Shotgun na-agụ ya na nsọtụ jikọtara ọnụ ka ejikọtara FLASH n'ime ogologo otu agụ na opekempe 20 bp iji zere ndakọrịta [25]. Ejiri BLASTN kọwapụta agụkọ ọnụ ọnụ site na iji bivalve NCBI Taxonomy database (e uru <1e-3 na 90% homology), na iji DUST [26] mee ihe nkpuchi nke usoro mgbagwoju anya dị ala. Ejiri BLASTN kọwapụta agụkọ ọnụ ọnụ site na iji bivalve NCBI Taxonomy database (e uru <1e-3 na 90% homology), na iji DUST [26] mee ihe nkpuchi nke usoro mgbagwoju anya dị ala. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN. начение e <1e-3 na 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с 6. Ejiri BLASTN kọwapụta agụkọ agụkọ ọnụ site na iji nchekwa data NCBI bivalve taxonomy (e uru <1e-3 na 90% homology), na iji DUST [26] na-eme usoro mgbagwoju anya dị ala.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90%复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源）复杂度 序列蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN. NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выпольнено 6 . Ejiri BLASTN kọwapụta agụkọ agụkọ ọnụ site na iji nchekwa data NCBI bivalve taxonomic (e uru <1e-3 na 90% homology), na iji DUST [26] na-eme usoro mgbagwoju anya dị ala.E kewara agụ akwụkwọ ụzọ abụọ: metụtara usoro bivalve (ebe a na-akpọ onwe-agụ) na enweghị njikọ (na-abụghị nke onwe).Eji MEGAHIT kpọkọta otu abụọ iche iche iji mepụta contigs [27].Ka ọ dị ugbu a, a na-ekesa nkesa taxonomic nke microbiome nke ọbịa site na iji Kraken2 [28] na eserese Krona na Galaxy [29, 30] nọchiri anya ya.Ekpebiri ndị kmers kacha mma ka ha bụrụ kmers-59 site na nnwale mbido anyị. Achọpụtara contigs nke onwe site na itinye aka na BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ. Achọpụtara contigs nke onwe site na itinye aka na BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e-10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN 1e-10 na гомология 60%) для окончательной аннотации. Achọpụtara contigs nke onwe site na dakọtara megide BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 na 60% homology) maka nkọwa ikpeazụ.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы скачать видео - . . вустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 na гомология 60%). Achọpụtara contigs nke onwe maka nkọwa ikpeazụ site na dakọtara megide BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 na 60% homology). N'otu aka ahụ, e ji BLASTN kọwapụta contigs otu na-abụghị nke onwe ya (nt NCBI nchekwa data, e uru <1e-10 na 60% homology). N'otu aka ahụ, e ji BLASTN kọwapụta contigs otu na-abụghị nke onwe ya (nt NCBI nchekwa data, e uru <1e-10 na 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, . N'otu aka ahụ, e ji BLASTN (data data NT NCBI, uru <1e-10 na 60% homology) kọwapụta contigs otu mba ofesi.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN. 0 na гомология 60%). N'otu aka ahụ, e jiri BLASTN kọwaa contigs na-abụghị otu nke onwe ya (nt NCBI nchekwa data, e uru <1e-10 na 60% homology). A na-eduzi BLASTX na contigs na-abụghị nke onwe site na iji ọdụ data nr na RefSeq protein NCBI (e uru <1e-10 na 60% homology). A na-eduzi BLASTX na contigs na-abụghị nke onwe site na iji ọdụ data nr na RefSeq protein NCBI (e uru <1e-10 na 60% homology). BLASTX был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr na RefSeq NCBI0 60%). Emekwara BLASTX na contigs na-abụghị nke onwe ya site na iji ọdụ data protein nr na RefSeq NCBI (e uru <1e-10 na 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧）还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60）吧） BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белкя nr na RefSeq NCBI . Emekwara BLASTX na contigs na-abụghị nke onwe ya site na iji ọdụ data protein nr na RefSeq NCBI (e uru <1e-10 na 60% homology).Ọdọ mmiri BLASTN na BLASTX nke contigs na-abụghị nke onwe na-anọchi anya contigs ikpeazụ (lee faịlụ mgbakwunye).
Edepụtara primers eji maka PCR na tebụl S1.Ejiri Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) kwalite mkpụrụ ndụ ihe nketa ccfDNA.A na-eji ọnọdụ mmeghachi omume ndị a: denaturation na 95 ° C maka nkeji 3, 95 ° C maka nkeji 1, setịpụrụ okpomọkụ maka nkeji 1, elongation na 72 ° C maka nkeji 1, okirikiri 35, na n'ikpeazụ 72 ° C n'ime nkeji 10..Ekewapụrụ ngwaahịa PCR site na electrophoresis na gels agarose (1.5%) nwere SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) na 95 V.
A na-anabata Mussels (Mytilus spp.) na mmiri mmiri 500 ml oxygenated (32 PSU) maka awa 24 na 4 Celsius.Plasmid DNA nwere ntinye nke na-etinye koodu galectin-7 cDNA mmadụ (Nchịkọta NCBI L07769) na vial na njedebe ikpeazụ nke 190 μg/μl.Anụ anụ ndị amụrụ n'okpuru otu ọnọdụ na-enweghị mgbakwunye DNA bụ njikwa.Ebe nchekwa nke atọ nwere DNA na-enweghị mọsel.Iji nyochaa ogo DNA dị na mmiri mmiri, a na-ewepụta ihe nlele mmiri (20 μl; ugboro atọ) site na tank nke ọ bụla n'oge a kara aka.Maka traceability DNA plasmid, a na-egbute mọsel LB n'oge egosipụtara wee nyochaa site na qPCR na ddPCR.N'ihi nnukwu nnu nke mmiri mmiri, a na-agbanye aliquots na mmiri dị mma PCR (1:10) tupu nyocha PCR niile.
Ejiri PCR dijitalụ (ddPCR) mee ihe site na iji protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Jiri profaịlụ okpomọkụ iji chọpụta okpomọkụ kacha mma (Table S1).A na-ebute mkpọda site na iji igwe ọkụ QX200 (BioRad).Emere ddPCR dị ka ndị a: 95°C maka 5 min, 50 cycles of 95°C for 30s and annealing temperature for 1 min and 72°C for 30 s, 4°C for 5 min and 90°C n’ime nkeji 5.A tụrụ ọnụọgụ mwụda na mmeghachi omume dị mma (ọnụọgụ nke oyiri/µl) site na iji onye na-agụ dobe QX200 (BioRad).Ajụjụ ndị na-erughị 10,000 ụmụ irighiri mmiri.A naghị eme njikwa ụkpụrụ oge ọ bụla ddPCR na-arụ.
Emere qPCR site na iji Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) na LGALS7 kpọmkwem primers.Emere PCR niile ọnụ na 20µl site na iji QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).Ejiri 15 min incubation malite qPCR na 95°C sochiri okirikiri 40 na 95°C maka sekọnd iri yana na 60°C maka sekọnd 60 na otu nchịkọta data.Emepụtara usoro mgbaze site na iji nha na-aga n'ihu na 95°C maka 5 s, 65°C maka 60 s, na 97°C na njedebe nke qPCR.Emere qPCR ọ bụla n'ime ugboro atọ, belụsọ maka nlele njikwa.
Ebe ọ bụ na a maara mọsel maka oke nzacha ha dị elu, anyị buru ụzọ nyocha ma ha nwere ike nzacha na idowe iberibe DNA dị n'ime mmiri osimiri.Anyị nwekwara mmasị ịmata ma iberibe irighiri ihe ndị a na-agbakọba n'ime usoro lymphatic ha nke mepere emepe.Anyị ji nnwale dozie esemokwu a site n'ịchọta akara nke iberibe DNA soluble agbakwunyere na tankị mọsel na-acha anụnụ anụnụ.Iji kwado nsochi nke DNA iberibe, anyị na-eji mba ọzọ (ọ bụghị onwe) plasmid DNA nwere galectin-7 gene.ddPCR na-achọpụta iberibe DNA plasmid na mmiri oke osimiri na mọsel.Nsonaazụ anyị na-egosi na ọ bụrụ na ọnụọgụ DNA nke dị n'ime mmiri dị n'oké osimiri nọgidere na-adịgide adịgide karịa oge (ruo ụbọchị 7) na enweghị mọsel, mgbe ahụ na ọnụnọ mọsel nke ọkwa a fọrọ nke nta ka ọ bụrụ kpamkpam n'ime awa 8 (Fig 1a,b).Achọpụtara iberibe DNA exogenous ngwa ngwa n'ime 15 min na mmiri intravalvular na hemolymph (Fig 1c).A ka nwere ike ịchọpụta iberibe ihe ndị a ruo awa 4 ka ekpughere ya.Ọrụ nzacha a n'ihe gbasara iberibe DNA dị ka ọrụ nzacha nke nje bacteria na algae [31].Nsonaazụ ndị a na-egosi na mọsel nwere ike nzacha ma kpokọta DNA mba ọzọ n'ime akụkụ mmiri ha.
Nleba anya nke DNA plasmid n'ime mmiri oke osimiri na ọnụnọ (A) ma ọ bụ enweghị (B) nke mọsel, tụrụ site na ddPCR.Na A, a na-egosipụta nsonaazụ ya dị ka pasentị, yana oke igbe ndị ahụ na-anọchi anya 75th na 25th percentiles.A na-egosi eriri logarithmic dabara adaba na ọbara ọbara, na mpaghara nke agba ntụ na-anọchi anya oge ntụkwasị obi 95%.Na B, ahịrị uhie na-anọchi anya ihe pụtara na ahịrị anụnụ anụnụ na-anọchite anya oge ntụkwasị obi 95% maka itinye uche.C Mgbakọ nke DNA plasmid na hemolymph na valvular fluid nke mọsel n'oge dị iche iche mgbe agbakwunyere DNA plasmid.A na-egosi nsonaazụ ya dị ka ahụrụ n'ụdị zuru oke/mL (± SE).
Ọzọ, anyị nyochara mmalite nke ccfDNA na mọsel anakọtara site na akwa mussel na agwaetiti Kerguelen, otu agwaetiti dịpụrụ adịpụ nke nwere oke mmetụta mmadụ.Maka ebumnuche a, cccDNA sitere na mussel hemolymphs dịpụrụ adịpụ ma sachaa ya site na ụzọ a na-ejikarị eme ka cccDNA mmadụ dị ọcha [32, 33].Anyị chọpụtara na mkpokọta hemolymph ccfDNA dị na mọsel dị na microgram dị ala kwa oke hemolymph kwa ml (lee tebụl S2, Ozi mgbakwunye).Ọnụ ọgụgụ a dị ukwuu karịa nke ndị nwere ahụike (nanogram dị ala kwa milliliter), mana n'ọnọdụ ndị a na-adịghị ahụkebe, na ndị ọrịa kansa, ọkwa ccfDNA nwere ike iru ọtụtụ micrograms kwa milliliter [34, 35].Ntụle nke oke nkesa hemolymph ccfDNA gosiri na iberi ndị a na-adịgasị iche na nha, sitere na 1000 bp ruo 1000 bp.ruo 5000 bp (Fig 2).Enwetara nsonaazụ ndị yiri ya site na iji silica nke dabeere na QIAamp Investigator Kit, usoro a na-ejikarị na sayensị nyocha iji kewapụ ngwa ngwa na sachaa DNA genomic site na nlele DNA dị ala, gụnyere ccfDNA [36].
Onye nnọchi anya ccfDNA electrophoregram nke mussel hemolymph.Ewepụtara ya na NucleoSnap Plasma Kit (n'elu) na QIAamp DNA Investigator Kit.Ibé Violin B na-egosi nkesa mkpokọta hemolymph ccfDNA (± SE) na mọsel.Ahịrị ojii na uhie na-anọchi anya etiti na nke mbụ na nke atọ, n'otu n'otu.
Ihe dị ka 1% nke ccfDNA n'ime mmadụ na primates nwere ebe mba ọzọ [21, 37].Nyere sistemu okirikiri mepere emepe nke bivalves, mmiri mmiri nwere microbial, yana oke nkesa mussel ccfDNA, anyị chere na mussel hemolymph ccfDNA nwere ike ịnwe ọdọ mmiri dị iche iche nke DNA microbial.Iji nwalee echiche a, anyị debere hemolymph ccfDNA site na nlele Aulacomya atra anakọtara na agwaetiti Kerguelen, na-ewepụta ihe karịrị nde 10 na-agụ, 97.6% nke gafere njikwa mma.Ekewaziri agụmagụ ndị a dabere na isi mmalite nke onwe na nke na-abụghị nke onwe site na iji ọdụ data BLASTN na NCBI bivalve (Fig. S1, Ozi mgbakwunye).
N'ime mmadụ, ma nuklia na mitochondrial DNA nwere ike ịhapụ n'ime ọbara [38].Otú ọ dị, na ọmụmụ ihe ugbu a, ọ gaghị ekwe omume ịkọwa n'ụzọ zuru ezu DNA genomic genomic DNA nke mọsel, ebe ọ bụ na e debeghị usoro nke A. atra genome ma ọ bụ kọwaa ya.Agbanyeghị, anyị nwere ike ịchọpụta ọtụtụ iberibe ccfDNA sitere na nke anyị site na iji ọba akwụkwọ bivalve (Fig. S2, Ozi mgbakwunye).Anyị gosikwara na ọnụnọ nke iberibe DNA nke anyị si malite site n'ịkwado PCR nke mkpụrụ ndụ ihe nketa A. atra nke e debere (Fig 3).N'otu aka ahụ, nyere na mitochondrial genome nke A. atra dị na ọdụ data ọha, mmadụ nwere ike ịchọta ihe akaebe maka ọnụnọ nke mitochondrial ccfDNA iberibe na hemolymph nke A. atra.E gosipụtara ọnụnọ nke iberibe DNA mitochondrial site na nkwalite PCR (Fig 3).
Mkpụrụ ndụ mitochondrial dị iche iche dị na hemolymph nke A. atra (ntụpọ uhie - nọmba ngwaahịa: SRX5705969) na M. platensis (ntụpọ anụnụ anụnụ - nọmba ngwaahịa: SRX5705968) kwadoro site na PCR.Ọgụgụ emegharịrị site na Breton et al., 2011 B Mmụba nke hemolymph supernatant sitere na A. atra echekwara na akwụkwọ FTA.Jiri ọkpọ 3 mm tinye ozugbo na PCR tube nwere ngwakọta PCR.
Nyere ụbara microbial dị n'ime mmiri oké osimiri, anyị lekwasịrị anya na mbụ na njirimara nke usoro DNA microbial na hemolymph.Iji mee nke a, anyị na-eji ụzọ abụọ dị iche iche.Atụmatụ nke mbụ jiri Kraken2, usoro nhazi usoro nhazi usoro dabere na algọridim nke nwere ike ịmata usoro microbial na nke ziri ezi tụnyere BLAST na ngwaọrụ ndị ọzọ [28].Ihe karịrị 6719 na-agụ ka e kpebisiri ike na ha sitere na nje bacteria, ebe 124 na 64 sitere na archaea na nje, n'otu n'otu (Fig 4).Iberibe DNA nke nje bacteria kasị ukwuu bụ Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), na Bacteroidates (17%) (Fig. 4a).Nkesa a kwekọrọ na ọmụmụ ihe gara aga banyere microbiome mussel na-acha anụnụ anụnụ [39, 40].Gammaproteobacteria bụ klas bụ isi nke Proteobacteria (44%), gụnyere ọtụtụ Vibrionales (Fig 4b).Usoro ddPCR kwadoro ọnụnọ nke Vibrio DNA iberibe na ccfDNA nke A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Iji nweta ozi ndị ọzọ gbasara nje bacteria sitere na ccfDNA, e mere ụzọ ọzọ (Fig. S2, Ozi Mgbakwụnye). N'okwu a, ndị na-agụ na-agụ nke ahụ gbakọtara ka agbakọtara dị ka ihe na-agụ ọnụ-ọgwụgwụ wee kewaa ya dị ka nke onwe (bivalves) ma ọ bụ nke onwe ya site na iji BLASTN na uru e nke 1e−3 yana mbelata ya na> 90% homology. N'okwu a, ndị na-agụ na-agụ nke ahụ gbakọtara ka agbakọtara dị ka ihe na-agụ ọnụ-ọgwụgwụ wee kewaa ya dị ka nke onwe (bivalves) ma ọ bụ nke onwe ya site na iji BLASTN na uru e nke 1e−3 yana mbelata ya na> 90% homology. A na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ ihe na-adịghị mma. ворчатые моллюски) или чужие по происхождению N'okwu a, a na-anakọta agụmagụ mkpirisi dị ka agụmagụ jikọtara ọnụ wee kewaa ya dị ka nwa amaala (bivalve) ma ọ bụ nke na-abụghị nke sitere na iji BLASTN na e uru nke 1e-3 yana mbelata ya na> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3的e 值和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用源性 的 分类 自身（双 壳类） 非 自身。 A na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ na ọ na-eme ka ọ bụrụ ihe na-adịghị mma. тые моллюски) или несобственные по происхождению N'okwu a, a na-anakọta ọnụ ọgụgụ ndị na-agụkọ ọnụ dị ka ihe jikọtara ọnụ na nkewa dị ka nke ya (bivalves) ma ọ bụ nke na-abụghị nke mbụ site na iji e BLASTN na 1e-3 ụkpụrụ na ọnụ ụzọ homology> 90%.Ebe ọ bụ na edobebeghị A. atra genome, anyị na-eji atụmatụ mgbakọ de novo nke MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) mgbakọ.Ngụkọta nke 147,188 contigs ka achọpụtara dị ka ndị dabere (bivalves) sitere.Ejiri e-uru nke 1e-10 gbawara contigs ndị a site na iji BLASTN na BLASTX.Atụmatụ a nyere anyị ohere ịchọpụta iberibe iri anọ na asatọ na-abụghị bivalve dị na A. atra ccfDNA.Ihe karịrị ọkara (57%) nke iberibe DNA ndị a nwetara site na nje bacteria, tumadi site na gill symbionts, gụnyere sulfotrophic symbionts, na site na gill symbionts Solemya velum (Fig 5).
N'ụba dịtụ n'ọkwa ụdị.B Microbial di iche iche nke phyla abụọ bụ isi (Firmiutes na Proteobacteria).Ngosipụta nke ddPCR C Vibrio spp.A. Iberibe mkpụrụ ndụ ihe nketa 16S rRNA (acha anụnụ anụnụ) na hemolymph atọ.
A tụlere mkpokọta 482 anakọtara.Profaịlụ izugbe nke nkesa taxonomic nke metagenomic contig annotations (prokaryotes na eukaryotes).B Nkesa zuru oke nke iberibe DNA nje bacteria BLASTN na BLASTX chọpụtara.
Nyocha Kraken2 gosikwara na mussel ccfDNA nwere iberibe DNA archaeal, gụnyere iberibe DNA nke Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), na Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Ọnụnọ nke iberibe DNA sitere na Euryarchaeota na Crenarchaeota, nke a na-ahụbu na mpaghara microbial nke California mussels, ekwesịghị iju ya anya [42].Ọ bụ ezie na a na-ejikọta Euryarchaeota na ọnọdụ dị oke njọ, a ghọtara ugbu a na ma Euryarchaeota na Crenarcheota bụ otu n'ime prokaryotes na-emekarị na gburugburu ebe obibi mmiri cryogenic [43, 44].Ọnụnọ nke microorganisms methanogenic na mọsel abụghị ihe ijuanya, n'ihi akụkọ na-adịbeghị anya banyere mpụta methane buru ibu site na ntapu ala dị na Kerguelen Plateau [45] na enwere ike imepụta microbial methane n'akụkụ oke osimiri nke Kerguelen Islands [46].
Nlebara anya anyị wee tụgharịa gaa na ọgụgụ sitere na nje DNA.N'ihe anyị maara nke ọma, nke a bụ ọmụmụ ihe mbụ a na-atụghị anya ya banyere ọdịnaya nje nke mọsel.Dị ka a tụrụ anya ya, anyị chọtara iberibe DNA nke bacteriophages (Caudovirales) (Fig 6b).Otú ọ dị, nje nje virus nke na-emekarị bụ DNA sitere na phylum nke nucleocytoviruses, nke a makwaara dị ka nje virus cytoplasmic buru ibu DNA (NCLDV), nke nwere genome kasị ukwuu nke nje ọ bụla.N'ime phylum a, ọtụtụ usoro DNA bụ nke ezinụlọ Mimimidoviridae (58%) na Poxviridae (21%), ndị ndị ọbịa sitere n'okike gụnyere vertebrates na arthropods, ebe obere akụkụ nke usoro DNA ndị a sitere na algae virological ama ama.Na-emetụta mmiri eukaryotic algae.E nwetakwara usoro ndị a site na nje Pandora, nje buru ibu nke nwere oke genome kachasị nke ụdị nje ọ bụla amaara.N'ụzọ na-akpali mmasị, ụdị nke ndị ọbịa mara na ha bu nje a, dị ka usoro hemolymph ccfDNA siri kpebisie ike, buru oke ibu (Ọgụgụ S3, Ozi Mgbakwụnye).Ọ na-agụnye nje ndị na-ebute ụmụ ahụhụ dị ka Baculoviridae na Iridoviridae, yana nje ndị na-ebute amoeba, algae na vertebrates.Anyị hụkwara usoro dabara na Pithovirus sibericum genome.Pitoviruses (nke a makwaara dị ka "virus nje zombie") bụ nke mbụ dịpụrụ adịpụ na permafrost dị afọ 30,000 na Siberia [47].Ya mere, nsonaazụ anyị kwekọrọ na akụkọ ndị gara aga na-egosi na ọ bụghị ụdị nje ndị a nke oge a ka anwụọla [48] nakwa na nje ndị a nwere ike ịdị na mbara ala mmiri ndị dịpụrụ adịpụ.
N'ikpeazụ, anyị nwalere iji hụ ma ànyị nwere ike ịhụ iberibe DNA sitere n'anụmanụ ndị ọzọ.BLASTN na BLASTX ji nt, nr na ụlọ akwụkwọ RefSeq (genomic na protein) mara ngụkọta nke contigs mba ofesi 482.Nsonaazụ anyị na-egosi na n'etiti iberibe mba ọzọ nke ccfDNA nke anụmanụ multicellular DNA nke ọkpụkpụ ọkpụkpụ na-ebutekarị (Fig 5).A hụkwara iberibe DNA sitere na ụmụ ahụhụ na ụdị ndị ọzọ.Achọpụtabeghị akụkụ buru ibu nke iberibe DNA, ikekwe n'ihi enweghị atụ nke ọnụ ọgụgụ dị ukwuu nke ụdị mmiri dị na ọdụ data genomic ma e jiri ya tụnyere ụdị ụwa [49].
N'akwụkwọ dị ugbu a, anyị na-etinye echiche LB na mọsel, na-arụ ụka na hemolymph ccfDNA shot sequencing nwere ike inye nghọta n'ime ihe mejupụtara gburugburu ebe obibi dị n'ụsọ oké osimiri.Karịsịa, anyị chọpụtara na 1) hemolymph mussel nwere oke dị elu (ọkwa microgram) nke dị ntakịrị (~ 1-5 kb) na-ekesa iberibe DNA;2) Mpekere DNA ndị a bụ ma ndị nweere onwe ha na ndị na-abụghị nke onwe 3) N'etiti isi mmalite nke mba ọzọ nke DNA ndị a, anyị hụrụ nje bacteria, archaeal na viral DNA, yana DNA nke anụmanụ ndị ọzọ multicellular;4) Mkpokọta nke iberibe ccfDNA ndị mba ọzọ na hemolymph na-eme ngwa ngwa ma na-enye aka na ọrụ nzacha ime nke mọsel.N'ikpeazụ, ọmụmụ ihe anyị na-egosi na echiche nke LB, bụ nke etinyere ugbu a karịsịa n'ihe gbasara biomedicine, na-akọwapụta ihe ọmụma bara ụba ma a na-enyochabeghị nke a ga-eji mee ka ọ ghọtakwuo mmekọrịta dị n'etiti ụdị sentinel na gburugburu ha.
Na mgbakwunye na primates, ccfDNA ka akọpụtala na anụ mamma, gụnyere ụmụ oke, nkịta, nwamba na ịnyịnya [50, 51, 52].Agbanyeghị, n'ihe ọmụma anyị, ọmụmụ ihe anyị bụ nke mbụ gosipụtara nchọpụta na usoro nke ccfDNA n'ụdị mmiri nwere sistemụ mgbasa ozi mepere emepe.Akụkụ ahụ a na-ahụ anya na ike nzacha mọsel nwere ike, opekata mpe n'akụkụ ya, kọwapụta njirimara nha dị iche iche nke ikesa iberibe DNA ma e jiri ya tụnyere ụdị ndị ọzọ.N'ime ụmụ mmadụ, ọtụtụ iberibe DNA na-ekesa n'ọbara bụ obere iberibe sitere na 150 ruo 200 bp.nke kacha elu nke 167 bp [34, 53].Obere akụkụ dị mkpa nke iberibe DNA dị n'etiti 300 na 500 bp n'ogo, na ihe dịka 5% dị ogologo karịa 900 bp.[54].Ihe kpatara nkesa nha a bụ na isi iyi nke ccfDNA na plasma na-apụta n'ihi ọnwụ cell, ma ọ bụ n'ihi ọnwụ cell ma ọ bụ n'ihi necrosis nke na-ekesa mkpụrụ ndụ hematopoietic na ndị nwere ahụike ma ọ bụ n'ihi apoptosis nke mkpụrụ ndụ tumo na ndị ọrịa cancer (nke a maara dị ka DNA na-ekesa tumor)., ctDNA).Ogo nkesa hemolymph ccfDNA anyị hụrụ na mọsel sitere na 1000 ruo 5000 bp, na-atụ aro na mussel ccfDNA nwere mmalite dị iche.Nke a bụ echiche ezi uche dị na ya, ebe ọ bụ na mọsel nwere sistemu vaskụla mepere emepe ma na-ebi na gburugburu mmiri mmiri nwere nnukwu mkpụrụ ndụ mkpụrụ ndụ ihe nketa DNA.N'ezie, nyocha ụlọ nyocha anyị na-eji DNA exogenous egosiwo na mọsel na-akwakọba iberibe DNA n'ime mmiri mmiri, ma ọ dịkarịa ala mgbe awa ole na ole gasịrị, ha na-eweda ya ala mgbe iwere cellular na / ma ọ bụ wepụta na / ma ọ bụ chekwaa na òtù dị iche iche.N'iburu ụkọ nke mkpụrụ ndụ (ma prokaryotic na eukaryotic), iji akụkụ intravalvular ga-ebelata ego ccfDNA sitere na isi mmalite nke onwe yana site na isi mmalite ndị mba ọzọ.N'iburu n'uche mkpa ọ dị n'ime mgbochi nke bivalve na ọnụ ọgụgụ dị ukwuu nke phagocytes na-ekesa, anyị na-ekwukwa na ọbụna ccfDNA si mba ọzọ na-eme ka phagocytes na-ekesa na-akwakọba DNA mba ọzọ mgbe ị na-etinye microorganisms na/ma ọ bụ irighiri ihe.N'ịchịkọta ọnụ, nsonaazụ anyị na-egosi na bivalve hemolymph ccfDNA bụ ebe nchekwa pụrụ iche nke ozi mkpụrụ ndụ ma na-ewusi ọnọdụ ha ike dị ka ụdị sentinel.
Ihe omuma anyi na-egosi na usoro na nyocha nke iberibe hemolymph ccfDNA sitere na nje nwere ike inye ozi dị mkpa gbasara ahịhịa nje na nje bacteria dị na gburugburu mmiri mmiri gbara ya gburugburu.Usoro ịgba ọsọ ekpughere usoro nje bacteria commensal A. atra gill nke agaraghị atụfu ma ọ bụrụ na ejirila usoro njirimara 16S rRNA a na-ahụkarị, n'ihi akụkụ nke enweghị mmasị n'ọbá akwụkwọ.N'ezie, iji data LB anyị na-anakọta site na M. platensis na otu mussel oyi akwa na Kerguelen gosiri na ihe mejupụtara nke gill-metụtara nje symbionts bụ otu maka ma mussel ụdị (Fig. S4, Mgbakwunye Ozi).Myirịta a nke mọsel abụọ dị iche iche nwere ike igosipụta nhazi nke obodo nje na oyi, sọlfọ, na mgbawa ugwu nke Kerguelen [55, 56, 57, 58].A kọwawo ọkwa dị elu nke microorganisms na-ebelata sọlfọ dị elu mgbe a na-ewe ihe ubi mọsel site na mpaghara mmiri gbara gburugburu [59], dịka ụsọ oké osimiri Port-au-France.Ihe ọzọ nwere ike ime bụ na commensal mussel flora nwere ike imetụta site na nnyefe kwụ ọtọ [60, 61].Achọkwuru nyocha iji chọpụta njikọ dị n'etiti gburugburu mmiri mmiri, elu elu oke osimiri, na nhazi nke nje bacteria symbiotic na mọsel.Ọmụmụ ihe ndị a na-aga n'ihu ugbu a.
Ogologo na ntinye nke hemolymph ccfDNA, ịdị mfe nke ịdị ọcha ya, yana ịdị elu dị elu iji kwe ka usoro egbe egbe ngwa ngwa bụ ụfọdụ uru dị na iji mussel ccfDNA iji chọpụta ụdị dị iche iche na gburugburu ebe obibi mmiri.Ụzọ a dị irè karịsịa maka ịkọwa obodo nje (viromes) na gburugburu ebe obibi [62, 63].N'adịghị ka nje bacteria, archaea, na eukaryotes, viral genomes enweghị mkpụrụ ndụ ihe nketa echekwara phylogenetic dị ka usoro 16S.Nsonaazụ anyị na-egosi na enwere ike iji biopsies mmiri mmiri sitere na ụdị ndị na-egosi ihe dị ka mọsel iji chọpụta ọnụọgụ nje ccfDNA buru ibu nke amaara na-efe efe ndị ọbịa na-ebikarị na gburugburu ebe obibi mmiri dị n'ụsọ osimiri.Nke a gụnyere nje ndị amaara na-ebute protozoa, arthropods, ụmụ ahụhụ, osisi, na nje nje nje (dịka ọmụmaatụ, bacteriophages).Achọtara nkesa yiri nke ahụ mgbe anyị nyochara hemolymph ccfDNA virome nke blue mọsel (M. platensis) anakọtara n'otu akwa mussel na Kerguelen (Table S2, Ozi Mgbakwụnye).Usoro Shotgun nke ccfDNA bụ n'ezie ụzọ ọhụrụ na-enweta ume n'ime ọmụmụ nke virome nke mmadụ ma ọ bụ ụdị ndị ọzọ [21, 37, 64].Ụzọ a bara uru karịsịa maka ịmụ nje virus DNA nwere okpukpu abụọ, ebe ọ bụ na ọ dịghị otu mkpụrụ ndụ ihe nketa na-echekwa n'etiti nje DNA niile nwere eriri abụọ, na-anọchite anya ụdị nje dị iche iche na nke sara mbara na Baltimore [65].Ọ bụ ezie na ọtụtụ n'ime nje ndị a ka na-ekewaghị ekewa ma nwee ike ịgụnye nje sitere na akụkụ a na-amaghị nke ọma nke ụwa nje [66], anyị chọpụtara na viromes na ndị ọbịa nke mọsel A. atra na M. platensis na-ada n'etiti ụdị abụọ ahụ.N'otu aka ahụ (lee foto S3, ozi ndị ọzọ).Myirịta a abụghị ihe ijuanya, n'ihi na ọ nwere ike igosi enweghị nhọrọ na ntinye DNA dị na gburugburu ebe obibi.Ọmụmụ ihe n'ọdịnihu na-eji RNA dị ọcha dị ugbu a iji mara virome RNA.
N'ime ọmụmụ ihe anyị, anyị jiri pipeline siri ike emebere site na ọrụ Kowarski na ndị ọrụ ibe ya [37], bụ ndị ji ihichapụ nzọụkwụ abụọ nke agụ na contigs tupu na mgbe mgbakọ nke ccfDNA nke ala, butere ọnụ ọgụgụ dị elu nke ndị na-agụghị akwụkwọ.Ya mere, anyị enweghị ike iwepụ na ụfọdụ n'ime ihe ndị a na-agụghị akwụkwọ nwere ike ka nwere ebe ha si malite, nke bụ isi n'ihi na anyị enweghị genome ntụaka maka ụdị mọsel a.Anyị jikwa pipeline a n'ihi na anyị nwere nchegbu banyere chimeras n'etiti onwe na nke na-agụghị onwe ya na ogologo ọgụgụ nke Illumina MiSeq PE75 mepụtara.Ihe ọzọ kpatara ọtụtụ ndị na-agụghị akwụkwọ bụ na ọtụtụ n'ime ụmụ nje ndị dị n'ime mmiri, karịsịa na mpaghara ndị dịpụrụ adịpụ dị ka Kerguelen, akọwabeghị ya.Anyị ji Illumina MiSeq PE75, na-eche na ogologo iberibe ccfDNA yiri ccfDNA mmadụ.Maka ọmụmụ ihe n'ọdịnihu, nyere nsonaazụ anyị na-egosi na hemolymph ccfDNA nwere ogologo ọgụgụ karịa mmadụ na/ma ọ bụ anụ mamma, anyị na-akwado iji usoro nhazi usoro dabara adaba maka iberi ccfDNA ogologo.Omume a ga-eme ka ọ dịkwuo mfe ịmatakwu ihe ngosi maka nyocha miri emi.Inweta usoro genome nke A. atra nuklia nke adịghị ugbu a ga-emekwa ka oke ịkpa oke nke ccfDNA sitere na isi mmalite nke onwe na nke na-abụghị nke onwe.Nyere na nyocha anyị lekwasịrị anya na enwere ike itinye echiche nke biopsy mmiri mmiri na mọsel, anyị na-atụ anya na ka a na-eji echiche a eme nchọpụta n'ọdịnihu, a ga-emepụta ngwá ọrụ ọhụrụ na pipeline iji mee ka ikike nke usoro a dịkwuo elu iji mụọ ụdị microbial dị iche iche nke mọsel.gburugburu ebe obibi mmiri.
Dị ka biomarker na-adịghị emerụ ahụ, ọkwa plasma mmadụ dị elu nke ccfDNA jikọtara ya na ọrịa dị iche iche, mmebi anụ ahụ, na ọnọdụ nrụgide [67,68,69].A na-ejikọta mmụba a na ntọhapụ nke iberibe DNA nke sitere na ya ma mebie anụ ahụ.Anyị lebara okwu a anya site n'iji nnukwu nrụgide okpomọkụ, bụ nke a na-ekpuchi mọsel na obere oge na okpomọkụ nke 30 Celsius.Anyị mere nyocha a na ụdị mọsel atọ dị iche iche na nnwale atọ onwe ha.Agbanyeghị, anyị ahụghị mgbanwe ọ bụla na ọkwa ccfDNA ka oke nrụgide okpomọkụ gasịrị (lee eserese S5, ozi ndị ọzọ).Nchọpụta a nwere ike ịkọwa, ma ọ dịkarịa ala n'otu akụkụ, eziokwu ahụ bụ na mọsel nwere usoro mgbasa ọbara nke mepere emepe ma na-akwakọba nnukwu DNA nke mba ọzọ n'ihi ọrụ nzacha ha dị elu.N'aka nke ọzọ, mọsel, dị ka ọtụtụ invertebrates, nwere ike na-eguzogide ọgwụ maka mmebi anụ ahụ na-akpata nrụgide, si otú ahụ na-egbochi mwepụta nke ccfDNA na hemolymph ha [70, 71].
Ka ọ dị ugbu a, nyocha DNA banyere ụdị dị iche iche dị n'ime mmiri na-elekwasị anya na DNA gburugburu ebe obibi (eDNA) metabarcoding.Otú ọ dị, usoro a na-ejikarị eme ihe na nyocha ihe dị iche iche mgbe a na-eji primers.Ojiji nke usoro egbe egbe na-agafe oke PCR na nhọrọ enweghị mmasị nke ntọala primer.Ya mere, n'otu echiche, usoro anyị dị nso na usoro eDNA Shotgun nke a na-eji eme ihe n'oge na-adịbeghị anya, nke na-enwe ike ịhazi DNA nke gbawara agbawa ozugbo wee nyochaa ihe fọrọ nke nta ka ọ bụrụ ihe niile dị ndụ [72, 73].Agbanyeghị, enwere ọtụtụ isi okwu ndị na-amata ọdịiche LB na usoro eDNA ọkọlọtọ.N'ezie, isi ihe dị iche n'etiti eDNA na LB bụ iji ndị ọbịa nzacha eke.Ojiji nke ụdị mmiri dị ka sponges na bivalves (Dresseina spp.) dị ka ihe nzacha eke maka ịmụ eDNA ka akọpụtala [74, 75].Agbanyeghị, ọmụmụ Dreissena ji biopsies anụ ahụ si na ya nweta DNA.Nyocha nke ccfDNA sitere na LB anaghị achọ biopsy anụ ahụ, akụrụngwa pụrụ iche na mgbe ụfọdụ dị oke ọnụ yana ngwa ngwa jikọtara eDNA ma ọ bụ biopsy anụ ahụ.N'ezie, anyị kọrọ n'oge na-adịbeghị anya na enwere ike ịchekwa ma nyochaa ccfDNA sitere na LB site na nkwado FTA na-enweghị ijigide agbụ oyi, nke bụ nnukwu ihe ịma aka maka nyocha na mpaghara dịpụrụ adịpụ [76].Mwepụta nke ccfDNA na biopsies mmiri dịkwa mfe ma na-enye DNA dị elu maka usoro egbe egbe na nyocha PCR.Nke a bụ nnukwu uru nyere ụfọdụ njedebe teknụzụ metụtara nyocha eDNA [77].Ịdị mfe na ọnụ ala dị ala nke usoro nlele ahụ dịkwa mma karịsịa maka mmemme nlekota ogologo oge.Na mgbakwunye na ikike nzacha ha dị elu, akụkụ ọzọ a ma ama nke bivalves bụ kemịkalụ mucopolysaccharide nke imi ha, nke na-akwalite nnabata nke nje [78, 79].Nke a na-eme bivalves ka ọ bụrụ ihe nzacha sitere n'okike maka ịkọwapụta ụdị ndụ dị iche iche na mmetụta mgbanwe ihu igwe na gburugburu ebe obibi mmiri.Ọ bụ ezie na enwere ike ịhụ ọnụnọ nke iberibe DNA ndị ọbịa na-enweta dị ka njedebe nke usoro ahụ ma e jiri ya tụnyere eDNA, ọnụ ahịa metụtara inwe ụdị ccfDNA dị otú ahụ ma e jiri ya tụnyere eDNA bụ ihe kwere nghọta n'otu oge maka oke ozi dị maka ọmụmụ ahụike.offset onye ọbịa.Nke a gụnyere ọnụnọ nke usoro nje agbakwunyere na genome nke onye ọbịa.Nke a dị mkpa karịsịa maka mọsel, n'ihi ọnụnọ nke leukemia retroviruses na-ebute n'ụzọ kwụ ọtọ na bivalves [80, 81].Uru ọzọ nke LB karịa eDNA bụ na ọ na-erigbu ọrụ phagocytic nke na-ekesa mkpụrụ ndụ ọbara na hemolymph, nke na-ekpuchi microorganisms (na genomes ha).Phagocytosis bụ isi ọrụ nke mkpụrụ ndụ ọbara na bivalves [82].N'ikpeazụ, usoro ahụ na-eji ohere dị elu nke nzacha nke mọsel (nkezi 1.5 l / h nke mmiri mmiri) na mgbasa ozi ụbọchị abụọ, nke na-eme ka ngwakọta nke mmiri mmiri dị iche iche dị iche iche na-enye ohere ijide eDNA heterologous.[83, 84].Ya mere, nyocha mussel ccfDNA bụ ụzọ na-atọ ụtọ nyere mmetụta nri, akụ na ụba na gburugburu ebe obibi nke mọsel.Dị ka nyocha nke LB anakọtara n'aka ụmụ mmadụ, usoro a na-emepekwa ohere nke ịlele mkpụrụ ndụ ihe nketa na mgbanwe epigenetic na DNA ndị ọbịa na nzaghachi na ihe ndị dịpụrụ adịpụ.Dịka ọmụmaatụ, teknụzụ usoro usoro ọgbọ nke atọ nwere ike ịtụ anya ka ha mee nyocha genome-wide methylation na ccfDNA nke ala site na iji usoro nanopore.Ekwesịrị ịkwado usoro a site n'eziokwu na ogologo nke mussel ccfDNA iberibe dị mma dabara na usoro nhazi usoro nke na-agụ ogologo oge nke na-enye ohere nyocha DNA methylation genome-wide site na otu usoro na-agba ọsọ na-enweghị mkpa maka mgbanwe kemịkalụ .85,86] Nke a bụ ihe na-akpali mmasị, dị ka egosipụtara na DNA methylation ụkpụrụ na-anọgide na-egosipụta nzaghachi maka ọtụtụ usoro gburugburu ebe obibi.Ya mere, ọ nwere ike inye nghọta bara uru banyere usoro ndị dị n'okpuru na-achịkwa nzaghachi mgbe ekpughere mgbanwe ihu igwe ma ọ bụ mmetọ [87].Agbanyeghị, iji LB enweghị oke.Ọ baghị uru ikwu, nke a chọrọ ọnụnọ nke ụdị ihe ngosi na gburugburu ebe obibi.Dị ka e kwuru n'elu, iji LB iji nyochaa ọdịdị dị iche iche nke ihe ndị dị ndụ e nyere na-achọkwa pipeline bioinformatics siri ike nke na-eburu n'uche ọnụnọ nke iberibe DNA sitere na isi iyi.Nsogbu ọzọ bụ isi bụ nnweta mkpụrụ ndụ ihe nketa maka ụdị mmiri.A na-atụ anya na atumatu ndị dị ka Marine Mammal Genomes Project na ọrụ Fish10k e hibere nso nso a [88] ga-eme ka nyocha dị otú ahụ dị mfe n'ọdịnihu.Ngwa nke echiche LB na ihe ndị na-eri nri mmiri na-adaba na ọganihu ọhụrụ na nkà na ụzụ nhazi usoro, na-eme ka ọ dị mma maka mmepe nke multi-ohm biomarkers iji nye ozi dị mkpa gbasara ahụike nke ebe obibi mmiri na nzaghachi nrụgide gburugburu ebe obibi.
Edokwala data usoro genome n'usoro NCBI Gụọ ebe nchekwa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 n'okpuru Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Mmetụta mgbanwe ihu igwe na ndụ mmiri na gburugburu ebe obibi.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Tụlee mmetụta ngwakọta nke mgbanwe ihu igwe na nrụgide mpaghara ndị ọzọ na gburugburu mmiri.gburugburu sayensi izugbe.2021;755:142564 .
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Sayensị nke mbụ nke March.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Mbelata ntachi obi na-ekpo ọkụ n'okpuru ọnọdụ nrụgide okpomọkụ ugboro ugboro na-akọwa oke okpomọkụ anwụ anwụ nke blue mọsel.Akụkọ sayensị 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Mgbanwe na-adịbeghị anya na ugboro ole, ihe kpatara na oke ọnwụ anụmanụ.Proc Natl Acad Sci USA.2015; 112:1083-8 .
Scarpa F, Sanna D, Azena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Ọtụtụ nje ndị na-abụghị ụdịdị akọwapụtara nwere ike butere oke ọnwụ nke Pinna nobilis.Ndụ.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Mmetụta mgbanwe ihu igwe nwere ike na ọrịa Arctic zoonotic.Int J Circumpolar ahụike.2005;64:468–77 .
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blue mussels (Mytilus edulis spp.) dị ka ihe mgbaàmà na nlekota mmetọ n'ụsọ oké osimiri: nyocha.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Njikọta biopsy mmiri mmiri na ọgwụgwọ ọrịa kansa.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48 .
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Mmiri biopsy maturation: Na-enye ohere ka DNA tumor kesaa.Na Rev Cancer.2017; 17:223–38 .
Mandel P., Metais P. Nucleic acid na plasma mmadụ.nkeji nzukọ nke ndị enyemaka Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ọrụ ọhụrụ maka DNA na-enweghị cell dị ka akara mkpụrụ ndụ maka ọgwụgwọ ọrịa kansa.Ọnụ ọgụgụ nke nyocha biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy na-abanye n'ụlọ ọgwụ - okwu mmejuputa iwu na ihe ịma aka n'ọdịnihu.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312 .
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW na ndị ọzọ.DNA nwa ebu n'afọ dị na plasma nke nne na serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Ọmụmụ nke usoro ime ime na nsogbu ya site na iji RNA na-ekesa extracellular n'ime ọbara ụmụ nwanyị n'oge ime.Dọkịta.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsy Liquid: A na-eji DNA na-enweghị cell na-enye onyinye iji chọpụta ọnya allogeneic na ntinye aka akụrụ.Nna Rev Nephrol.2021;17:591–603 .
Juan FC, Lo YM Innovations na nchọpụta ọmụmụ nwa: usoro ọmụmụ genome nke nne.Ana MD.2016;67:419-32 .
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Nchọpụta ọrịa nje ngwa ngwa site na usoro metagenomic nke ọgbọ na-esote nke mmiri ahụ nwere ọrịa.Nat ọgwụ.2021;27:115-24 .