Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Þróun örveru sníkjudýra felur í sér mótvægi á milli náttúruvals, sem veldur því að sníkjudýr batna, og erfðaflæðis, sem veldur því að sníkjudýr missa gena og safna skaðlegum stökkbreytingum.Hér, til að skilja hvernig þessi mótvirkni á sér stað á mælikvarða einni stórsameind, lýsum við cryo-EM uppbyggingu ríbósóms Encephalitozoon cuniculi, heilkjörnungalífveru með eitt minnsta erfðamengi í náttúrunni.Mikil lækkun rRNA í E. cuniculi ríbósómum fylgir áður óþekktum byggingabreytingum, svo sem þróun áður óþekktra samrunna rRNA tengiliða og rRNA án bunga.Að auki lifði E. cuniculi ríbósómið af tap á rRNA brotum og próteinum með því að þróa hæfileikann til að nota litlar sameindir sem líkja eftir niðurbrotnum rRNA brotum og próteinum.Á heildina litið sýnum við að sameindabyggingar sem lengi hefur verið talið minnka, úrkynjast og verða fyrir lamandi stökkbreytingum hafa fjölda uppbótaraðferða sem halda þeim virkum þrátt fyrir mikla sameindasamdrætti.
Vegna þess að flestir hópar örveru sníkjudýra hafa einstök sameindaverkfæri til að nýta hýsil þeirra, þurfum við oft að þróa mismunandi meðferðarúrræði fyrir mismunandi hópa sníkjudýra1,2.Hins vegar benda nýjar vísbendingar til þess að sumir þættir þróunar sníkjudýra séu samræmdir og að mestu fyrirsjáanlegir, sem gefa til kynna hugsanlegan grundvöll fyrir víðtæka lækningalega inngrip í sníkjudýrum 3,4,5,6,7,8,9.
Fyrri vinnu hefur bent á algenga þróunartilhneigingu í örveru sníkjudýrum sem kallast erfðamengislækkun eða erfðamengi rotnun10,11,12,13.Núverandi rannsóknir sýna að þegar örverur gefast upp á frjálsum lífsstíl sínum og verða innanfrumu sníkjudýr (eða endosymbionts) verða erfðamengi þeirra fyrir hægum en ótrúlegum myndbreytingum á milljónum ára9,11.Í ferli sem kallast rotnun erfðamengis safna örveru sníkjudýr upp skaðlegum stökkbreytingum sem breyta mörgum áður mikilvægum genum í gerviefni, sem leiðir til hægfara genataps og stökkbreytingarhruns14,15.Þetta hrun getur eyðilagt allt að 95% af genum í elstu innanfrumulífverum samanborið við náskyldar frílifandi tegundir.Þannig er þróun innanfrumu sníkjudýra togstreita milli tveggja andstæðra afla: Darwinískt náttúruval, sem leiðir til batnaðar sníkjudýra, og hruns erfðamengisins, sem kastar sníkjudýrum í gleymsku.Hvernig sníkjudýrinu tókst að koma upp úr þessari togstreitu og halda virkni sameindabyggingar sinnar er enn óljóst.
Þó að ekki sé fullkomlega skilið hvernig hnignun erfðamengisins er, virðist það einkum eiga sér stað vegna tíðrar erfðaflæðis.Vegna þess að sníkjudýr lifa í litlum, kynlausum og erfðafræðilega takmörkuðum stofnum, geta þau ekki í raun útrýmt skaðlegum stökkbreytingum sem stundum eiga sér stað við afritun DNA.Þetta leiðir til óafturkræfra uppsöfnunar skaðlegra stökkbreytinga og minnkunar á erfðamengi sníkjudýra.Þar af leiðandi missir sníkjudýrið ekki aðeins genum sem eru ekki lengur nauðsynleg til að lifa af í innanfrumu umhverfinu.Það er vanhæfni sníkjudýrastofna til að útrýma á áhrifaríkan hátt óreglulegum skaðlegum stökkbreytingum sem veldur því að þessar stökkbreytingar safnast fyrir um erfðamengið, þar á meðal mikilvægustu genin þeirra.
Mikið af núverandi skilningi okkar á minnkun erfðamengis byggist eingöngu á samanburði á erfðamengisröðum, með minni athygli að breytingum á raunverulegum sameindum sem gegna heimilishaldi og þjóna sem hugsanleg lyfjamarkmið.Samanburðarrannsóknir hafa sýnt að byrði skaðlegra örverubreytinga innan frumu virðist gera prótein og kjarnsýrur tilhneigingu til að misfellast og safnast saman, sem gerir þau háðari og ofnæmi fyrir hita19,20,21,22,23.Að auki upplifðu ýmsir sníkjudýr – óháð þróun sem stundum er aðskilin með allt að 2,5 milljörðum ára – fyrir svipuðu tapi á gæðaeftirlitsstöðvum í próteinmyndun þeirra5,6 og DNA viðgerðaraðferðum24.Hins vegar er lítið vitað um áhrif innanfrumulífsstíls á alla aðra eiginleika frumu stórsameinda, þar á meðal sameindaaðlögun að vaxandi álagi skaðlegra stökkbreytinga.
Í þessari vinnu, til að skilja betur þróun próteina og kjarnsýra innanfrumu örvera, ákváðum við uppbyggingu ríbósóma innanfrumu sníkjudýrsins Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi er sveppalík lífvera sem tilheyrir hópi sníkjudýra örsníkjudýra sem hafa óvenju lítil heilkjörnunga erfðamengi og eru því notuð sem fyrirmyndarlífverur til að rannsaka erfðamengishruni25,26,27,28,29,30.Nýlega var uppbygging cryo-EM ríbósóma ákvörðuð fyrir miðlungs skert erfðamengi Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb erfðamengi).Þessar uppbyggingar benda til þess að eitthvað tap á rRNA mögnun sé bætt upp með þróun nýrra tengiliða milli nálægra ríbósómapróteina eða öflun nýrra msL131,32 ríbósómapróteina.Tegundir heilaþekju (erfðaefni ~2,5 milljónir bp), ásamt nánustu ættingja þeirra Ordospora, sýna fullkomna minnkun erfðamengis í heilkjörnungum - þeir hafa færri en 2000 próteinkóða gen, og búist er við að ríbósóm þeirra séu ekki aðeins laus við rRNA þenslubrot (rRNA-gerfðabrot) sem hafa einnig fjóra bakteríubúta úr ríbósómum. ríbósómal prótein vegna skorts á samsvörunum í erfðamengi E. cuniculi26,27,28.Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að E. cuniculi ríbósómið geti leitt í ljós áður óþekktar aðferðir við sameindaaðlögun að rotnun erfðamengisins.
Cryo-EM uppbyggingin okkar táknar minnsta heilkjörnunga umfrymisríbósóma sem hægt er að einkenna og veitir innsýn í hvernig endanleg stig erfðamengisminnkunar hefur áhrif á uppbyggingu, samsetningu og þróun sameindavélarinnar sem er óaðskiljanlegur í frumunni.Við komumst að því að E. cuniculi ríbósómið brýtur í bága við hinar víða varðveittu meginreglur um RNA-fellingu og ríbósómsamsetningu og uppgötvuðum nýtt áður óþekkt ríbósómprótein.Alveg óvænt sýnum við að microsporidia ríbósóm hafa þróað hæfileikann til að binda litlar sameindir og gerum tilgátu um að styttingar í rRNA og próteinum kveiki á þróunarnýjungum sem geta að lokum veitt ríbósóminu gagnlega eiginleika.
Til að bæta skilning okkar á þróun próteina og kjarnsýra í innanfrumulífverum ákváðum við að einangra E. cuniculi gró úr ræktun sýktra spendýrafrumna til að hreinsa ríbósóm þeirra og ákvarða uppbyggingu þessara ríbósóma.Erfitt er að fá mikið magn af sníkjudýrum vegna þess að ekki er hægt að rækta örsporídíur í næringarefni.Þess í stað vaxa þau og fjölga sér aðeins inni í hýsilfrumunni.Þess vegna, til að fá E. cuniculi lífmassa til ríbósómhreinsunar, sýktum við nýrnafrumulínu spendýra RK13 með E. cuniculi gróum og ræktuðum þessar sýktu frumur í nokkrar vikur til að leyfa E. cuniculi að vaxa og fjölga sér.Með því að nota sýkt frumu einlag upp á um hálfan fermetra gátum við hreinsað um 300 mg af Microsporidia gróum og notað þau til að einangra ríbósóm.Við trufluðum síðan hreinsuðu gróin með glerperlum og einangruðum hrá ríbósómin með því að nota þrepaskipt pólýetýlen glýkól brot á lýsötunum.Þetta gerði okkur kleift að fá um það bil 300 µg af hráum E. cuniculi ríbósómum til byggingargreiningar.
Við söfnuðum síðan cryo-EM myndum með því að nota ríbósómsýnin sem fengust og unnum þessar myndir með því að nota grímur sem samsvara stóru ríbósóma undireiningunni, litlu undireiningahausnum og litlu undireiningunni.Meðan á þessu ferli stóð söfnuðum við myndum af um 108.000 ríbósómum ögnum og tölvunum cryo-EM myndum með upplausninni 2,7 Å (viðbótarmyndir 1-3).Við notuðum síðan cryoEM myndir til að móta rRNA, ríbósómaprótein og dvalaþátt Mdf1 sem tengist E. cuniculi ríbósómum (mynd 1a, b).
a Uppbygging E. cuniculi ríbósóms í flóknu með dvalaþáttinn Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kort af dvalarstuðli Mdf1 sem tengist E. cuniculi ríbósóminu.c Secondary structure map sem ber saman endurheimt rRNA í Microsporidian tegundum við þekkta ríbósóma uppbyggingu.Spjöldin sýna staðsetningu mögnuðu rRNA brotanna (ES) og ríbósóma virkra staða, þar á meðal afkóðun stað (DC), sarcinicin lykkju (SRL) og peptíðýl transferasa miðstöð (PTC).d Rafeindaþéttleiki sem samsvarar peptidyl transferasa miðju E. cuniculi ríbósómsins bendir til þess að þessi hvatastaður hafi sömu uppbyggingu í E. cuniculi sníkjudýrinu og hýslum þess, þar á meðal H. sapiens.e, f Samsvarandi rafeindaþéttleiki afkóðunstöðvarinnar (e) og skýringarmynd afskráningarmiðstöðvarinnar (f) benda til þess að E. cuniculi hafi leifar U1491 í stað A1491 (E. coli númerun) í mörgum öðrum heilkjörnungum.Þessi breyting bendir til þess að E. cuniculi gæti verið viðkvæmt fyrir sýklalyfjum sem beinast að þessum virka stað.
Öfugt við áður þekkta uppbyggingu V. necatrix og P. locustae ríbósóma (báðar byggingar tákna sömu microsporidia fjölskyldu Nosematidae og eru mjög lík hvort öðru), gangast 31,32 E. cuniculi ríbósóm í gegnum fjölmarga ferli rRNA og prótein sundrun.Frekari denaturation (viðbótarmyndir 4-6).Í rRNA voru mest sláandi breytingar meðal annars algjört tap á magnaða 25S rRNA brotinu ES12L og hluta hrörnun h39, h41 og H18 helices (mynd 1c, aukamynd 4).Meðal ríbósómapróteina voru mest áberandi breytingar meðal annars algjört tap á eS30 próteini og styttingu eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 og eS7 prótein (viðbótarupplýsingar 5).
Þannig endurspeglast gríðarleg minnkun á erfðamengi Encephalotozoon/Ordospora tegunda í ríbósómbyggingu þeirra: E. cuniculi ríbósóm verða fyrir mestu tapi á próteininnihaldi í heilkjörnunga umfrymisríbósómum, sem eru háð byggingareinkennum, og þeir hafa ekki einu sinni þessi rRNA og próteinbrot sem eru ekki aðeins varðveitt í þremur, heldur einnig víðfeðmum lífverum.Uppbygging E. cuniculi ríbósómsins veitir fyrsta sameindalíkanið fyrir þessar breytingar og sýnir þróunaratburði sem hafa verið yfirsést bæði af samanburði erfðafræði og rannsóknum á innanfrumu lífsameindabyggingu (aukamynd 7).Hér að neðan lýsum við öllum þessum atburðum ásamt líklegri þróunaruppruna þeirra og hugsanlegum áhrifum þeirra á virkni ríbósóma.
Við komumst svo að því að, auk stórra rRNA styttinga, hafa E. cuniculi ríbósóm rRNA afbrigði á einum af virkum stöðum þeirra.Þótt peptíðýltransferasa miðstöð E. cuniculi ríbósómsins hafi sömu byggingu og önnur heilkjörnungaríbósóm (mynd 1d), er afkóðun miðstöðin frábrugðin vegna raðbreytileika við núkleótíð 1491 (E. coli númerun, mynd 1e, f).Þessi athugun er mikilvæg vegna þess að afkóðunarstaður heilkjörnungaríbósóma inniheldur venjulega leifar G1408 og A1491 samanborið við leifar af bakteríugerð A1408 og G1491.Þessi breytileiki liggur til grundvallar mismunandi næmni bakteríu- og heilkjörnungaríbósóma fyrir amínóglýkósíðfjölskyldu ríbósómasýklalyfja og annarra lítilla sameinda sem miða á afkóðunarstaðinn.Á afkóðunarstað E. cuniculi ríbósómsins var leif A1491 skipt út fyrir U1491, sem gæti skapað einstakt bindiviðmót fyrir litlar sameindir sem miða á þennan virka stað.Sama A14901 afbrigði er einnig til staðar í öðrum microsporidia eins og P. locustae og V. necatrix, sem bendir til þess að það sé útbreitt meðal microsporidia tegunda (mynd 1f).
Vegna þess að E. cuniculi ríbósómsýni okkar voru einangruð úr efnaskiptaóvirkum gróum, prófuðum við cryo-EM kortið af E. cuniculi fyrir áður lýst ríbósómbindingu við streitu eða hungurskilyrði.Dvalaþættir 31,32,36,37, 38. Við pössuðum áður staðfesta uppbyggingu vetrardvala ríbósómsins við cryo-EM kortið af E. cuniculi ríbósóminu.Til tengingar voru S. cerevisiae ríbósóm notuð í flóknum með dvalaþátt Stm138, engispretturíbósóm í flóknum með Lso232 þáttum og V. necatrix ríbósóm í flóknum með Mdf1 og Mdf231 þáttum.Á sama tíma fundum við cryo-EM þéttleika sem samsvarar hvíldarstuðlinum Mdf1.Líkt og Mdf1 bindist V. necatrix ríbósóminu, binst Mdf1 einnig E. cuniculi ríbósóminu, þar sem það hindrar E-stað ríbósómsins, sem getur hugsanlega hjálpað til við að gera ríbósóm aðgengileg þegar gró sníkjudýra verða efnafræðilega óvirk við óvirkjun líkamans (mynd 2).).
Mdf1 hindrar E-stað ríbósómsins, sem virðist hjálpa til við að gera ríbósómið óvirkt þegar gró sníkjudýra verða efnafræðilega óvirk.Í uppbyggingu E. cuniculi ríbósómsins komumst við að því að Mdf1 myndar áður óþekktan snertingu við L1 ríbósómstofninn, þann hluta ríbósómsins sem auðveldar losun afasýleraðs tRNA frá ríbósóminu við próteinmyndun.Þessir tengiliðir benda til þess að Mdf1 losni frá ríbósóminu með því að nota sama kerfi og afasetýlerað tRNA, sem gefur mögulega skýringu á því hvernig ríbósómið fjarlægir Mdf1 til að endurvirkja próteinmyndun.
Samt sem áður, uppbygging okkar leiddi í ljós óþekkt samband milli Mdf1 og L1 ríbósómfótarins (hluti ríbósómsins sem hjálpar til við að losa afasýlerað tRNA úr ríbósóminu við próteinmyndun).Sérstaklega notar Mdf1 sömu tengiliði og olnbogahluti afasýleruðu tRNA sameindarinnar (mynd 2).Þessi áður óþekkta sameindalíkan sýndi að Mdf1 losnar frá ríbósóminu með því að nota sama kerfi og afasetýlerað tRNA, sem útskýrir hvernig ríbósómið fjarlægir þennan dvalaþátt til að endurvirkja próteinmyndun.
Við smíði rRNA líkansins komumst við að því að E. cuniculi ríbósómið hefur óeðlilega brotin rRNA búta, sem við kölluðum samruna rRNA (mynd 3).Í ríbósómum sem spanna þrjú svið lífsins, brjótast rRNA saman í mannvirki þar sem flestir rRNA basar annað hvort basapar og brjóta saman eða hafa samskipti við ríbósómaprótein38,39,40.Hins vegar, í E. cuniculi ríbósómum, virðast rRNA brjóta í bága við þessa fellingarreglu með því að breyta sumum af þyrlum sínum í óbrotin rRNA svæði.
Uppbygging H18 25S rRNA helix í S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi.Venjulega, í ríbósómum sem spanna lífssviðin þrjú, spólast þessi tengill í RNA-helix sem inniheldur 24 til 34 leifar.Í Microsporidia, aftur á móti, er þessi rRNA tengill minnkaður smám saman í tvo einþátta uridín-ríka tengla sem innihalda aðeins 12 leifar.Flestar þessara leifa verða fyrir leysiefnum.Myndin sýnir að sníkjudýra örsporidia virðast brjóta í bága við almennar reglur um rRNA-fellingu, þar sem rRNA-basar eru venjulega tengdir öðrum basum eða taka þátt í rRNA-próteinvíxlverkunum.Í microsporidia taka sum rRNA brot á sig óhagstæðan brot, þar sem fyrrum rRNA helix verður að einþátta broti sem er aflangt nánast í beinni línu.Tilvist þessara óvenjulegu svæða gerir microsporidia rRNA kleift að binda fjarlæg rRNA brot með því að nota lágmarksfjölda RNA basa.
Mest sláandi dæmið um þessa þróunarbreytingu má sjá í H18 25S rRNA helix (mynd 3).Hjá tegundum frá E. coli til manna, innihalda basar þessarar rRNA helix 24-32 núkleótíð, sem mynda örlítið óreglulegan helix.Í áður auðkenndum ríbósómabyggingum frá V. necatrix og P. locustae,31,32 eru basar H18 helixsins að hluta til afhjúpaðir, en núkleótíðbasapörun er varðveitt.Hins vegar, í E. cuniculi verður þetta rRNA brot stystu tengin 228UUUGU232 og 301UUUUUUUUUUU307.Ólíkt dæmigerðum rRNA brotum, þá spóla þessir uridínríku tenglar ekki eða komast í mikla snertingu við ríbósómaprótein.Þess í stað taka þeir upp leysiopna og að fullu óbrotna uppbyggingu þar sem rRNA þræðir eru framlengdir nánast beint.Þessi teygða sköpulag útskýrir hvernig E. cuniculi notar aðeins 12 RNA basa til að fylla 33 Å bilið milli H16 og H18 rRNA helices, á meðan aðrar tegundir þurfa að minnsta kosti tvöfalt fleiri rRNA basa til að fylla bilið.
Þannig getum við sýnt fram á að með orkufræðilega óhagstæðari fellingu hafa sníkjudýra örsporidia þróað stefnu til að draga saman jafnvel þá rRNA-hluta sem eru áfram í stórum dráttum varðveittir í tegundum á þremur sviðum lífsins.Eins og gefur að skilja, með því að safna stökkbreytingum sem umbreyta rRNA þyrlum í stutta fjöl-U tengla, getur E. cuniculi myndað óvenjuleg rRNA brot sem innihalda eins fá kirni og mögulegt er til að binda fjarlæg rRNA brot.Þetta hjálpar til við að útskýra hvernig microsporidia náði stórkostlegri minnkun á grunnsameindabyggingu þeirra án þess að tapa byggingar- og virkniheilleika þeirra.
Annar óvenjulegur eiginleiki E. cuniculi rRNA er útlit rRNA án þykknunar (mynd 4).Bungur eru kirni án basapöra sem snúast út úr RNA helix í stað þess að fela sig í henni.Flest rRNA útskot virka sem sameinda lím, hjálpa til við að binda aðliggjandi ríbósómaprótein eða önnur rRNA brot.Sumar bungurnar virka sem lamir, sem gerir rRNA spírunni kleift að sveigjast og brjóta saman á besta hátt fyrir afkastamikla próteinmyndun 41 .
a rRNA útskot (S. cerevisiae númerun) er ekki í E. cuniculi ríbósómbyggingu, en er til staðar í flestum öðrum heilkjörnungum b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi innri ríbósóm.sníkjudýr skortir mörg af hinum fornu, mjög varðveittu rRNA bungum.Þessar þykknanir koma á stöðugleika í uppbyggingu ríbósóma;þess vegna bendir fjarvera þeirra í microsporidia til skertans stöðugleika rRNA-fellingar í microsporidia sníkjudýrum.Samanburður við P-stöngla (L7/L12 stilkar í bakteríum) sýnir að tap á rRNA-höggum fellur stundum saman við að nýir hnúðar birtast við hlið týndu högganna.H42 helix í 23S/28S rRNA er með fornri bungu (U1206 í Saccharomyces cerevisiae) sem talin er vera að minnsta kosti 3,5 milljarða ára gömul vegna verndar hennar á þremur sviðum lífsins.Í microsporidia er þessi bunga eytt.Hins vegar kom ný bunga við hlið týndu bungunnar (A1306 í E. cuniculi).
Áberandi, við komumst að því að E. cuniculi ríbósóm skortir flestar rRNA-bungur sem finnast í öðrum tegundum, þar á meðal meira en 30 bungur sem varðveittar eru í öðrum heilkjörnungum (mynd 4a).Þetta tap útilokar marga snertingu á milli ríbósóma undireininga og aðliggjandi rRNA-heilna, sem skapar stundum stór hol holur innan ríbósómsins, sem gerir E. cuniculi ríbósómið gljúpara miðað við hefðbundnari ríbósóm (mynd 4b).Sérstaklega komumst við að því að flestar þessar bungur týndust einnig í áður greindum V. necatrix og P. locustae ríbósómbyggingum, sem gleymdust við fyrri byggingargreiningar31,32.
Stundum fylgir tapi á rRNA bungum myndast nýjar bungur við hlið týndu bungunnar.Til dæmis inniheldur ríbósómal P-stöngull U1208 bungur (í Saccharomyces cerevisiae) sem lifði frá E. coli til manna og er því talin vera 3,5 milljarða ára gömul.Meðan á próteinmyndun stendur, hjálpar þessi bunga P-stilknum að færa sig á milli opinna og lokaðra sköpulags þannig að ríbósómið geti fengið þýðingarþætti og skilað þeim á virka staðinn.Í E. cuniculi ríbósómum er þessi þykknun engin;hins vegar getur ný þykknun (G883) sem staðsett er aðeins í þremur grunnpörum stuðlað að endurheimt á besta sveigjanleika P stilksins (mynd 4c).
Gögnin okkar um rRNA án bunga benda til þess að rRNA lágmörkun sé ekki takmörkuð við tap rRNA frumefna á yfirborði ríbósómsins, heldur geti einnig falið í sér ríbósómkjarna, sem skapar sníkjusértækan sameindagalla sem ekki hefur verið lýst í frílifandi frumum.lifandi tegunda sést.
Eftir að hafa mótað kanónísk ríbósómaprótein og rRNA, komumst við að því að hefðbundnir ríbósómalegir þættir geta ekki útskýrt þrjá hluta cryo-EM myndarinnar.Tvö þessara brota eru litlar sameindir að stærð (mynd 5, aukamynd 8).Fyrsti hluti er settur á milli ríbósómapróteina uL15 og eL18 í stöðu sem venjulega er upptekin af C-enda eL18, sem er stytt í E. cuniculi.Þó að við getum ekki ákvarðað deili á þessari sameind er stærð og lögun þessarar þéttleikaeyju vel útskýrð af nærveru spermidínsameinda.Bindingu þess við ríbósómið er stöðugt með microsporidia-sértækum stökkbreytingum í uL15 próteinum (Asp51 og Arg56), sem virðast auka sækni ríbósómsins í þessa litlu sameind, þar sem þeir leyfa uL15 að vefja litlu sameindinni inn í ríbósóma uppbyggingu.Viðbótarmynd 2).8, viðbótargögn 1, 2).
Cryo-EM myndgreining sem sýnir nærveru núkleótíða utan ríbósans bundin við E. cuniculi ríbósóm.Í E. cuniculi ríbósóminu skipar þetta kirni sama stað og 25S rRNA A3186 kirni (Saccharomyces cerevisiae númerun) í flestum öðrum heilkjörnungaríbósómum.b Í ríbósómabyggingu E. cuniculi er þetta kirni staðsett á milli ríbósómapróteina uL9 og eL20 og kemur þar með stöðugleika á milli próteinanna tveggja.cd eL20 röð varðveislu greining meðal microsporidia tegunda.Fræðslutré Microsporidia tegunda (c) og margfeldisröðun eL20 próteinsins (d) sýna að núkleótíðbindandi leifar F170 og K172 eru varðveittar í flestum dæmigerðum Microsporidia, að undanskildum S. lophii, að undanskildum snemma greinóttum Microsporidia, sem hélt ES39L rRNA framlengingunni.e Þessi mynd sýnir að núkleótíðbindandi leifar F170 og K172 eru aðeins til staðar í eL20 í mjög skertu erfðamengi microsporidia, en ekki í öðrum heilkjörnungum.Á heildina litið benda þessi gögn til þess að Microsporidian ríbósóm hafi þróað núkleótíðbindingarstað sem virðist binda AMP sameindir og nota þær til að koma á stöðugleika milli próteina og próteina í uppbyggingu ríbósóma.Mikil varðveisla þessa bindistaðar í Microsporidia og fjarvera hans í öðrum heilkjörnungum bendir til þess að þessi staður geti veitt sértækan lifunarkost fyrir Microsporidia.Þannig virðist núkleótíðbindandi vasinn í microsporidia ríbósóminu ekki vera úrkynjaður eiginleiki eða lokaform rRNA niðurbrots eins og áður hefur verið lýst, heldur frekar gagnleg þróunarnýjung sem gerir microsporidia ríbósóminu kleift að binda litlar sameindir beint og nota þær sem sameinda byggingareiningar.byggingareiningar fyrir ríbósóm.Þessi uppgötvun gerir microsporidia ríbósómið eina ríbósómið sem vitað er að notar eitt kirni sem byggingareining.f Tilgáta þróunarleið sem er fengin af núkleótíðbindingu.
Annar lítill mólþéttleiki er staðsettur á snertifleti milli ríbósómapróteina uL9 og eL30 (mynd 5a).Þessu viðmóti var áður lýst í uppbyggingu Saccharomyces cerevisiae ríbósómsins sem bindistað fyrir 25S núkleótíð rRNA A3186 (hluti af ES39L rRNA framlengingunni)38.Sýnt var fram á að í hrörnuðum P. locustae ES39L ríbósómum binst þetta tengi óþekkt stakt núkleótíð 31 og gert er ráð fyrir að þetta núkleótíð sé minnkað lokaform rRNA, þar sem lengd rRNA er ~130-230 basar.ES39L er minnkað í eitt núkleótíð 32.43.Cryo-EM myndirnar okkar styðja þá hugmynd að þéttleika sé hægt að útskýra með kirni.Hins vegar sýndi hærri upplausn uppbyggingar okkar að þetta kirni er sameind utan ríbósóma, hugsanlega AMP (mynd 5a, b).
Við spurðum síðan hvort núkleótíðbindistaðurinn birtist í E. cuniculi ríbósóminu eða hvort hann hafi verið til áður.Þar sem núkleótíðbinding er aðallega miðlað af Phe170 og Lys172 leifum í eL30 ríbósómaprótíninu, metum við varðveislu þessara leifa í 4396 fulltrúa heilkjörnunga.Eins og í tilviki uL15 hér að ofan, komumst við að því að Phe170 og Lys172 leifar eru mjög varðveittar aðeins í dæmigerðum Microsporidia, en ekki til í öðrum heilkjörnungum, þar á meðal óhefðbundnum Microsporidia Mitosporidium og Amphiamblys, þar sem ES39L rRNA brotið er ekki minnkað 44, 45, 45c).-e).
Samanlagt styðja þessi gögn þá hugmynd að E. cuniculi og hugsanlega aðrar kanónískar microsporidia hafi þróað hæfileikann til að fanga á skilvirkan hátt mikinn fjölda lítilla umbrotsefna í ríbósómbyggingunni til að vega upp á móti lækkun á rRNA- og próteinmagni.Með því hafa þeir þróað einstakan hæfileika til að binda núkleótíð utan ríbósómsins, sem sýnir að sameindabyggingar sníkjudýra bæta upp með því að fanga mikið af litlum umbrotsefnum og nota þau sem uppbyggingarlíkingar á niðurbrotið RNA og próteinbrot..
Þriðji óhermdi hluti af cryo-EM kortinu okkar, fannst í stóru ríbósóma undireiningunni.Tiltölulega há upplausn (2,6 Å) kortsins okkar bendir til þess að þessi þéttleiki tilheyri próteinum með einstökum samsetningum af stórum hliðarkeðjuleifum, sem gerði okkur kleift að bera kennsl á þennan þéttleika sem áður óþekkt ríbósómaprótein sem við greindum sem það var nefnt msL2 (Microsporidia-sértækt prótein L2) (aðferðir, mynd 6).Samheitaleit okkar sýndi að msL2 er varðveitt í Microsporidia clade af ættkvíslinni Encephaliter og Orosporidium, en er ekki til í öðrum tegundum, þar á meðal öðrum Microsporidia.Í ríbósóma uppbyggingu tekur msL2 upp bil sem myndast við tap á útbreiddu ES31L rRNA.Í þessu tómi hjálpar msL2 að koma á stöðugleika í rRNA-fellingu og getur bætt upp tapið á ES31L (mynd 6).
rafeindaþéttleiki og líkan af Microsporidia-sértæku ríbósómapróteini msL2 sem finnast í E. cuniculi ríbósómum.b Flest heilkjörnungaríbósóm, þar á meðal 80S ríbósóm Saccharomyces cerevisiae, hafa ES19L rRNA mögnun glatað í flestum Microsporidian tegundum.Áður staðfest uppbygging V. necatrix microsporidia ríbósómsins bendir til þess að tap á ES19L í þessum sníkjudýrum sé bætt upp með þróun nýja msL1 ríbósómapróteins.Í þessari rannsókn komumst við að því að E. cuniculi ríbósómið þróaði einnig viðbótar ríbósómal RNA líkja prótein sem augljós bætur fyrir tap á ES19L.Hins vegar hafa msL2 (nú merkt sem tilgáta ECU06_1135 próteinið) og msL1 mismunandi uppbyggingu og þróunaruppruna.c Þessi uppgötvun á myndun þróunarlega óskyldra msL1 og msL2 ríbósómapróteina bendir til þess að ef ríbósóm safnast upp skaðlegum stökkbreytingum í rRNA þeirra geti þau náð áður óþekktum fjölbreytileika í samsetningu jafnvel í litlum undirhópi náskyldra tegunda.Þessi uppgötvun gæti hjálpað til við að skýra uppruna og þróun hvatbera ríbósómsins, sem er þekktur fyrir mjög skert rRNA og óeðlilegan breytileika í próteinsamsetningu milli tegunda.
Við bárum síðan saman msL2 próteinið við msL1 próteinið sem áður var lýst, eina þekkta örsporidíusértæka ríbósómapróteinið sem finnst í V. necatrix ríbósóminu.Við vildum prófa hvort msL1 og msL2 séu þróunarlega skyld.Greining okkar sýndi að msL1 og msL2 eru í sama holi í ríbósóma uppbyggingu, en hafa mismunandi frum- og háskólabyggingu, sem gefur til kynna sjálfstæða þróunaruppruna þeirra (mynd 6).Þannig gefur uppgötvun okkar á msL2 vísbendingar um að hópar af þéttum heilkjörnungategundum geti sjálfstætt þróað byggingarlega aðgreind ríbósómaprótein til að vega upp á móti tapi á rRNA brotum.Þessi niðurstaða er áberandi að því leyti að flest heilkjörnungaríbósóm í umfrymi innihalda óbreytt prótein, þar á meðal sömu fjölskyldu 81 ríbósómapróteina.Framkoma msL1 og msL2 í ýmsum tegundum örspora sem bregðast við tapi á útbreiddum rRNA hlutum bendir til þess að niðurbrot sameindabyggingar sníkjudýrsins valdi því að sníkjudýr leita að jöfnunarstökkbreytingum, sem að lokum getur leitt til þess að þeir eignist mismunandi sníkjudýrahópa.mannvirki.
Að lokum, þegar líkanið okkar var lokið, bárum við saman samsetningu E. cuniculi ríbósómsins við það sem spáð var út frá erfðamengisröðinni.Áður var talið að nokkur ríbósómaprótein, þar á meðal eL14, eL38, eL41 og eS30, vantaði í erfðamengi E. cuniculi vegna þess að samstæður þeirra eru greinilega ekki til í erfðamengi E. cuniculi.Einnig er spáð tapi á mörgum ríbósómapróteinum í flestum öðrum mjög skertum innanfrumu sníkjudýrum og endosymbionts.Til dæmis, þó að flestar frílifandi bakteríur innihaldi sömu fjölskyldu af 54 ríbósómapróteinum, hafa aðeins 11 af þessum próteinfjölskyldum greinanleg samsvörun í hverju greindu erfðamengi baktería sem takmarkast við hýsil.Þessari hugmynd til stuðnings hefur tap á ríbósómapróteinum sést með tilraunum í V. necatrix og P. locustae microsporidia, sem skortir eL38 og eL4131,32 próteinin.
Samt sem áður sýna mannvirki okkar að aðeins eL38, eL41 og eS30 glatast í raun í E. cuniculi ríbósóminu.eL14 próteinið var varðveitt og uppbygging okkar sýndi hvers vegna þetta prótein fannst ekki í homology leitinni (Mynd 7).Í E. cuniculi ríbósómum tapast megnið af eL14 bindistaðnum vegna niðurbrots á rRNA-magnaða ES39L.Þar sem ES39L var ekki til, missti eL14 megnið af aukabyggingu sinni og aðeins 18% af eL14 röðinni var eins í E. cuniculi og S. cerevisiae.Þessi lélega varðveisla röðarinnar er ótrúleg vegna þess að jafnvel Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens — lífverur sem þróuðust með 1,5 milljarða ára millibili — deila meira en 51% af sömu leifum í eL14.Þetta afbrigðilega tap á varðveislu útskýrir hvers vegna E. cuniculi eL14 er nú merkt sem hugsanlegt M970_061160 prótein en ekki sem eL1427 ríbósómaprótein.
og Microsporidia ríbósómið missti ES39L rRNA framlenginguna, sem eyddi að hluta til eL14 ríbósómal próteinbindingarstaðinn.Í fjarveru ES39L tapar eL14 örgrópróteinið efri uppbyggingu, þar sem fyrrum rRNA-bindandi α-helix hrynur í lágmarkslengdar lykkju.b Margraða röðun sýnir að eL14 próteinið er mjög varðveitt í heilkjörnungategundum (57% raðauðkenni á milli ger og manna samsvörunar), en illa varðveitt og ólíkt í microsporidia (þar sem ekki meira en 24% leifa eru eins og eL14 samkynhneigð).frá S. cerevisiae eða H. sapiens).Þessi lélega varðveisla raðar og breytileiki í efri uppbyggingu skýrir hvers vegna eL14 samsvörunin hefur aldrei fundist í E. cuniculi og hvers vegna talið er að þetta prótein hafi glatast í E. cuniculi.Aftur á móti var E. cuniculi eL14 áður merkt sem hugsanlegt M970_061160 prótein.Þessi athugun bendir til þess að fjölbreytileiki microsporidia erfðamengis sé ofmetinn eins og er: sum gen sem nú eru talin glatast í microsporidia eru í raun varðveitt, þó í mjög aðgreindum myndum;í staðinn er talið að sum sé að kóða fyrir microsporidia gen fyrir ormasértæk prótein (td ímyndaða próteinið M970_061160) kóða í raun fyrir mjög fjölbreytt prótein sem finnast í öðrum heilkjörnungum.
Þessi niðurstaða bendir til þess að rRNA denaturation geti leitt til stórkostlegs taps á varðveislu raðar í aðliggjandi ríbósómapróteinum, sem gerir þessi prótein ógreinanleg fyrir samheitaleit.Þannig gætum við ofmetið raunverulegt niðurbrot sameinda í litlum erfðamengislífverum, þar sem sum prótein sem talið er að hafi glatast haldast í raun, þó í mjög breyttu formi.
Hvernig geta sníkjudýr haldið virkni sameindavéla sinna við miklar erfðamengisskerðingar?Rannsókn okkar svarar þessari spurningu með því að lýsa flókinni sameindabyggingu (ríbósóm) E. cuniculi, lífveru með eitt minnsta heilkjörnunga erfðamengi.
Það hefur verið vitað í næstum tvo áratugi að prótein- og RNA sameindir í örveru sníkjudýrum eru oft frábrugðnar einsleitum sameindum sínum í frílifandi tegundum vegna þess að þær skortir gæðaeftirlitsstöðvar, minnkar í 50% af stærð þeirra í frílifandi örverum o.s.frv.margar lamandi stökkbreytingar sem skerða fellingu og virkni.Til dæmis er búist við að ríbósóm lítilla erfðamengislífvera, þar á meðal margra innanfrumu sníkjudýra og endosymbionts, skorti nokkur ríbósómaprótein og allt að þriðjung af rRNA núkleótíðum samanborið við frílifandi tegundir 27, 29, 30, 49. Hins vegar hvernig þessar sameindir starfa aðallega í sníkjudýrum, rannsakaði það aðallega erfðaefnisleifar.
Rannsókn okkar sýnir að uppbygging stórsameinda getur leitt í ljós marga þætti þróunar sem erfitt er að vinna úr hefðbundnum samanburðarrannsóknum á erfðafræðilegum rannsóknum á innanfrumu sníkjudýrum og öðrum lífverum sem eru takmarkaðar á hýsil (aukamynd 7).Til dæmis sýnir dæmið um eL14 próteinið að við getum ofmetið raunverulegt niðurbrotsstig sameindabúnaðarins í sníkjudýrum.Talið er að heilasníkjudýr séu með hundruðir sértækra gena sem eru sértækar fyrir öreindir.Hins vegar sýna niðurstöður okkar að sum þessara að því er virðist sértæku gena eru í raun bara mjög mismunandi afbrigði af genum sem eru algeng í öðrum heilkjörnungum.Þar að auki sýnir dæmið um msL2 próteinið hvernig við lítum framhjá nýjum ríbósómapróteinum og vanmetum innihald sameindavéla með sníkjudýrum.Dæmið um litlar sameindir sýnir hvernig við getum horft framhjá sniðugustu nýjungum í sameindabyggingum sníkjudýra sem geta veitt þeim nýja líffræðilega virkni.
Samanlagt bæta þessar niðurstöður skilning okkar á muninum á sameindabyggingu lífvera sem takmarkast við hýsil og hliðstæða þeirra í frílifandi lífverum.Við sýnum að sameindavélar, sem lengi hafa verið taldar minnkaðar, úrkynjaðar og háðar ýmsum lamandi stökkbreytingum, hafa þess í stað kerfisbundið yfirséð óvenjulega byggingareinkenni.
Á hinn bóginn benda rRNA-brotin sem ekki eru fyrirferðarmikil og samrunabrotin sem við fundum í ríbósómum E. cuniculi til þess að erfðamengisskerðing geti breytt jafnvel þeim hlutum grunnsameindavélarinnar sem varðveitast á þremur sviðum lífsins - eftir tæplega 3,5 milljarða ára .sjálfstæða þróun tegunda.
Bungulausu og samrunnu rRNA bútarnir í E. cuniculi ríbósómum eru sérstaklega áhugaverðir í ljósi fyrri rannsókna á RNA sameindum í endosymbiotic bakteríum.Til dæmis, í aphid endosymbiont Buchnera aphidicola, hefur verið sýnt fram á að rRNA og tRNA sameindir hafa hitanæma uppbyggingu vegna A+T samsetningar skekkju og hátt hlutfalls af non-canonical basapörum20,50.Þessar breytingar á RNA, sem og breytingar á próteinsameindum, eru nú taldar vera ábyrgar fyrir ofháð endosymbionts á maka og vanhæfni endosymbionts til að flytja hita 21, 23 .Þrátt fyrir að sníkjudýr microsporidia rRNA hafi skipulagslega aðgreindar breytingar bendir eðli þessara breytinga til þess að minni hitastöðugleiki og meiri háð fylgispróteinum geti verið algeng einkenni RNA sameinda í lífverum með skert erfðamengi.
Á hinn bóginn sýna uppbygging okkar að sníkjudýr microsporidia hafa þróað einstaka hæfileika til að standast víðtæka varðveitt rRNA og próteinbrot, þróað hæfileikann til að nota mikið og auðvelt að fá lítil umbrotsefni sem byggingarlega líkja eftir úrkynjað rRNA og próteinbrot.Niðurbrot sameindabyggingar..Þessi skoðun er studd af þeirri staðreynd að litlar sameindir sem vega upp á móti tapi á próteinbrotum í rRNA og ríbósómum E. cuniculi bindast örsporidia-sértækum leifum í uL15 og eL30 próteinum.Þetta bendir til þess að binding lítilla sameinda við ríbósóm geti verið afurð jákvæðs vals, þar sem Microsporidia-sértækar stökkbreytingar í ríbósómapróteinum hafa verið valdar fyrir hæfni þeirra til að auka sækni ríbósóma í litlar sameindir, sem getur leitt til skilvirkari ríbósóma lífvera.Uppgötvunin leiðir í ljós snjöll nýjung í sameindabyggingu örvera sníkjudýra og gefur okkur betri skilning á því hvernig sameindabyggingar sníkjudýra viðhalda starfsemi sinni þrátt fyrir afoxandi þróun.
Sem stendur er auðkenning þessara litlu sameinda enn óljós.Ekki er ljóst hvers vegna útlit þessara litlu sameinda í ríbósóma uppbyggingu er ólíkt milli microsporidia tegunda.Sérstaklega er ekki ljóst hvers vegna núkleótíðbinding sést í ríbósómum E. cuniculi og P. locustae, en ekki í ríbósómum V. necatrix, þrátt fyrir tilvist F170 leifar í eL20 og K172 próteinum V. necatrix.Þessi eyðing getur stafað af leifum 43 uL6 (staðsett við hlið kirnisbindingarvasans), sem er týrósín í V. necatrix en ekki þreónín í E. cuniculi og P. locustae.Fyrirferðarmikil arómatísk hliðarkeðja Tyr43 getur truflað núkleótíðbindingu vegna sterískrar skörunar.Að öðrum kosti getur sýnileg núkleótíðeyðing verið vegna lítillar upplausnar á cryo-EM myndgreiningu, sem hindrar mótun V. necatrix ríbósómabrota.
Á hinn bóginn bendir vinna okkar til þess að ferlið við rotnun erfðamengisins geti verið uppfinningamaður.Sérstaklega bendir uppbygging E. cuniculi ríbósómsins til þess að tap á rRNA og próteinbrotum í microsporidia ríbósóminu skapi þróunarþrýsting sem stuðlar að breytingum á byggingu ríbósóma.Þessi afbrigði eiga sér stað langt frá virka stað ríbósómsins og virðast hjálpa til við að viðhalda (eða endurheimta) ákjósanlegri samsetningu ríbósóma sem annars myndi raskast af minnkaðri rRNA.Þetta bendir til þess að stór nýjung á microsporidia ríbósómi virðist hafa þróast í þörf á að jafna genasvif.
Kannski er þetta best lýst með núkleótíðbindingu, sem aldrei hefur sést í öðrum lífverum hingað til.Sú staðreynd að núkleótíðbindandi leifar eru til staðar í dæmigerðum microsporidia, en ekki í öðrum heilkjörnungum, bendir til þess að núkleótíðbindistaðir séu ekki bara minjar sem bíða þess að hverfa, eða lokastaðurinn fyrir rRNA til að endurheimta form einstakra núkleótíða.Þess í stað virðist þessi síða vera gagnlegur eiginleiki sem hefði getað þróast yfir nokkrar lotur af jákvæðu vali.Núkleótíðbindistaðir geta verið aukaafurð náttúruvals: þegar ES39L hefur verið brotið niður, neyðast örsporídíur til að leita bóta til að endurheimta ákjósanlegri lífmyndun ríbósóma í fjarveru ES39L.Þar sem þetta núkleótíð getur líkt eftir sameindasnertingum A3186 núkleótíðsins í ES39L, verður núkleótíð sameindin að byggingareining ríbósómsins, binding þess er enn betri með stökkbreytingu á eL30 röðinni.
Hvað varðar sameindaþróun innanfrumu sníkjudýra sýnir rannsókn okkar að kraftar darwinísks náttúruvals og erfðasvif erfðamengishruni starfa ekki samhliða, heldur sveiflast.Í fyrsta lagi útilokar erfðafræðilegt rek mikilvæga eiginleika lífsameinda, sem gerir bætur mjög nauðsynlegar.Aðeins þegar sníkjudýr fullnægja þessari þörf með náttúruvali Darwins munu stórsameindir þeirra hafa tækifæri til að þróa glæsilegustu og nýstárlegustu eiginleika þeirra.Mikilvægt er að þróun kirnisbindingarstaða í E. cuniculi ríbósóminu bendir til þess að þetta tap-til-ávinningsmynstur sameindaþróunar dragi ekki aðeins niður skaðlegar stökkbreytingar, heldur veiti sníkjudýrum stórsameindum alveg nýjar aðgerðir.
Þessi hugmynd er í samræmi við áhrifamikla jafnvægiskenningu Sewell Wright, sem segir að strangt kerfi náttúruvals takmarki getu lífvera til nýsköpunar51,52,53.Hins vegar, ef erfðasvif truflar náttúrulegt val, getur þetta rek framkallað breytingar sem eru í sjálfu sér ekki aðlögunarhæfar (eða jafnvel skaðlegar) en leitt til frekari breytinga sem veita meiri hæfni eða nýja líffræðilega virkni.Umgjörð okkar styður þessa hugmynd með því að sýna fram á að sams konar stökkbreyting sem dregur úr fellingu og virkni lífsameindar virðist vera aðal kveikjan að framförum hennar.Í samræmi við vinna-vinna þróunarlíkanið sýnir rannsókn okkar að rotnun erfðamengis, sem venjulega er litið á sem hrörnunarferli, er einnig stór drifkraftur nýsköpunar, stundum og jafnvel oft sem gerir stórsameindum kleift að öðlast nýja sníkjudýrastarfsemi.getur notað þá.