Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Þróun örverusníkjudýra felur í sér mótvirkni milli náttúruvals, sem veldur því að sníkjudýr batna, og erfðafræðilegs reks, sem veldur því að sníkjudýr missa gen og safna skaðlegum stökkbreytingum. Til að skilja hér hvernig þessi mótvirkni á sér stað á kvarða eins stórsameindar, lýsum við frost-EM uppbyggingu ríbósóms Encephalitozoon cuniculi, heilkjörnunga með eitt minnsta erfðamengi náttúrunnar. Mikil fækkun rRNA í E. cuniculi ríbósómum fylgir fordæmalausar byggingarbreytingar, svo sem þróun áður óþekktra samruna rRNA tengja og rRNA án bungu. Að auki lifði E. cuniculi ríbósómið af tap á rRNA brotum og próteinum með því að þróa með sér getu til að nota litlar sameindir sem byggingarlíkingar af niðurbrotnum rRNA brotum og próteinum. Í heildina sýnum við fram á að sameindabyggingar sem lengi hefur verið taldar vera minnkaðar, hrörnandi og háðar lamandi stökkbreytingum hafa fjölda uppbótarkerfa sem halda þeim virkum þrátt fyrir mikla sameindasamdrætti.
Þar sem flestir hópar örverusníkjudýra hafa einstök sameindatæki til að nýta sér hýsla sína, þurfum við oft að þróa mismunandi meðferðir fyrir mismunandi hópa sníkjudýra1,2. Hins vegar benda nýjar vísbendingar til þess að sumir þættir í þróun sníkjudýra séu samleitnir og að mestu leyti fyrirsjáanlegir, sem bendir til hugsanlegs grundvallar fyrir víðtækar meðferðarúrræði gegn örverusníkjudýrum3,4,5,6,7,8,9.
Fyrri rannsóknir hafa bent á sameiginlega þróunarstefnu í örverusníkjudýrum sem kallast erfðamengisrýrnun eða erfðamengisrýrnun10,11,12,13. Núverandi rannsóknir sýna að þegar örverur hætta frjálsu lífi sínu og verða innanfrumusníkjudýr (eða innri samlífisdýr), gangast erfðamengi þeirra undir hægar en ótrúlegar myndbreytingar yfir milljónir ára9,11. Í ferli sem kallast erfðamengisrýrnun safnast örverusníkjudýr fyrir skaðlegum stökkbreytingum sem breyta mörgum áður mikilvægum genum í gervigen, sem leiðir til smám saman genataps og stökkbreytingahruns14,15. Þetta hrun getur eyðilagt allt að 95% af genum í elstu innanfrumulífverum samanborið við náskyldar frjálsar tegundir. Þannig er þróun innanfrumusníkjudýra togstreita milli tveggja andstæðra afla: Darwinísks náttúruvals, sem leiðir til umbóta á sníkjudýrum, og hruns erfðamengisins, sem kastar sníkjudýrum í gleymskunnar dá. Hvernig sníkjudýrinu tókst að komast út úr þessari togstreitu og viðhalda virkni sameindabyggingar sinnar er enn óljóst.
Þótt ekki sé að fullu skilið hvernig erfðamengið rotnar virðist það aðallega eiga sér stað vegna tíðs erfðaflæðis. Þar sem sníkjudýr lifa í litlum, kynlausum og erfðafræðilega takmörkuðum stofnum geta þau ekki á áhrifaríkan hátt útrýmt skaðlegum stökkbreytingum sem stundum eiga sér stað við DNA-afritun. Þetta leiðir til óafturkræfrar uppsöfnunar skaðlegra stökkbreytinga og fækkunar á erfðamengi sníkjudýrsins. Fyrir vikið missir sníkjudýrið ekki aðeins gen sem eru ekki lengur nauðsynleg fyrir lifun sína í innanfrumuumhverfinu. Það er vanhæfni sníkjudýrastofna til að útrýma á áhrifaríkan hátt einstaka skaðlegum stökkbreytingum sem veldur því að þessar stökkbreytingar safnast fyrir um allt erfðamengið, þar á meðal mikilvægustu genin þeirra.
Núverandi skilningur okkar á erfðamengisminnkun byggist að miklu leyti eingöngu á samanburði á erfðamengisröðum, þar sem minni athygli er lögð á breytingu á raunverulegum sameindum sem sinna heimilishaldi og eru hugsanleg lyfjamarkmið. Samanburðarrannsóknir hafa sýnt að skaðleg stökkbreyting innan frumna örvera virðist auka líkur á að prótein og kjarnsýrur felli sig saman og safnist saman, sem gerir þau háðari fylgdarmönnum og ofnæmari fyrir hita19,20,21,22,23. Að auki upplifðu ýmis sníkjudýr - stundum með allt að 2,5 milljarða ára millibili óháð þróun - svipað tap á gæðastjórnunarstöðvum í próteinmyndun sinni5,6 og DNA viðgerðarferlum24. Hins vegar er lítið vitað um áhrif innanfrumulífsstíls á alla aðra eiginleika frumu stórsameinda, þar á meðal aðlögun sameinda að vaxandi byrði skaðlegra stökkbreytinga.
Í þessari vinnu, til að skilja betur þróun próteina og kjarnsýra innanfrumuörvera, ákvörðuðum við byggingu ríbósóma innanfrumusníkjudýrsins Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi er sveppalík lífvera sem tilheyrir flokki sníkjudýra örspora sem hafa óvenju lítil erfðamengi heilkjörnunga og eru því notuð sem fyrirmyndarlífverur til að rannsaka erfðamengisrof25,26,27,28,29,30. Nýlega var frystingar-EM ríbósómbygging ákvörðuð fyrir miðlungs minnkað erfðamengi Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb erfðamengi). Þessar byggingar benda til þess að einhver tap á rRNA mögnun sé bætt upp með þróun nýrra tengsla milli nágranna ríbósómpróteina eða öflun nýrra msL131,32 ríbósómpróteina. Tegundirnar Encephalitozoon (erfðamengi ~2,5 milljónir bp), ásamt nánasta ættingja sínum Ordospora, sýna fram á hámarks erfðamengisminnkun í heilkjörnungum – þær hafa færri en 2000 prótein-kóðandi gen og það er búist við að ríbósóm þeirra séu ekki aðeins laus við rRNA útvíkkunarbrot (rRNA brot sem aðgreina heilkjörnunga ríbósóm frá bakteríuríbósómum) heldur einnig með fjögur ríbósómprótein vegna skorts á samsvarandi próteinum í erfðamengi E. cuniculi26,27,28. Því komumst við að þeirri niðurstöðu að ríbósóm E. cuniculi geti leitt í ljós áður óþekktar aðferðir til sameindaaðlögunar að erfðamengisminnkun.
Kryo-EM uppbygging okkar er minnsta ríbósóm heilkjörnunga í umfrymi sem hefur verið greint og veitir innsýn í hvernig endanlegt magn erfðamengisminnkunar hefur áhrif á uppbyggingu, samsetningu og þróun sameindavélarinnar sem er óaðskiljanlegur hluti frumunnar. Við komumst að því að ríbósómið í E. cuniculi brýtur gegn mörgum af þeim víða varðveittu meginreglum um RNA fellingu og samsetningu ríbósóma og uppgötvuðum nýtt, áður óþekkt ríbósómprótein. Við sýnum nokkuð óvænt fram á að ríbósóm í örsporídíum hafa þróað getu til að binda litlar sameindir og setjum fram þá tilgátu að styttingar í rRNA og próteinum hleypi af stað þróunarnýjungum sem gætu að lokum veitt ríbósóminu gagnlega eiginleika.
Til að bæta skilning okkar á þróun próteina og kjarnsýra í innanfrumulífverum ákváðum við að einangra E. cuniculi gró úr ræktun sýktra spendýrafruma til að hreinsa ríbósóm þeirra og ákvarða uppbyggingu þessara ríbósóma. Það er erfitt að fá mikið magn af sníkjudýraörsporídíum þar sem ekki er hægt að rækta örsporídíur í næringarefnum. Í staðinn vaxa og fjölga þær sér aðeins innan hýsilfrumunnar. Þess vegna, til að fá E. cuniculi lífmassa til hreinsunar ríbósóma, smituðum við spendýra nýrnafrumulínuna RK13 með E. cuniculi gróum og ræktuðum þessar sýktu frumur í nokkrar vikur til að leyfa E. cuniculi að vaxa og fjölga sér. Með því að nota sýkt frumueinlag sem var um það bil hálfur fermetri, gátum við hreinsað um það bil 300 mg af Microsporidia gróum og notað þau til að einangra ríbósóm. Við sundruðum síðan hreinsuðu gróin með glerperlum og einangruðum hráu ríbósómin með því að nota stigvaxandi pólýetýlen glýkól aðgreiningu á lýsatunum. Þetta gerði okkur kleift að fá um það bil 300 µg af hráum E. cuniculi ríbósómum til byggingargreiningar.
Við söfnuðum síðan myndum af frystingar-EM með því að nota ríbósómsýnin sem mynduðust og unnum úr þessum myndum með því að nota grímur sem samsvaruðu stóru ríbósómeiningunni, litlu einingarhausnum og litlu einingunni. Í þessu ferli söfnuðum við myndum af um 108.000 ríbósómögnum og reiknuðum út frystingar-EM myndir með 2,7 Å upplausn (viðbótarmyndir 1-3). Við notuðum síðan frystingar-EM myndir til að líkja eftir rRNA, ríbósómpróteini og vetrardvalaþætti Mdf1 sem tengist E. cuniculi ríbósómum (Mynd 1a, b).
a Uppbygging ríbósómsins í E. cuniculi í tengslum við vetrardvalaþáttinn Mdf1 (pdb id 7QEP). b Kort af vetrardvalaþættinum Mdf1 sem tengist ríbósóminu í E. cuniculi. c Kort af annars stigs uppbyggingu sem ber saman endurheimt rRNA í Microsporidian tegundum við þekktar ríbósómbyggingar. Spjöldin sýna staðsetningu magnaðra rRNA brota (ES) og virkra svæða ríbósómsins, þar á meðal afkóðunarstaðarins (DC), sarcinicin lykkjans (SRL) og peptídýl transferasa miðstöðvarinnar (PTC). d Rafeindaþéttleikinn sem samsvarar peptídýl transferasa miðstöðinni í E. cuniculi ríbósóminu bendir til þess að þessi hvatastaður hafi sömu uppbyggingu í E. cuniculi sníkjudýrinu og hýslum þess, þar á meðal H. sapiens. e, f Samsvarandi rafeindaþéttleiki afkóðunarstöðvarinnar (e) og skýringarmynd af afkóðunarstöðinni (f) benda til þess að E. cuniculi hafi leifarnar U1491 í stað A1491 (númerun E. coli) í mörgum öðrum heilkjörnungum. Þessi breyting bendir til þess að E. cuniculi gæti verið viðkvæm fyrir sýklalyfjum sem beinast að þessum virka stað.
Ólíkt áður þekktum uppbyggingum ríbósóma af gerðinni V. necatrix og P. locustae (báðar uppbyggingarnar eru af sömu örsporídíuætt Nosematidae og eru mjög líkar hver annarri), gangast 31,32 E. cuniculi ríbósóm undir fjölmörg ferli rRNA og próteinbrotnunar. Frekari denatúrering (viðbótarmyndir 4-6). Í rRNA voru áberandi breytingar meðal annars algjört tap á magnaða 25S rRNA brotinu ES12L og að hluta til hrörnun á h39, h41 og H18 helixum (mynd 1c, viðbótarmynd 4). Meðal ríbósómpróteina voru áberandi breytingar meðal annars algjört tap á eS30 próteininu og stytting á eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 og eS7 próteinum (viðbótarmyndir 4, 5).
Þannig endurspeglast hin mikla fækkun erfðamengja Encephalotozoon/Ordospora tegunda í ríbósómbyggingu þeirra: E. cuniculi ríbósóm upplifa mesta próteinmissi í heilkjörnungum umfrymis ríbósómum sem eru háð byggingargreiningu, og þau hafa ekki einu sinni þau rRNA og próteinbrot sem eru víða varðveitt, ekki aðeins í heilkjörnungum, heldur einnig í þremur lífsviðum. Uppbygging E. cuniculi ríbósómsins veitir fyrstu sameindalíkanið fyrir þessar breytingar og sýnir þróunaratburði sem hafa verið gleymdir bæði í samanburðarerfðafræði og rannsóknum á innanfrumulíffræðilegri sameindabyggingu (viðbótarmynd 7). Hér að neðan lýsum við hverjum þessara atburða ásamt líklegum þróunaruppruna þeirra og hugsanlegum áhrifum á virkni ríbósóma.
Við komumst síðan að því að auk stórra rRNA styttinga hafa E. cuniculi ríbósóm rRNA breytileika á einum af virku stöðum sínum. Þó að peptídýl transferasa miðstöð E. cuniculi ríbósómsins hafi sömu uppbyggingu og önnur heilkjörnunga ríbósóm (Mynd 1d), þá er afkóðunarmiðstöðin mismunandi vegna raðbreytileika við núkleótíð 1491 (E. coli númerun, Mynd 1e, f). Þessi athugun er mikilvæg vegna þess að afkóðunarstaður heilkjörnunga ríbósóma inniheldur yfirleitt leifarnar G1408 og A1491 samanborið við bakteríuleifar A1408 og G1491. Þessi breytileiki liggur að bakteríu- og heilkjörnunga ríbósóma fyrir amínóglýkósíð fjölskyldu ríbósóma sýklalyfja og öðrum litlum sameindum sem miða á afkóðunarstaðinn. Á afkóðunarstað E. cuniculi ríbósómsins var leif A1491 skipt út fyrir U1491, sem hugsanlega skapaði einstakt bindingarviðmót fyrir litlar sameindir sem miða á þennan virka stað. Sama A14901 afbrigðið er einnig til staðar í öðrum örsporidíutegundum eins og P. locustae og V. necatrix, sem bendir til þess að það sé útbreitt meðal örsporidíutegunda (Mynd 1f).
Þar sem E. cuniculi ríbósómsýnin okkar voru einangruð úr efnaskiptaóvirkum gróum, prófuðum við frost-EM kortið af E. cuniculi til að athuga hvort ríbósómbinding væri rétt lýst við streitu- eða sveltisaðstæður. Vetrardvalaþættir 31, 32, 36, 37, 38. Við pöruðum saman áður staðfesta byggingu vetrardvalar ríbósómsins við frost-EM kortið af E. cuniculi ríbósóminu. Til að tengja saman voru S. cerevisiae ríbósóm notuð í fléttu með vetrardvalaþættinum Stm138, engisprettu ríbósóm í fléttu með Lso232 þættinum og V. necatrix ríbósóm í fléttu með Mdf1 og Mdf231 þáttum. Á sama tíma fundum við frost-EM þéttleikann sem samsvaraði hvíldarþættinum Mdf1. Líkt og Mdf1 binst ríbósóminu í V. necatrix, binst Mdf1 einnig ríbósóminu í E. cuniculi, þar sem það lokar fyrir E-stað ríbósómsins, sem hugsanlega hjálpar til við að gera ríbósóm aðgengileg þegar sníkjudýragró verða efnaskiptaóvirk við óvirkjun líkamans (Mynd 2).
Mdf1 lokar fyrir E-stað ríbósómsins, sem virðist hjálpa til við að óvirkja ríbósómið þegar sníkjudýrsgró verða efnaskiptaóvirk. Í uppbyggingu ríbósómsins í E. cuniculi komumst við að því að Mdf1 myndar áður óþekkt tengilið við L1 ríbósómstilkinn, þann hluta ríbósómsins sem auðveldar losun afasetýleraðs tRNA frá ríbósóminu við próteinmyndun. Þessi tengiliði benda til þess að Mdf1 losni frá ríbósóminu með sama aðferð og afasetýlerað tRNA, sem veitir mögulega skýringu á því hvernig ríbósómið fjarlægir Mdf1 til að endurvirkja próteinmyndun.
Hins vegar leiddi uppbygging okkar í ljós óþekkt snertiflöt milli Mdf1 og L1 ríbósómleggsins (þann hluta ríbósómsins sem hjálpar til við að losa afasetýlerað tRNA úr ríbósóminu við próteinmyndun). Einkum notar Mdf1 sömu snertiflöt og olnbogahluti afasetýleraðs tRNA sameindarinnar (Mynd 2). Þessi áður óþekkta sameindalíkan sýndi að Mdf1 losnar frá ríbósóminu með sama ferli og afasetýlerað tRNA, sem skýrir hvernig ríbósómið fjarlægir þennan dvalaþátt til að endurvirkja próteinmyndun.
Þegar við smíðuðum rRNA líkanið komumst við að því að ríbósómið í E. cuniculi hefur óeðlilega brotna rRNA brot, sem við kölluðum samruna rRNA (Mynd 3). Í ríbósómum sem spanna þrjú lífsvið, brotnar rRNA saman í strúktúra þar sem flestir rRNA basar annað hvort parast saman og brotna saman eða hafa samskipti við ríbósómprótein38,39,40. Hins vegar, í ríbósómum í E. cuniculi, virðast rRNA brjóta gegn þessari brotreglu með því að breyta sumum af helixum sínum í óbrotin rRNA svæði.
Uppbygging H18 25S rRNA helix í S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi. Venjulega, í ríbósómum sem spanna þrjú lífsvið, vefjast þessi tengill saman í RNA helix sem inniheldur 24 til 34 leifar. Í Microsporidia, hins vegar, minnkar þessi rRNA tengill smám saman í tvo einþátta úridínríka tengla sem innihalda aðeins 12 leifar. Flestir þessara leifa eru útsettir fyrir leysiefnum. Myndin sýnir að sníkjudýra-microsporidia virðast brjóta gegn almennum meginreglum um rRNA fellingu, þar sem rRNA basar eru venjulega tengdir öðrum basum eða taka þátt í rRNA-prótein víxlverkunum. Í microsporidia taka sum rRNA brot á sig óhagstæða fellingu, þar sem fyrrverandi rRNA helix verður að einþátta bút sem lengist næstum í beinni línu. Tilvist þessara óvenjulegu svæða gerir microsporidia rRNA kleift að bindast fjarlægum rRNA brotum með því að nota lágmarksfjölda RNA basa.
Áberandi dæmi um þessa þróunarbreytingu má sjá í H18 25S rRNA helix (Mynd 3). Í tegundum frá E. coli til manna innihalda basar þessa rRNA helix 24-32 núkleótíð, sem mynda örlítið óreglulegan helix. Í áður greindum ríbósómbyggingum frá V. necatrix og P. locustae,31,32 eru basar H18 helix að hluta til ósnúnaðir, en núkleótíðbasapörun er varðveitt. Hins vegar, í E. cuniculi, verður þetta rRNA brot stystu tengipörin 228UUUUGU232 og 301UUUUUUUUUU307. Ólíkt dæmigerðum rRNA brotum snúast þessir úridínríku tengipör ekki saman eða komast í mikla snertingu við ríbósómprótein. Í staðinn taka þeir upp leysiefnaopnar og fullkomlega ósnúnar byggingar þar sem rRNA þræðirnir eru næstum beinir. Þessi teygða byggingu skýrir hvernig E. cuniculi notar aðeins 12 RNA basa til að fylla 33 Å bilið milli H16 og H18 rRNA helixanna, en aðrar tegundir þurfa að minnsta kosti tvöfalt fleiri rRNA basa til að fylla bilið.
Þannig getum við sýnt fram á að, með orkuóhagstæðri fellingu, hafa sníkjudýraörsporíur þróað aðferð til að draga saman jafnvel þá rRNA hluta sem eru enn að mestu varðveittir milli tegunda í þremur lífsviðum. Greinilega, með því að safna stökkbreytingum sem umbreyta rRNA helixum í stutta poly-U tengla, getur E. cuniculi myndað óvenjuleg rRNA brot sem innihalda eins fá núkleótíð og mögulegt er til límingar á fjarlægum rRNA brotum. Þetta hjálpar til við að útskýra hvernig örsporíur náðu dramatískri minnkun á grunn sameindabyggingu sinni án þess að missa byggingarlega og virkniheild sína.
Annar óvenjulegur eiginleiki E. cuniculi rRNA er útlit rRNA án þykknunar (Mynd 4). Bungur eru núkleótíð án basapara sem snúast út úr RNA helixinum í stað þess að fela sig í honum. Flestir rRNA útskot virka sem sameindalím, sem hjálpa til við að binda aðliggjandi ríbósómprótein eða önnur rRNA brot. Sumir bungurnar virka sem hjörur, sem gerir rRNA helixinum kleift að beygja sig og brjótast saman á besta mögulega hátt fyrir afkastamikla próteinmyndun 41.
a Útskot úr rRNA (S. cerevisiae númerun) er ekki til staðar í ríbósómbyggingu E. cuniculi, en er til staðar í flestum öðrum heilkjörnungum eins og E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi innri ríbósómum. Sníkjudýr skortir margar af hinum fornu, mjög varðveittu rRNA bungum. Þessar þykkingar koma ríbósómbyggingunni í jafnvægi; því bendir fjarvera þeirra í örsporídíum til minni stöðugleika rRNA fellingar í örsporídíasníkjudýrum. Samanburður við P-stilka (L7/L12 stilka í bakteríum) sýnir að tap á rRNA bólum fellur stundum saman við birtingu nýrra bóla við hliðina á týndu bólunum. H42-helixinn í 23S/28S rRNA hefur forna bungu (U1206 í Saccharomyces cerevisiae) sem er talin vera að minnsta kosti 3,5 milljarða ára gömul vegna verndar hennar á þremur sviðum lífsins. Í örsporídíum er þessi bunga horfin. Hins vegar birtist ný bunga við hliðina á þeirri týndu (A1306 í E. cuniculi).
Það er athyglisvert að við komumst að því að E. cuniculi ríbósóm skortir flestar þær rRNA bungur sem finnast í öðrum tegundum, þar á meðal meira en 30 bungur sem varðveittir eru í öðrum heilkjörnungum (Mynd 4a). Þetta tap útilokar margar snertingar milli ríbósómeininga og aðliggjandi rRNA helixa, sem stundum myndar stór holrými innan ríbósómsins, sem gerir E. cuniculi ríbósómið gegndræpara samanborið við hefðbundnari ríbósóm (Mynd 4b). Athyglisvert er að við komumst að því að flestar þessar bungur týndust einnig í áður greindum V. necatrix og P. locustae ríbósómbyggingum, sem fyrri byggingargreiningar höfðu ekki tekið eftir31,32.
Stundum fylgir tap á rRNA bungum myndun nýrra bunga við hliðina á þeirri týndu. Til dæmis inniheldur ríbósóm P-stofninn U1208 bungu (í Saccharomyces cerevisiae) sem lifði af frá E. coli til manna og er því talinn vera 3,5 milljarða ára gamall. Við próteinmyndun hjálpar þessi bunga P-stofninum að færa sig á milli opinna og lokaðra byggingar þannig að ríbósómið geti fengið til sín þýðingarþætti og flutt þá á virka staðinn. Í E. cuniculi ríbósómum er þessi þykknun ekki til staðar; hins vegar getur ný þykknun (G883) sem er aðeins staðsett í þremur basapörum stuðlað að því að endurheimta bestu mögulegu sveigjanleika P-stofnsins (Mynd 4c).
Gögn okkar um rRNA án útskota benda til þess að lágmörkun rRNA takmörkist ekki við tap á rRNA frumefnum á yfirborði ríbósómsins, heldur geti það einnig falið í sér kjarna ríbósómsins, sem skapar sníkjudýrasértækan sameindagalla sem hefur ekki verið lýst í frjálsum frumum. Lifandi tegundir hafa sést.
Eftir að hafa líkjað eftir hefðbundnum ríbósómpróteinum og rRNA komumst við að því að hefðbundnir ríbósómþættir geta ekki útskýrt þessa þrjá hluta frystingarmyndarinnar. Tvö af þessum brotum eru smáar sameindir að stærð (Mynd 5, Viðbótarmynd 8). Fyrsti hlutinn er á milli ríbósómpróteinanna uL15 og eL18 á stað sem venjulega er upptekinn af C-enda eL18, sem er styttur í E. cuniculi. Þó að við getum ekki ákvarðað hver sameindin er, þá er stærð og lögun þessarar þéttleikaeyju vel útskýrð með nærveru spermidínsameinda. Binding hennar við ríbósómið er stöðuguð með örsporídíu-sértækum stökkbreytingum í uL15 próteinunum (Asp51 og Arg56), sem virðast auka sækni ríbósómsins fyrir þessa litlu sameind, þar sem þær leyfa uL15 að vefja litlu sameindina inn í ríbósómbyggingu. Viðbótarmynd 2). 8, viðbótargögn 1, 2).
Kryo-EM myndgreining sýnir nærveru núkleótíða utan ríbósans sem eru bundin við ríbósómið í E. cuniculi. Í ríbósóminu í E. cuniculi er þetta núkleótíð á sama stað og 25S rRNA A3186 núkleótíðið (Saccharomyces cerevisiae númerun) í flestum öðrum heilkjörnunga ríbósómum. b Í ríbósómbyggingu E. cuniculi er þetta núkleótíð staðsett á milli ríbósómpróteinanna uL9 og eL20, sem stöðugar þannig tengslin milli próteinanna tveggja. cd Greining á varðveislu eL20 raðar meðal örsporidíutegunda. Þyrpingartré örsporidíutegunda (c) og margfeldi raðröðunar eL20 próteinsins (d) sýna að núkleótíðbindandi leifarnar F170 og K172 eru varðveittar í flestum dæmigerðum örsporidíutegundum, að undanskildum S. lophii, að undanskildum örsporidíu með snemmbúnum greinum, sem héldu ES39L rRNA framlengingunni. e Þessi mynd sýnir að núkleótíðbindandi leifarnar F170 og K172 eru aðeins til staðar í eL20 í mjög afoxuðu erfðamengi örsporídíu, en ekki í öðrum heilkjörnungum. Í heildina benda þessar upplýsingar til þess að ríbósóm örsporídíu hafi þróað núkleótíðbindandi stað sem virðist binda AMP sameindir og nota þær til að koma á stöðugleika prótein-prótein víxlverkunum í ríbósómbyggingu. Mikil varðveisla þessa bindandi staðar í örsporídíu og fjarvera hans í öðrum heilkjörnungum bendir til þess að þessi staður geti veitt örsporídíu sértækan lifunarforskot. Þannig virðist núkleótíðbindandi vasinn í ríbósómi örsporídíu ekki vera úrkynjað einkenni eða lokaform rRNA niðurbrots eins og áður hefur verið lýst, heldur gagnleg þróunarnýjung sem gerir ríbósómi örsporídíu kleift að binda beint litlar sameindir og nota þær sem byggingareiningar fyrir ríbósóm. Þessi uppgötvun gerir ríbósóm örsporídíu að eina ríbósóminu sem vitað er að notar eitt núkleótíð sem byggingareiningu sína. f Tilgáta um þróunarferil sem er dreginn af núkleótíðbindingu.
Seinni lágmólþungaþéttleikinn er staðsettur á tengifletinum milli ríbósómpróteina uL9 og eL30 (Mynd 5a). Þessum tengifleti hefur áður verið lýst í uppbyggingu Saccharomyces cerevisiae ríbósómsins sem bindingarstaður fyrir 25S núkleótíðið í rRNA A3186 (hluti af ES39L rRNA framlengingu)38. Það var sýnt fram á að í úrkynjuðum P. locustae ES39L ríbósómum bindur þetta tengifleti óþekkt stakt núkleótíð 31 og gert er ráð fyrir að þetta núkleótíð sé minnkað lokaform af rRNA, þar sem lengd rRNA er ~130-230 basar. ES39L er minnkað í eitt núkleótíð 32,43. Kryo-EM myndir okkar styðja þá hugmynd að hægt sé að útskýra þéttleika með núkleótíðum. Hins vegar sýndi hærri upplausn uppbyggingar okkar að þetta núkleótíð er utanríbósóma sameind, hugsanlega AMP (Mynd 5a, b).
Við spurðum síðan hvort núkleótíðbindingarstaðurinn birtist í ríbósóminu í E. cuniculi eða hvort hann væri til staðar áður. Þar sem núkleótíðbinding er aðallega miðluð af Phe170 og Lys172 leifunum í eL30 ríbósómpróteininu, mátum við varðveislu þessara leifa í 4396 dæmigerðum heilkjörnungum. Eins og í tilviki uL15 hér að ofan, komumst við að því að Phe170 og Lys172 leifarnar eru mjög varðveittar aðeins í dæmigerðum Microsporidia, en fjarverandi í öðrum heilkjörnungum, þar á meðal ódæmigerðum Microsporidia Mitosporidium og Amphiamblys, þar sem ES39L rRNA brotið er ekki afoxað 44, 45, 46 (Mynd 5c). -e).
Samanlagt styðja þessi gögn þá hugmynd að E. cuniculi og hugsanlega aðrar þekktar örsporíður hafi þróað með sér hæfileikann til að fanga mikið magn lítilla umbrotsefna í ríbósómbyggingu á skilvirkan hátt til að bæta upp fyrir lækkun á rRNA og próteinmagni. Með því að gera það hafa þeir þróað með sér einstaka hæfileika til að binda núkleótíð utan ríbósómsins, sem sýnir að sameindabyggingar sníkjudýra bæta upp fyrir þetta með því að fanga mikið magn lítilla umbrotsefna og nota þau sem byggingarlíkingar af niðurbrotnu RNA og próteinbrotum.
Þriðji óhermdi hluti kryo-EM kortsins okkar, sem finnst í stóru ríbósómeiningunni. Tiltölulega há upplausn (2,6 Å) kortsins bendir til þess að þessi þéttleiki tilheyri próteinum með einstaka samsetningu stórra hliðarkeðjuleifa, sem gerði okkur kleift að bera kennsl á þennan þéttleika sem áður óþekkt ríbósómprótein sem við greindum sem. Það var nefnt msL2 (Microsporidia-sértækt prótein L2) (aðferðir, mynd 6). Samsvörunarleit okkar sýndi að msL2 er varðveitt í Microsporidia klaða ættkvíslanna Encephaliter og Orosporidium, en fjarverandi í öðrum tegundum, þar á meðal öðrum Microsporidia. Í ríbósómbyggingunni er msL2 í skarði sem myndast við tap á framlengdu ES31L rRNA. Í þessu skarði hjálpar msL2 til við að stöðuga rRNA fellingu og getur bætt upp fyrir tap á ES31L (Mynd 6).
a Rafeindaþéttleiki og líkan af ríbósómpróteininu msL2, sem er sértækt fyrir Microsporidia og finnst í ríbósómum E. cuniculi. b Flest heilkjörnunga ríbósóm, þar á meðal 80S ríbósómið í Saccharomyces cerevisiae, hafa glatað ES19L rRNA mögnun í flestum Microsporidian tegundum. Áður staðfest uppbygging V. necatrix microsporidia ríbósómsins bendir til þess að tap á ES19L í þessum sníkjudýrum sé bætt upp með þróun nýja msL1 ríbósómpróteinsins. Í þessari rannsókn komumst við að því að E. cuniculi ríbósómið þróaði einnig viðbótar ríbósóm RNA hermiprótein sem augljósa uppbót fyrir tap á ES19L. Hins vegar hafa msL2 (sem nú er merkt sem hið tilgátulega ECU06_1135 prótein) og msL1 mismunandi byggingarlega og þróunarlega uppruna. c Þessi uppgötvun á myndun þróunarlega óskyldra msL1 og msL2 ríbósómpróteina bendir til þess að ef ríbósóm safna skaðlegum stökkbreytingum í rRNA sínu, geti þau náð fordæmalausum fjölbreytileika í samsetningu jafnvel í litlum undirhópi náskyldra tegunda. Þessi uppgötvun gæti hjálpað til við að skýra uppruna og þróun mítókondríu ríbósómsins, sem er þekkt fyrir mjög minnkað rRNA og óeðlilega breytileika í próteinsamsetningu milli tegunda.
Við bárum síðan msL2 próteinið saman við msL1 próteinið sem áður hefur verið lýst, eina þekkta ríbósómpróteinið sem er sértækt fyrir örsporíur og finnst í ríbósóminu V. necatrix. Við vildum prófa hvort msL1 og msL2 væru þróunarlega skyld. Greining okkar sýndi að msL1 og msL2 eru í sama holrými í ríbósómbyggingunni, en hafa mismunandi frum- og þrívíddarbyggingu, sem bendir til óháðs þróunarfræðilegs uppruna þeirra (Mynd 6). Þannig veitir uppgötvun okkar á msL2 vísbendingar um að hópar af þéttum heilkjörnungategundum geta sjálfstætt þróað byggingarlega aðgreind ríbósómprótein til að bæta upp fyrir tap á rRNA brotum. Þessi niðurstaða er athyglisverð þar sem flest heilkjörnunga ríbósóm í umfrymi innihalda óbreytanlegt prótein, þar á meðal sömu fjölskyldu 81 ríbósómpróteina. Tilkoma msL1 og msL2 í ýmsum klöðum örsporída sem svar við tapi á framlengdum rRNA brotum bendir til þess að niðurbrot sameindabyggingar sníkjudýrsins valdi því að sníkjudýr leita að uppbótarstökkbreytingum, sem geta að lokum leitt til þess að þau myndist í mismunandi sníkjudýrastofnum.
Að lokum, þegar líkanið okkar var tilbúið, bárum við saman samsetningu ríbósómsins í E. cuniculi við þá sem spáð var út frá erfðamengisröðinni. Áður var talið að nokkur ríbósómprótein, þar á meðal eL14, eL38, eL41 og eS30, væru ekki til í erfðamengi E. cuniculi vegna þess að samsvarandi prótein virtust ekki vera til staðar í erfðamengi E. cuniculi. Tap margra ríbósómpróteina er einnig spáð í flestum öðrum mjög afoxuðum innanfrumu sníkjudýrum og innri samlífisfrumum. Til dæmis, þó að flestar frjálslifandi bakteríur innihaldi sömu fjölskyldu 54 ríbósómpróteina, þá hafa aðeins 11 af þessum próteinfjölskyldum greinanlega samsvarandi próteina í hverju greindu erfðamengi hýsiltakmarkaðra baktería. Til stuðnings þessari hugmynd hefur tap á ríbósómpróteinum sést tilraunakennt í V. necatrix og P. locustae örsporídíum, sem skortir eL38 og eL4131,32 próteinin.
Hins vegar sýna uppbygging okkar að aðeins eL38, eL41 og eS30 hafa í raun tapast í ríbósóminu í E. cuniculi. Próteinið eL14 varðveittist og uppbygging okkar sýndi hvers vegna þetta prótein fannst ekki í samsvörunarleitinni (Mynd 7). Í ríbósómum í E. cuniculi tapast megnið af bindingarstað eL14 vegna niðurbrots á rRNA-magnaða ES39L. Í fjarveru ES39L missti eL14 megnið af annars stigs uppbyggingu sinni og aðeins 18% af eL14 röðinni var eins í E. cuniculi og S. cerevisiae. Þessi lélega varðveisla raðarinnar er merkileg því jafnvel Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens — lífverur sem þróuðust með 1,5 milljarða ára millibili — deila meira en 51% af sömu leifum í eL14. Þetta óeðlilega tap á varðveislu skýrir hvers vegna E. cuniculi eL14 er nú skilgreint sem hugsanlegt M970_061160 prótein en ekki sem eL1427 ríbósómpróteinið.
og Microsporidia ríbósómið missti ES39L rRNA framlengingu, sem að hluta til útilokaði bindingarstað eL14 ríbósómpróteinsins. Í fjarveru ES39L tapast annars stigs uppbygging eL14 örgrópróteinsins, þar sem fyrrverandi rRNA-bindandi α-helix hrörnar í lágmarkslengdarlykkju. b Margfeldi raðröðunarröðun sýnir að eL14 próteinið er mjög varðveitt í heilkjörnungategundum (57% raðgreining milli ger- og mannalíkinda), en illa varðveitt og frábrugðið í örgrópróteinum (þar sem ekki meira en 24% af leifum eru eins og eL14 líkindin). frá S. cerevisiae eða H. sapiens). Þessi lélega raðgreining og breytileiki í annars stigs uppbyggingu skýrir hvers vegna eL14 líkindin hefur aldrei fundist í E. cuniculi og hvers vegna talið er að þetta prótein hafi glatast í E. cuniculi. Aftur á móti var E. cuniculi eL14 áður merkt sem hugsanlegt M970_061160 prótein. Þessi athugun bendir til þess að fjölbreytileiki erfðamengis örsporídía sé ofmetinn um þessar mundir: sum gen sem nú eru talin glatast í örsporídíum eru í raun varðveitt, þótt í mjög aðgreindum myndum; í staðinn er talið að sum kóði fyrir örsporídíugenum fyrir ormasértæk prótein (t.d. hið tilgátulega prótein M970_061160) kóðar í raun fyrir mjög fjölbreyttu próteinin sem finnast í öðrum heilkjörnungum.
Þessi niðurstaða bendir til þess að afnáttúrun rRNA geti leitt til mikils taps á varðveislu raðar í aðliggjandi ríbósómpróteinum, sem gerir þessi prótein ógreinanleg við samsvörunarleit. Þannig gætum við ofmetið raunverulegt stig sameindaniðurbrots í litlum erfðamengislífverum, þar sem sum prótein sem talið er að hafi glatast eru enn til staðar, þótt í mjög breyttri mynd sé.
Hvernig geta sníkjudýr viðhaldið virkni sameindavéla sinna við aðstæður þar sem erfðamengið minnkar verulega? Rannsókn okkar svarar þessari spurningu með því að lýsa flókinni sameindabyggingu (ríbósómi) E. cuniculi, lífveru með eitt minnsta erfðamengi heilkjörnunga.
Það hefur verið vitað í næstum tvo áratugi að prótein- og RNA-sameindir í örverusníkjudýrum eru oft frábrugðnar samsvarandi sameindum sínum í frjálsum lífverum vegna þess að þær skortir gæðastjórnunarstöðvar, eru minnkaðar niður í 50% af stærð sinni í frjálsum örverum o.s.frv. - margar lamandi stökkbreytingar sem skerða fellingu og virkni. Til dæmis er búist við að ríbósóm lítilla erfðamengislífvera, þar á meðal margra innanfrumusníkjudýra og innri samlífisfrumna, skorti nokkur ríbósómprótein og allt að þriðjung af rRNA núkleótíðum samanborið við frjálsar tegundir 27, 29, 30, 49. Hins vegar er virkni þessara sameinda í sníkjudýrum enn að mestu leyti ráðgáta, aðallega rannsökuð með samanburðarerfðafræði.
Rannsókn okkar sýnir að uppbygging stórsameinda getur leitt í ljós marga þætti þróunar sem erfitt er að draga fram úr hefðbundnum samanburðarrannsóknum á erfðamengjum innanfrumusníkjudýra og annarra lífvera sem eru hýsiltakmarkaðar (viðbótarmynd 7). Til dæmis sýnir dæmið um eL14 próteinið að við getum ofmetið raunverulegt niðurbrot sameindakerfisins í sníkjudýrategundum. Talið er nú að heilasníkjudýr hafi hundruð af örsporídíusértækum genum. Niðurstöður okkar sýna þó að sum þessara sýnilega sértæku gena eru í raun bara mjög ólík afbrigði af genum sem eru algeng í öðrum heilkjörnungum. Ennfremur sýnir dæmið um msL2 próteinið hvernig við horfum fram hjá nýjum ríbósómpróteinum og vanmetum innihald sníkjudýrasameindavéla. Dæmið um litlar sameindir sýnir hvernig við getum horft fram hjá snjallustu nýjungum í sameindabyggingu sníkjudýra sem geta gefið þeim nýja líffræðilega virkni.
Samanlagt bæta þessar niðurstöður skilning okkar á muninum á sameindabyggingu lífvera sem eru takmörkuð við hýsil og hliðstæðum þeirra í frjálsum lífverum. Við sýnum fram á að sameindavélar, sem lengi hefur verið taldar vera afoxaðar, úrkynjaðar og háðar ýmsum lamandi stökkbreytingum, hafa í staðinn safn af kerfisbundið gleymdum óvenjulegum byggingareiginleikum.
Hins vegar benda lítt fyrirferðarmiklar rRNA bútarnir og samruna bútarnir sem við fundum í ríbósómum E. cuniculi til þess að erfðamengisminnkun geti breytt jafnvel þeim hlutum grunnsameindavélarinnar sem eru varðveittir í þremur sviðum lífsins – eftir næstum 3,5 milljarða ára óháða þróun tegunda.
Bungulausu og samrunaðu rRNA brotin í E. cuniculi ríbósómum eru sérstaklega áhugaverð í ljósi fyrri rannsókna á RNA sameindum í innri samlífisbakteríum. Til dæmis, í blaðlúsinni Buchnera aphidicola, hefur verið sýnt fram á að rRNA og tRNA sameindir hafa hitanæmar uppbyggingar vegna A+T samsetningarskekkju og mikils hlutfalls af óhefðbundnum basapörum20,50. Þessar breytingar á RNA, sem og breytingar á próteinsameindum, eru nú taldar vera ábyrgar fyrir of mikilli háðni innri samlífisbaktería á maka og vanhæfni innri samlífisbaktería til að flytja hita21, 23. Þó að rRNA í sníkjudýrum örsporídía hafi byggingarlega ólíkar breytingar, bendir eðli þessara breytinga til þess að minnkað hitastöðugleiki og meiri háð fylgipróteinum geti verið algeng einkenni RNA sameinda í lífverum með minnkað erfðamengi.
Hins vegar sýna uppbygging okkar að örsporíur sníkjudýra hafa þróað einstaka hæfileika til að standast víðtækt varðveitt rRNA og próteinbrot, og þróað hæfileikann til að nota mikið og auðfáanleg lítil umbrotsefni sem byggingarlíkingar af úrkynjaðum rRNA og próteinbrotum. Niðurbrot sameindabyggingar. Þessi skoðun er studd af þeirri staðreynd að litlar sameindir sem bæta upp fyrir tap á próteinbrotum í rRNA og ríbósómum E. cuniculi bindast örsporíum-sértækum leifum í uL15 og eL30 próteinum. Þetta bendir til þess að binding lítilla sameinda við ríbósóm geti verið afurð jákvæðs vals, þar sem örsporíum-sértækar stökkbreytingar í ríbósómpróteinum hafa verið valdar fyrir getu sína til að auka sækni ríbósóma fyrir litlar sameindir, sem getur leitt til skilvirkari ríbósómlífvera. Uppgötvunin leiðir í ljós snjalla nýjung í sameindabyggingu örverusníkjudýra og gefur okkur betri skilning á því hvernig sameindabyggingar sníkjudýra viðhalda virkni sinni þrátt fyrir afoxunarþróun.
Eins og er er enn óljóst hvernig þessar litlu sameindir eru greindar. Það er ekki ljóst hvers vegna útlit þessara litlu sameinda í ríbósómbyggingu er mismunandi eftir tegundum örspora. Einkum er ekki ljóst hvers vegna núkleótíðbinding sést í ríbósómum E. cuniculi og P. locustae, en ekki í ríbósómum V. necatrix, þrátt fyrir nærveru F170 leifarinnar í eL20 og K172 próteinum V. necatrix. Þessi eyðing gæti stafað af leif 43 uL6 (staðsett við hliðina á núkleótíðbindingarvasanum), sem er týrósín í V. necatrix en ekki þreónín í E. cuniculi og P. locustae. Fyrirferðarmikil arómatísk hliðarkeðja Tyr43 getur truflað núkleótíðbindingu vegna sterískrar skörunar. Einnig gæti augljós núkleótíðeyðing stafað af lágri upplausn frystingar-EM myndgreiningar, sem hindrar líkanagerð V. necatrix ríbósómbrota.
Hins vegar bendir vinna okkar til þess að erfðamengisrýrnunin geti verið hugmyndaríkur kraftur. Einkum bendir uppbygging ríbósómsins í E. cuniculi til þess að tap á rRNA og próteinbrotum í ríbósóminu microsporidia skapi þróunarþrýsting sem stuðlar að breytingum á uppbyggingu ríbósóma. Þessi afbrigði koma fyrir langt frá virka svæðinu í ríbósóminu og virðast hjálpa til við að viðhalda (eða endurheimta) bestu mögulegu samsetningu ríbósóma sem annars myndi raskast af minnkuðu rRNA. Þetta bendir til þess að mikilvæg nýjung í ríbósóminu í microsporidia virðist hafa þróast í þörf fyrir að stuðla að genadrift.
Þetta sést kannski best með núkleótíðbindingu, sem hefur aldrei sést í öðrum lífverum hingað til. Sú staðreynd að núkleótíðbindandi leifar eru til staðar í dæmigerðum örsporídíum, en ekki í öðrum heilkjörnungum, bendir til þess að núkleótíðbindandi staðir séu ekki bara leifar sem bíða eftir að hverfa, eða lokastaðurinn fyrir rRNA til að endurheimta formi einstakra núkleótíða. Þess í stað virðist þessi staður vera gagnlegur eiginleiki sem gæti hafa þróast í gegnum nokkrar umferðir af jákvæðu vali. Núkleótíðbindandi staðir geta verið aukaafurð náttúruvals: þegar ES39L er brotið niður eru örsporídíur neyddar til að leita bóta til að endurheimta bestu mögulegu ríbósómmyndun í fjarveru ES39L. Þar sem þetta núkleótíð getur hermt eftir sameindatengingum A3186 núkleótíðsins í ES39L, verður núkleótíðsameindin byggingareining ríbósómsins, en binding þess batnar enn frekar með stökkbreytingu á eL30 röðinni.
Hvað varðar sameindaþróun innanfrumusníkjudýra sýnir rannsókn okkar að kraftar Darwinsískrar náttúruvals og erfðafræðilegs reks erfðamengisrýrnunar virka ekki samsíða heldur sveiflast. Í fyrsta lagi útrýmir erfðafræðilegur rekur mikilvæga eiginleika lífsameinda, sem gerir það sárlega nauðsynlegt að bæta upp fyrir þá. Aðeins þegar sníkjudýr uppfylla þessa þörf með Darwinsísku náttúruvali munu stórsameindir þeirra fá tækifæri til að þróa með sér áhrifamestu og nýstárlegustu eiginleika sína. Mikilvægt er að þróun núkleótíðbindisstaða í ríbósóminu E. cuniculi bendir til þess að þetta tap-til-vinningsmynstur sameindaþróunar ekki aðeins afskrifi skaðlegar stökkbreytingar, heldur veiti stundum sníkjudýra-stórsameindum alveg nýja virkni.
Þessi hugmynd er í samræmi við jafnvægiskenningu Sewell Wright, sem segir að strangt kerfi náttúruvals takmarki getu lífvera til nýsköpunar51,52,53. Hins vegar, ef erfðafræðilegur rekstrarbreyting truflar náttúruval, geta þessir rekstrarbreytingar valdið breytingum sem í sjálfu sér eru ekki aðlögunarhæfar (eða jafnvel skaðlegar) heldur leiða til frekari breytinga sem veita meiri hæfni eða nýja líffræðilega virkni. Rammi okkar styður þessa hugmynd með því að sýna fram á að sama tegund stökkbreytinga sem dregur úr fellingu og virkni lífsameinda virðist vera aðalhvataurinn að umbótum hennar. Í samræmi við þróunarlíkanið sem allir vinna, sýnir rannsókn okkar að erfðamengisrýrnun, sem hefðbundið er litið á sem hrörnunarferli, er einnig mikilvægur drifkraftur nýsköpunar, sem stundum og jafnvel oft gerir stórsameindum kleift að öðlast nýja sníkjudýravirkni.