Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan stuðning fyrir CSS. Til að fá bestu upplifunina mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökktir á samhæfnistillingu í Internet Explorer). Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Þarmamyndun mannsins kemur á fót crypt-villus eiginleikum 3D þekjuþekju örarkitektúrs og staðbundinnar skipulags.Þessi einstaka uppbygging er nauðsynleg til að viðhalda jafnvægi í þörmum með því að vernda stofnfrumu sess í basal crypt fyrir utanaðkomandi örverumótefnavaka og umbrotsefni þeirra. Auk þess eru þarmavilli og seytandi slím til staðar starfrænt aðgreindar frumur á yfirborði þekjuvefsins. Að byggja upp þrívíddarþekjuþekju er afar mikilvægt fyrir smíði in vitro þarmalíkana. Athyglisvert er að lífræna eftirhermandi þörmum á flís getur framkallað sjálfsprottna þrívíddarmyndun þarmaþekju með aukinni lífeðlisfræðilegri virkni og lífeðlisfræði.Hér bjóðum við upp á endurskapanlega aðferð til að örva meltingarveginn í þörmum sem örvandi og örvunarflögu. innbyggður blendingur flís. Við lýsum nákvæmum aðferðum við framleiðslu tækis, ræktun á Caco-2 eða þarmalífrænum þekjufrumum í hefðbundnum aðstæðum sem og á örflæðisvettvangi, örvun á 3D formgerð og lýsingu á þekktum þrívíddarþekju með því að nota margar myndgreiningaraðferðir. Þessi aðferð við að stjórna vökva í grunnflæði með vökvakerfi ná fram endurnýjun vökva. tro morphogenesis aðferðin notar lífeðlisfræðilega viðeigandi klippiálag og vélræna hreyfingu og krefst ekki flókins frumuverkfræði eða meðhöndlunar, sem gæti farið fram úr öðrum núverandi aðferðum.Við sjáum fyrir okkur að fyrirhugaða siðareglur okkar gæti haft víðtæk áhrif á lífeindafræðilega rannsóknarsamfélagið, sem veitir aðferð til að endurnýja 3D þekjulög í þörmum in vitro fyrir lífeðlisfræðilegar, klínískar og lyfjafræðilegar, lyfjafræðilegar og lyfjafræðilegar.
Tilraunir sýna að Caco-2 frumur í þekju í þörmum sem ræktaðar eru í þörmum á flís 1,2,3,4,5 eða tvílaga örvökvabúnaði6,7 geta gengist undir sjálfsprottna 3D formgerð in vitro án þess að hafa skýran skilning á undirliggjandi verkunarháttum. Í nýlegri rannsókn okkar komumst við að því að nægilegt magn af ræktun sem leynist í ræktun og 3D er nægilegt fjarlægt úr sýklalyfjum og 3D ræktunartæki. thelial morphogenesis in vitro, sem hefur verið sýnt fram á með Caco-2 og þarmalíffærum sem eru fengnar af sjúklingum.Þekjufrumur voru staðfestar. Í þessari rannsókn beinum við okkur sérstaklega að frumuframleiðslu og styrkdreifingu öflugs Wnt mótlyfja, Dickkopf-1 (DKK-1), í þörmum á flís og breyttum örvökvabúnaði sem inniheldur Transwell innlegg, sem kallast "Hybrid Chip". prótein 1, eða Soggy-1) í þörmum á flís hamlar formgerð eða truflar forskipaða þrívíddarþekjulagið, sem bendir til þess að andstæð streita við ræktun sé ábyrg fyrir formgerð í þörmum in vitro. Þess vegna er hagnýt aðferð til að ná öflugri formgerð í þekjuvef við hlið þekjuvefsins eða viðhalda lágmarksþekjuviðmóti í þekjuvef. með virkri skolun (td í þörmum-á-flís eða blending-á-flís-pöllum) eða dreifingu .Basolateral miðla (td frá Transwell innskotum í stór basolateral lón í holum).
Í þessari samskiptareglu bjóðum við upp á ítarlega aðferð til að búa til örtæki í þörmum á flís og Transwell-innsettan blendingsflögur (skref 1-5) til að rækta þekjufrumur í þörmum á pólýdímetýlsíloxan (PDMS)-byggðum gljúpum himnum (skref 6A, 7A, 8, 9) eða pólýesterhimnur, 8B himnur, 8B himnur, B og 9B himnur. ed 3D morphogenesis in vitro (skref 10). Við greindum einnig frumu- og sameindaeiginleika sem benda til vefjasértækrar vefjamyndunar og ættarháðrar frumuaðgreiningar með því að beita mörgum myndgreiningaraðferðum (skref 11-24). Við framkallum formgerð með þekjufrumum úr mönnum, eins og með tæknilegum Caco-2 frumum í þörmum, þar með talið frumuræktun í þörmum. sköpun 2D einlaga, og þarma lífefnafræðilega og æxlun lífmekanísks örumhverfis.in vitro.Til að framkalla 3D formgerð úr 2D þekjueinlögum, fjarlægðum við morfogen mótlyf í báðum ræktuðum formum með því að flæða miðlinum inn í basolateral hólf ræktunarinnar. Að lokum getum við útvegað 3D nýtingu á þekjulaginu sem hægt er að nota. að móta formgerðaháðan þekjuvöxt, langsum hýsil-örverusamrækt, sýkingarsýkingu, bólguáverka, truflun á þekjuþekju og meðferð sem byggir á probioticum Dæmi.áhrif.
Samskiptareglur okkar geta verið gagnlegar fyrir breitt svið vísindamanna í grunnlíffræði (td slímhúð í þörmum, stofnfrumulíffræði og þróunarlíffræði) og hagnýtum rannsóknum (td forklínískum lyfjaprófum, sjúkdómslíkönum, vefjaverkfræði og meltingarfræði) víðtæk áhrif. Vegna endurgerðanleika og styrkleika siðareglur okkar til að framkalla tæknilega 3D æðamyndun okkar í 3D vítrógenu. vera dreift til áhorfenda sem rannsaka gangverk frumuboða meðan á þroskun í þörmum stendur, endurnýjun eða samvægi. Auk þess er samskiptareglur okkar gagnlegar til að spyrjast fyrir um sýkingar undir ýmsum smitefnum eins og Norovirus 8, Alvarlegt bráða öndunarfæraheilkenni Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella cholerio eða Vihimurium 9.Áhorfendur um meinafræði sjúkdóma og meingerð eru einnig gagnlegar. Notkun á örlífeðlisfræðikerfi í þörmum getur leyft lengdarsamrækt 10 og síðar mat á vörn hýsils, ónæmissvörun og sýklatengda áverka viðgerð í meltingarvegi (GI) 11 .Aðrir meltingarfærasjúkdómar sem tengjast lekandi þörmum, æðabólgusjúkdómi, ristilbólgu, æðabólgu, eða ristilbólgu. iðraþekjuheilkenni er hægt að líkja eftir þegar þrívíddarþekjulög í þörmum eru útbúin með því að nota þrívíddarþekjulög sjúklings, þessir sjúkdómar eru ma villous rýrnun, dulmálsskemmdir, slímhúðarskemmdir eða skert þekjuþekjuþekju. Vefsýni eða stofnfrumuafleidd þarmasjúkdómur,13, getur bætt við hærri lífrænum sjúkdómum13 líkanið,13 lífrænum sjúkdómum. frumugerðir, eins og einkjarna frumur í útlægum blóði sjúklinga (PBMC), til líköna sem innihalda 3D þarma villus-crypt örarkitektúr.vefjasértækar ónæmisfrumur, 5.
Þar sem hægt er að laga þrívíddarþekjuþekjusmábyggingu og sjá fyrir sér án skurðarferlisins, gætu áhorfendur sem vinna að staðbundnum umritunarfræði og háupplausnar- eða ofurupplausnarmyndagerð haft áhuga á kortlagningu okkar á tímabundnu gangverki gena og próteina á þekjuveggjum.Hefur áhuga á tækni.Svörun við örveru- eða ónæmisáreiti. Ennfremur er hægt að koma á langvarandi hýsil-örveru-víxlun 10, 14 sem samræma þarmajafnvægi í þrívíddarslímhúðslaginu í þörmum með því að rækta saman ýmsar örverutegundir, örverusamfélög eða saursýki, sérstaklega í saurflögunni.Þessi nálgun er sérstaklega aðlaðandi fyrir áhorfendur sem læra slímhúð ónæmisfræði, meltingarfærafræði, örverufræði manna, ræktunarfræði og klíníska örverufræði sem leitast við að rækta áður óræktaða þarmaörveru á rannsóknarstofunni. Ef hægt er að aðlaga in vitro formgerða siðareglur okkar að skalanlegum ræktunarsniðum, svo sem samfelldum plötum 248 í fjölbrunnu, 248 plötum. hliðarhólf, samskiptareglunum er einnig hægt að dreifa til þeirra sem þróa lyfjafræðilega, lífeðlisfræðilega eða afkastamikla skimunar- eða löggildingarvettvang fyrir matvælaiðnaðinn.Sem sönnun fyrir meginreglunni sýndum við nýlega fram á hagkvæmni margföldunarkerfis með miklum afköstum sem hægt er að skalast við í 24-brunnu plötuformi-á-,1-flísar, 7,6 og 7,6 flísar. mörgum rannsóknarstofum, iðnaði eða yfirvöldum og eftirlitsstofnunum er hægt að flýta fyrir staðfestingu á in vitro formgerðaaðferðinni okkar til að skilja frumuendurforritun á in vitro formgerð þarma á umritunarstigi til að prófa lyf eða líffræðileg lyf. Frásog og flutningur lyfjaframbjóðenda var metinn með því að nota þrívíddarlíkan þarma- eða frumefna til að meta sérsniðna þörmum eða flísar. sis ferli.
Takmarkaður fjöldi tilraunalíkana sem skipta máli fyrir menn hafa verið notaðir til að rannsaka þekjumyndun þarma, aðallega vegna skorts á útfæranlegum samskiptareglum til að framkalla 3D formgerð in vitro. Reyndar er mikið af núverandi þekkingu um formgerð þarma byggt á dýrarannsóknum (td sebrafiskur20, mýs21 eða kjúklingar, 21, kostnaðarsamar, 21 eða kostnaðarsamar,-21). og síðast en ekki síst, ákvarða ekki þroskaferli manna nákvæmlega. Þessi líkön eru einnig mjög takmörkuð hvað varðar hæfni sína til að prófa á fjölhliða stigstærðan hátt. Þess vegna er aðferðin okkar til að endurnýja 3D vefjabyggingu in vitro betri en in vivo dýralíkön sem og önnur hefðbundin kyrrstæð 2D frumuræktarlíkön. Eins og áður hefur verið lýst, nota 3D staðbundnar frumubyggingar til að skoða mismunandi frumuuppbyggingu. crypt-villus ásinn til að bregðast við ýmsum slímhúð eða ónæmisörvun. ta byggir upp samfélög sín og framleiðir á samverkandi hátt örveruumbrotsefni (td stuttkeðju fitusýrur) sem móta frumuskipulag og stofnfrumuhólf í grunnkrupunum. Þessa eiginleika er aðeins hægt að sýna fram á þegar þrívíddarþekjulög eru stofnuð in vitro.
Auk aðferðar okkar við að búa til þrívíddarþekjubyggingu í þörmum eru til nokkrar in vitro aðferðir. Þarmalífræn ræktun er fullkomnasta vefjaverkfræðitækni sem byggir á ræktun á stofnfrumum þarma við sérstakar formgerðaraðstæður23,24,25. Hins vegar er notkun þrívíddar lífrænna líkana fyrir flutningsgreiningu eða samþörung í þörmum oft krefjandi. sed innan lífræns efnis og þess vegna er innleiðing ljóshluta eins og örverufrumna eða utanaðkomandi mótefnavaka takmörkuð.Aðgangur að lífrænum holrúmum er hægt að bæta með því að nota örinndælingartæki,26,27 en þessi aðferð er ífarandi og vinnufrek og krefst sérhæfðrar þekkingar til að framkvæma. Ennfremur endurspegla hefðbundnar lífrænar ræktanir sem viðhaldið er í hydrogel vinnupallum við kyrrstöðu aðstæður ekki nákvæmlega virka in vivo líffræði.
Aðrar aðferðir sem notaðar eru af nokkrum rannsóknarhópum nota forgerða þrívíddar vatnshlaupsvinnupalla til að líkja eftir uppbyggingu þekjuþekju í þörmum með því að rækta einangraðar þarmafrumur úr mönnum á hlaupyfirborðinu. Framleiða vatnshlaupsvinnupalla með því að nota þrívíddarprentaðar, örmölaðar eða steinþekjuformaðar mót. Þessi aðferð sýnir sjálfskipulögð frumueinangruð, stigvaxandi frumueðlisfræðilega uppröðun á frumufræðilegum frumum. koma á háu stærðarhlutfalli þekjubyggingu og stroma-þekjuþekjuvíxlun með því að setja stromal frumur í vinnupallinum. Hins vegar getur eðli forbyggðra vinnupalla komið í veg fyrir að sjálfsprottið formgerðaferli sjálft birtist. Þessar líkön veita heldur ekki kraftmikið ljósflæði eða millivefsflæði, skortir það vökvaskurðarálag sem þarfnast nýlegrar líkamsfrumurannsóknar og þarmaeðlisfræðilegrar virkni sem notað er til að öðlast nýleg virkni í þörmum. vinnupallar í örflæðisvettvangi og mynstrað þekjukerfi þarma með leysi-ætsaðferðum. Þarmalíffæri úr músum fylgja ætum mynstrum til að mynda þarmarpípulaga uppbyggingu og hægt er að endurskoða vökvaflæði innanljóss með því að nota örvökvaeiningu. Hins vegar, þetta líkan sýnir hvorki sjálfsprottið sjálfsprottið frumfræðilegt ferli til sams konar hreyfingar3 til hreyfingar3. örlítið þarmarör með sjálfsprottnum formerfðafræðilegum ferlum. Þrátt fyrir flókna framleiðslu mismunandi þarmahluta innan rörsins, skortir þetta líkan einnig ljósvökvaflæði og vélræna aflögun. Auk þess getur virkni líkansins verið takmörkuð, sérstaklega eftir að lífprentunarferlinu er lokið, truflar tilraunaaðstæður eða frumu-til-frumu samskipti. Þess í stað veitir fyrirhugaða líffræðilega eðlisfræðilega aðferðin okkar sjálfkrafa, líffræðilega, líffræðilega, líffræðilega aðferðafræði okkar. líkja eftir hreyfanleika í þörmum, aðgengi að sjálfstæðum apical og basolateral hólf og endurskapa flókið líffræðilegt örumhverfi með mát. Þess vegna getur in vitro 3D morfogenes siðareglur okkar veitt viðbótaraðferð til að sigrast á áskorunum núverandi aðferða.
Samskiptareglur okkar eru algjörlega einbeittar að 3D þekjuformgerð, með aðeins þekjufrumur í ræktun og engar aðrar gerðir nærliggjandi frumna eins og mesenchymal frumur, æðaþelsfrumur og ónæmisfrumur.Eins og áður hefur verið lýst er kjarninn í siðareglunum okkar framkalla þekjuformgerð með því að fjarlægja morphogen hliðarseytingarhömlun á innleidda gufuhömlunum á innfluttu seytingarefninu. t-á-flís og blendingur-á-flís gerir okkur kleift að endurskapa bylgjað 3D þekjulag, fleiri líffræðilegar flóknir eins og þekju- og mesenchymal samskipti 33,34, utanfrumu Matrix (ECM) útfellingu 35 og, í líkaninu okkar, crypt-villus eiginleikar sem miðla frekari stofnfrumuskemmum í basal frumum, sem eru eftir í basal frumu crypt (mebla crypt). senchyme gegnir lykilhlutverki við framleiðslu ECM próteina og stjórnun á frumumyndun þarma35,37,38.Bæting mesenchymal frumna við líkanið okkar jók formgerðaferlið og skilvirkni frumutengingar. Innþekjulagið (þ.e. háræðar eða sogæða) gegnir mikilvægu hlutverki við að stjórna sameindaflutningi í æðafrumu39 og ónæmisfrumum. Ræktunarhlutar sem hægt er að tengja á milli vefjalíkana eru forsenda þegar vefjalíkön eru hönnuð til að sýna fram á milliverkanir margra líffæra. Þess vegna gæti þurft að taka inn æðaþelsfrumur til að líkja nákvæmari lífeðlisfræðilegum eiginleikum með upplausn á líffærastigi. Ónæmisfrumur sem unnar eru af sjúklingi eru einnig nauðsynlegar til að sýna meðfædd ónæmissvörun, mótefnavakakynningu, mótefnavaka í samhengi við meðfædda ónæmissjúkdóm í vefjum, víxlfræðilega aðlögunarhæfni í þörmum.
Notkun blendingsflaga er einfaldari en þarma-á-flís vegna þess að uppsetning tækisins er einfaldari og notkun Transwell-innleggja gerir ráð fyrir stigstærðanlega ræktun á þekjuþekju í þörmum. Hins vegar eru Transwell-innskot með pólýesterhimnum ekki teygjanleg og geta ekki líkt eftir peristaltic-líkum hreyfingum. Ennfremur er hún áfram í apical hólfinu í apical hólfinu í apical hólfinu. apical hliðinni. Ljóst er að kyrrstöðueiginleikar í apical hólfinu gera sjaldan kleift að rækta langtíma bakteríu í ​​blendingum flögum. Þó að við getum framkallað 3D formgerð í Transwell innskotum þegar notaðar eru blendingar, getur skortur á lífeðlisfræðilega viðeigandi lífeðlisfræði og apical vökvaflæði takmarkað hagkvæmni fyrir hugsanlega notkunarflögu.
Fullskala endurgerð á dulmálsás mannsins í þörmum-á-flís og blendingur-á-flís ræktun hefur ekki verið að fullu staðfest. Þar sem formgerð hefst frá þekjulaga einlagi, gefur 3D örarkitektúr ekki endilega formfræðilega líkingu við dulmál í lífi. lium, dulmáls- og villusvæðin voru ekki skýrt afmörkuð. Þrátt fyrir að hærri efri rásir á flísinni leiði til aukinnar hæðar örþroskaþekjunnar, er hámarkshæðin enn takmörkuð við ~300–400 µm. Raunveruleg dýpt garnaþarma manna í smáþörmum og þörmum er ~135 µm hæð og ~135 µm í þörmum, ~600 µm41.
Frá sjónarhóli myndgreiningar getur verið að myndatöku af þrívíddar örarkitektúr með ofurupplausn á staðnum sé takmörkuð við þörmum á flís, þar sem nauðsynleg vinnslufjarlægð frá hlutlinsunni að þekjulaginu er af stærðargráðunni nokkra millimetra. Til að vinna bug á þessu vandamáli gæti verið þörf á fjarlægu markmiði. Ennfremur, að búa til þunna hluta til að búa til myndgreiningu, þar sem PD er krefjandi undirbúningur sýnisins í PD-laginu. millilaga örframleiðsla á þörmum á flís felur í sér varanlega viðloðun á milli hvers lags, það er afar krefjandi að opna eða fjarlægja efra lagið til að skoða yfirborðsbyggingu þekjulagsins. Til dæmis með því að nota skanna rafeindasmásjá (SEM).
Vatnsfælni PDMS hefur verið takmarkandi þáttur í rannsóknum sem byggja á örvökva sem fjalla um vatnsfælnar smásameindir, þar sem PDMS getur aðsogað slíkar vatnsfælnar sameindir á ósértækan hátt. Hægt er að íhuga val við PDMS með öðrum fjölliða efnum. Að öðrum kosti getur yfirborðsbreyting á PDMS (td húðun með fitusæknum) (td húðun með fitusæknum) (42-glýsýlen) talist adlaða með fitusæknum efnum(42) frásog vatnsfælna sameinda.
Að lokum hefur aðferðin okkar ekki verið vel einkennd hvað varðar skimun með miklum afköstum eða „ein stærð sem hentar öllum“ notendavænum tilraunavettvangi. Núverandi siðareglur krefjast sprautudælu fyrir hvert örtæki, sem tekur pláss í CO2 útungunarvél og kemur í veg fyrir tilraunir í stórum stíl. Þessa takmörkun er hægt að bæta verulega með sveigjanleika ræktunarsniðs nýstárlegra, por-, 6-, 4- eða 9-brunns ous innlegg sem leyfa stöðuga áfyllingu og fjarlægingu á basolateral miðlum).
Til að framkalla 3D formgerð þarmaþekju frá mönnum in vitro, notuðum við örflæðisflögu í þörmum sem innihélt tvær samsíða örrásir og teygjanlega gljúpa himnu á milli til að búa til holrúm-háræðaviðmót. Við sýnum einnig notkun einrásar örflæðistækis (blendingsflísa inna hliðarflæðis) sem veitir samfellda æðaflæðisflögu í þversum og hliðarflæði. báðir vettvangar, má sýna fram á formgerð ýmissa þekjufrumna í þörmum manna með því að beita stefnustýrðri stjórnun á flæði til að fjarlægja mótefnamótefni úr grunnhólfinu. Öll tilraunaaðferðin (Mynd 1) samanstendur af fimm hlutum: (i) örframleiðsla á þörmaflögunni eða Transwell insertable blending 1-5stepsli; Caco-2 frumur) eða þarmalífræn efni úr mönnum;kassar 2-5), (iii) ræktun þekjufrumna í þekju á þarmaflísum eða blendingsflögum (skref 6-9), (iv) framkalla 3D formgerð in vitro (skref 10) og (v) ) til að einkenna 3D þekjusmábyggingu (skref 11-24). með því að bera saman myndun þekjuvefs við staðbundnar, tímabundnar, skilyrtar eða verklagsstýringar.
Við notuðum tvo mismunandi ræktunarpalla: þarma-á-flís með beinum rásum eða ólínulegum snúnum rásum, eða blendingsflögur sem innihalda Transwell (TW) innsetningar í örflæðistæki, framleitt eins og lýst er í ramma 1, og skref 1 -5.“Tækjaframleiðsla“ sýnir helstu skrefin í að búa til staka flís eða blendingsflögu mannlegs frumu eða frumufrumu2. þarmalífræn efni) og ræktunaraðferð sem notuð er í þessari bókun.“In vitro formgerð“ sýnir heildarskrefin þar sem Caco-2 eða lífrænar þekjufrumur eru ræktaðar á þarmaflís eða á Transwell innskotum á blendingsflögu, fylgt eftir með framköllun á 3D formgerð og myndun einkennandi kerfisþekjuþekjukerfis sýnir hvert forritsnúmer fyrir neðan. Stinal þekjulög geta verið notuð, td í frumuaðgreiningu, rannsóknum á lífeðlisfræði í þörmum, stofnun vistkerfa hýsils og örverulífvera og sjúkdómslíköns. Ónæmisflúrljómunarmyndir í „Cell Differentiation“ sem sýna kjarna, F-aktín og MUC2 tjáð í 3D Caco-2 merki frumunnar sem myndast í gufulagi frumunnar og merki frumunnar er til staðar í gut2 frumunni. cus sem er seytt frá slímhúðflötum. Flúrljómandi myndir í Gut Physiology sýna slím framleitt með litun fyrir síalsýru og N-asetýlglúkósamínleifar með því að nota flúrljómandi hveitikímaagglútínín. Myndirnar tvær sem skarast á „Host-Microbe Co-Cultures“ sýna dæmigerða hýsil-örveru-samræktun í samræktun á grænni samræktun á samræktun á samræktun. flúrljómandi prótein (GFP) með örverkuðum 3D Caco-2 þekjufrumum. Hægra spjaldið sýnir staðsetningu GFP E. coli samræktað með 3D Caco-2 þekjufrumum, fylgt eftir með ónæmisflúrljómun litun með F-aktíni (rauðu) og kjarna (blár gufu). gen (td lípópólýsykra, LPS) og ónæmisfrumur (td PBMC;grænn).Caco-2 frumur voru ræktaðar til að koma á þrívíddarþekjulagi.Mvarðastikur, 50 µm.Myndir í neðri röð: „Aðgreining frumna“ aðlöguð með leyfi frá tilvísun.2.Oxford University Press;Afritað með leyfi frá tilv.5.NAS;„Host-Microbe Co-Culture“ aðlagað með leyfi frá tilv.3.NAS;„Sjúkdómslíkön“ aðlöguð með leyfi frá tilvísun.5.NAS.
Bæði þörmum-á-flís og blendingur flísar voru framleiddar með því að nota PDMS eftirlíkingar sem voru teknar úr kísilmótum með mjúkri lithography1,44 og mynstrað með SU-8. Hönnun örrása í hverri flís er ákvörðuð með hliðsjón af vatnsaflsfræði eins og klippuálagi og vatnsaflsþrýstingi1,4,12. Upprunalega gut-on-a-endea-flís hönnunin (Extended Gut-on-a-endea). beinar örrásir, hefur þróast í flókna þörmum-á-flís (Extended Data Fig. 1b) sem inniheldur par af bognum örrásum til að framkalla aukinn dvalartíma vökva, ólínulegt flæðimynstur og fjölása aflögun ræktaðra frumna (mynd 2a–f) 12 sen.Við höfum sýnt fram á að snúið Gut-Chip örvar einnig sterklega 3D formgerð á svipuðum tímaramma með svipaðri þekjuvexti samanborið við upprunalega Gut-Chip, óháð ræktuðu frumugerðinni. Þess vegna, til að framkalla 3D formgerð, eru línuleg og flókin á-flís þarmahönnun sem hægt er að skipta um með silcon-SUPD-neikvættum þörmum sem skiptast á MS-SUPD-neikvættum þörmum. eftir mótun (mynd.2a).Til að búa til þörmum á flís var undirbúið efra PDMS lagið tengt í röð við gljúpa PDMS filmu og síðan stillt saman við neðra PDMS lagið með óafturkræfri tengingu með því að nota kórónumeðferðartæki (mynd 2b–f). Til að búa til blendingsflögur voru hertar PDMS eftirmyndir tengdar við einrásar glerflísargler til að búa til einrása glerflísargler til að búa til flísarflögur. 2klst og aukin gögn mynd 2).Bengiferlið er framkvæmt með því að meðhöndla yfirborð PDMS eftirmyndarinnar og glers með súrefnisplasma eða kórónumeðferð.Eftir dauðhreinsun á örframleidda tækinu sem var tengt við sílikonrörið var uppsetning tækisins tilbúin til að framkvæma 3D formgerð þarmaþekju (Mynd 2).
a, Skýringarmynd af undirbúningi PDMS hluta úr SU-8 mynstri kísilmótum. Óhertu PDMS lausninni var hellt á kísilmót (vinstri), hert við 60 °C (miðja) og tekið úr form (hægri). PDMS sem var úr forminu var skorið í bita og hreinsað til frekari notkunar.b, Ljósmynd af sílikonlaginu, mynd af silconi. mót sem notað er til að búa til PDMS gljúpu himnuna.d, Röð ljósmynda af efri og neðri PDMS íhlutum og samsettum þarmabúnaði á flís.e, Skýringarmynd af röðun efri, himnu og neðri PDMS íhluta. Hvert lag er óafturkræft tengt með plasma eða kórónumeðferð. um chambers.g, Uppsetning á þörmum á flís fyrir örvökvafrumuræktun. Framleidda þörmurinn á flís sem var settur saman með kísilröri og sprautu var settur á hylki. Flísbúnaðurinn var settur á lok 150 mm Petri fat til vinnslu. Bindiefnið er notað til að loka kísillflögunni snapshots og Hybrid flís morsis túpu með hybrid-flögu morsis túpu. ert sem útbúið var sjálfstætt til að rækta tvívíddar einlög þekjufrumna í þörmum voru sett í blendingaflöguna til að framkalla þrívíddarformgerð í þörmum. Miðillinn er gegnsýrður í gegnum örrásir undir frumulaginu sem komið er fyrir á Transwell innskotinu.Mvarðarstikur, 1 cm.h Endurprentuð með leyfi frá tilvísun.4.Elsevier.
Í þessari samskiptareglu voru Caco-2 frumulínan og þarmalífræn efni notuð sem uppsprettur þekju (mynd 3a). Báðar tegundir frumna voru ræktaðar sjálfstætt (reitur 2 og rammi 5) og notaðar til að sá ECM-húðaðar örrásir í þörmum á flís eða Transwell innlegg. en göngur 10 og 50) í T-flöskum eru tíndar til að undirbúa sundraðar frumusvökva með trypsínvökva (reitur 2). Þarmalífræn efni úr þörmum úr vefjasýni úr þörmum eða skurðaðgerð voru ræktuð í Matrigel vinnupallahvelfingum í 24-brunn plötum til að styðja við burðarvirki örumhverfis, sem innihalda nauðsynlega vöxt, Módín og Nógín. þáttum sem útbúnir eru eins og lýst er í ramma 3 var bætt við annan hvern dag þar til lífrænu efnin stækkuðu í ~500 µm í þvermál. Fullvaxið lífrænt efni er safnað og skipt í stakar frumur til að sáð er í þörmum eða Transwell innskotum á flís (reitur 5). Eins og áður hefur verið greint frá er hægt að aðgreina það eftir sjúkdómi, krabbameini í ristli, æðabólgu, 12, æðabólgu, ), vefjaskemmdir (td sár á móti svæði sem ekki er meinsemd) og staðsetning meltingarvegar í meltingarvegi (td skeifugörn, skeifugörn, meltingarveg, ristli, ristli eða endaþarmi). Við bjóðum upp á bjartsýni í ramma 5 til að rækta lífræna ristil (kólóíða) sem venjulega krefjast hærri styrks af morfogenum en smágirni.
a, Verkflæði til að framkalla meltingarveg í þörmum í þörmum. Caco-2 þekjuþekju í þörmum og þarmalífræn efni eru notuð í þessari samskiptareglu til að sýna fram á 3D formgerð. Einangruðu þekjufrumurnar voru sáð í tilbúna þörmum-á-flögu tækinu (flísundirbúningur). Þegar frumur eru festar á PD á MS-himnu er sáð í frumuhimnu á daginn. 0 (D0), apical (AP) flæði er hafið og viðhaldið fyrstu 2 dagana (flæði, AP, D0-D2). Basolateral (BL) flæði er einnig hafið ásamt hringlaga teygjuhreyfingum (teygju, flæði, AP og BL) þegar fullkomið 2D einlag myndast. Þarma þrívíddar ræktun, 5 daga örveruflónun (P-5 dagar sjálfsprottinn). andstæðamyndir sýna dæmigerða formgerð Caco-2 frumna á hverju tilraunaþrepi eða tímapunkti (súlurit, 100 µm). Fjórar skýringarmyndir sem sýna samsvarandi föll þarmamótunar (efst til hægri). Strikuðu örvarnar í skýringarmyndinni tákna stefnu vökvaflæðis.b, SEM mynd sem sýnir yfirborðssvæði Caco-2 3, sem sýnir yfirborð Caco-2 3. strikaður kassi) sýnir endurmyndaða microvilli á 3D Caco-2 laginu (hægri).c, Lárétt framhlið af staðfestum Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rautt) og samfelldar bursta landamærahimnur merktar F-aktín (grænt) og kjarna (blár) Ónæmisflúrljómun confocal visualization of the epithelial visualization of the epithelial chipsAr til kynna staðsetningin á þekjuskemmunni á milliskemmunni. brenniplan fyrir hverja confocal view.d, Tímaferli formfræðilegra breytinga á lífrænum frumum sem ræktaðar eru á flís sem fæst með fasaskilamyndasmásjá á dögum 3, 7, 9, 11 og 13. Innfellingin (efst til hægri) sýnir mikla stækkun meðfylgjandi myndar.e, DIC smámynd af lífrænum 3D þekjuvef sem tekin var í þörmum á dag, flúormerki sem tekin var í þörmum. stofnfrumur (LGR5;magenta), bikarfrumur (MUC2; grænt), F-aktín (grátt) og kjarna (blýan) ræktað á þarmaflísum í 3 daga, í sömu röð (vinstri) og 13 daga (miðja) lífrænum frumum á þekjulaginu. Sjá einnig útvíkkuð gögn mynd 3, sem undirstrikar LGR5 merkjamyndir án MUC2-merkis (e. MUC3D-merkjamerki) lífræn þekjuvef komið fyrir í þörmum á flís með því að lita plasmahimnuna með CellMask litarefni (til hægri) á 13. degi ræktunar.Mvarðarsúla er 50 μm nema annað sé tekið fram.b Endurprentað með leyfi frá tilvísun.2.Oxford University Press;c Lagað með leyfi frá Tilvísun.2.Oxford University Press;e og f aðlöguð með leyfi með tilvísun.12 Undir Creative Commons leyfi CC BY 4.0.
Í þörmum á flís er nauðsynlegt að breyta vatnsfælnu yfirborði PDMS gljúpu himnunnar fyrir árangursríka ECM húðun. Í þessari samskiptareglu beitum við tveimur mismunandi aðferðum til að breyta vatnsfælni PDMS himna. Til að rækta Caco-2 frumur nægði yfirborðsvirkjun með UV/ósonmeðferð eingöngu til að draga úr vatnsfælni ECMMS frumunnar og samhliða vatnsfælni ECMMS frumunnar og til að draga úr vatnsfælni ECMMS frumunnar. Hins vegar, örvökvaræktun á lífrænum þekjuþekju krefst efnafræðilegrar virkni yfirborðs til að ná skilvirkri útfellingu ECM próteina með því að beita pólýetýlenimíni (PEI) og glútaraldehýði í röð á PDMS örrásir.Eftir yfirborðsbreytingar voru ECM prótein sett til að hylja starfhæfða líffærafrumuna og síðan sett inn í PDMS yfirborðið og einangrað PDMS frumunni. Idic frumuræktun byrjar á því að blanda aðeins miðlinum inn í efri örrásina þar til frumurnar mynda algjört einlag, en neðri örrásin viðheldur kyrrstæðum aðstæðum. Þessi fínstillta aðferð fyrir yfirborðsvirkjun og ECM húðun gerir kleift að festa lífræna þekjuvef til að framkalla 3D formgerð á PDMS yfirborðinu.
Transwell ræktun þarf einnig ECM húðun áður en frumu sáð er;Hins vegar, Transwell ræktun þarf ekki flókin formeðferðarskref til að virkja yfirborð gljúpra innleggja. Til að vaxa Caco-2 frumur á Transwell innskotum, flýtir ECM húðun á gljúpum innskotum festingu aðgreindra Caco-2 frumna (<1 klst.) og myndun þéttmóta hindrunar (<1-2 dögum í ECM ræktuðum líffærum, einangruðum líffærum á TransTowell seyðjum). húðuð innskot, fest við himnuyfirborðið (<3 klst.) og viðhaldið þar til lífrænu efnin mynda algjört einlag með hindrunarheilleika. Transwell ræktanir eru framkvæmdar í 24-brunn plötum án þess að nota blendingsflögur.
In vitro 3D morphogenesis er hægt að hefja með því að beita vökvaflæði til basolateral hliðar á rótgrónu þekjulagi. Í þörmum á flís hófst þekjumótun þegar miðillinn var látinn renna inn í efri og neðri örrásir (mynd 3a). Eins og áður hefur verið lýst er mikilvægt að koma vökvaflæði í inferior leyndarmálið (morfogen) leyndarmálsstefnu. Til að veita frumum sem eru bundnar á gljúpar himnur nægjanlegt magn næringarefna og sermi og mynda ljósskeruálag, beitum við venjulega tvöföldu flæði í þörmum á flís. Í blendingsflögum voru Transwell innlegg sem innihéldu þekjueinlög sett inn í blendingsflögurnar. Síðan var miðlinum borið á undir basolateral hlið hins porous Transwell-reeds í gegnum porous Transwell-reed-dagana í gegnum 3-gjúpa Transwell-reed-dagana. basolateral flæði í báðum ræktunarpöllunum.
Hægt er að greina formfræðilega eiginleika örverkrænna 3D þekjulaga með því að beita ýmsum myndgreiningaraðferðum, þar á meðal fasaskilamyndasmásjá, DIC-smásjá, SEM, eða ónæmisflúrljómun confocal smásjárskoðun (myndir 3 og 4). Hægt er að framkvæma fasaskilaskil eða DIC-myndgreiningu á hvaða tíma sem er í ræktun 3-þekjulagsins og protheli. optískt gagnsæi PDMS- og pólýesterfilma, bæði þörmum-á-flís og blendingur flísarpallur geta veitt rauntíma myndgreiningu á staðnum án þess að þurfa að skera eða taka tækið í sundur. Þegar ónæmisflúrljómun er framkvæmt (myndir 1, 3c, f og 4b, c), eru frumur venjulega festar með 4% (PFA1t-hýði) og fylgt eftir með 4% (PFA1ton-hýði) % (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), í röð. Það fer eftir frumugerð, mismunandi bindiefni, permeabilizers og blokkunarefni. Aðalmótefni sem miða á ættháð frumu- eða svæðismerki eru notuð til að auðkenna frumur sem eru óhreyfðar á staðnum á flísinni, fylgt eftir með öðru hvoru nucle dye-ínóefni (td, 6 mótefni og a,′ amid-nótefni (td. 2-fenýlen) indól, DAPI) eða F-aktín (td flúrljómandi merkt phalloidin). Einnig er hægt að framkvæma lifandi myndgreiningu sem byggir á flúrljómun á staðnum til að greina slímmyndun (mynd.1, „Frumuaðgreining“ og „Garmalífeðlisfræði“), tilviljunarkennd landnám örverufrumna (Mynd 1, „Hýsingarörverusamræktun“), nýliðun ónæmisfrumna (Mynd 1, „Sjúkdómslíkön“) eða útlínur þrívíddar þekjuvefsgerð (Mynd 3 og 4 aðskilin á gufc). efra lagið frá neðra microchannel laginu, eins og lýst er í ref.Eins og sýnt er á mynd 2, 3D þekjuformgerð sem og örvilli á apical bursta landamærum er hægt að sjá með SEM (Mynd 3b). Tjáningu aðgreiningarmerkja er hægt að meta með því að framkvæma magn PCR5 eða einfrumu vaxa RNA í þessu tilviki einfrumu 3D í guli. flögur eða blendingsflögur eru tíndar með trypsínvæðingu og síðan notaðar til sameinda- eða erfðagreiningar.
a, Vinnuflæði til að framkalla þarmaformgerð í blendingsflögu. Caco-2 og þarmalífræn efni eru notuð í þessari samskiptareglu til að sýna fram á 3D formgerð í blendingsflöguvettvangi. Aðgreindum þekjufrumum var sáð í tilbúnum Transwell innskotum (TW prep; sjá mynd hér að neðan). Þegar allar frumur sem sáðar voru í pólýesterhimnu voru sáðar í pólýesterfrumum, var sáð í gegnum frumur sem sáðar voru í gegnum frumur í frumum og pólýesterfrumum. við kyrrstæðar aðstæður (TW ræktun). Eftir 7 daga var stakt Transwell innlegg sem innihélt 2D einlag af þekjufrumum samþætt í blendingsflögu til að koma á basolateral flæði (Flow, BL), sem að lokum leiddi til myndunar 3D þekjulags (morphogenesis). kveikt á hverju tilraunaþrepi eða tímapunkti. Skýringarmyndirnar í efri lögum sýna tilraunauppsetninguna fyrir hvert skref.b, Hybrid flísar (skírteini til vinstri) geta leitt til 3D formgerða lífrænna þekjufrumna með samfókus smásjárskoðun ofan frá og niður tekin á mismunandi Z stöðum (efri, miðju og neðri;sjá hægri skýringarmynd og samsvarandi punktalínur).sýndi augljós formfræðileg einkenni.F-aktín (blár), kjarni (grár).c, flúrljómunarsamrænar smámyndir (3D hornmynd) af þekjufrumum sem eru fengnar úr lífrænum frumum sem ræktaðar eru í kyrrstöðu Transwell (TW; innfelldur innan hvíts strikaðs kassa) á móti blendingsflögu (stærsta heila skotið) með samanburði á 32D lóðréttri mynd á móti 32D lóðréttri mynd. (innsett í efra hægra horninu; „XZ“) sýna einnig 2D og 3D eiginleika.Mærðarstika, 100 µm.c Endurprentuð með leyfi frá tilvísun.4.Elsevier.
Hægt er að útbúa viðmið með því að rækta sömu frumur (Caco-2 eða þarmalífrænar þekjufrumur) í tvívíð einlög við hefðbundnar kyrrstæðar ræktunaraðstæður. Athyglisvert er að næringarefnaþurrkur getur orðið vegna takmarkaðrar rúmmálsgetu örrásanna (þ.e. ~4 µL í efstu rásinni á upprunalegu þarmaflæðishönnuninni, áður en efri hliðarflæðið var borið saman, áður en það er borið saman). .
Mjúka steinþrykkjaferlið ætti að fara fram í hreinu herbergi. Fyrir hvert lag á flísinni (efri og neðri lag og himnur) og blendingsflögur voru notaðar mismunandi ljósmyndagrímur og framleiddar á aðskildum kísilskífum vegna þess að hæð örrásanna var mismunandi. Markhæð efri og neðri örrásar þarma á flísinni er 500, µm hæð 500m, µm hæð af flögunni. er 200 µm.
Settu 3 tommu sílikonskífu í fat með asetoni. Snúðu plötunni varlega í 30 sekúndur, loftþurrkaðu síðan diskinn.Flyttu diskinn yfir á disk með IPA, snúðu síðan plötunni í 30 sekúndur til að þrífa.
Mögulega er hægt að nota piranha lausn (blanda af vetnisperoxíði og óblandaðri brennisteinssýru, 1:3 (rúmmál/rúmmál)) til að hámarka fjarlægingu lífrænna leifa af yfirborði kísilskífunnar.
Piranha lausn er afar ætandi og myndar hita. Viðbótaröryggisráðstafanir eru nauðsynlegar. Við förgun úrgangs skal leyfa lausninni að kólna og flytja í hreint, þurrt úrgangsílát. Notaðu aukaílát og merktu úrgangsílát á réttan hátt. Vinsamlega fylgdu öryggisleiðbeiningum stöðvarinnar fyrir nánari verklagsreglur.
Þurrkaðu skífurnar með því að setja þær á 200 °C heita plötu í 10 mín. Eftir þurrkun var skífan hrist fimm sinnum í lofti til að kólna.
Hellið ~10 g af photoresist SU-8 2100 á miðjuna á hreinsuðu sílikonskífunni. Notaðu pincet til að dreifa photoresist jafnt á diskinn. Settu diskinn af og til á 65°C heita plötu til að gera photoresist minna klístrað og auðveldara að dreifa henni. Ekki setja diskinn beint á hitaplötuna.
SU-8 var jafnt dreift á skífuna með því að keyra snúningshúð. Forritaðu innkomu snúning á SU-8 í 5–10 s til að fjölga sér við 500 snúninga á mínútu við hröðun upp á 100 snúninga/sekúndu. Stilltu aðalsnúninginn fyrir 200 µm þykktarmynstur við 1.500 sn./mín. 50 eða µm hæð efra lagið í þörmum á flísinni; sjá „Mikilvæg skref“ hér að neðan) stillt á 300 rpm/s 30 sekúndur við 1.200 rpm.
Hægt er að stilla aðal snúningshraða í samræmi við markþykkt SU-8 mynstursins á kísilskífunni.
Til að búa til SU-8 mynstur með 500 µm hæð fyrir efra lag þörmanna á flísinni, voru snúningshúðin og mjúku bökunarþrepin í þessum kassa (skref 7 og 8) endurtekin í röð (sjá skref 9) til að framleiða tvö lög af 250 µm þykkt lag af SU-8, sem hægt er að sameina 1 µ lag af 1 0 lag af lýsingu, sem hægt er að sameina með 1 µ0 lagi með 1 0 lagi. m hár.
Mjúkbakaðu SU-8 húðuðu diskana með því að setja diskana varlega á heita plötu við 65 °C í 5 mínútur, skiptu síðan yfir í 95 °C og ræktaðu í 40 mínútur til viðbótar.
Til að ná 500 μm hæð á SU-8 mynstrinu í efri örrásinni, endurtakið skref 7 og 8 til að búa til tvö 250 μm þykk SU-8 lög.
Notaðu UV Mask Aligner til að framkvæma lampapróf í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda til að reikna út lýsingartíma oblátunnar.(lýsingartími, ms) = (lýsingarskammtur, mJ/cm2)/(lampastyrkur, mW/cm2).
Eftir að lýsingartíminn hefur verið ákvarðaður skaltu setja ljósmyndagrímuna á grímuhaldarann ​​á útfjólubláu grímujafnara og setja ljósmyndagrímuna á SU-8 húðuðu skúffuna.
Settu prentaða yfirborð ljósmyndagrímunnar beint á SU-8 húðuðu hliðina á kísilskífunni til að lágmarka útfjólubláa dreifingu.
Lýstu SU-8 húðuðu skífunni og ljósmyndamaskanum lóðrétt fyrir 260 mJ/cm2 af UV-ljósi í fyrirfram ákveðinn lýsingartíma (sjá skref 10 í þessum kassa).
Eftir útsetningu fyrir UV voru SU-8-húðaðar sílikonplötur bakaðar við 65°C í 5 mínútur og 95°C í 15 mínútur á hverri hitaplötu til að búa til mynstur með hæð 200 μm. Lengdu eftirbökunartímann við 95 °C í 30 mínútur til að búa til mynstur með 500 µm hæð.
Framkallaranum er hellt í glerskál og bakaða oblátið sett í fatið. Rúmmál SU-8 framkallarans getur verið mismunandi eftir stærð glerplötunnar. Gakktu úr skugga um að nota nóg SU-8 framkallarefni til að fjarlægja óvarið SU-8 alveg. Til dæmis, þegar notaður er 150 mm þvermál glerskál með 1 L rúmtak með 5 mL - 0 mL tilefni, notaðu ~30 SU mL tilefni. snúningur.
Skolið þróaða mótið með ~10 ml af fersku framkallaefni og síðan IPA með því að úða lausninni með pípettu.
Settu skúffuna í plasmahreinsiefni og útsettu fyrir súrefnisplasma (loftgas, markþrýstingur 1 × 10−5 Torr, afl 125 W) í 1,5 mín.
Setjið oblátuna í lofttæmiþurrkara með glerrennibraut inni. Hægt er að setja oblátur og skyggnur hlið við hlið.Ef tómarúmþurrkanum er skipt í nokkur lög með plötu, setjið skyggnurnar í neðra hólfið og obláturnar í efra hólfið.Sleppið 100 μL af trichloro(1H, fluoro-glase lausn, 1H, fluorocyle og glæru) lofttæmi fyrir síun.
Þiðið hettuglas af frosnum Caco-2 frumum í 37°C vatnsbaði, flytjið síðan þíða frumurnar í T75 flösku sem inniheldur 15 ml af 37°C forhitaðri Caco-2 miðli.
Til að fara í gegnum Caco-2 frumur við ~90% samrennsli skaltu fyrst hita Caco-2 miðil, PBS og 0,25% trypsín/1 mM EDTA í 37°C vatnsbaði.
Sogðu miðlinum með lofttæmi. Þvoðu frumurnar tvisvar með 5 ml af volgu PBS með því að endurtaka lofttæmissog og bæta við fersku PBS.