Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Uppbygging þarmaþarms manna skapar eiginleika þrívíddar þekjufrumubyggingar og rýmisskipulags í dulkóða og þörmum. Þessi einstaka uppbygging er nauðsynleg til að viðhalda jafnvægi þarma með því að vernda stofnfrumunið í grunnþekjunni gegn utanaðkomandi örverufræðilegum mótefnum og umbrotsefnum þeirra. Að auki sýna þarmaþörmum og seytandi slími virkniþekjufrumur með verndandi hindrun á yfirborði þarmaslímhúðar. Þess vegna er endurgerð þrívíddar þekjufrumubygginga mikilvæg fyrir smíði in vitro þarmalíkana. Athyglisvert er að lífræn eftirlíking af þarmaflís getur örvað sjálfsprottna þrívíddaruppbyggingu þarmaþekjunnar með bættri lífeðlisfræðilegri virkni og lífvélafræði. Hér bjóðum við upp á endurtakanlega aðferð til að örva þarmauppbyggingu í þörmum á örvökvaflís sem og í Transwell-innbyggðum blendingsflís. Við lýsum ítarlegum aðferðum við framleiðslu tækja, ræktun Caco-2 eða þarmalíffæraþekjufrumna í hefðbundnum aðstæðum sem og á örvökvaflís, örvun þrívíddaruppbyggingar og einkenningu. á þrívíddarþekju með því að nota margar myndgreiningaraðferðir. Þessi aðferð nær fram endurnýjun á virkri þarmaörbyggingu með því að stjórna vökvaflæði í hliðarlægð í 5 daga. In vitro formgerðaraðferð okkar notar lífeðlisfræðilega mikilvæga skerspennu og vélræna hreyfingu og krefst ekki flókinnar frumuverkfræði eða meðferðar, sem gæti skilað betri árangri en aðrar núverandi aðferðir. Við sjáum fyrir okkur að fyrirhuguð aðferð okkar gæti haft víðtæk áhrif á lífeðlisfræðilega rannsóknarsamfélagið og veitt aðferð til að endurnýja þrívíddarþekjulög þarma in vitro fyrir lífeðlisfræðilegar, klínískar og lyfjafræðilegar notkunar.
Tilraunir sýna að Caco-2 þekjufrumur í þörmum, ræktaðar í gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eða tvílaga örvökvakerfi6,7, geta gengist undir sjálfkrafa þrívíddarmyndun in vitro án þess að skilja undirliggjandi ferlið skýrt. Í nýlegri rannsókn okkar komumst við að því að fjarlægja basolateral seytandi formógenblokka úr ræktunartækjum er nauðsynlegt og nægjanlegt til að örva þrívíddar þekjumyndun in vitro, sem hefur verið sýnt fram á með Caco-2 og þarmalíffærum sem eru fengnir frá sjúklingum. Þekjufrumur voru staðfestar. Í þessari rannsókn einbeittum við okkur sérstaklega að frumuframleiðslu og styrkdreifingu öflugs Wnt-mótlyfs, Dickkopf-1 (DKK-1), í þarmaflís og breyttum örvökvatækjum sem innihalda Transwell-innskot, kallað „hybrid chip“. Við sýnum fram á að viðbót utanaðkomandi Wnt-mótlyfja (eins og DKK-1, Wnt-bæli 1, seytað frizzled-related protein 1 eða Soggy-1) í þarmaflísina hamlar formgerð eða truflar forbyggða 3D þekjulagið, sem bendir til þess að mótvægisstreita við ræktun sé ábyrg fyrir þarmaformgerð in vitro. Þess vegna er hagnýt aðferð til að ná öflugri formgerð við þekjuviðmótið að fjarlægja eða viðhalda lágmarks magni Wnt-mótlyfja í basolateral hólfinu með virkri skolun (t.d. í gut-on-a-chip eða hybrid-on-a-chip pöllum) eða dreifingu. Basolateral miðill (t.d. frá Transwell-innskotum í stór basolateral geymi í brunna).
Í þessari aðferð bjóðum við upp á ítarlega aðferð til að búa til örgjörva með þarmaflís og Transwell-innsetningarhæfar blendingsflögur (skref 1-5) til að rækta þarmaþekjufrumur á pólýdímetýlsíloxan (PDMS)-byggðum porous himnum (skref 6A, 7A, 8, 9) eða pólýesterhimnum úr Transwell-innsetningum (skref 6B, 7B, 8, 9) og framkalla þrívíddarmyndun in vitro (skref 10). Við greindum einnig frumu- og sameindaeiginleika sem benda til vefjasértækrar vefjamyndunar og ætternisháðrar frumuþróunar með því að nota margar myndgreiningaraðferðir (skref 11-24). Við framkalla formgerð með því að nota þarmaþekjufrumur úr mönnum, svo sem Caco-2 eða þarmalíffæra, í tveimur ræktunarformum með tæknilegum upplýsingum, þar á meðal yfirborðsbreytingum á porous himnum, gerð tvívíddar einlaga og lífefnafræðilegri og afritun lífvélræns örumhverfis í þörmum in vitro. Til að framkalla þrívíddarmyndun úr tvívíddar þekjueinlögum fjarlægðum við formgerð. mótlyf í báðum ræktuðum formum með því að láta miðilinn flæða inn í basolateral hólf ræktunarinnar. Að lokum gefum við framsetningu á notagildi endurnýjanlegs þrívíddar þekjulags sem hægt er að nota til að líkja eftir formgerðarháðum þekjuvexti, langtíma samræktun hýsils og örveruflórunnar, sýkingu sýkla, bólguskaða, truflun á þekjuhindrun og meðferðir sem byggja á góðgerlum. Dæmi. Áhrif.
Aðferð okkar gæti nýst fjölbreyttum vísindamönnum í grunnrannsóknum (t.d. slímhúðarlíffræði þarma, stofnfrumulíffræði og þroskalíffræði) og hagnýtum rannsóknum (t.d. forklínískum lyfjaprófunum, sjúkdómslíkönum, vefjaverkfræði og meltingarfærafræði) með víðtæk áhrif. Vegna endurtekningarhæfni og áreiðanleika aðferðar okkar til að örva þrívíddarmyndun þarmaþekju in vitro, sjáum við fyrir okkur að tæknileg aðferð okkar geti verið dreift til áhorfenda sem rannsaka gangverk frumuboða við þroska, endurnýjun eða jafnvægi þarma. Að auki er aðferð okkar gagnleg til að kanna sýkingar af völdum ýmissa sýkla eins og Nóróveiru 8, Alvarlegt bráða öndunarfærasjúkdóm Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 eða Vibrio cholerae. Áhorfendur á sjúkdómsfræði og sjúkdómsvaldandi þætti eru einnig gagnlegir. Notkun á örlífeðlisfræðilegu þarmakerfi á örgjörva getur gert kleift að framkvæma langtíma samræktun 10 og síðan meta vörn hýsilsins, ónæmissvörun og viðgerðir á sýklatengdum meiðslum í meltingarvegi 11. Aðrar meltingarfærasjúkdómar sem tengjast lekaþarmsheilkenni, glútenóþoli, Crohns sjúkdómi, sáraristilbólgu, pouchitis eða iðraólguheilkenni er hægt að herma eftir þegar þrívíddarþekjulög þarma eru útbúin með því að nota þrívíddarþekjulög þarma sjúklingsins. Þessir sjúkdómar fela í sér rýrnun villusvöðva, styttingu á villusvöðva, slímhúðarskemmdir eða skert þekjuþröskuld. Sýnataka eða stofnfrumugerð þarmalíffæra12,13. Til að módela betur flækjustig sjúkdómsumhverfisins gætu lesendur íhugað að bæta við sjúkdómstengdum frumugerðum, svo sem einkjarnafrumum úr útlægum blóði sjúklinga (PBMC), við líkön sem innihalda þrívíddar örarkitektúr þarmavillus-villus. vefjasértækar ónæmisfrumur, 5.
Þar sem þrívíddar örbygging þekjuvefs er hægt að festa og sjá án þess að þurfa að skipta henni, gætu áhorfendur sem vinna að rúmfræðilegri umritun og myndgreiningu í mikilli eða ofurupplausn haft áhuga á kortlagningu okkar á rúmfræðilegri og tímabundinni virkni gena og próteina á þekjuvefsneksum. Áhugasamir um tækni. Viðbrögð við örverufræðilegum eða ónæmisfræðilegum áreiti. Ennfremur er hægt að koma á lengdarsamræðum milli hýsils og örveruflóru 10, 14 sem samhæfa þarmajafnvægi í þrívíddar slímhúð þarmanna með því að samrækta ýmsar örverutegundir, örverusamfélög eða hægðaörveruflóru, sérstaklega í þarma-á-flísa. í kerfinu. Þessi aðferð er sérstaklega aðlaðandi fyrir áhorfendur sem rannsaka slímhúðarónæmisfræði, meltingarfærafræði, örveruflóru manna, ræktunarfræði og klíníska örverufræði sem vilja rækta áður óræktaða þarmaflóru í rannsóknarstofu. Ef in vitro formgerðaraðferð okkar er hægt að aðlaga að stigstærðum ræktunarformum, svo sem fjölbrunnsinnsetningum í 24, 96 eða 384 holsplötum sem stöðugt fylla á basolateral hólf, er einnig hægt að dreifa aðferðinni til þeirra sem þróa lyfja-, lífeðlisfræðileg eða háafköst skimunar- eða staðfestingarpalla fyrir matvælaiðnaðinn. Sem sönnun á meginreglunni sýndum við nýlega fram á hagkvæmni fjölþætts háafkösts formgerðarkerfis sem er stigstærðanlegt í 24 holsplötuform. Að auki hafa margar líffæri-á-flísa vörur verið markaðssettar16,17,18. Þess vegna er hægt að flýta fyrir staðfestingu á in vitro formgerðaraðferð okkar og hugsanlega taka hana upp af mörgum rannsóknarstofum, iðnaði eða stjórnvöldum og eftirlitsstofnunum til að skilja frumuendurforritun in vitro þarmamyndunar á umritunarstigi til að prófa lyf eða líftækni. Frásog og Flutningur lyfjaefnis var metinn með því að nota þrívíddar þarmastaðgöngur eða með sérsniðnum eða viðskiptalegum líffærislíkönum til að meta endurtekningarhæfni þarmamyndunarferlisins.
Takmarkaður fjöldi tilraunalíkana sem skipta máli fyrir menn hefur verið notaður til að rannsaka þróun þarmaþekju, aðallega vegna skorts á nothæfum aðferðum til að örva þrívíddarþekju in vitro. Reyndar byggist mikil af núverandi þekkingu á þróun þarmaþekju á dýrarannsóknum (t.d. sebrafiskar20, mýs21 eða kjúklingar22). Hins vegar eru þær vinnuafls- og kostnaðarfrekar, geta verið siðferðilega vafasamar og síðast en ekki síst ákvarða þær ekki nákvæmlega þroskaferli manna. Þessi líkön eru einnig mjög takmörkuð í getu sinni til að vera prófuð á margvíslega stigstærðanlegan hátt. Þess vegna skilar aðferð okkar til að endurnýja þrívíddarvefsbyggingar in vitro betri árangri en dýralíkön in vivo sem og aðrar hefðbundnar kyrrstæðar tvívíddarfrumuræktarlíkön. Eins og áður hefur verið lýst, gerði notkun þrívíddarþekjubygginga okkur kleift að skoða rúmfræðilega staðsetningu aðgreindra frumna í kryptu-villus ásnum sem svar við ýmsum slímhúðar- eða ónæmisörvum. Þrívíddarþekjulög geta veitt rými til að rannsaka hvernig örverufrumur keppa um að mynda rúmfræðilegar sess og vistfræðilega þróun sem svar við þáttum hýsilsins (t.d. innri og ytri slímlög, seytingu á ...). IgA og örverueyðandi peptíð). Þar að auki getur þrívíddarþekjubygging gert okkur kleift að skilja hvernig þarmaflóran byggir upp samfélög sín og framleiðir í samverkandi hætti örveruefnaskiptaefni (t.d. stuttkeðju fitusýrur) sem móta frumuskipulag og stofnfrumunet í grunnfrumukrufum. Þessi einkenni er aðeins hægt að sýna fram á þegar þrívíddarþekjulög eru mynduð in vitro.
Auk aðferðar okkar til að búa til þrívíddarþekjubyggingar í þörmum eru til nokkrar in vitro aðferðir. Ræktun á þarmalíffærum er nýjustu tækni í vefjaverkfræði sem byggir á ræktun stofnfrumna í þörmum við ákveðin formgerðarskilyrði23,24,25. Hins vegar er notkun þrívíddarlíffæralíkana til flutningsgreiningar eða samræktunar hýsil-örveruflóru oft krefjandi þar sem þarmaholrýmið er umlukið líffærinu og því er innleiðing á lumenþáttum eins og örverufrumum eða utanaðkomandi mótefnavaka takmörkuð. Aðgangur að líffæraholum er hægt að bæta með því að nota örinnsprautu,26,27 en þessi aðferð er ífarandi og vinnuaflsfrek og krefst sérhæfðrar þekkingar. Ennfremur endurspegla hefðbundnar líffæraræktanir sem haldnar eru í vetnisgelgrindum við kyrrstæðar aðstæður ekki nákvæmlega virka lífvélafræði in vivo.
Aðrar aðferðir sem nokkrir rannsóknarhópar hafa notað nota forbyggða þrívíddar vetnisgelgrindur til að líkja eftir þekjubyggingu þarma með því að rækta einangraðar þarmafrumur úr mönnum á yfirborði gelsins. Búið til vetnisgelgrindur með þrívíddarprentun, örfræsingu eða steingerðar mót. Þessi aðferð sýnir sjálfskipulagða uppröðun einangraðra þekjufrumna in vitro með lífeðlisfræðilega mikilvægum formgerðarhalla, sem skapar þekjubyggingu með háu hlutfalli og stroma-þekju krossrök með því að fella stromafrumur inn í grindina. Hins vegar getur eðli forbyggðra grindanna komið í veg fyrir að sjálfsprottna formgerðarferlið sjálft birtist. Þessar gerðir veita heldur ekki kraftmikið flæði í lumen eða millivef, og skortir vökvaþrýstinginn sem þarmafrumur þurfa til að gangast undir formgerð og öðlast lífeðlisfræðilega virkni. Önnur nýleg rannsókn notaði vetnisgelgrindur í örvökvakerfi og mynstraði þarmaþekjubyggingar með því að nota leysigeislatækni. Þarmalíffæri músa fylgja etsuðum mynstrum til að mynda þarmapípulaga byggingar og vökvaflæði innan lumensins er hægt að endurskapa með því að nota ... Örflæðisfræðieining. Hins vegar sýnir þessi líkan hvorki sjálfsprottna formgerð né felur í sér vélrænar líffræðilegar hreyfingar í þörmum. Þrívíddar prentunartækni frá sama hópi gátu búið til smáþarmsrör með sjálfsprottnum formgerðum. Þrátt fyrir flókna smíði mismunandi þarmahluta innan rörsins skortir þessa líkan einnig vökvaflæði í lungum og vélræna aflögun. Að auki getur virkni líkansins verið takmörkuð, sérstaklega eftir að lífprentunarferlinu er lokið, sem truflar tilraunaaðstæður eða frumuskiptingar. Í staðinn býður fyrirhuguð aðferð okkar upp á sjálfsprottna þarmaformgerð, lífeðlisfræðilega mikilvæga skerspennu, lífvélafræði sem líkir eftir hreyfanleika þarma, aðgengi að sjálfstæðum topp- og botnhólfum og endursköpun flókinna líffræðilegra örumhverfa með mátbyggingu. Þess vegna gæti in vitro þrívíddar formgerðaaðferð okkar veitt viðbótaraðferð til að sigrast á áskorunum núverandi aðferða.
Aðferð okkar beinist alfarið að þrívíddarþekjumyndun, þar sem aðeins þekjufrumur eru í ræktun og engar aðrar gerðir af nærliggjandi frumum eins og mesenchymalfrumum, æðaþelsfrumum og ónæmisfrumum. Eins og áður hefur verið lýst er kjarni aðferðarinnar að örva þekjumyndun með því að fjarlægja myndunarhemla sem seytast á basolateral hlið innflutts miðilsins. Þó að öflug mátbygging gut-on-a-chip og hybrid-on-a-chip geri okkur kleift að endurskapa bylgjulaga þrívíddarþekjulagið, þá þarf enn að skoða frekar frekar líffræðilega flækjustig eins og þekju-mesenchymal víxlverkun33,34, utanfrumuefnisútfellingu (ECM)35 og, í líkani okkar, eiginleika kryptu og villus sem miðla stofnfrumuníkum í basalkryptum. Stromalfrumur (td fibroblasts) í mesenchymum gegna lykilhlutverki í framleiðslu ECM próteina og stjórnun á þarmamyndun in vivo35,37,38. Viðbót mesenchymalfrumna Við batnaði skilvirkni frumubindingar í líkani okkar. Æðaþelslagið (þ.e. háræðar eða eitlar) gegnir mikilvægu hlutverki í stjórnun sameindaflutninga39 og nýliðunar ónæmisfrumna40 í þarmaumhverfinu. Ennfremur eru æðakerfisþættir sem hægt er að tengja saman vefjalíkön forsenda þegar vefjalíkön eru hönnuð til að sýna fram á milliverkanir margra líffæra. Þess vegna gæti þurft að taka með æðaþelsfrumur til að móta nákvæmari lífeðlisfræðilega eiginleika með upplausn á líffærastigi. Ónæmisfrumur frá sjúklingum eru einnig nauðsynlegar til að sýna meðfædda ónæmissvörun, mótefnavakakynningu, meðfædda aðlögunarhæfa ónæmisvíxlverkun og vefjasértæka ónæmi í samhengi við að herma eftir þarmasjúkdómum.
Notkun blendingaflísa er einfaldari en þarma-á-flísa þar sem uppsetning tækisins er einfaldari og notkun Transwell-innskota gerir kleift að rækta þarmaþekju á stigstærð. Hins vegar eru Transwell-innskot sem fást í verslunum með pólýesterhimnum ekki teygjanleg og geta ekki hermt eftir peristaltískum hreyfingum. Ennfremur var topphólfið í Transwell-innskotinu, sem var sett í blendingaflísina, kyrrstætt án þess að skerspenna væri á topphliðinni. Ljóst er að stöðugleikaeiginleikarnir í topphólfinu gera sjaldan kleift að rækta bakteríur til langs tíma í blendingaflísum. Þó að við getum örvað þrívíddarmyndun á öflugan hátt í Transwell-innskotum þegar blendingaflísar eru notaðir, getur skortur á lífeðlisfræðilega mikilvægri lífvélafræði og vökvaflæði í topphólfinu takmarkað hagkvæmni blendingaflísapalla fyrir hugsanleg notkun.
Fullar endurgerðir á ásnum á þörmum mannsins í ræktun með gut-on-a-chip og blending-on-a-chip hafa ekki verið að fullu staðfestar. Þar sem formgerð hefst frá einþekjuþekjulagi, veita þrívíddar örarkitektúrar ekki endilega formfræðilega líkingu við frumuskiljur in vivo. Þó að við höfum einkennt fjölgandi frumufjölgun nálægt grunnþekjusvæðinu í örgerða þrívíddarþekjunni, voru frumuskiljur og villussvæði ekki skýrt afmörkuð. Þó að hærri efri rásir á flísinni leiði til aukinnar hæðar örgerða þekjunnar, er hámarkshæðin enn takmörkuð við ~300–400 µm. Raunveruleg dýpt þarmaskilja manna í smáþörmum og ristli er ~135 µm og ~400 µm, talið í sömu röð, og hæð smáþarmsvillanna er ~600 µm41.
Frá sjónarhóli myndgreiningar gæti myndgreining á þrívíddar örbyggingar með mikilli upplausn á staðnum verið takmörkuð við þarmann á flís, þar sem nauðsynleg vinnufjarlægð frá hlutglerinu að þekjulaginu er í stærðargráðu nokkrir millimetrar. Til að vinna bug á þessu vandamáli gæti verið nauðsynlegt að nota fjarlægan hlutgler. Ennfremur er krefjandi að búa til þunnar sneiðar til að undirbúa myndgreiningarsýni vegna mikillar teygjanleika PDMS. Þar að auki, þar sem lag-fyrir-lag örsmíði þarmanna á flís felur í sér varanlega viðloðun milli hvers lags, er afar krefjandi að opna eða fjarlægja efra lagið til að skoða yfirborðsbyggingu þekjulagsins. Til dæmis með því að nota skannandi rafeindasmásjá (SEM).
Vatnsfælni PDMS hefur verið takmarkandi þáttur í örvökvafræðilegum rannsóknum sem fjalla um vatnsfælnar smásameindir, þar sem PDMS getur aðsogað slíkar vatnsfælnar sameindir á ósértækan hátt. Hægt er að íhuga aðra valkosti í stað PDMS með öðrum fjölliðuefnum. Einnig er hægt að íhuga yfirborðsbreytingar á PDMS (t.d. húðun með fitusæknum efnum 42 eða pólý(etýlen glýkóli) 43) til að lágmarka aðsog vatnsfælinna sameinda.
Að lokum hefur aðferð okkar ekki verið vel skilgreind hvað varðar að bjóða upp á háafkösta skimun eða notendavæna tilraunavettvang sem hentar öllum. Núverandi aðferðafræði krefst sprautudælu fyrir hvert örtæki, sem tekur pláss í CO2-ræktunarofni og kemur í veg fyrir stórar tilraunir. Þessa takmörkun er hægt að bæta verulega með því að auka sveigjanleika nýstárlegra ræktunarforma (t.d. 24-hols, 96-hols eða 384-hols porous innlegg sem leyfa stöðuga endurnýjun og fjarlægingu á basolateral miðli).
Til að örva þrívíddarmyndun þarmaþekju manna in vitro, notuðum við örvökvaflís í þörmum sem innihélt tvær samsíða örrásir og teygjanlega porous himnu á milli til að búa til tengiflöt milli holrýmis og háræða. Við sýnum einnig fram á notkun á einrásar örvökvatæki (blendingsflísi) sem veitir samfellda basalhliða flæði undir skautuðum þekjulögum sem ræktaðar eru á Transwell innskotum. Í báðum kerfum er hægt að sýna fram á myndun ýmissa þarmaþekjufrumna í mönnum með því að beita stefnustýrðri flæðisstjórnun til að fjarlægja myndunarblokka úr basalhliða hólfinu. Öll tilraunaaðferðin (mynd 1) samanstendur af fimm hlutum: (i) örsmíði þarmaflísarinnar eða Transwell innsetningarblendingsflísins (skref 1-5; rammi 1), (ii) undirbúningur þarmaþekjufrumna (Caco-2 frumur) eða þarmalíffæra í mönnum; kassar 2-5), (iii) ræktun þarmaþekjufrumna á þarmaflögum eða blendingsflögum (skref 6-9), (iv) örvun þrívíddarmyndunar in vitro (skref 10) og (v)) til að lýsa þrívíddar örbyggingu þekjufrumnanna (skref 11-24). Að lokum var viðeigandi samanburðarhópur (rætt nánar hér að neðan) hannaður til að staðfesta virkni in vitro myndunar með því að bera saman myndun þekjufrumna við rúmfræðilega, tímabundna, skilyrta eða verklagsbundna samanburðarhópa.
Við notuðum tvær mismunandi ræktunarpallar: þarma-á-flísa með beinum rásum eða ólínulegum flóknum rásum, eða blendingsflísa sem innihéldu Transwell (TW) innskot í örvökvatæki, smíðað eins og lýst er í ramma 1, og skref 1-5. „Tækjaframleiðsla“ sýnir helstu skrefin í að búa til eina flís eða blendingsflísa. „Ræktun þarmaþekjufrumna úr mönnum“ útskýrir frumuuppsprettu (Caco-2 eða þarmalíffæri úr mönnum) og ræktunarferlið sem notað er í þessari aðferð. „In vitro formgerð“ sýnir heildarskrefin þar sem Caco-2 eða líffærafræðilegar þekjufrumur eru ræktaðar á þarmaflís eða á Transwell innskotum blendingsflísa, fylgt eftir af örvun þrívíddar formgerðar og myndun einkenndrar þekjubyggingar. Skrefnúmer forritsins eða kassanúmerið er sýnt fyrir neðan hverja ör. Forritið veitir dæmi um hvernig hægt er að nota komið þekjulög úr þarma, til dæmis í frumugreiningu, rannsóknum á þarmalífeðlisfræði, stofnun vistkerfa hýsil-örveruflóru og sjúkdómslíkön. Ónæmisflúrljómun. Myndir í „Frumudreifing“ sem sýna kjarna, F-aktín og MUC2 tjáð í 3D Caco-2 þekjulaginu sem myndast á þarmaflísinni. MUC2 boðleiðir eru til staðar í bikarfrumum og slími sem seytist frá slímhúð. Flúrljómandi myndir í Gut Physiology sýna slím sem framleitt er með litun fyrir síalsýru og N-asetýlglúkósamín leifum með því að nota flúrljómandi hveitikím agglútínín. Tvær skarast myndirnar í „Hýsils-örveru samræktun“ sýna dæmigerðar samræktanir hýsils-örveruflóru í þörmum á flís. Vinstri spjaldið sýnir samræktun E. coli sem tjáir grænt flúrljómandi prótein (GFP) með örhönnuðum 3D Caco-2 þekjufrumum. Hægri spjaldið sýnir staðsetningu GFP E. coli sem var ræktað með 3D Caco-2 þekjufrumum, fylgt eftir af ónæmisflúrljómunarlitun með F-aktíni (rautt) og kjarna (blátt). Sjúkdómslíkön sýna heilbrigðan samanborið við lekann þarma í þarmabólguflísum undir lífeðlisfræðilegri áskorun með bakteríumótefnavökum (t.d. lípópólýsakkaríði, LPS) og ónæmisfrumur (t.d. PBMC; grænt). Caco-2 frumur voru ræktaðar til að mynda þrívíddar þekjulag. Kvarðastika, 50 µm. Myndir í neðstu röð: „Aðgreining frumna“ aðlagað með leyfi frá tilvísun.2. Oxford University Press; Endurtekið með leyfi frá tilvísun 5. NAS; „Samræktun hýsils-örvera“ aðlagað með leyfi frá tilvísun 3. NAS; „Sjúkdómalíkön“ aðlagað með leyfi frá tilvísun 5. NAS.
Bæði þarmaflísar og blendingsflísar voru framleiddar með PDMS eftirlíkingum sem voru teknar úr kísilmótum með mjúkri litografíu1,44 og mynstraðar með SU-8. Hönnun örrásanna í hverjum flís er ákvörðuð með því að taka tillit til vatnsaflfræðilegra þátta eins og skerspennu og vatnsaflfræðilegs þrýstings1,4,12. Upprunalega þarmaflísarhönnunin (útvíkkuð gögn mynd 1a), sem samanstóð af tveimur samsíða beinum örrásum, hefur þróast í flókna þarmaflísarhönnun (útvíkkuð gögn mynd 1b) sem inniheldur tvær sveigðar örrásir til að örva aukinn dvalartíma vökva, ólínulega flæðimynstur og fjölása aflögun ræktaðra frumna (mynd 2a-f)12. Þegar endurskapa þarf flóknari lífvélafræði þarmaflísar er hægt að velja flókna þarmaflísar. Við höfum sýnt fram á að flókna þarmaflísarhönnunin örvar einnig sterklega þrívíddarmyndun á svipuðum tíma með svipuðum vexti þekjuvefs samanborið við upprunalega hönnunina. Gut-Chip, óháð frumugerð ræktaðrar. Þess vegna, til að örva þrívíddarmyndun, eru línulegar og flóknar þarmahönnun á flís víxlanleg. PDMS eftirlíkingar hertar á kísilmótum með SU-8 mynstrum gáfu neikvæða eiginleika eftir afmótun (Mynd 2a). Til að framleiða þarma á flís var efra PDMS lagið, sem var búið til, tengt í röð við porous PDMS filmu og síðan samstillt við neðra PDMS lagið með óafturkræfri límingu með því að nota kóróna meðferðartæki (Mynd 2b-f). Til að framleiða blendingsflögur voru hertar PDMS eftirlíkingar bundnar við glerskifur til að búa til einrásar örflæðitæki sem gætu rúmað Transwell innlegg (Mynd 2h og Ítarleg gögn Mynd 2). Límingarferlið er framkvæmt með því að meðhöndla yfirborð PDMS eftirlíkingarinnar og glersins með súrefnisplasma eða kóróna meðferð. Eftir sótthreinsun örframleidda tækisins sem fest var við kísilrörið var tækið tilbúið til að framkvæma þrívíddarmyndun þarmaþekjunnar (Mynd 2g).
a, Skýringarmynd af undirbúningi PDMS-hluta úr SU-8 mynstruðum kísilmótum. Óherta PDMS-lausnin var hellt í kísilmót (vinstri), hert við 60°C (miðja) og tekin úr mótinu (hægri). Afmótaða PDMS-ið var skorið í bita og hreinsað til frekari notkunar. b, Ljósmynd af kísilmótinu sem notað var til að undirbúa efra lag PDMS. c, Ljósmynd af kísilmótinu sem notað var til að framleiða porous himnu PDMS. d, Röð ljósmynda af efri og neðri PDMS-íhlutum og samsettu þarmatæki á örflögum. e, Skýringarmynd af röðun efri, himnu- og neðri PDMS-íhluta. Hvert lag er óafturkræft tengt með plasma- eða kórónameðferð. f, Skýringarmynd af smíðaða þarma-á-örflögum með ofan á lagðar flóknar örrásir og lofttæmisklefa. g, Uppsetning þarma-á-örflögum fyrir örvökvafrumuræktun. Smíðaða þarman á örflögum, sett saman með kísilröri og sprautu, var sett á hlífðargler. Flísatækið var sett á Lok á 150 mm Petri-skál til vinnslu. Bindiefnið er notað til að loka sílikonrörinu. h, Myndir af framleiðslu blendingsflísa og þrívíddarmyndun með því að nota blendingsflísa. Transwell-innskot, sem voru útbúin sjálfstætt til að rækta tvívíddar einlög af þekjufrumum í þörmum, voru sett í blendingsflísinn til að örva þrívíddarmyndun í þörmum. Miðillinn er blóðflæði í gegnum örrásir undir frumulaginu sem er komið fyrir á Transwell-innskotinu. Kvarðastika, 1 cm. h Endurprentað með leyfi frá tilvísun. 4. Elsevier.
Í þessari aðferð voru Caco-2 frumulínan og þarmalíffæri notuð sem þekjufrumuuppsprettur (Mynd 3a). Báðar frumugerðirnar voru ræktaðar óháð hvoru öðru (Kassi 2 og Kassi 5) og notaðar til að sá ECM-húðuðum örrásum úr þarmaflís eða Transwell-innskotum. Þegar frumur eru samflenndar (>95% þekja í flöskum) eru venjulega ræktaðar Caco-2 frumur (milli göngu 10 og 50) í T-flöskum teknar til að útbúa sundraðar frumulausnir með trypsiniseringarvökva (Kassi 2). Mannleg þarmalíffæri úr þarmasýnum eða skurðaðgerðum voru ræktuð í Matrigel-hvelfingum í 24-holu plötum til að styðja við byggingarlegt örumhverfi. Miðill sem innihélt nauðsynleg formefni (eins og Wnt, R-spondin og Noggin) og vaxtarþætti sem voru útbúnir eins og lýst er í Kassi 3 var bætt við annan hvern dag þar til líffærin uxu í ~500 µm í þvermál. Fullvaxin líffæri eru teknar og sundrað í stakar frumur fyrir... Sáning á þarmaflóru eða Transwell-innskot á flís (kassi 5). Eins og við höfum áður greint frá er hægt að greina á milli sjúkdómstegundar12,13 (t.d. sáraristilbólga, Crohns sjúkdómur, krabbamein í ristli og endaþarmi eða heilbrigður gjafi), skemmdarsvæði (t.d. skemmd á móti svæði án skemmda) og staðsetningu meltingarvegarins (t.d. skeifugörn, ásgörn, dausgörn, blindþarmur, ristill eða endaþarmur). Við bjóðum upp á fínstillta aðferð í kassi 5 fyrir ræktun ristillíffæra (kólíða) sem þurfa venjulega hærri styrk morfógena en smáþarmalíffæri.
a, Verkflæði til að örva þarmamyndun í þarmaflís. Caco-2 þarmaþekjufrumur manna og þarmalíffæri eru notuð í þessari aðferð til að sýna fram á þrívíddarmyndun. Einangraðar þekjufrumur voru sáðar í undirbúið þarma-á-flís tæki (flís undirbúningur). Þegar frumum hefur verið sáð (sáð) og fest (fest) við PDMS porous himnu á degi 0 (D0), hefst toppflæði (AP) og viðhaldist fyrstu 2 dagana (flæði, AP, D0-D2). Basolateral (BL) flæði hefst einnig ásamt hringlaga teygjuhreyfingum (teygja, flæði, AP og BL) þegar heilt tvívítt einlag myndast. Þrívíddarmyndun í þörmum átti sér stað sjálfkrafa eftir 5 daga örvökvaræktun (myndun, D5). Fasa andstæðumyndir sýna dæmigerða formgerð Caco-2 frumna á hverju tilraunaskrefi eða tímapunkti (súlurit, 100 µm). Fjórar skýringarmyndir sem sýna samsvarandi kaskáða þarmamyndunar (efst til hægri). Strikamerkið Örvar í skýringarmyndinni tákna stefnu vökvaflæðisins.b, SEM mynd sem sýnir yfirborðsbyggingu þrívíddar Caco-2 þekjuvefsins (vinstri megin). Innskotið sem lýsir upp stækkaða svæðið (hvítur strikaður kassi) sýnir endurnýjaða örvilli á þrívíddar Caco-2 laginu (hægri).c, Lárétt framsýn af þrívíddar Caco-2, claudin (ZO-1, rauð) og samfelldum burstajaðarhimnum merktum F-aktíni (grænt) og kjarna (blár). Ónæmisflúrljómun í samsvörun þekjufrumna á þarmaflísum. Örvar sem vísa á miðju skýringarmyndina gefa til kynna staðsetningu brenniflatar fyrir hverja samsvörunarsýn.d, Tímaferli formfræðilegra breytinga í líffæri sem ræktuð voru á flís sem fengin var með fasaandstæðusmásjá á dögum 3, 7, 9, 11 og 13. Innskotið (efst til hægri) sýnir mikla stækkun á meðfylgjandi mynd.e, DIC smásjármynd af þrívíddarþekju líffæris sem komið var fyrir í þörmum á sneið tekin á degi 7.f, Yfirlagðar ónæmisflúrljómunarmyndir sem sýnir merki fyrir stofnfrumur (LGR5; magenta), bikarfrumur (MUC2; grænt), F-aktín (grátt) og kjarna (blágrænt) ræktaðar á þarmaflísum í 3 daga, talið í sömu röð (vinstri) og 13 daga (miðja) líffæri á þekjulaginu. Sjá einnig mynd 3 af ítarlegum gögnum, sem sýnir LGR5 merkjagjöf án MUC2 merkjagjöf. Flúrljómunarmyndir sem sýna þekjuflísarörbyggingu (hægra megin) þrívíddar líffærisþekju sem komið var á fót í þörmum á flís með því að lita plasmahimnuna með CellMask litarefni (hægra megin) á 13. degi ræktunar. Kvarðastika er 50 μm nema annað sé tekið fram. b Endurprentað með leyfi frá tilvísun. 2. Oxford University Press; c Aðlagað með leyfi frá tilvísun. 2. Oxford University Press; e og f aðlagað með leyfi með tilvísun. 12 Undir Creative Commons leyfi CC BY 4.0.
Í þörmum á flís er nauðsynlegt að breyta vatnsfælnu yfirborði PDMS porous himnunnar til að ECM húðun takist. Í þessari aðferð notum við tvær mismunandi aðferðir til að breyta vatnsfælni PDMS himna. Til að rækta Caco-2 frumur var yfirborðsvirkjun með útfjólubláum/ósónmeðferð einni nægjanleg til að draga úr vatnsfælni PDMS yfirborðsins, húða ECM og festa Caco-2 frumur við PDMS himnuna. Hins vegar krefst örvökvaræktun líffæraþekju efnafræðilegrar yfirborðsvirkjunar til að ná fram skilvirkri útfellingu ECM próteina með því að bera pólýetýlenímín (PEI) og glútaraldehýð í röð á PDMS örrásir. Eftir yfirborðsbreytingu voru ECM prótein sett til að þekja virkjaða PDMS yfirborðið og síðan sett inn í einangraða líffæraþekjuna. Eftir að frumurnar hafa fest sig hefst örvökvafrumuræktunin með því að blása aðeins miðlinum inn í efri örrásina þar til frumurnar mynda heilt einlag, á meðan neðri örrásin viðheldur kyrrstöðu. Þessi fínstillta aðferð fyrir yfirborðsvirkjun og ECM húðun gerir kleift að festa líffæraþekjuna. þekjuvefur til að örva þrívíddarmyndun á yfirborði PDMS.
Transwell ræktanir þurfa einnig ECM húðun fyrir sáningu frumna; Hins vegar þurfa Transwell ræktanir ekki flóknar formeðferðarskref til að virkja yfirborð porous innleggja. Til að rækta Caco-2 frumur á Transwell innleggjum flýtir ECM húðun á porous innleggjum fyrir viðhengi aðskilinna Caco-2 frumna (<1 klukkustund) og myndun þéttra tengipunkta (<1-2 dagar). Til að rækta líffæri á Transwell innleggjum eru einangruð líffæri sáð á ECM-húðaðar innlegg, fest við himnuyfirborð (<3 klst.) og haldið þar til líffærin mynda heilt einlag með heilbrigðri hindrun. Transwell ræktanir eru framkvæmdar í 24 hols plötum án þess að nota blendingsflögur.
Hægt er að hefja þrívíddarmyndun in vitro með því að beita vökvaflæði á basolateral hlið þekjulags sem hefur myndast. Í þörmum á flís hófst þekjumyndun þegar ræktunarvökvinn var dælt í efri og neðri örrásirnar (Mynd 3a). Eins og áður hefur verið lýst er mikilvægt að koma vökvaflæði inn í neðri (basolateral) hólfið til að fjarlægja stöðugt stefnumiðaða myndunarhemla. Til að veita frumum sem eru bundnar á porous himnum nægilegt næringarefni og sermi og mynda klippispennu í lumen, beitum við venjulega tvöföldu flæði í þörmum á flís. Í blendingsflögum voru Transwell-innskot sem innihéldu þekjueinlög sett inn í blendingsflögurnar. Síðan var ræktunarvökvinn settur undir basolateral hlið porous Transwell-innskotsins í gegnum örrásina. Þarmamyndun átti sér stað 3-5 dögum eftir að basolateral flæði hófst í báðum ræktunarpöllum.
Hægt er að greina formfræðilega eiginleika örgerðra þrívíddarþekjulaga með því að nota ýmsar myndgreiningaraðferðir, þar á meðal fasaskilgreiningarsmásjá, mismunadreifingarskilgreiningarsmásjá (DIC), SEM eða ónæmisflúrljómunarsamfókussmásjá (myndir 3 og 4). Fasaskilgreining eða DIC myndgreining er auðvelt að framkvæma hvenær sem er meðan á ræktun stendur til að fylgjast með lögun og útskoti þrívíddarþekjulaga. Vegna sjónræns gegnsæis PDMS og pólýesterfilma geta bæði gut-on-a-chip og blendingsflögupallar veitt rauntíma myndgreiningu á staðnum án þess að þurfa að skipta tækinu í sneiðar eða taka það í sundur. Þegar ónæmisflúrljómunarmyndgreining er framkvæmd (myndir 1, 3c, f og 4b, c) eru frumur venjulega festar með 4% (þyngd/rúmmál) paraformaldehýði (PFA), fylgt eftir með Triton X-100 og 2% (þyngd/rúmmál) nautgripasermisalbúmíni (BSA), í þeirri röð. Eftir því hvaða frumugerð er um að ræða er hægt að nota mismunandi festiefni, gegndræpisefni og blokkunarefni. Aðalmótefni sem miða á Ættarháð frumu- eða svæðismerki eru notuð til að varpa ljósi á frumur sem eru festar á staðnum á flísinni, og síðan auka mótefni ásamt mótlitarefni sem beinist annað hvort að kjarna (t.d. 4′,6-díamídínó-2-fenýlen) indóli, DAPI) eða F-aktíni (t.d. flúrljómandi merkt fallóídín). Einnig er hægt að framkvæma flúrljómunarmyndgreiningu á staðnum til að greina slímframleiðslu (Mynd 1, „Frumudreifing“ og „Þarmafrumnalífeðlisfræði“), handahófskennda nýlenduvæðingu örverufrumna (Mynd 1, „Samrækt hýsils-örveru“), nýliðun ónæmisfrumna (Mynd 1, „Sjúkdómslíkön“) eða útlínur þrívíddar þekjuvefs (Mynd 3c,f og 4b,c). Þegar þörmum er breytt á flísinni til að aðskilja efra lagið frá neðra örrásarlaginu, eins og lýst er í tilvísun. Eins og sýnt er á mynd 2, er hægt að sjá þrívíddar þekjuvefsformgerðina sem og örvilli á toppbrúninni með rafeindasmásjá. (Mynd 3b). Hægt er að meta tjáningu aðgreiningarmerkja með því að framkvæma megindlega PCR5 eða RNA-raðgreiningu á einum frumu. Í þessu tilviki eru þrívíddarlög af þekjufrumum, sem ræktaðar eru í þarmaflögum eða blendingaflögum, tekin með trypsineringu og síðan notuð til sameinda- eða erfðagreiningar.
a, Verkflæði til að örva þarmamyndun í blendingsflögum. Caco-2 og þarmalíffæri eru notuð í þessari aðferð til að sýna fram á þrívíddarmyndun í blendingsflögu. Aðskildar þekjufrumur voru sáðar í undirbúnar Transwell-innsetningar (TW-undirbúningur; sjá mynd hér að neðan). Þegar frumum hafði verið sáð (sáðað) og festar við pólýesterhimnur í Transwell-innsetningum voru allar frumur ræktaðar við kyrrstæðar aðstæður (TW-ræktun). Eftir 7 daga var ein Transwell-innsetning sem innihélt tvívíddar einlag af þekjufrumum samþætt í blendingsflögu til að kynna grunnflæði (Flow, BL), sem að lokum leiddi til myndunar þrívíddar þekjulags (myndun). Fasaandstæðusmásjármyndir sem sýna formfræðilega eiginleika þekjufrumna úr líffærum manna sem eru fengnar úr eðlilegum gjafa (C103 lína) uppstigandi ristli á hverju tilraunaskrefi eða tímapunkti. Skýringarmyndirnar í efri lögum sýna tilraunastillinguna fyrir hvert skref. b, Blendingsflögur (vinstri skýringarmynd) geta leitt til þrívíddarmyndunar líffæraþekjufrumna með Smásjármyndir ofan frá og niður teknar á mismunandi Z-stöðum (efri, miðju og neðri; sjá hægri skýringarmynd og samsvarandi punktalínur). sýndu greinileg formfræðileg einkenni. F-aktín (blágrænt), kjarni (grátt). c, Flúrljómunarsmásjármyndir (3D hornmynd) af þekjufrumum sem eru fengnar úr líffærafræðilegum efnum, ræktaðar í kyrrstæðri Transwell (TW; innskot í hvítum strikakassa) samanborið við blendingsflögu (stærsta heildarmyndin) þar sem 2D og 3D formgerð er borin saman, talið í sömu röð. Par af 2D lóðréttum þversniðum (innskot í efra hægra horninu; „XZ“) sýna einnig 2D og 3D eiginleika. Kvarðastika, 100 µm. c Endurprentað með leyfi frá tilvísun. 4. Elsevier.
Hægt er að útbúa samanburðarsýni með því að rækta sömu frumur (Caco-2 eða þarmalíffæraþekjufrumur) í tvívíð einlög við hefðbundnar kyrrstæðar ræktunaraðstæður. Athyglisvert er að næringarefnaskortur getur stafað af takmörkuðu rúmmáli örrásanna (þ.e. ~4 µL í efstu rásinni á upprunalegu þarmaflísarhönnuninni). Því er einnig hægt að bera saman þekjubyggingu fyrir og eftir beitingu basolateral flow.
Mjúklitografíuferlið ætti að fara fram í hreinu herbergi. Fyrir hvert lag á örgjörvanum (efri og neðri lög og himnur) og blendingsflögum voru mismunandi ljósgrímur notaðar og framleiddar á aðskildum kísilplötum vegna þess að hæð örrásanna var mismunandi. Markmiðshæð efri og neðri örrásanna í meltingarveginum á örgjörvanum er 500 µm og 200 µm, talið í sömu röð. Markmiðshæð rásarinnar á blendingsflögunni er 200 µm.
Setjið 3 tommu kísilþynnu í skál með asetoni. Hvirflið plötunni varlega í 30 sekúndur og loftþurrkið hana síðan. Færið þynnuna yfir á plötu með IPA og snúið henni síðan í 30 sekúndur til að þrífa hana.
Hægt er að nota piranha-lausn (blanda af vetnisperoxíði og óblandaðri brennisteinssýru, 1:3 (rúmmál/rúmmál)) til að hámarka fjarlægingu lífrænna leifa af yfirborði kísilþynnunnar.
Piranha-lausn er afar ætandi og myndar hita. Nauðsynlegt er að gera frekari öryggisráðstafanir. Við förgun úrgangs skal leyfa lausninni að kólna og flytja hana í hreint, þurrt ílát. Notið aukaílát og merkið ílátin rétt. Vinsamlegast fylgið öryggisleiðbeiningum stofnunarinnar til að fá nánari upplýsingar.
Þurrkið skífurnar með því að setja þær á 200°C heitan helluplötu í 10 mínútur. Eftir þurrkun var skífan hrist fimm sinnum í lofti til að kólna.
Hellið um 10 g af ljósþolnu efni SU-8 2100 á miðju hreinsaðrar kísilplötu. Notið pinsett til að dreifa ljósþolnu efninu jafnt á plötuna. Setjið plötuna öðru hvoru á 65°C heitan plötu til að gera ljósþolið minna klístrað og auðveldara að dreifa því. Setjið ekki plötuna beint á heita plötuna.
SU-8 var dreift jafnt á skífuna með því að keyra snúningshúðun. Forritið snúning SU-8 í 5–10 sekúndur til að breiðast út við 500 snúninga á mínútu með hröðun upp á 100 snúninga á mínútu/s. Stillið aðalsnúninginn fyrir 200 µm þykktarmynstur við 1.500 snúninga á mínútu, eða náið 250 µm þykkt (sem gerir 500 µm hæð fyrir efra lag innyflanna á flísinni; sjá „Mikilvæg skref“ hér að neðan) stillt á hröðun upp á 300 snúninga á mínútu/s og 30 sekúndur við 1.200 snúninga á mínútu.
Hægt er að stilla aðalsnúningshraðann í samræmi við markþykkt SU-8 mynstrsins á kísilplötunni.
Til að búa til SU-8 mynstur sem eru 500 µm há fyrir efra lag innyflanna á flísinni, voru snúningshúðunin og mjúkbakunarskrefin í þessum kassa (skref 7 og 8) endurtekin í röð (sjá skref 9) til að framleiða tvö lög af 250 µm þykku lagi af SU-8, sem hægt er að leggja saman og sameina með útfjólubláum geislum í skrefi 12 í þessum kassa, og mynda þannig 500 µm hátt lag.
Bakið SU-8 húðuðu skífurnar varlega með því að setja þær varlega á heitaplötu við 65°C í 5 mínútur, stillið síðan á 95°C og ræktið í 40 mínútur til viðbótar.
Til að ná 500 μm hæð SU-8 mynstursins í efri örrásinni skal endurtaka skref 7 og 8 til að búa til tvö 250 μm þykk SU-8 lög.
Notið UV-grímujöfnunartækið og framkvæmið lampapróf samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda til að reikna útsetningartíma skífunnar. (útsetningartími, ms) = (útsetningarskammtur, mJ/cm2)/(lampaafl, mW/cm2).
Eftir að lýsingartíminn hefur verið ákvarðaður skal setja ljósgrímuna á grímuhaldarann ​​á útfjólubláa grímujafnaranum og setja ljósgrímuna á SU-8 húðaða skífuna.
Setjið prentaða yfirborð ljósgrímunnar beint á SU-8 húðaða hlið kísilplötunnar til að lágmarka útfjólubláa geislun.
Látið SU-8 húðaða skífuna og ljósgrímuna verða lóðrétt fyrir 260 mJ/cm2 af útfjólubláu ljósi í fyrirfram ákveðinn útsetningartíma (sjá skref 10 í þessum ramma).
Eftir útfjólubláa geislun voru SU-8-húðaðar kísilplötur bakaðar við 65°C í 5 mínútur og 95°C í 15 mínútur á hvorri heitri plötu til að búa til mynstur með hæð 200 µm. Framlengið eftirbökunartímann við 95°C í 30 mínútur til að búa til mynstur með hæð 500 µm.
Framköllunarefnið er hellt í glerskál og bökuð skífa sett í skálina. Rúmmál SU-8 framköllunarefnisins getur verið breytilegt eftir stærð glerplötunnar. Gakktu úr skugga um að nota nægilegt magn af SU-8 framköllunarefni til að fjarlægja alveg óútsett SU-8. Til dæmis, þegar notaður er glerskál með 150 mm þvermál og 1 lítra rúmmál, notaðu ~300 ml af SU-8 framköllunarefni. Framkallaðu mótið í 25 mínútur og snúðu því varlega öðru hvoru.
Skolið þróaða mótið með ~10 ml af ferskum framköllunartæki og síðan IPA með því að úða lausninni með pípettu.
Setjið skífuna í plasmahreinsitæki og látið hana verða fyrir súrefnisplasma (andrúmsloftsgas, markþrýstingur 1 × 10−5 Torr, afl 125 W) í 1,5 mínútur.
Setjið skífuna í lofttæmisþurrkara með glerþynnu inni í henni. Hægt er að setja skífur og þynnugler hlið við hlið. Ef lofttæmisþurrkarinn er skipt í nokkur lög með plötu, setjið þá þynnurnar í neðra hólfið og skífurnar í það efra. Setjið 100 μL af tríklór(1H, 1H, 2H, 2H-perflúoroktýl)sílanlausn á glerþynnu og beitið lofttæmi til að silanisera.
Þíðið hettuglas með frosnum Caco-2 frumum í 37°C vatnsbaði og flytjið síðan þíðu frumurnar í T75 flösku sem inniheldur 15 ml af 37°C forhituðu Caco-2 miðli.
Til að Caco-2 frumur komist í gegn við ~90% samflæði, skal fyrst hita Caco-2 miðilinn, PBS og 0,25% trypsín/1 mM EDTA í 37°C vatnsbaði.
Sogið ræktunarvökvann upp með lofttæmingu. Þvoið frumurnar tvisvar með 5 ml af volgu PBS með því að endurtaka lofttæmingu og bæta við fersku PBS.