Næringarefnaöflun og dreifing samþættir fæðuöflun skordýra og lífsferilseiginleika. Til að bæta upp fyrir skort á tilteknum næringarefnum á mismunandi lífsstigum geta skordýr fengið þessi næringarefni með viðbótarfóðrun, til dæmis með því að nærast á seytingu hryggdýra í ferli sem kallast pollar. Mýflugan Anopheles arabiani virðist vera vannærð og þarfnast því næringarefna bæði fyrir efnaskipti og æxlun. Markmið þessarar rannsóknar var að meta hvort hræring An. arabiensis á kúþvagi til næringarefnaöflunar bæti lífsferilseiginleika.
Gakktu úr skugga um að það sé öruggt. arabiensis laðaðist að lyktinni af fersku, 24 klukkustunda, 72 klukkustunda og 168 klukkustunda gömlu kúþvagi, og hýsilleitandi og blóðfóðraðar (48 klukkustundum eftir blóðmáltíð) kvenkyns moskítóflugur voru mældar í Y-rörs lyktarmæli og þungaðar kvenkyns moskítóflugur voru metnar fyrir hrygningarpróf. Sameinuð efna- og rafgreining var síðan notuð til að bera kennsl á lífvirk efni í kúþvagi í öllum fjórum aldursflokkum. Tilbúnar blöndur af lífvirkum efnasamböndum voru metnar í Y-rörs og vettvangstilraunum. Til að rannsaka kúþvag og helsta köfnunarefnisinnihaldandi efnasamband þess, þvagefni, sem hugsanlegt viðbótarfæði fyrir malaríuvektora voru fóðrunarbreytur og lífsferilseiginleikar mæld. Hlutfall kvenkyns moskítóflugna og magn kúþvags og þvagefnis sem frásogast var metið. Eftir fóðrun voru kvenkyns moskítóflugur metnar fyrir lifun, bundið flug og æxlun.
Leitaðu að blóði og næringu hýsilsins. Í rannsóknarstofu- og vettvangsrannsóknum laðast Arabar að náttúrulegum og tilbúnum ilm af fersku og öldruðu kúþvagi. Óléttar kvendýr voru áhugalausar um svörun kúþvags á hrygningarstöðum. Kvendýr sem leita að hýsil og sjúga blóð taka virkan upp kúþvag og þvagefni og úthluta þessum auðlindum í samræmi við lífsferilsviðskipti sem fall af lífeðlisfræðilegu ástandi fyrir flug, lifun eða æxlun.
Öflun og dreifing kúaþvags af tegundinni Anopheles arabinis til að bæta lífsferilseinkenni. Viðbótarfóðrun kúaþvags hefur bein áhrif á getu smitbera með því að auka daglega lifun og þéttleika smitbera, og óbeint með því að breyta flugvirkni og ætti því að íhuga þetta í framtíðarlíkönum.
Næringarefnaöflun og dreifing samþættir fæðuleit skordýra og lífsferilseinkenni [1,2,3]. Skordýr geta valið og aflað sér fæðu og framkvæmt bætur fyrir fæðuna út frá fæðuframboði og næringarefnaþörf [1, 3]. Dreifing næringarefna fer eftir lífsferilsferlinu og getur leitt til mismunandi krafna um gæði og magn fæðu á mismunandi lífsstigum skordýra [1, 2]. Til að bæta upp fyrir skort á tilteknum næringarefnum geta skordýr fengið þessi næringarefni með viðbótarfóðrun, svo sem á leðju, ýmsum saur og seytingu hryggdýra og hræjum, ferli sem kallast pollar [2]. Þó að fjölbreytni fiðrilda- og mölflugnategunda sé aðallega lýst, eru einnig vatnsgöt í öðrum skordýraættbálkum, og aðdráttarafl að og næring á þessum tegundum auðlinda getur haft veruleg áhrif á heilsu og aðra lífsferilseiginleika [2, 4, 5, 6], 7]. Malaríuflugan Anopheles gambiae sensu lato (sl) kemur fram sem „vannæringarfullorðin“ fullorðin [8], þannig að vökvun getur gegnt mikilvægu hlutverki í lífsferilseinkennum hennar, en þessi hegðun hefur hingað til verið vanrækt. Notkun hristingar sem leið til að auka næringarefnainntöku í þessu mikilvæga farartæki krefst athygli þar sem þetta getur haft mikilvægar faraldsfræðilegar afleiðingar.
Köfnunarefnisneysla fullorðinna kvenkyns Anopheles moskítóflugna er takmörkuð vegna lágs kaloríuforða sem berast frá lirfustigi og óhagkvæmrar nýtingar á blóðmjöli [9]. Kvenkyns Ann.gambiae sl bætir venjulega upp fyrir þetta með því að bæta við blóðmjöli [10, 11], sem setur fleiri í hættu á að smitast af sjúkdómnum og moskítóflugur í meiri hættu á að vera rándýrar. Einnig geta moskítóflugur notað viðbótarfóðrun hryggdýraskít til að afla köfnunarefnissambanda sem auka aðlögun og flughæfni, eins og önnur skordýr hafa sýnt fram á [2]. Í þessu sambandi er sterk og greinileg aðdráttarafl einnar af systkinategundunum innan An. Gambíska sl tegundaflókið, Anopheles arabinis, ferskt og gamalt kúþvag [12,13,14], áhugavert. Anopheles arabinis er tækifærissinnað í hýsilkjörum sínum og er þekkt fyrir að umgangast og nærast á nautgripum. Kúþvag er auðlind rík af köfnunarefnissambandum, þar sem þvagefni nemur 50-95% af heildar köfnunarefni í fersku þvagi [15, 16]. Eins og Með aldri kúþvags nýta örverur þessar auðlindir til að draga úr flækjustigi köfnunarefnissambanda innan sólarhrings [15]. Með hraðri aukningu ammóníaks, sem tengist lækkun lífræns köfnunarefnis, dafna alkalófíkar örverur (margar hverjar framleiða efnasambönd sem eru eitruð fyrir moskítóflugur) [15], sem geta verið kvenkyns Ann. arabiensis sem laðast helst að þvagi sem er eldra en 24 klukkustundir [13, 14].
Í þessari rannsókn var leitað að moskítóflugum frá hýsli og blóðfóðruðum moskítóflugum. Á fyrsta gonadotropin hringrás sinni var moskítóflugan arabiensis metin til að afla köfnunarefnissambanda, þar á meðal þvagefnis, með þvagblöndun. Næst var gerð röð tilrauna til að meta hvernig kvenkyns moskítóflugur ráðstafa þessari mögulegu næringarefnaauðlind til að bæta lifun, æxlun og frekari fæðuöflun. Að lokum var lykt af fersku og þroskuðu kúaþvagi metin til að ákvarða hvort þetta veitti áreiðanlegar vísbendingar um moskítóflugur frá hýsli og blóðfóðruðum moskítóflugum. Í leit sinni að þessari mögulegu næringarefnaauðlind uppgötvaði moskítófluga arabiensis efnafræðileg tengsl á bak við mismunandi aðdráttarafl. Tilbúnar lyktarblöndur af rokgjörnum lífrænum efnasamböndum (VOC) sem greind voru í 24 klukkustunda þroskuðu þvagi voru frekar metnar við vettvangsaðstæður, sem útvíkkaði niðurstöðurnar sem fengust við rannsóknarstofuaðstæður og sýndi fram á áhrif lyktar af nautgripaþvagi á mismunandi lífeðlisfræðileg ástand. Aðdráttarafl moskítóflugna. Niðurstöðurnar staðfesta að moskítófluga An. arabiensis afla sér og dreifir köfnunarefnissambanda sem finnast í þvagi hryggdýra til að hafa áhrif á lífsferilseinkenni. Þessar niðurstöður eru ræddar í samhengi við hugsanlegar faraldsfræðilegar afleiðingar og hvernig hægt er að nota þær til eftirlits og eftirlits með vektorum.
Anopheles arabicans (Dongola stofn) var haldið við 25 ± 2°C, 65 ± 5% RH og 12:12 klst. ljós:myrkur hringrás. Lirfurnar voru alin upp í plastbökkum (20 cm × 18 cm × 7 cm) fylltum með eimuðu vatni og fóðraðar með Tetramin® fiskifóður (Tetra Werke, Melle, Þýskalandi). Púpur voru safnaðar í 30 ml bollum (Nolato Hertila, Åstorp, Sjálandi) og síðan fluttar í Bugdorm búr (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taívan) til að leyfa fullorðnum dýrum að koma upp. Fullorðnum dýrum var gefin 10% súkrósalausn að vild þar til 4 dögum eftir uppkomu (dpe), en þá var hýsilleitandi kvendýrum boðið upp á fóður rétt fyrir tilraunina, eða þau voru svelt yfir nótt með eimuðu vatni fyrir tilraunina, eins og lýst er hér að neðan. Kvendýr sem notuð voru í tilraunum með flugrör voru aðeins svelt í 4-6 klukkustundir. með vatni að vild. Til að undirbúa blóðsugandi moskítóflugur fyrir síðari lífprófanir var 4 dpe kvenkyns moskítóflugum gefið afstrengjandi sauðablóð (Håtunalab, Bro, SE) með himnufóðrunarkerfi (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Bretlandi). Fullþrönguðum kvenkyns moskítóflugum var síðan flutt í einstök búr og þeim gefið fóður beint, eins og lýst er hér að neðan, eða 10% súkrósa að vild í 3 daga fyrir tilraunirnar sem lýst er hér að neðan. Síðarnefndu kvenkyns moskítóflugurnar voru notaðar fyrir lífprófanir í flugröri og fluttar á rannsóknarstofuna og fengu síðan eimað vatn að vild í 4-6 klukkustundir fyrir tilraunina.
Fóðrunarpróf voru notuð til að magngreina þvag- og þvagefnisneyslu hjá fullorðnum arabískum kvenkyns ... rakastig. Þessar tilraunir voru endurteknar 5 til 10 sinnum. Eftir að moskítóflugurnar höfðu fengið fæði voru þær settar í -20°C þar til frekari greiningar voru gerðar.
Leitið að nautgripaþvagi og þvagefni sem hýsillinn og blóðsugandi kvenkyns moskítófluga (Anopheles arabianus) taka upp. Í fóðrunartilraun (A) fengu kvenkyns moskítóflugur fæði sem samanstóð af fersku og þroskuðu kúþvagi, mismunandi styrk þvagefnis, súkrósa (10%) og eimuðu vatni (H2O). Hýsilleitandi kvenkyns moskítóflugur (B) og blóðfóðraðar kvenkyns moskítóflugur (C) tóku upp meiri súkrósa en nokkurt annað fæði sem prófað var. Athugið að hýsilleitandi kvenkyns moskítóflugur tóku upp 72 klukkustunda kúþvag minna en 168 klukkustunda kúþvag (B). Meðal heildar köfnunarefnisinnihald (± staðalfrávik) þvags er sýnt í innskotsmyndinni. Hýsilleitandi kvenkyns moskítóflugur (D, F) og blóðsugandi kvenkyns moskítóflugur (E, G) taka upp þvagefni á skammtaháðan hátt. Meðal innöndunarmagn (D, E) með mismunandi bókstafanöfnum var marktækt frábrugðið hvert öðru (einhliða ANOVA með Tukey's post hoc greiningu; p < 0,05). Villustikur tákna staðalvillu meðaltalsins (BE). Bein strikalína táknar lógaritmalínu (F, G)
Til að losa frásogaða fæðu voru moskítóflugurnar settar hverja fyrir sig í 1,5 ml örskiljunarrör sem innihéldu 230 µl af eimuðu vatni og vefurinn var sundurrofinn með einnota pestli og þráðlausum mótor (VWR International, Lund, SE), og síðan skilvindaður við 10 krpm í 10 mínútur. Ofanvökvinn (200 µl) var fluttur í 96 hols örplötu (Sigma-Aldrich) og gleypni (λ620) var ákvörðuð með litrófsmæli (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Einnig voru moskítóflugurnar malaðar í 1 ml af eimuðu vatni, 900 µl af því voru fluttir í kúvettu til litrófsgreiningar (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Til að magngreina fæðuinntöku var staðalkúrfa búin til með raðþynningu til að gefa 0,2 µl til 2,4 µl af 1 mg ml-1 xýleni. Sýaníð. Síðan var ljósþéttleiki þekktra litarefnastyrkja notaður til að ákvarða magn fæðu sem hver moskítófluga innbyrti.
Rúmmálsgögn voru greind með einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) og síðan parasamanburði Tukey eftir á (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, Bandaríkin, 1989–2007). Línulegar aðhvarfsgreiningar lýstu styrkháðri þvagefnisinntöku og báru saman svörun milli hýsilleitandi og blóðsjúgandi moskítóflugna (GraphPad Prism v8.0.0 fyrir Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, Bandaríkin).
Um það bil 20 µl af þvagsýnum frá hverjum aldurshópi voru bundin á Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 möskvi, Sigma Aldrich) og sett í blikkhylki (8 mm × 5 mm). Hylki voru sett í brunahólf CHNS/O greiningartækis (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkin) til að ákvarða köfnunarefnisinnihald í fersku og þroskuðu þvagi samkvæmt verklagsreglum framleiðanda. Heildarköfnunarefni (g N l-1) var magngreint út frá þekktum þvagefnisþéttni sem notaður var sem staðall.
Til að meta áhrif mataræðis á lifun kvenkyns moskítóflugna sem leituðu að hýsil og sögðu blóð, voru moskítóflugur settar hver fyrir sig í stórar Petri-skálar (12 cm í þvermál og 6 cm á hæð; Semadeni) með möskvaþöktu gati í lokinu (3 cm í þvermál) til loftræstingar og fæðuöflunar. Fóður var gefið strax eftir 4 daga dagsetningu og innihélt 1% þynnt ferskt og þroskað kúþvag, fjórar styrkleikar af þvagefni og tvær samanburðarhópar, 10% súkrósi og vatn. Hvert fóður var pípettað á tanntampón (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) sem var sett í 5 ml sprautu (Thermo Fisher Scientific, Gautaborg, SE), stimpillinn fjarlægður og settur ofan á Petri-skál (mynd 1).1A). Breyttu mataræði þínu á hverjum degi. Haltu rannsóknarstofunni eins og lýst er hér að ofan. Eftirlifandi moskítóflugur voru taldar tvisvar á dag, en dauðar moskítóflugur voru fargaðar þar til síðasta moskítóflugan dó (n = 40 í hverri meðferð). Lifun moskítóflugna sem fengu mismunandi fóður var tölfræðilega greind með Kaplan-Meyer lifunarferlum og log-rank prófum. til að bera saman lifunardreifingu milli mataræðis (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Sérsniðin flugmýflugvél byggð á Attisano o.fl.[17], gerð úr 5 mm þykkum glærum akrýlplötum (10 cm breiðum x 10 cm löngum x 10 cm háum) án fram- og afturplata (Mynd 3: efst). Snúningsbúnaður með lóðréttu röri úr gasgreiningarsúlu (0,25 mm innra þvermál; 7,5 cm langur) með endum límdum við skordýranál sem hangir á milli tveggja neodymium segla með 9 cm millibili. Lárétt rör úr sama efni (6,5 cm langur) skar lóðrétta rörið í tvennt til að mynda bundinn arm og arm sem bar lítinn álpappírsbút sem ljósrofsmerki.
Kvenkyns moskítóflugur, sem höfðu verið sveltar í 24 klukkustundir, fengu ofangreint mataræði í 30 mínútur áður en þær voru festar. Fullfóðraðar kvenkyns moskítóflugur voru síðan svæfðar hver fyrir sig á ís í 2-3 mínútur og festar við skordýrapinna með bývaxi (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) og síðan bundnar við arma láréttu röranna. Fljúgandi mylla. Snúningar á flugi voru skráðir með sérsmíðuðum gagnaskráningarbúnaði, síðan geymdir og birtir með PC-Lab 2000™ hugbúnaði (útg. 4.01; Velleman, Gavere, BE). Flugmyllan var sett í loftslagsstýrt herbergi (12 klst.:12 klst., ljós:myrkur, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Til að sjá mynstur flugvirkni var heildarfjarlægð flogin (m) og heildarfjöldi samfelldra flugvirkni reiknuð út á klukkustund yfir 24 klukkustunda tímabil. Að auki voru meðalfjarlægðir sem einstakar konur flugu bornar saman milli meðferða og greindar með einhliða ANOVA og Tukey's post hoc greiningu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), þar sem meðalfjarlægð var talin háð breyta, en meðferð er óháður þáttur. Að auki er meðalfjöldi skota reiknaður út í 10 mínútna skrefum.
Til að meta áhrif fæðis á æxlunargetu An.arabiensis voru sex hrygnur (4 dpe) fluttar beint í Bugdorm búr (30 cm × 30 cm × 30 cm) eftir blóðsöfnun og síðan gefin tilraunafóður í 48 klst. eins og lýst er hér að ofan. Fóður var síðan fjarlægt og hrygningarbikarar (30 ml; Nolato Hertila) fylltir með 20 ml af eimuðu vatni voru gefnir á þriðja degi í 48 klst., skipt út á 24 klst. fresti. Endurtakið hvert fóður 20-50 sinnum. Egg voru talin og skráð fyrir hvert tilraunabúr. Undirsýni af eggjum voru notuð til að meta meðalstærð og lengdarbreytileika einstakra eggja (n ≥ 200 á fóður) með því að nota Dialux-20 smásjá (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Þýskalandi) búin Leica myndavél (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Þýskalandi). Eftirstandandi egg voru geymd í loftslagsstýrðu herbergi við stöðluð eldisskilyrði í 24 klst. og úrtak af nýlega uppkomnum lirfum af fyrsta stigi (n ≥ 200 á fóður) var mælt, eins og lýst er hér að ofan. Fjöldi eggja og stærð eggja og lirfa var borinn saman milli meðferða og með einstefnu ANOVA og Tukey's post hoc greiningu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Rokgjarn efni í höfðrými úr fersku (1 klst. eftir sýnatöku), 24 klst., 72 klst. og 168 klst. gömlu þvagi voru safnað úr sýnum sem tekin voru úr Zebu nautgripum, Arsi kynþáttum. Til þæginda voru þvagsýni tekin snemma morguns meðan kýrnar voru enn í fjósinu. Þvagsýni voru tekin úr 10 einstaklingum og 100-200 ml af hverju sýni voru flutt í einstaka pólýamíð bökunarpoka (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Þýskalandi) í 3 lítra pólýamíð með loki í vínýlklóríð plasttunnum. Rokgjarn efni í höfðrými úr hverju nautgripaþvagi voru tekin annað hvort beint (ferskt) eða eftir þroska við stofuhita í 24 klst., 72 klst. og 168 klst., þ.e. hvert þvagsýni var dæmigert fyrir hvern aldurshóp.
Til að safna flóknum efnum í aðalsúlunni var lokað kerfi notað til að láta virkt kolefnissíað gas (100 ml mín-1) streyma í gegnum pólýamíðpoka að adsorpsjónsdælunni í 2,5 klst. með því að nota lofttæmisdælu (KNF Neuberger, Freiburg, Þýskalandi). Sem samanburðaraðferð var söfnun í aðalsúlunni framkvæmd úr tómum pólýamíðpoka. Adsorpsjónsdálkurinn var úr Teflon-rörum (5,5 cm x 3 mm í þvermál) sem innihélt 35 mg af Porapak Q (50/80 möskva; Waters Associates, Milford, MA, Bandaríkin) á milli glerullartappa. Fyrir notkun var dálkurinn skolaður með 1 ml af endureimuðu n-hexani (Merck, Darmstadt, Þýskalandi) og 1 ml af pentani (99,0% hreint leysiefni GC-gæði, Sigma Aldrich). Adsorberuðu flóknu efnin voru skoluð út með 400 μl af pentani. Aðsoguðu efnin voru sett saman og síðan geymd við -20°C þar til þau voru notuð til frekari greiningar.
Hegðunarviðbrögð hýsilleitandi og blóðætandi An. Rokgjörn útdrættir úr höfðrými, safnaðir úr fersku, 24 klst., 72 klst. og 168 klst. gömlu þvagi, voru greindir fyrir rokgjörn útdrætti úr Arabidopsis moskítóflugum með því að nota beinan glerrörslyktarmæli [18]. Tilraunirnar voru gerðar á ZT 13-15, hámarkstímabili heimaleitar An. Arab [19]. Lyktarmælir úr glerröri (80 cm × 9,5 cm innra þvermál) var lýstur upp með 3 ± 1 lx af rauðu ljósi að ofan. Loftflæði með síuðu og rakastilltu koli (25 ± 2 °C, 65 ± 2% rakastig) fór í gegnum lífprófið við 30 cm s-1. Loft er leitt í gegnum röð af ryðfríu stáli möskvaskjám, sem myndar lagskipt flæði og einsleita strókabyggingu. Tanntampóndreifari (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), hengdur upp úr 5 cm spólu á vindenda lyktarmælisins, með örvunarskiptum á 5 mínútna fresti. Til greiningar voru 10 μl af hverju höfuðrýmisútdrætti, þynnt 1:10, notað sem örvun. Jafnt magn af pentani var notað sem samanburðarhópur. Einstakar moskítóflugur sem leita að hýsil eða sjúga blóð voru settar í einstök losunarbúr 2-3 klukkustundum fyrir upphaf tilraunarinnar. Losunarbúrið var sett á vindhlið lyktarmælisins og moskítóflugurnar fengu að aðlagast í 1 mínútu og síðan var fiðrildaloki búrsins opnaður til að losa. Aðdráttarafl að meðferð eða samanburði var greint sem hlutfall moskítóflugna sem komust í snertingu við upptökin innan 5 mínútna frá losun. Hvert rokgjörnt höfuðrýmisútdráttur og samanburður voru endurteknir að minnsta kosti 30 sinnum og til að forðast áhrif hvers dags var sami fjöldi meðferða og samanburða prófaður á hverjum tilraunadegi. Leitarsvörun frá hýsil og blóðfóðruðum Ans. Arabísk samanburður á höfuðrýmissettum var greind með nafngildri lógískri aðhvarfsgreiningu og síðan paraðri samanburði fyrir oddatöluhlutföll (JMP Pro, v14.0.0, SAS). Stofnunin hf.).
Hrygningarviðbrögð An. Höfuðrýmisútdrættir úr fersku og öldruðu kúþvagi voru greind í Bugdorm búrum (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastbollar (30 ml; Nolato Hertila) fylltir með 20 ml af eimuðu vatni voru hrygningarundirlag og voru settir í gagnstæð horn búrsins, 24 cm í sundur. Meðferðarbollar voru stilltir með 10 μl af hvoru höfuðrýmisútdrætti í 1:10 þynningu. Jafnt magn af pentani var notað til að stilla samanburðarbollann. Meðferðar- og samanburðarbollar voru skipt á milli hverrar tilraunar til að hafa stjórn á áhrifum staðsetningar. Tíu blóðfóðruðum kvendýrum var sleppt í tilraunabúr á ZT 9-11 og eggin í bollunum voru talin 24 klukkustundum síðar. Formúlan til að reikna hrygningarvísitöluna er: (fjöldi eggja sem verpt var í meðferðarbollann - fjöldi eggja sem verpt var í samanburðarbollann)/(heildarfjöldi eggja sem verpt var). Hver meðferð var endurtekin 8 sinnum.
Gasgreining og greining á rafeindaloftnetsmynstri (GC-EAD) á kvenkyns An.arabiensis var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [20]. Í stuttu máli voru ferskir rokgjörnir útdrættir í höfðrými aðskildir með Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, Kaliforníu, Bandaríkjunum) búnir HP-5 dálki (30 m × 0,25 mm innra þvermál, 0,25 μm filmuþykkt, Agilent Technologies). og öldrandi þvag. Vetni var notað sem hreyfanlegt efni með meðallínulegri flæðishraða upp á 45 cm s-1. Hvert sýni (2 μl) var sprautað inn í 30 sekúndur án klofnings með inntakshita 225 °C. Hitastig GC-ofnsins var stillt frá 35 °C (3 mínútna bið) til 300 °C (10 mínútna bið) við 10 °C mín-1. Í GC-frárennslisskiptinum var 4 psi af köfnunarefni bætt við og klofið 1:1 í Gerstel 3D/2 lágdauðarúmmálskrossi (Gerstel, Mülheim, Þýskalandi) milli logajónunarskynjarans og EAD. GC-frárennslisháræðan fyrir EAD var látin fara í gegnum Gerstel ODP-2 flutningslínu, sem fylgist með hitastigi GC-ofnsins plús 5 °C, í glerrör (10 cm × 8 mm), þar sem það var blandað við kolefnissíað, rakt loft (1,5 l mín-1). Loftnetið var komið fyrir 0,5 cm frá úttaki rörsins. Hver einstök moskítófluga var ein endurtekning og fyrir moskítóflugur sem leita að hýsil voru að minnsta kosti þrjár endurtekningar gerðar á þvagsýnum af hverjum aldri.
Auðkenning lífvirkra efnasambanda í söfnum fersks og gamals nautgripaþvags í höfðrými með því að nota sameinuð GC og massagreini (GC-MS; 6890 GC og 5975 MS; Agilent Technologies) til að framkalla loftnetssvörun í GC-EAD greiningu, sem starfar í rafeindajónunarham við 70 eV. GC var útbúinn með HP-5MS UI-húðaðri bræddri kísilháræðasúlu (60 m × 0,25 mm innra þvermál, 0,25 μm filmuþykkt) með helíum sem hreyfanlega fasa með meðallínulegri flæðishraða upp á 35 cm s-1. 2 μl sýni var sprautað inn með sömu sprautustillingum og ofnhita og fyrir GC-EAD greininguna. Efnasamböndin voru greind út frá varðveislutíma þeirra (Kovát vísitala) og massaspektrum samanborið við sérsniðið bókasafn og NIST14 bókasafnið (Agilent). Auðkennd efnasambönd voru staðfest með því að sprauta inn áreiðanlegum stöðlum (Viðbótarskrá 1: Tafla S2). Til magngreiningar var heptýlasetat (10 ng, 99,8% efnafræðilegur hreinleiki, Aldrich) var sprautað inn sem ytri staðall.
Mat á virkni tilbúinnar lyktarblöndu sem samanstendur af lífvirkum efnasamböndum sem greind eru í fersku og öldruðu þvagi til að laða að sér Ans.arabiensis sem leitar að hýsil og sjúgar blóð, með því að nota sama lyktarmæli og aðferð og að ofan. Tilbúnar blöndur hermdu eftir samsetningu og hlutföllum efnasambanda í blönduðum rokgjörnum útdrætti úr fersku, 24 klukkustunda, 48 klukkustunda, 72 klukkustunda og 168 klukkustunda öldruðu þvagi (Mynd 5D-G; Viðbótarskrá 1: Tafla S2). Til greiningar skal nota 10 μl af 1:100 þynningu af fullkomlega tilbúinni blöndu, með heildarlosunarhraða á bilinu um það bil 140-2400 ng klst., til að meta aðdráttarafl fyrir moskítóflugur sem leita að hýsil og blóðsjúgar blóðflugur. Því næst er prófið framkvæmt á heildarblöndum, þar sem frádráttarblöndur af einstökum efnasamböndum úr heildarblöndunni eru fjarlægðar. Leitarsvörun frá hýsil og blóðfóðruðum Ans. Arabar samanborið við tilbúinnar og frádráttarblöndur voru greindar með nafngildislógískri aðhvarfsgreiningu og síðan paraða samanburði fyrir oddatöluhlutföll. (JMP Pro, útgáfa 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Til að meta hvort kúaþvag gæti þjónað sem búsvæði fyrir malaríumoskítóflugur, var ferskt og gamalt kúaþvag, safnað eins og lýst er hér að ofan, ásamt vatni sett í 3 lítra fötur (100 ml) með möskvastærð og sett í beitugildrur fyrir moskítóflugur. (BG-HDT útgáfa; BioGents, Regensburg, Þýskalandi). Tíu gildrur voru settar 50 m frá hvor annarri í haga, 400 m frá þorpssamfélaginu (Silay, Eþíópía, 5°53´24´´N, 37°29´24´´A) og án nautgripa, á föstum varpstöðvum og þorpum. Fimm gildrur voru hitaðar til að líkja eftir nærveru hýsil, en fimm gildrur voru látnar óhitaðar. Hver meðferðarstaður er skipt á hverri nóttu í samtals fimm nætur. Fjöldi moskítóflugna sem veiddar voru í gildrum með beitu með þvagi af mismunandi aldri var borinn saman með aðhvarfsgreiningu með beta tvíliðudreifingu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Í þorpi þar sem malaría er landlæg nálægt bænum Maki í Oromia-héraði í Eþíópíu (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ A; Mynd 6A). Rannsóknin var framkvæmd frá miðjum ágúst til miðs september, áður en árleg úðun með leifar af úðaefni innandyra hófst, ásamt löngu regntímabili. Fimm pör af húsum (20–50 m í sundur) staðsett í útjaðri þorpsins voru valin fyrir rannsóknina (Mynd 6A). Viðmiðin sem notuð voru til að velja húsin voru: engin dýr leyfð í húsinu, engin eldun innandyra (að draga eldivið eða viðarkol) var leyfð (að minnsta kosti á tilraunatímabilinu) og hús með hámarki tveimur íbúum, sem sofa í skordýraeitri. undir meðhöndluðu moskítóneti. Siðferðilegt samþykki hefur verið veitt af siðanefnd rannsókna (IRB/022/2016) Náttúruvísindadeildar (CNS-IRB), Addis Ababa háskóla, í samræmi við leiðbeiningar sem settar voru í yfirlýsingu Alþjóðalæknasamtakanna í Helsinki. Samþykki hvers heimilisföður var fengið með aðstoð heilbrigðisstarfsfólks. Allt ferlið er samþykkt af sveitarstjórnum á umdæmis- og deildarstigi („kebele“). Tilraunahönnunin fylgdi 2 × 2 latneskum ferningum, þar sem tilbúnum blöndum og samanburðarhópum var úthlutað pöruðum húsum fyrstu nóttina og skipt á milli húsa næstu tilraunanótt. Þetta ferli var endurtekið tíu sinnum. Að auki, til að meta moskítóflugnavirkni í völdum húsum, voru CDC-gildrurnar stilltar til að keyra fimm nætur í röð í upphafi, miðju og lok vettvangsrannsóknarinnar á sama tíma dags.
Tilbúin blanda sem innihélt sex lífvirk efni var leyst upp í heptani (97,0% leysiefni GC gæðaflokks, Sigma Aldrich) og losuð við 140 ng klst. með því að nota bómullarþrýstisauma [20]. Þrýstisaumin gerði öllum efnum kleift að losna í föstum hlutföllum allan 12 klukkustunda tilraunina. Heptan var notað sem samanburðarpróf. Hettuglasið var hengt upp við hliðina á inngangspunkti ljósgildru Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, Flórída, Bandaríkin; Mynd 6A). Gildrurnar voru hengdar 0,8 – 1 m yfir jörðu, nálægt fótlegg rúmsins, og sjálfboðaliði svaf undir ómeðhöndluðu moskítóneti og starfaði á milli 18:00 og 06:30. Moskítóflugur sem veiddar voru eftir kyni og lífeðlisfræðilegu ástandi (ófóðraðar, fóðraðar, hálfóléttar og óléttar [21] voru síðan skimaðar með PCR greiningu (polymerase chain reaction) til að bera kennsl á tegundirnar sem voru formfræðilega greindar sem A. gambiae sl. Meðlimir flókins [23]. Í Í vettvangsrannsókninni var gildrafesting paraðra húsa greind með nafngildislógískri aðlögunarlíkani, þar sem aðdráttarafl var háð breyta og meðferð (tilbúin blanda vs. samanburðarhópur) var föst áhrif (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hér greinum við frá χ² og p-gildum úr líkindahlutfallsprófinu.
Metið hvort það sé öruggt. arabiensis gat fengið þvag, aðal köfnunarefnisgjafa þess, þvagefni, með beinni fóðrun, innan 48 klst. frá gjöf í 4 daga eftir (dpe) fóðrunartilraunir fyrir hýsilleitandi og blóðfóðraðar kvendýr (Mynd 1A). Bæði hýsilleitandi og blóðsogandi kvendýr frásoguðu marktækt meiri súkrósa en nokkurt annað fóður eða vatn (F(5.426) = 20,15, p < 0,0001 og F(5.299) = 56,00, p < 0,0001, talið í sömu röð; Mynd 1B, C). Ennfremur borðuðu hýsilleitandi kvendýr minna í þvagi eftir 72 klukkustundir samanborið við þvag eftir 168 klukkustundir (Mynd 1B). Þegar þeim var boðið fóður sem innihélt þvagefni frásoguðu hýsilleitandi kvendýr marktækt meira magn af þvagefni við 2,69 mM samanborið við allar aðrar styrkleikar og vatn, en var óaðgreinanlegt frá 10% súkrósa (F(10.813)). = 15,72, p < 0,0001; Mynd 1D). Þetta var í andstöðu við svörun blóðfóðraðra kvenna, sem yfirleitt tóku upp marktækt meira af þvagefnisinnihaldandi fæði en vatni, þó marktækt minna en 10% súkrósa (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Mynd 1).1E). Ennfremur, þegar borið var saman milli þessara tveggja lífeðlisfræðilegu ástanda, tóku blóðtökur á kvendýrum meira þvagefni en hýsilleitandi kvendýr við lægsta styrk, og þessar kvendýr tóku upp svipað magn af þvagefni við hærri styrk (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Mynd 1F, G). Þó að inntaka úr þvagefnisinnihaldandi fæði virtist hafa kjörgildi (Mynd 1D,E), gátu kvendýr í báðum lífeðlisfræðilegum ástandum stjórnað magni þvagefnis sem frásogast yfir allt svið þvagefnisþéttni á lógaritma-línulegan hátt (Mynd 1F,G). ).Á sama hátt virðast moskítóflugur stjórna köfnunarefnisupptöku sinni með því að stjórna magni þvags sem frásogast, þar sem magn köfnunarefnis í þvagi endurspeglast í magni frásogaðs þvags (mynd 1B, C og B innskot).
Til að meta áhrif þvags og þvagefnis á lifun moskítóflugna sem leituðu að hýsil og sögðu blóð, fengu kvendýr þvag á öllum fjórum aldri (ferskt, 24 klst., 72 klst. og 168 klst. eftir útsetningu) og mismunandi þvagefnisþéttni, ásamt eimuðu vatni og 10% súkrósa, var notað sem samanburðarhópur (Mynd 2A). Þessi lifunargreining sýndi að mataræði hafði marktæk áhrif á heildarlifun hjá kvendýrum sem leituðu að hýsil (þvag: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; þvagefni: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Mynd 2B, C) og blóðfóðruðum kvendýrum (þvag: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; þvagefni: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Mynd 2D, E). Í öllum tilraunum höfðu kvendýr sem fengu þvag, þvagefni og vatn marktækt lægri lifunartíðni samanborið við kvendýr sem fengu súkrósa (Mynd 2B-E). Kvendýr sem leituðu að hýsil og fengu ferskt og gamalt þvag sýndu mismunandi lifunartíðni, þar sem þær sem fengu 72 klst. gamalt þvag (p = 0,016) höfðu lægstu lifunarlíkurnar (Mynd 2B). Ennfremur lifðu kvendýr sem fengu 135 mM þvagefni lengur en samanburðarhópurinn í vatni (p < 0,04) (Mynd 2C). Í samanburði við vatn lifðu konur sem fengu ferskt þvag og 24 klst. þvag lengur (p = 0,001 og p = 0,012, talið í sömu röð; Mynd 2D), en konur sem fengu 72 klst. þvag lifðu lengur en þær sem fengu stutt kvenþvag og 24 klst. gamalt þvag (p < 0,0001 og p = 0,013, talið í sömu röð; Mynd 2D). Þegar kvendýr sem fengu 135 mM þvagefni voru blóðfóðruð... lifði lengur en allar aðrar styrkleikar þvagefnis og vatns (p < 0,013; Mynd 2E).
Lifun hýsil- og blóðsugandi kvenkyns moskítóflugna af tegundinni Anopheles arabinis sem nærast á kúþvagi og þvagefni. Í lífprófinu (A) fengu kvenkyns moskítóflugur fæði sem samanstóð af fersku og þroskuðu kúþvagi, mismunandi styrk þvagefnis, súkrósa (10%) og eimuðu vatni (H2O). Lifun hýsilleitandi (B, C) og blóðsugandi (D, E) moskítóflugna var skráð á 12 klukkustunda fresti þar til allar kvenkyns moskítóflugur sem nærast á þvagi (B, D) og þvagefni (C, E) og samanburðarhópsins, súkrósa og vatn, voru dauðar.
Heildarfjarlægð og fjöldi skota sem ákvarðaður var í flugmylluprófinu yfir 24 klukkustunda tímabil var mismunandi milli moskítóflugna sem leituðu að hýsil og blóðsugandi moskítóflugna, sem sýndu minni flugvirkni í heildina (Mynd 3). Moskítóflugur sem leituðu að hýsil og gáfu ferskt og gamalt þvag eða súkrósa og vatn sýndu mismunandi flugmynstur (Mynd 3), þar sem kvenkyns moskítóflugur sem gáfu ferskt þvag voru virkari í dögun, en þær sem fengu 24 og 168 klukkustunda gamalt þvag. Moskítóflugur sem nærðust á þvagi sýndu mismunandi flugmynstur og voru aðallega daglega virkar. Kvenkyns moskítóflugur sem gáfu súkrósa eða 72 klukkustunda gamalt þvag sýndu virkni yfir 24 klukkustunda tímabilið, en kvenkyns moskítóflugur sem gáfu vatn voru virkari á miðju tímabili. Moskítóflugur sem fengu súkrósa sýndu mesta virkni seint á kvöldin og snemma morguns, en þær sem innbyrtu 72 klukkustunda gamalt þvag upplifðu stöðuga lækkun á virkni yfir 24 klukkustundir (Mynd 3).
Fluggeta veiðimannlegrar blóðsugandi kvenkyns moskítóflugna (Anopheles arabinis) sem nærist á kúþvagi og þvagefni. Í flugmylluprófinu voru kvenkyns moskítóflugur, sem nærðust á fersku og öldruðu kúþvagi, mismunandi styrk þvagefnis, súkrósa (10%) og eimuðu vatni (H2O), bundnar við lárétta, frjálst snúandi arma (hér að ofan). Fyrir hýsilleitandi (vinstri) og blóðsugandi (hægri) kvenkyns moskítóflugur var heildarfjarlægð og fjöldi fluga á klukkustund fyrir hvert mataræði yfir 24 klukkustunda tímabil skráð (dökk: grátt; ljós: hvítt). Meðalfjarlægð og meðalfjöldi fluga eru sýnd hægra megin við daglega virknigrafið. Villustikur tákna staðalvillu meðaltalsins. Tölfræðileg greining, sjá texta.
Almennt fylgdi heildarflugvirkni kvenkyns sem leituðu að hýsil svipuðu mynstri og flugfjarlægð yfir 24 klukkustunda tímabil. Meðalflugfjarlægð var marktækt háð fæði sem neytt var (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), og kvenkyns sem leituðu að hýsil sem neyttu þvags í 72 klukkustundir flugu marktækt lengri vegalengdir samanborið við allt annað fæði (p < 0,0001), og moskítóflugur sem fengu súkrósa flugu lengur en moskítóflugur sem fengu ferskar (p = 0,022) og 24 klst. gamlar þvagfæðir (p = 0,022). Ólíkt flugvirkni sem lýst er með þvagefæðinu, sýndu kvenkyns sem leituðu að hýsil sem neyttu þvagefnis viðvarandi flugvirkni yfir 24 klukkustunda tímabil og náði hámarki á seinni hluta myrkrafasans (Mynd 3). Þótt virknimynstrið væri svipað, juku kvenkyns sem leituðu að hýsil sem neyttu þvagefnis marktækt meðalflugfjarlægð eftir frásoguðu styrk (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Kvenkyns einstaklingar sem leituðu að hýslum og fengu hvaða þvagefnisþéttni sem er flugu lengur en kvenkyns einstaklingar sem fengu annað hvort vatn eða súkrósa (p < 0,03).
Heildarflugvirkni blóðsugandi moskítóflugna var stöðug og viðhéltst í 24 klukkustundir á öllum fæðutegundum, með aukinni þvagvirkni á seinni hluta myrkratímabilsins hjá kvendýrum sem fengu vatn, sem og hjá kvendýrum sem fengu ferskar og 24 klukkustunda gamlar (mynd 3). Þótt þvagfæði hefði marktæk áhrif á meðalflugfjarlægð hjá blóðfóðruðum kvendýrum (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), hafði þvagefnisfæði ekki áhrif (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) með öðru þvagi og samanburðarfæði (ferskt, p = 0,0091; 72 klukkustundir, p = 0,0022; 168 klukkustundir, p = 0,001; súkrósi, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Áhrif þvag- og þvagefnisfóðrunar á æxlunarþætti voru metin í eggjavarpsgreiningum (Mynd 4A) og rannsökuð út frá fjölda eggja sem hver kvendýr verpir, stærð eggjanna og nýklaktum lirfum í fyrsta stigi. Fjöldi eggja sem verpir. Arabísk kvendýr sem fengu þvag voru mismunandi eftir fæðu (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Mynd 4B). Kvendýr sem fengu 24-klukkustunda þvag- og blóðmjöl verpir marktækt fleiri eggjum en kvendýr sem fengu annað þvagfóður og voru svipuð þeim sem fengu súkrósa (Mynd 4B). Á sama hátt var stærð eggja sem kvendýr sem fengu þvag verpir mismunandi eftir fæðu (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), þar sem kvendýr sem fengu þvag og súkrósa verpir marktækt stærri eggjum en kvendýr sem fengu vatn, en egg kvendýra sem fengu 168 klst. af þvagi voru marktækt minni (Mynd 4C). Að auki hafði þvagfæði marktæk áhrif á lirfustærð. (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), þar sem marktækt stærri lirfur komu úr eggjum 24 og 72 klukkustunda gömlu þvagfóðruðu kvendýra en úr eggjum lirfa úr vatnsfóðruðum kvendýrum og 168 klukkustunda þvagfóðruðum kvendýrum (Mynd 4D).
Æxlunargeta kvenkyns moskítóflugna af tegundinni Anopheles arabinis sem nærist á kúþvagi og þvagefni. Kvenkyns moskítóflugur, sem fengu blóðfóðraðar mýflugur, fengu fóður sem samanstóð af fersku og þroskuðu kúþvagi, mismunandi styrk þvagefnis, súkrósa (10%) og eimuðu vatni (H2O) í 48 klukkustundir áður en þær voru settar í lífpróf og eggjahvarfefni fengust (A). Fjöldi eggja (B, E), stærð eggja (C, F) og stærð lirfa (D, G) voru marktækt undir áhrifum fóðursins (kúþvag: BD; þvagefni: EG). Meðaltöl fyrir hverja breytu mæld með mismunandi bókstafanöfnum voru marktækt frábrugðin hvert öðru (einhliða ANOVA með Tukey's post hoc greiningu; p < 0,05). Villustikur tákna staðalvillu meðaltalsins.
Þvagefni, sem er aðal köfnunarefnisþátturinn í þvagi, hafði marktæk áhrif á æxlunarþætti í öllum rannsóknunum þegar það var gefið blóðfóðruðum kvendýrum. Fjöldi eggja sem kvendýr sem fengu þvagefni verptu eftir blóðmáltíð, var breytilegur eftir þvagefnisþéttni (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Kvendýr sem fengu þvagefnisþéttni á milli 134 µM og 1,34 mM verptu fleiri eggjum (Mynd 4E). Kvendýr sem fengu þvagefnisþéttni upp á 134 µM eða meira verptu stærri eggjum en kvendýr sem fengu vatn (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Mynd 4F) og stærð lirfa, þó að svipuð þvagefnisþéttni hjá mæðrum (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) hafi haft áhrif á hana (Mynd 4G).
Heildar aðdráttarafl fyrir rokgjörn útdrætti úr þvagi sem leitar að hýsil. Aldur þvags hafði marktæk áhrif á arabiensis-flugurnar sem metnar voru í lyktarmæli í glerröri (Mynd 5A) (χ² = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Mynd 5B). Eftirgreining sýndi að lykt af fölsku þvagi eftir 24 klukkustundir olli marktækt meiri aðdráttarafli samanborið við allar aðrar meðferðir (72 klukkustundir: p = 0,0060, 168 klukkustundir: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), fyrir utan lykt af fersku þvagi (p = 0,13; Mynd 5B). Þó að heildar aðdráttarafl blóðsugandi moskítóflugna að þvaglykt væri ekki marktækt frábrugðið (χ² = 8,78, df = 4, p = 0,067; Mynd 5C), reyndust þessar kvenkyns moskítóflugur vera marktækt aðlaðandi fyrir rokgjörn útdrætti úr þvagi samanborið við 72 klukkustunda gamalt þvag samanborið við samanburðarhópa (p = ...). 0,0066; Mynd 5C).
Hegðunarviðbrögð við náttúrulegri og tilbúinni lykt af kúþvagi í leit að hýsil og blóðfóðruðum Anopheles arabianus. Skýringarmynd af lyktarmæli úr glerröri (A). Aðdráttarafl rokgjörns útdráttar úr fersku og öldruðu kúþvagi að hýsil (B) og blóðsugandi (C) moskítóflugum. Finndu tentaklaviðbrögð Lord An. Sýnd eru útdrættir úr fersku (D), 24 klukkustunda (E), 72 klukkustunda (F) og 168 klukkustunda (G) öldruðu kúþvagi. Rafeindaloftnetsgreiningar (EAD) sýna spennubreytingar sem svörun við lífvirkum efnum í höfðrýminu sem eru elueruð úr gasgreini og greind með logajónunarnema (FID). Kvarðastika táknar svörunarvídd (mV) á móti varðveislutíma (s). Eiginleikar og losunarhraði (µg klst-1) líffræðilega virku efnasambandanna eru sýndir. Ein stjarna (*) gefur til kynna stöðuga svörun með lágu sveifluvídd. Tvöfaldar stjörnur (**) gefa til kynna óendurtakanlegar svörun. Finndu hýsilinn (H) og Blóðsugandi (I) An.arabiensis hefur mismunandi aðdráttarafl miðað við tilbúnar blöndur af ferskum og öldruðum kúþvaglykt. Meðalhlutfall moskítóflugna sem laðast að mismunandi bókstafanöfnum var marktækt frábrugðið hvert öðru (einhliða ANOVA með Tukey's post hoc greiningu; p < 0,05). Villustikur tákna staðalvillu kvarðans.
Kvenkyns Ann.arabiensis, 72 klst. og 120 klst. eftir blóðmáltíð, meðan á hrygningu stóð, sýndi engin áhersla á rokgjörn útdrætti úr fersku og þroskuðu kúaþvagi samanborið við pentan samanburðarhóp (χ² = 3,07, p > 0,05; Viðbótarskrá 1: Mynd S1).
Fyrir kvenkyns Ann.arabiensis greindu GC-EAD og GC-MS greiningar átta, sex, þrjú og þrjú lífvirk efni (Mynd 5D-G). Þó að munur hafi sést á fjölda efnasambanda sem vöktu rafgreiningarviðbrögð, voru flest þessara efnasambanda til staðar í hverju útdrætti úr rokgjörnu loftneti sem safnað var úr fersku og þroskuðu þvagi. Þess vegna voru aðeins efnasambönd sem vöktu lífeðlisfræðileg viðbrögð frá kvenkyns loftnetum yfir þröskuldinum tekin með í frekari greiningar fyrir hvert útdrátt.
Heildarlosunarhraði rokgjörnra lífvirkra efnasambanda í þvagsöfnuninni jókst úr 29 µg klst. í fersku þvagi í 242 µg klst. í 168 klukkustunda öldruðu þvagi, aðallega vegna aukinnar tíðni p-kresóls og m-formaldehýðs fenóls sem og fenóls. Aftur á móti minnkaði losunarhraði annarra efnasambanda, svo sem 2-sýklóhexen-1-óns og dekanals, með hækkandi aldri þvags, sem tengdist minnkun á merkjastyrk (gnægð) í litrófinu (mynd 5D) og lífeðlisfræðilegum viðbrögðum við þessum efnasamböndum (mynd 5D-G hægri hluti).
Í heildina hafði tilbúna blandan svipað náttúrulegt hlutfall lífvirkra efnasambanda sem greindust í rokgjörnum útdrætti úr ferskum og öldruðum þvagrýmum (Mynd 5D–G) og virtist ekki vekja verulega aðdráttarafl í leit að hýsli (χ² = 8,15, df = 4, p = 0,083; Mynd 5H) eða blóðsugandi moskítóflugum (χ² = 4,91, df = 4, p = 0,30; Mynd 5I). Hins vegar sýndu parasamanburðir eftir á milli meðferða að moskítóflugur sem leituðu að hýsli laðuðust verulega að tilbúnu blöndunni af 24 klst. öldruðu þvagi samanborið við pentan samanburðarhópa (p = 0,0086; Mynd 5H).
Til að meta hlutverk einstakra efnisþátta í tilbúnum blöndum af 24 klst. gömlu þvagi voru sex frádráttarblöndur metnar á móti heildarblöndum í Y-rörsprófi, þar sem einstök efnasambönd voru fjarlægð. Fyrir moskítóflugur sem leituðu að hýsil hafði það marktæk áhrif á hegðunarviðbrögð að draga einstök efnasambönd úr heildarblöndunni (χ² = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Viðbótarskrá 1: Mynd S2A), allar frádráttarblöndur voru aðlaðandi en Minni en fullblandaðar. Aftur á móti hafði fjarlæging einstakra efnasambanda úr fullblandaðri blöndu ekki áhrif á hegðunarviðbrögð blóðsugandi moskítóflugna (χ² = 11,38, df = 6, p = 0,077), fyrir utan decanal, sem leiddi til lægri styrk samanborið við heildarblönduna (p = 0,022; Viðbótarskrá 1: Mynd S2B).
Í þorpi í Eþíópíu þar sem malaría er landlæg var virkni tilbúinnar blöndu af kúþvagi sem hefur verið látið standa allan sólarhringinn við að laða að moskítóflugur við vettvangsaðstæður metin í tíu nætur (Mynd 6A). Alls voru 4.861 moskítófluga veidd og greind, þar af voru 45,7% Anthropus.gambiae sl, 18,9% voru Anopheles pharoensis og 35,4% voru Culex spp. (Viðbótarskrá 1: Tafla S1). Anopheles arabinis er eini tegundin í An.Gambian tegundaflókanum sem greindist með PCR greiningu. Að meðaltali voru 320 moskítóflugur veiddar á hverri nóttu, og á þeim tíma veiddu gildrur með tilbúinni beitublöndu fleiri moskítóflugur en paraðar gildrur án blöndu (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Gildrur án beitu voru settar upp á hverri af fimm samanburðarnóttunum í upphafi, miðju og lok tilraunarinnar. Svipaður fjöldi moskítóflugna var veiddur í hverju pari af... gildrur, sem bendir til þess að enginn skekkja sé milli húsa (χ²(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) og enginn stofnfækkun sé á rannsóknartímabilinu. Í samanburði við samanburðargildrur jókst fjöldi moskítóflugna sem veiddar voru í gildrunum sem innihéldu tilbúna blönduna marktækt: hýsilleit (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nýleg blóðtöku (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) og þungun (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Viðbótarskrá 1: Tafla S1). Þetta endurspeglast einnig í heildarfjölda moskítóflugna sem veiddar voru: hýsilleit > blóðsugandi > þunguð > hálfþunguð > karlkyns.
Vettvangsmat á virkni 24-klukkustunda tilbúinnar kúþvaglyktarblöndu. Vettvangsrannsóknir voru gerðar í suðurhluta Eþíópíu (kort), nálægt bænum Maki (innskot), með ljósgildru frá Centers for Disease Control (CDC) (hægra megin) í pöruðum húsum, með latneskum ferningi (loftmynd) (A). Tilbúnar lyktargildrur frá CDC laða að og fanga kvenkyns Anopheles arabesques (B), en ekki Anopheles farroes (C), á annan hátt, sem er lífeðlisfræðilega ástandsháð áhrif. Að auki náðu þessar gildrur marktækt auknum fjölda af hýsilflugum af gerðinni Culex. (D) Samanborið við samanburðarhóp. Súlurnar vinstra megin tákna meðalvalsvísitölu moskítóflugna sem veiddar voru í pörum af lyktarbeitugildrum (grænum) og samanburðargildrum (opnum) (N = 10), en súlurnar hægra megin tákna meðalvalsvísitölu í pörum af samanburðargildrum (opnum; N = 5). Stjörnur gefa til kynna tölfræðilegt marktæknistig (*p = 0,01 og ***p < 0,0001)
Tegundirnar þrjár voru veiddar á mismunandi hátt í gildrum sem innihéldu tilbúnar blöndur. Í leit að hýsli (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blóðgjöf (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) og meðgöngu (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) var .arabiensis veidd í gildrunni og losaði tilbúna blönduna (Mynd 6B), en magn An var ekki mismunandi. Pharoensis í mismunandi lífeðlisfræðilegum ástöndum fundust (Mynd 6C). Fyrir Culex fannst aðeins marktæk aukning í fjölda moskítóflugna sem leituðu að hýslum í gildrum sem voru notaðar með tilbúnu blöndunni (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Mynd 6D), samanborið við samanburðargildrur.
Gildrur fyrir beituflugur fyrir hýsil, staðsettar utan hugsanlegra hýsla, milli varpstöðva og dreifbýlissamfélaga í Eþíópíu, voru notaðar til að meta hvort malaríuflugur noti kúaþvaglykt sem vísbendingu um búsvæði hýsilsins. Engar moskítóflugur voru veiddar í fjarveru hýsilvísbendinga, hita og með eða án kúaþvaglyktar (Viðbótarskrá 1: Mynd S3). Hins vegar, í viðurvist mikils hitastigs og kúaþvaglyktar, laðast kvenkyns malaríuflugur að og veiddar, þó í litlum fjölda, óháð aldri þvags (χ²(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Viðbótarskrá 1: Mynd S3). Aftur á móti veiddu vatnsviðmið ekki malaríuflugur við hátt hitastig (Viðbótarskrá 1: Mynd S3).
Malaríuflugur afla sér og dreifa köfnunarefnisríkum efnasamböndum með því að nærast á kúþvagi (þ.e. pollum) til að auka lífsferilseinkenni, svipað og önnur skordýr [2, 4, 24, 25, 26]. Kúþvag er auðfáanleg endurnýjanleg auðlind sem tengist náið hvíldarstöðum malaríusmitara, svo sem fjósum og háum gróðri nálægt sveitahúsum og hrygningarstöðum. Kvenkyns moskítóflugur finna þessa auðlind með lyktarskyni og geta stjórnað upptöku köfnunarefnisríkra efnasambanda í þvagi, þar á meðal þvagefni, helsta köfnunarefnisþáttinum í þvagi [15, 16]. Eftir lífeðlisfræðilegu ástandi kvenkyns moskítóflugunnar eru næringarefni í þvagi úthlutað til að auka flugvirkni og lifun kvenkyns moskítóflugna sem leita að hýsil, sem og lifun og æxlunareiginleika blóðfóðraðra einstaklinga á fyrsta kynkirtlahringrásinni. Þess vegna gegnir þvagblöndun mikilvægu næringarhlutverki fyrir malaríusmitara sem eru lokaðir eins og vannærðir fullorðnir [8], þar sem hún veitir kvenkyns moskítóflugum getu til að afla sér mikilvægra köfnunarefnisríkra efnasambanda með því að taka þátt í lágáhættufóðrun. Þessi niðurstaða hefur verulegar faraldsfræðilegar afleiðingar, þar sem kvenkyns moskítóflugur auka líftíma sinn. væntingar, virkni og æxlunargeta, sem allt hefur áhrif á getu smitbera. Ennfremur gæti þessi hegðun verið markmið framtíðar smitberastjórnunaráætlana.