Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Þú ert að nota vafraútgáfu með takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Sýnir hringekju með þremur skyggnum í einu.Notaðu Fyrri og Næsta hnappana til að fara í gegnum þrjár skyggnur í einu, eða notaðu sleðahnappana í lokin til að fara í gegnum þrjár skyggnur í einu.
Blóð-heilaþröskuldurinn og blóð-heilaþröskuldurinn koma í veg fyrir að líflækningaefni nái markmiðum sínum í miðtaugakerfinu og hindra þannig árangursríka meðferð á taugasjúkdómum.Til að uppgötva nýja heilaflutningsefni in vivo, kynntum við T7 fagur peptíðsafn og raðsöfnuðum blóði og heila- og mænuvökva (CSF) með því að nota holla með meðvitundarholslíkani af rottum.Sérstakir fagklónar voru mjög auðgaðir á CSF eftir fjórar umferðir af vali.Prófanir á einstökum frambjóðendum peptíðum leiddi í ljós meira en 1000-falda auðgun í CSF.Lífvirkni peptíðmiðlaðrar sendingar til heilans var staðfest með 40% lækkun á magni amyloid-β í heila- og mænuvökva með því að nota BACE1 peptíðhemla sem tengdur var við hið auðkennda nýja flutningspeptíð.Þessar niðurstöður benda til þess að peptíðin sem auðkennd eru með in vivo fagavalsaðferðum geti verið gagnleg burðarefni fyrir almenna afhendingu stórsameinda til heilans með lækningaáhrifum.
Miðtaugakerfismiðaðar rannsóknir hafa að miklu leyti beinst að því að bera kennsl á bjartsýni lyf og efni sem sýna miðtaugakerfismiðaða eiginleika, með minni fyrirhöfn við að uppgötva aðferðir sem knýja fram virka lyfjagjöf til heilans.Þetta er að byrja að breytast núna þar sem lyfjagjöf, sérstaklega stórar sameindir, er óaðskiljanlegur hluti af nútíma lyfjaþróun í taugavísindum.Umhverfi miðtaugakerfisins er vel varið af heilaæðaþröskuldarkerfinu, sem samanstendur af blóð-heilaþröskuldi (BBB) ​​og blóð-heilaþröskuldi (BCBB)1, sem gerir það erfitt að koma lyfjum til heilans1,2.Áætlað er að næstum öll lyf með stórum sameindum og meira en 98% af lyfjum með litlum sameindum séu eytt úr heilanum3.Þess vegna er mjög mikilvægt að bera kennsl á ný heilaflutningskerfi sem veita skilvirka og sértæka afhendingu lækningalyfja til miðtaugakerfisins 4,5.Hins vegar bjóða BBB og BCSFB einnig upp á frábært tækifæri til lyfjagjafar þar sem þau komast inn í og ​​komast inn í allar byggingar heilans í gegnum víðtæka æðakerfi hans.Þannig er núverandi viðleitni til að nota ekki ífarandi aðferðir við afhendingu til heilans að miklu leyti byggðar á vélbúnaði viðtakamiðaðrar flutnings (PMT) með því að nota innrænan BBB6 viðtaka.Þrátt fyrir nýlegar framfarir í notkun transferrínviðtakaferilsins7,8, er þörf á frekari þróun nýrra afhendingarkerfa með bætta eiginleika.Í þessu skyni var markmið okkar að bera kennsl á peptíð sem geta miðlað CSF flutningi, þar sem þau gætu í grundvallaratriðum verið notuð til að skila stórsameindum til miðtaugakerfisins eða til að opna nýjar viðtakaleiðir.Sérstaklega geta sértækir viðtakar og flutningsaðilar heilaæðakerfisins (BBB og BSCFB) þjónað sem hugsanleg markmið fyrir virka og sértæka afhendingu líflækningalyfja.Heila- og mænuvökvi (CSF) er seytingarafurð choroid plexus (CS) og er í beinni snertingu við millivefsvökva heilans í gegnum subarachnoid space og ventricular space4.Nýlega hefur verið sýnt fram á að heila- og mænuvökvi dreifist óhóflega inn í millivef heilans9.Við vonumst til að fá aðgang að parenchymal rýminu með því að nota þennan subarachnoid innflæðisveg eða beint í gegnum BBB.Til að ná þessu innleiðum við öfluga in vivo fagavalsstefnu sem auðkennir helst peptíð sem flutt eru með öðrum hvorum þessara tveggja mismunandi leiða.
Við lýsum nú raðbundinni in vivo fögum sýna skimunaraðferð með CSF sýnatöku ásamt mikilli afköst raðgreiningar (HTS) til að fylgjast með fyrstu vallotum með mesta fjölbreytileika safnsins.Skimun var gerð á rottum með meðvitund með varanlega ígrædda stóra bruna (CM) holnál til að forðast blóðmengun.Mikilvægt er að þessi aðferð velur bæði heilamiðun og peptíð með flutningsvirkni yfir heilaæðaþröskuldinn.Við notuðum T7 fagur vegna smæðar þeirra (~60 nm)10 og lögðum til að þeir væru hentugir til að flytja blöðrur sem leyfa þverfrumuleið yfir æðaþels- og/eða þekju-mergþröskuld.Eftir fjórar umferðir af skömmtun voru fögurhópar einangraðir sem sýndu sterka in vivo CSF-auðgun og tengsl heila öræða.Mikilvægt er að við gátum staðfest niðurstöður okkar með því að sýna fram á að ákjósanleg og efnafræðilega framleidd best frambjóðandi peptíð geta flutt próteinfarm inn í heila- og mænuvökva.Í fyrsta lagi voru lyfhrif miðtaugakerfisins staðfest með því að sameina leiðandi flutningspeptíð með hemli á BACE1 peptíðinu.Auk þess að sýna fram á að in vivo starfrænar skimunaraðferðir geti greint ný heilaflutningspeptíð sem áhrifaríka próteinflutningsbera, gerum við ráð fyrir að svipaðar hagnýtar valaðferðir verði einnig mikilvægar við að bera kennsl á nýjar heilaflutningsleiðir.
Byggt á plaque-myndandi einingum (PFU), eftir fagpökkunarskrefið, var safn handahófskenndra 12-mera línulegra T7 fagapeptíða með fjölbreytni upp á um það bil 109 hannað og búið til (sjá Efni og aðferðir).Það er mikilvægt að hafa í huga að við greindum þetta bókasafn vandlega áður en í vivo skönnun.PCR mögnun á fagasafnssýnum með því að nota breytta primera mynduðu magni sem áttu beint við HTS (aukamynd 1a).Vegna a) HTS11 raðunarvillna, b) áhrifa á gæði frumra (NNK)1-12, og c) tilvistar villigerðar (wt) faga (beinagrind innskot) í biðsafninu, var raðsíunaraðferð útfærð til að draga aðeins út staðfestar raðupplýsingar (viðbótarmynd 1b).Þessi síuskref eiga við um öll HTS raðasöfn.Fyrir staðlaða bókasafnið fengust alls 233.868 lestur, þar af stóðust 39% síuviðmiðin og voru notuð við safngreiningu og val fyrir síðari umferðir (aukamynd 1c–e).Lesið var aðallega margfeldi af 3 basapörum að lengd með toppi við 36 núkleótíð (viðbótarmynd 1c), sem staðfestir hönnun safnsins (NNK) 1-12.Athyglisvert er að um það bil 11% af meðlimum safnsins innihéldu 12-víddar villigerð (wt) burðarás PAGISRELVDKL innskot og næstum helmingur raðanna (49%) innihélt innskot eða úrfellingar.HTS bókasafnssafnsins staðfesti mikla fjölbreytni peptíða í safninu: meira en 81% af peptíðröðunum fundust aðeins einu sinni og aðeins 1,5% komu fram í ≥4 eintökum (viðbótarmynd 2a).Tíðni amínósýra (aa) á öllum 12 stöðum á efnisskránni var í góðu samræmi við tíðnina sem búist var við fyrir fjölda kódona sem myndast af úrkynjaðri NKK efnisskrá (aukamynd 2b).Tíðni aa leifa sem kóðuð var með þessum innskotum sem kom fram var í góðu samræmi við reiknaða tíðni (r = 0,893) (aukamynd 2c).Undirbúningur fagasafna fyrir inndælingu felur í sér skref mögnunar og fjarlægingar endotoxins.Þetta hefur áður verið sýnt fram á að hugsanlega dregur úr fjölbreytileika fagasafna12,13.Þess vegna raðuðum við plötumögnuðu fagasafni sem hafði gengist undir endotoxin fjarlægingu og borum það saman við upprunalega safnið til að áætla tíðni AA.Sterk fylgni (r = 0,995) sást á milli upprunalegu laugarinnar og mögnuðu og hreinsuðu laugarinnar (aukamynd. 2d), sem gefur til kynna að samkeppni á milli klóna sem magnaðir voru upp á plötum með T7-fögum olli ekki meiriháttar skekkju.Þessi samanburður er byggður á tíðni þrípeptíðmynda í hverju safni, þar sem ekki er hægt að fanga að fullu fjölbreytileika bókasöfnanna (~109) jafnvel með HTS.Tíðnigreining á aa í hverri stöðu leiddi í ljós litla stöðuháða hlutdrægni á síðustu þremur stöðum á innskráðri efnisskrá (aukamynd 2e).Að lokum komumst við að þeirri niðurstöðu að gæði og fjölbreytileiki safnsins væru ásættanleg og aðeins smávægilegar breytingar á fjölbreytileika komu fram vegna mögnunar og undirbúnings fagasafna á milli nokkurra vallota.
Raðsýni úr heila- og mænuvökva er hægt að framkvæma með því að setja holnál með skurðaðgerð í CM rotta með meðvitund til að auðvelda auðkenningu á T7-fögum sem sprautað er í bláæð (iv) með BBB og/eða BCSFB (mynd 1a-b).Við notuðum tvo sjálfstæða valarma (armir A og B) í fyrstu þremur umferðunum af vali í lífi (mynd 1c).Við hækkuðum smám saman strangleika valsins með því að minnka heildarmagn af fögum sem var kynnt í fyrstu þremur umferðum valsins.Fyrir fjórðu pönnunarlotuna sameinuðum við sýni úr greinum A og B og gerðum þrjú óháð val til viðbótar.Til að rannsaka in vivo eiginleika T7 föguagna í þessu líkani var villigerð fögu (PAGISRELVDKL aðalinnskot) sprautað í rottur um halaæð.Endurheimt föga úr heila- og mænuvökva og blóði á mismunandi tímapunktum sýndi að tiltölulega litlar T7 icosahedral fögur höfðu hraðan upphafsúthreinsunarfasa úr blóðhólfinu (aukamynd. 3).Miðað við títrana sem gefnir voru og blóðrúmmál rottanna reiknuðum við út að aðeins um það bil 1% vigt.fagur úr gefnum skammti greindist í blóði 10 mínútum eftir inndælingu í bláæð.Eftir þessa fyrstu hröðu lækkun mældist hægari frumúthreinsun með helmingunartíma 27,7 mínútur.Mikilvægt er að aðeins mjög fáar fögur voru sóttar úr CSF hólfinu, sem gefur til kynna lágan bakgrunn fyrir villigerð phage flæði inn í CSF hólfið (viðbótarmynd 3).Að meðaltali greindust aðeins um 1 x 10-3% títrar af T7 fögum í blóði og 4 x 10-8% af fögum með innrennsli í upphafi í heila- og mænuvökva yfir allt sýnatökutímabilið (0-250 mín).Athyglisvert er að helmingunartími (25,7 mín.) villigerðarfaga í heila- og mænuvökva var svipaður og sást í blóði.Þessi gögn sýna að hindrunin sem aðskilur CSF hólfið frá blóðinu er ósnortinn í rottum með CM-hylki, sem gerir val á fögumsöfnum in vivo kleift að bera kennsl á klóna sem eru auðveldlega fluttir úr blóðinu inn í CSF hólfið.
(a) Að setja upp aðferð til að taka aftur sýni úr heila- og mænuvökva (CSF) úr stórri laug.(b) Skýringarmynd sem sýnir frumustaðsetningu miðtaugakerfis (CNS) hindrunarinnar og valstefnu sem notuð er til að bera kennsl á peptíð sem fara yfir blóð-heilaþröskuldinn (BBB) ​​og blóð-heilaþröskuldinn.(c) In vivo skimunarflæðirit fyrir fagaskjá.Í hverri vallotu var fögum (dýraauðkenni innan örvarnar) sprautað í bláæð.Tvær sjálfstæðar aðrar greinar (A, B) eru geymdar aðskildar þar til 4. umferð valsins.Fyrir vallotur 3 og 4 var hver föguklón sem dregin var út úr CSF handvirkt raðgreind.(d) Hreyfifræði faga einangruð úr blóði (rauðir hringir) og heila- og mænuvökva (grænir þríhyrningar) í fyrstu lotu vals í tveimur rottum með holræsi eftir inndælingu í bláæð á T7 peptíðsafninu (2 x 1012 fagur/dýr).Bláir reitir gefa til kynna meðaltal upphafsstyrks fögu í blóði, reiknað út frá magni fögu sem sprautað er inn, að teknu tilliti til heildar blóðrúmmáls.Svörtu ferningarnir gefa til kynna skurðpunkt y línunnar framreiknuð út frá styrk fagurs í blóði.(e,f) Sýndu hlutfallslega tíðni og dreifingu allra mögulegra þrípeptíðmóta sem skarast sem finnast í peptíðinu.Fjöldi mótífa sem finnast í 1000 lestrum er sýndur.Marktækt (p < 0,001) auðguð myndefni eru merkt með rauðum doppum.(e) Fylgnidreifingarrit sem ber saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmótífsins í sprautuðu safni við fagur úr blóði frá dýrum #1.1 og #1.2.(f) Fylgnidreifingarrit sem ber saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmótífa dýrafaga #1.1 og #1.2 einangruð í blóði og heila- og mænuvökva.(g, h) Framsetning raðar auðkennis á fögum auðgað í blóði (g) á móti inndældum söfnum og fögum auðgað í CSF (h) á móti blóði eftir lotu af in vivo vali í báðum dýrum.Stærð eins bókstafs kóðans gefur til kynna hversu oft þessi amínósýra kemur fyrir í þeirri stöðu.Grænt = skautað, fjólublátt = hlutlaust, blátt = basískt, rautt = súr og svart = vatnsfælnar amínósýrur.Mynd 1a, b var hönnuð og framleidd af Eduard Urich.
Við sprautuðum fagpeptíðsafni í tvær CM hljóðfærarottur (klæddar A og B) og einangruðum fagur úr heila- og mænuvökva og blóði (mynd 1d).Upphafleg hröð úthreinsun safnsins var minna áberandi samanborið við villigerðina.Meðalhelmingunartími safnsins sem sprautað var í báðum dýrunum var 24,8 mínútur í blóði, svipað og villigerð fögur, og 38,5 mínútur í CSF.Blóð- og heila- og mænuvökvafagasýni úr hverju dýri voru gefin fyrir HTS og öll auðkennd peptíð greind með tilliti til tilvistar stutts þrípeptíðmótífs.Þrípeptíðmótíf voru valin vegna þess að þau veita lágmarksgrundvöll fyrir uppbyggingu bygginga og peptíð-próteinsamskipta14,15.Við fundum góða fylgni í dreifingu mótífa á milli sprautaða fagasafnsins og klóna sem dregin voru út úr blóði beggja dýranna (mynd 1e).Gögnin benda til þess að samsetning safnsins sé aðeins lítillega auðguð í blóðhólfinu.Amínósýrutíðni og samstöðuröð voru greind frekar í hverri stöðu með því að nota aðlögun á Weblogo16 hugbúnaðinum.Athyglisvert er að við fundum sterka auðgun á glýsínleifum í blóði (mynd 1g).Þegar blóð var borið saman við klóna sem valdir voru úr CSF, sást sterkt val og nokkurt frával mótífa (Mynd 1f), og ákveðnar amínósýrur voru helst til staðar á fyrirfram ákveðnum stöðum í 12-liða (Mynd 1h).Sérstaklega var marktækur munur á einstökum dýrum í heila- og mænuvökva, en blóðglýsínauðgun sást hjá báðum dýrum (aukamynd. 4a–j).Eftir stranga síun á raðgögnum í heila- og mænuvökva dýra #1.1 og #1.2 fengust samtals 964 og 420 einstök 12-mera peptíð (viðbótarmynd 1d–e).Einangruðu fagklónin voru mögnuð og látin fara í aðra umferð af in vivo vali.Fagur, sem dreginn var út úr annarri vallotu, voru látnar undirgangast HTS í hverju dýri og öll auðkennd peptíð voru notuð sem inntak í mótífaþekkingaráætlun til að greina tilvist þrípeptíðmótífa (mynd 2a, b, ef).Í samanburði við fyrstu lotu fögursins sem var endurheimt úr CSF, sáum við frekara val og afval á mörgum myndefnum í CSF í greinum A og B (mynd 2).Netaauðkenningaralgrím var beitt til að ákvarða hvort þau táknuðu mismunandi mynstur samræmdrar röð.Greinileg líkindi sást á milli 12-víddar raðanna sem endurheimt var af CSF í öðrum flokki A (mynd 2c, d) og klæði B (mynd 2g, h).Samanlögð greiningin í hverri grein leiddi í ljós mismunandi valsnið fyrir 12-mera peptíð (viðbótarmynd 5c,d) og aukningu á CSF/blóðtítrahlutfalli með tímanum fyrir sameinuð klón eftir aðra vallotu samanborið við fyrstu vallotu (viðbótarmynd 5e).).
Auðgun mótífa og peptíða í heila- og mænuvökva með tveimur samfelldum umferðum af in vivo vali á virkum fögum.
Öllum heila- og mænuvökvafögum sem endurheimtust úr fyrstu lotu hvers dýrs (dýr #1.1 og #1.2) var safnað saman, magnað upp, HT-raðað og endursprautað saman (2 x 1010 fagur/dýr) 2 SM rottur með holur (#1.1 → #).2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4).(a,b,e,f) Fylgnidreifingarrit sem bera saman hlutfallslega tíðni þrípeptíðmynda allra fögum sem eru unnin í CSF í fyrstu og annarri vallotu.Hlutfallsleg tíðni og dreifing mótífa sem tákna öll möguleg þrípeptíð sem skarast sem finnast í peptíðum í báðum stefnum.Fjöldi mótífa sem finnast í 1000 lestrum er sýndur.Myndefni sem voru marktækt (p < 0,001) valin eða útilokuð í einu af samanburðarsafnunum eru auðkennd með rauðum punktum.(c, d, g, h) Framsetning raðarmerkis á öllum CSF-ríkum 12 amínósýrum löngum raðir byggðar á umferðum 2 og 1 í vali in vivo.Stærð eins bókstafs kóðans gefur til kynna hversu oft þessi amínósýra kemur fyrir í þeirri stöðu.Til að tákna lógóið er tíðni CSF raða sem dregin eru út úr einstökum dýrum á milli tveggja vallota borin saman og auðguðu raðirnar í annarri umferð eru sýndar: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4.Auðguðustu amínósýrurnar á tiltekinni stöðu í (c, d) dýrum nr.2.1 og nr.2.2 eða (g, h) í dýrum nr.2.3 og nr.2.4 eru sýndar í lit.Grænt = skautað, fjólublátt = hlutlaust, blátt = basískt, rautt = súr og svart = vatnsfælnar amínósýrur.
Eftir þriðju vallotu, auðkenndum við 124 einstakar peptíðraðir (#3.1 og #3.2) úr 332 CSF-uppleystum fagurklónum einangruðum úr tveimur dýrum (viðbótarmynd 6a).Röð LGSVS (18,7%) var með hæsta hlutfallslega hlutfallið, þar á eftir komu villigerðin PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) og SARGSWREIVSLS (2,2%).Í síðustu fjórðu umferð sameinuðum við tvær óháð völdum greinum úr þremur aðskildum dýrum (mynd 1c).Af 925 raðgreindum fögum klónum sem endurheimt var úr CSF fundum við í fjórðu umferð 64 einstakar peptíð raðir (aukamynd 6b), þar á meðal fór hlutfallslegt hlutfall villigerðar fögum niður í 0,8%.Algengustu CSF klónarnir í fjórðu umferð voru LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) og RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Lengdarsvið valinna peptíðanna stafar af innsetningum/úrfellingum á núkleótíðum eða ótímabærum stöðvunartáknum í frumurum safnsins þegar úrkynjaðir kóðar eru notaðir við hönnun NNK safns.Ótímabær stöðvunarkódon mynda styttri peptíð og eru valin vegna þess að þau innihalda hagstæða aa mótíf.Lengri peptíð geta stafað af innsetningum/úrfellingum í primerum tilbúnu söfnanna.Þetta staðsetur hönnuð stöðvunarkódon utan rammans og les hann þar til nýr stöðvunarkódon birtist niðurstreymis.Almennt reiknuðum við auðgunarstuðla fyrir allar fjórar valloturnar með því að bera saman inntaksgögnin við sýnishornsúttaksgögnin.Fyrir fyrstu lotu skimunar, notuðum við villigerð fagurtítra sem ósértæka bakgrunnsviðmiðun.Athyglisvert er að neikvætt fagurval var mjög sterkt í fyrstu CSF hringrásinni, en ekki í blóði (Mynd 3a), sem gæti stafað af litlum líkum á óvirkri dreifingu flestra meðlima peptíðsafnsins inn í CSF hólfið eða ættingja fög hafa tilhneigingu til að haldast á skilvirkari hátt eða fjarlægja úr blóðrásinni en bakteríufagur.Hins vegar, í annarri umferð pönnunar, kom fram sterkt úrval af fögum í CSF í báðum klæðunum, sem bendir til þess að fyrri umferðin hafi verið auðguð á föðum sem sýna peptíð sem stuðla að CSF upptöku (mynd 3a).Aftur, án verulegrar blóðauðgunar.Einnig í þriðju og fjórðu lotu auðguðust fögur klónarnir marktækt á CSF.Með því að bera saman hlutfallslega tíðni hverrar einstakrar peptíðraðar á milli síðustu tveggja umferða valsins, komumst við að því að röðin var enn auðguð í fjórðu valinu (mynd 3b).Alls voru 931 þrípeptíð mótíf dregin út úr öllum 64 einstöku peptíðröðunum með því að nota báðar peptíðstefnur.Auðguðu myndefnin í fjórðu umferð voru skoðuð betur með tilliti til auðgunarsniðs þeirra yfir allar umferðir samanborið við sprautað safn (skerðing: 10% auðgun) (aukamynd. 6c).Almenn valmynstur sýndi að flestar af þeim hvötum sem rannsökuð voru voru auðguð í öllum fyrri umferðum beggja valgreina.Hins vegar voru sum mótíf (td SGL, VSG, LGS GSV) aðallega úr valflokki A, á meðan önnur (td FGW, RTN, WGF, NTR) voru auðguð í öðrum flokki B.
Staðfesting á CSF flutningi á CSF auðgað fagur-sýnt peptíð og biotinylated leader peptíð samtengd streptavidin farms.
(a) Auðgunarhlutföll reiknuð út í öllum fjórum umferðunum (R1-R4) byggt á inndældum (inntak = I) fagur (PFU) títrum og ákvörðum CSF fagur títrum (framleiðsla = O).Auðgunarstuðlar fyrir síðustu þrjár umferðirnar (R2-R4) voru reiknaðar út með samanburði við fyrri umferð og fyrstu umferð (R1) með þyngdargögnum.Opnar stangir eru heila- og mænuvökvi, skyggðar stangir eru plasma.(***p<0,001, byggt á t-prófi nemenda).(b) Listi yfir algengustu fagpeptíðin, raðað eftir hlutfallslegu hlutfalli þeirra við allar fög sem safnað er í CSF eftir 4. umferð valsins.Sex algengustu fagklónarnir eru auðkenndir í lit, númeraðir og auðgunarþættir þeirra á milli umferða 3 og 4 í vali (innfellingar).(c,d) Sex auðguðust fagklónar, tómar fagur og foreldrisfagur peptíðsöfn frá 4. umferð voru greind hver fyrir sig í CSF sýnatökulíkani.CSF og blóðsýni voru tekin á tilgreindum tímapunktum.(c) Jafnt magn af 6 kandídata fögum klónum (2 x 1010 fögur/dýr), tómum fögum (# 1779) (2 x 1010 fögur/dýr) og stofnföskum peptíðsöfnum (2 x 1012 fögum/dýrum) Sprautaðu að minnsta kosti 3 CM í dósinni sem gefin er aðskilin í æðar dýrsins.Lyfjahvörf heila- og æðakerfis (CSF) hvers inndælts fagklóns og fagpeptíðasafns með tímanum eru sýnd.(d) sýnir meðalhlutfall CSF/blóð fyrir allar endurheimtar fögur/ml yfir sýnatökutímann.(e) Fjögur tilbúin leiðtogapeptíð og ein spæna stjórna voru tengd bíótíni við streptavídín í gegnum N-enda þeirra (tetramer skjár) fylgt eftir með inndælingu (bláæðar í bláæð, 10 mg streptavídín/kg).Að minnsta kosti þrjár þræddar rottur (N = 3).).CSF sýnum var safnað á tilgreindum tímapunktum og streptavidín styrkur var mældur með CSF and-streptavidin ELISA (nd = ekki greint).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, byggt á ANOVA prófi).(f) Samanburður á amínósýruröð auðgaðasta fagpeptíðklónsins #2002 (fjólublár) við önnur valin fagpeptíðklón úr 4. vallotu.Sams konar og svipuð amínósýrubrot eru litakóðuð.
Af öllum auðguðu fögum í fjórðu umferð (mynd 3b) voru sex umsækjendur klónar valdir til frekari einstaklingsgreiningar í CSF sýnatökulíkani.Jafnt magn af sex kandídata fögum, tómum fögum (engin innskot) og spádómapeptíðasöfnum var sprautað í þrjú CM dýr með holur og lyfjahvörf voru ákvörðuð í CSF (mynd 3c) og blóði (aukamynd 7) prófum.Allir fagklónar sem prófaðir voru beittu CSF hólfinu á stigi sem var 10-1000 sinnum hærra en á tómu viðmiðunarfögum (#1779).Til dæmis höfðu klónar #2020 og #2077 um 1000 sinnum hærri CSF títra en viðmiðunarfagur.Lyfjahvarfafræðileg snið hvers valins peptíðs er mismunandi, en öll hafa þau mikla CSF homing getu.Við sáum stöðuga fækkun með tímanum fyrir klóna #1903 og #2011, en fyrir klóna #2077, #2002 og #2009 gæti aukning á fyrstu 10 mínútunum bent til virkan flutnings en þarf að staðfesta.Klón #2020, #2002 og #2077 náðu stöðugleika á háu stigi, á meðan styrkur CSF klóns #2009 minnkaði hægt eftir fyrstu aukningu.Við bárum síðan saman hlutfallslega tíðni hvers CSF frambjóðanda við blóðstyrk þess (mynd 3d).Fylgni meðaltítra hvers umsækjenda um CSF við blóðtítra hans á öllum sýnatökutímum sýndi að þrír af sex umsækjendum voru marktækt auðgaðir á CSF í blóði.Athyglisvert er að klón #2077 sýndi meiri blóðstöðugleika (viðbótarmynd 7).Til að staðfesta að peptíðin sjálf séu fær um að flytja á virkan hátt annan farm en fagagnir inn í CSF hólfið, mynduðum við fjögur leiðtogapeptíð afleidd með bíótíni á N-endanum þar sem peptíðin festast við fagagnina.Bíótínýleruð peptíð (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) voru samtengd streptavidíni (SA) til að fá fjölmerísk form sem líkja nokkuð eftir rúmfræði faga.Þetta snið gerði okkur einnig kleift að mæla útsetningu fyrir SA í blóði og heila- og mænuvökva sem farmflytjandi próteinpeptíð.Mikilvægt er að oft var hægt að endurskapa phage gögn þegar tilbúið peptíð voru gefin á þessu SA-tengda sniði (mynd 3e).Skrældu peptíðin höfðu minni upphaflega útsetningu og hraðari úthreinsun CSF með ómælanlegum styrk innan 48 klst.Til að öðlast innsýn í afhendingarleiðir þessara peptíðfagklóna inn í CSF rýmið, greindum við staðsetningu einstakra fagpeptíðhits með því að nota ónæmisvefjaefnafræði (IHC) til að greina fagagnir beint 1 klukkustund eftir inndælingu í bláæð in vivo.Sérstaklega var hægt að greina klóna #2002, #2077 og #2009 með sterkri litun í heilaháræðum, en viðmiðunarfagur (#1779) og klón #2020 greindust ekki (aukamynd 8).Þetta bendir til þess að þessi peptíð stuðli að áhrifum á heilann einmitt með því að fara yfir BBB.Nánari ítarleg greining er nauðsynleg til að prófa þessa tilgátu, þar sem BSCFB leiðin gæti einnig átt við.Þegar amínósýruröð auðgaðasta klónsins (#2002) var borin saman við önnur valin peptíð kom fram að sum þeirra hafa svipaðar amínósýrulengingar, sem gæti bent til svipaðs flutningskerfis (mynd 3f).
Vegna einstaks plasmaprófíls og marktækrar aukningar á CSF með tímanum, var fögur sýna klón #2077 kannað frekar á lengri 48 klst tímabil og var fær um að endurskapa hröð aukningu á CSF sem sést í tengslum við viðvarandi SA gildi (mynd 4a).Varðandi önnur auðkennd fagklón, litaðist #2077 sterklega fyrir háræðar í heila og sýndi umtalsverða samsetningu með háræðamerkjalektíni þegar það var skoðað í hærri upplausn og hugsanlega einhverja litun í parenchymal rýminu (Mynd 4b).Til að kanna hvort hægt væri að ná fram peptíðmiðluðum lyfjafræðilegum áhrifum í miðtaugakerfi, gerðum við tilraun þar sem bíótínýleruðum útgáfum af i) #2077 transitpeptíðinu og ii) BACE1 hemla peptíðinu var blandað saman við SA í tveimur mismunandi hlutföllum.Fyrir eina samsetningu notuðum við aðeins BACE1 peptíðhemilinn og fyrir hina notuðum við 1:3 hlutfall BACE1 peptíðhemils og #2077 peptíðs.Bæði sýnin voru gefin í bláæð og magn beta-amyloid peptíðs 40 (Abeta40) í blóði og heila- og mænuvökva var mælt með tímanum.Abeta40 var mæld í CSF þar sem það endurspeglar BACE1 hömlun í heilablóðfalli.Eins og búist var við lækkuðu báðir flétturnar verulega blóðþéttni Abeta40 (mynd 4c, d).Hins vegar eru aðeins sýni sem innihalda blöndu af peptíð nr.2077 og hemill á BACE1 peptíðinu sem var samtengt við SA olli marktækri lækkun á Abeta40 í heila- og mænuvökva (mynd 4c).Gögnin sýna að peptíð nr.2077 er fær um að flytja 60 kDa SA próteinið inn í miðtaugakerfið og framkallar einnig lyfjafræðileg áhrif með SA-tengdum hemlum BACE1 peptíðsins.
(a) Klónasprauta (2 × 10 fögur/dýr) af T7 fögum sem sýnir langtíma lyfjahvörf CSF peptíðs #2077 (RLSSVDSDLSGC) og ósprautaðrar viðmiðunarfaga (#1779) í að minnsta kosti þrjár CM-þróaðar rottur.(b) Confocal smásjá mynd af dæmigerðum heilaberki í rottum (2 × 10 10 fagur/dýr) sem sprautað var í fagur sem sýnir mótlitun á peptíð #2077 og æðum (lektín).Þessir föguklónar voru gefnir 3 rottum og leyft að fara í hringrás í 1 klukkustund fyrir gegnflæði.Heili var sneiddur í sneiðar og litaður með fjölstofna FITC-merktum mótefnum gegn T7 föguhylki.Tíu mínútum fyrir gegnflæði og síðari festingu var DyLight594-merkt lektín gefið í bláæð.Flúrljómandi myndir sem sýna lektínlitun (rauð) á luminal hlið öræða og fögum (græn) í holrými háræða og heilavefs um æðar.Kvarðastöngin samsvarar 10 µm.(c, d) Bíótínýlerað BACE1 hamlandi peptíð eitt sér eða í samsetningu með bíótínýleruðu flutningspeptíð #2077 var tengt streptavidíni fylgt eftir með inndælingu í bláæð á að minnsta kosti þremur CM rottum með holur (10 mg streptavidín/kg).BACE1 peptíð hemla-miðluð lækkun á Aβ40 var mæld með Aβ1-40 ELISA í blóði (rautt) og heila- og mænuvökva (appelsínugult) á tilgreindum tímapunktum.Fyrir betri skýrleika er punktalína dregin á línuritið í 100% mælikvarða.(c) Hlutfallslækkun á Aβ40 í blóði (rauðir þríhyrningar) og heila- og mænuvökva (appelsínugulir þríhyrningar) hjá rottum sem voru meðhöndlaðar með streptavidíni tengt við flutningspeptíð #2077 og BACE1 hamlandi peptíð í 3:1 hlutfalli.(d) Hlutfallslækkun á Aβ40 í blóði (rauðir hringir) og heila- og mænuvökva (appelsínugulir hringir) hjá rottum sem eru meðhöndlaðar með streptavidíni sem eingöngu er tengt við BACE1 hamlandi peptíð.Aβ styrkur í samanburðarhópnum var 420 pg/ml (staðalfrávik = 101 pg/ml).
Áfangaskjár hefur verið beitt með góðum árangri á nokkrum sviðum líflæknisfræðilegra rannsókna17.Þessi aðferð hefur verið notuð fyrir in vivo æðafjölbreytileikarannsóknir18,19 sem og rannsóknir sem beinast að heilaæðum20,21,22,23,24,25,26.Í þessari rannsókn útvíkkuðum við beitingu þessarar valaðferðar ekki aðeins til beina auðkenningar á peptíðum sem miða á heilaæðar, heldur einnig til uppgötvunar umsækjenda með virka flutningseiginleika til að fara yfir blóð-heila þröskuldinn.Við lýsum nú þróun in vivo valferlis í CM-þurruðum rottum og sýnum möguleika þess til að bera kennsl á peptíð með CSF homing eiginleika.Með því að nota T7 fagur sem sýnir safn af 12-mera handahófi peptíðum, gátum við sýnt fram á að T7 fagur er nógu lítill (u.þ.b. 60 nm í þvermál)10 til að aðlagast blóð-heila þröskuldinum og fara þar með beint yfir blóð-heila þröskuldinn eða choroid plexus.Við sáum að uppskera CSF frá CM rottum með holur var vel stýrð in vivo virk skimunaraðferð og að útdregin fagur tengdist ekki aðeins æðakerfinu heldur virkaði einnig sem flutningsefni yfir blóð-heilaþröskuldinn.Ennfremur, með því að safna blóði samtímis og beita HTS á CSF og fögur úr blóði, staðfestum við að val okkar á CSF var ekki undir áhrifum af blóðauðgun eða hæfni til stækkunar á milli valsumferða.Hins vegar er blóðhólfið hluti af valferlinu, þar sem fagur sem geta náð til CSF hólfsins verða að lifa af og dreifast í blóðrásinni nógu lengi til að auðga sig í heilanum.Til þess að ná áreiðanlegum röðupplýsingum úr hráum HTS gögnum, innleiddum við síur sem lagaðar voru að vettvangssértækum raðunarvillum í greiningarvinnuflæðinu.Með því að fella hreyfibreytur inn í skimunaraðferðina, staðfestum við hröð lyfjahvörf villigerðar T7 faga (t½ ~ 28 mín) í blóði24, 27, 28 og ákváðum einnig helmingunartíma þeirra í heila- og mænuvökva (t½ ~ 26 mín) á mínútu).Þrátt fyrir svipaðar lyfjahvarfasnið í blóði og CSF, var aðeins hægt að greina 0,001% af blóðþéttni faga í CSF, sem gefur til kynna lágan bakgrunnshreyfanleika villigerðar T7-faga yfir blóð-heilaþröskuldinn.Þessi vinna undirstrikar mikilvægi fyrstu lotu vals þegar notaðar eru in vivo aðferðir til að rýma, sérstaklega fyrir fagurkerfi sem eru fljótt hreinsuð úr blóðrásinni, þar sem fáir klónar komast í miðtaugakerfið.Þannig var minnkun á fjölbreytileika safnsins mjög mikil í fyrstu umferð, þar sem aðeins takmörkuðum fjölda klóna var að lokum safnað í þessu mjög stranga CSF líkani.Þessi in vivo aðferð innifalin í nokkrum valþrepum eins og virkri uppsöfnun í CSF hólfinu, klónalifun í blóðhólfinu og fljótur flutningur á T7 fagklónum úr blóðinu innan fyrstu 10 mínútna (mynd 1d og viðbótarmynd 4M).).Þannig, eftir fyrstu lotu, voru mismunandi klónar á fögum greind í CSF, þó að sama upphafssafnið hafi verið notað fyrir einstök dýr.Þetta bendir til þess að mörg ströng valskref fyrir heimildasöfn með miklum fjölda bókasafnsmeðlima leiði til verulegrar minnkunar á fjölbreytileika.Þess vegna verða tilviljanakenndir atburðir óaðskiljanlegur hluti af upphaflegu valferlinu og hafa mikil áhrif á niðurstöðuna.Líklegt er að mörg af klónunum í upprunalega safninu hafi mjög svipaða tilhneigingu til auðgunar CSF.Hins vegar, jafnvel við sömu tilraunaaðstæður, geta valniðurstöður verið mismunandi vegna þess hve fáir hvern tiltekinn klón er í upphaflegu safninu.
Mótífin sem eru auðguð í CSF eru ólík þeim sem eru í blóðinu.Athyglisvert var að við tókum eftir fyrstu breytingunni í átt að glýsínríkum peptíðum í blóði einstakra dýra.(Mynd 1g, aukamyndir 4e, 4f).Fagur sem innihalda glýsínpeptíð geta verið stöðugri og ólíklegri til að vera tekin úr blóðrásinni.Hins vegar fundust þessi glýsínríku peptíð ekki í sýnum í heila- og mænuvökva, sem bendir til þess að safnsöfnin hafi farið í gegnum tvö mismunandi valþrep: eitt í blóðinu og annað leyft að safnast fyrir í heila- og mænuvökvanum.CSF-auðgaðir klónar sem verða til í fjórðu vallotunni hafa verið mikið prófuð.Staðfest var að næstum allir klónarnir sem voru prófaðir fyrir sig væru auðgaðir á CSF samanborið við auða viðmiðunarfaga.Eitt peptíðslag (#2077) var skoðað nánar.Það sýndi lengri helmingunartíma í plasma samanborið við önnur högg (Mynd 3d og viðbótarmynd 7), og athyglisvert, þetta peptíð innihélt cysteinleifar í C-endanum.Nýlega hefur verið sýnt fram á að viðbót cysteins við peptíð getur bætt lyfjahvörf þeirra með því að bindast albúmíni 29 .Þetta er sem stendur óþekkt fyrir peptíð #2077 og krefst frekari rannsóknar.Sum peptíð sýndu gildisháð í CSF auðgun (gögn ekki sýnd), sem gæti tengst sýndri yfirborðsrúmfræði T7 hylkisins.T7 kerfið sem við notuðum sýndi 5-15 eintök af hverju peptíði fyrir hverja föguögn.IHC var framkvæmt á frambjóðandi blýfaga klónum sem sprautað var í bláæð í heilaberki rotta (aukamynd 8).Gögnin sýndu að að minnsta kosti þrír klónar (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) höfðu samskipti við BBB.Það á eftir að ákvarða hvort þessi BBB-víxlverkun leiði til uppsöfnunar CSF eða flutnings þessara klóna beint til BCSFB.Mikilvægt er að við sýnum að valin peptíð halda CSF flutningsgetu sinni þegar þau eru mynduð og bundin við próteinfarm.Binding N-enda bíótínýleraðra peptíða við SA endurtekur í raun niðurstöðurnar sem fengust með viðkomandi fögum klónum þeirra í blóði og heila- og mænuvökva (mynd 3e).Að lokum sýnum við að blýpeptíð #2077 er fær um að stuðla að heilavirkni bíótínýleraðs peptíðhemils BACE1 sem er samtengt við SA, sem veldur áberandi lyfjafræðilegum áhrifum í miðtaugakerfi með því að draga verulega úr Abeta40 gildum í CSF (mynd 4).Okkur tókst ekki að bera kennsl á neinar samsvörun í gagnagrunninum með því að framkvæma leit í peptíðröð samkynhneigðra allra hittinga.Það er mikilvægt að hafa í huga að stærð T7 safnsins er um það bil 109, en fræðileg bókasafnsstærð fyrir 12-mera er 4 x 1015. Þess vegna völdum við aðeins lítið brot af fjölbreytileikarými 12-mera peptíðsafnsins, sem getur þýtt að hægt sé að bera kennsl á fínstilltari peptíð með því að bera kennsl á aðliggjandi hitaröð þessara aðliggjandi rýma.Tilgáta, ein af ástæðunum fyrir því að við höfum ekki fundið nein náttúruleg samsvörun þessara peptíða gæti verið afval við þróun til að koma í veg fyrir stjórnlausa innkomu ákveðinna peptíðmótífa inn í heilann.
Samanlagt gefa niðurstöður okkar grunn fyrir framtíðarvinnu við að greina og einkenna flutningskerfi heilaæðahindrunarinnar in vivo nánar.Grunnuppsetning þessarar aðferðar er byggð á hagnýtri valstefnu sem auðkennir ekki aðeins klóna með æðabindingareiginleika í heila, heldur felur einnig í sér mikilvægt skref þar sem farsæl klón hafa innri virkni til að fara yfir líffræðilegar hindranir in vivo inn í miðtaugakerfið.er að útskýra flutningsmáta þessara peptíða og val þeirra fyrir bindingu við öræðakerfi sem er sértækt fyrir heilasvæðið.Þetta getur leitt til uppgötvunar á nýjum leiðum fyrir flutning BBB og viðtaka.Við gerum ráð fyrir að auðkennd peptíð geti beinlínis tengst heilaæðaviðtökum eða bindlum sem eru fluttir í gegnum BBB eða BCSFB.Peptíðferjurnar með CSF flutningsvirkni sem fundust í þessari vinnu verða rannsakaðar frekar.Við erum nú að rannsaka heilasérhæfni þessara peptíða fyrir getu þeirra til að fara yfir BBB og/eða BCSFB.Þessi nýju peptíð verða afar verðmæt verkfæri fyrir hugsanlega uppgötvun nýrra viðtaka eða ferla og fyrir þróun nýrra mjög skilvirkra vettvanga fyrir afhendingu stórsameinda, svo sem lífefna, til heilans.
Hreinsaðu stóru brunninn (CM) með því að nota breytingu á áður lýstri aðferð.Svæfingar Wistar rottur (200-350 g) voru settar á stereótaxísk tæki og miðgildi skurðar var gerður yfir rakaðan og smitgátlega undirbúinn hársvörð til að afhjúpa höfuðkúpuna.Boraðu tvö göt á svæði efri rimarinnar og festu festiskrúfurnar í götin.Önnur gat var borað í hlið hnakkakamsins til að leiða stöðluðu hnút úr ryðfríu stáli inn í CM.Settu tannsement í kringum holnálina og festu með skrúfum.Eftir ljósherðingu og sementsherðingu var húðsárinu lokað með 4/0 supramid saum.Rétt staðsetning holnálarinnar er staðfest með sjálfsprottnum leka á heila- og mænuvökva (CSF).Fjarlægðu rottuna úr staðalímyndabúnaðinum, fáðu viðeigandi umönnun og verkjameðferð eftir aðgerð og leyfðu henni að jafna sig í að minnsta kosti eina viku þar til merki um blóð sjást í heila- og mænuvökva.Wistar rottur (Crl:WI/Han) voru fengnar frá Charles River (Frakklandi).Allar rottur voru geymdar við sérstakar aðstæður án sjúkdómsvalda.Allar dýratilraunir voru samþykktar af dýralæknastofu Baselborgar, Sviss, og voru framkvæmdar í samræmi við dýraleyfi nr. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Haltu rottunni varlega við meðvitund með CM holnál í hendi.Fjarlægðu Datura úr holnálinu og safnaðu 10 µl af heila- og mænuvökva sem flæðir sjálfkrafa.Þar sem friðhelgi holnálarinnar var á endanum í hættu voru aðeins tær sýni úr heila- og mænuvökva án vísbendinga um blóðmengun eða mislitun tekin með í þessari rannsókn.Samhliða voru um það bil 10–20 μl af blóði tekin úr litlum skurði á halaoddinum í rör með heparíni (Sigma-Aldrich).CSF og blóði var safnað á ýmsum tímapunktum eftir inndælingu T7 fagur í bláæð.Um það bil 5–10 μl af vökva var fleygt áður en hverju CSF sýni var safnað, sem samsvarar dauðarúmmáli leggsins.
Bókasöfn voru mynduð með því að nota T7Select 10-3b vektorinn eins og lýst er í T7Select kerfishandbókinni (Novagen, Rosenberg o.fl., InNovations 6, 1-6, 1996).Í stuttu máli var tilviljanakennd 12-mera DNA innskot mynduð á eftirfarandi sniði:
NNK merkið var notað til að forðast tvöfalda stöðvunarkódon og oftjáningu amínósýru í innskotinu.N er handblandað jafnmólhlutfall hvers núkleótíðs og K er handblandað jafnmólhlutfall adeníns og cýtósínkjarna.Einstrengja svæðum var breytt í tvíþátta DNA með frekari ræktun með dNTP (Novagen) og Klenow ensími (New England Biolabs) í Klenow jafnalausn (New England Biolabs) í 3 klukkustundir við 37°C.Eftir hvarfið var tvíþátta DNA endurheimt með EtOH útfellingu.DNA sem myndast var melt með skerðingarensímum EcoRI og HindIII (bæði frá Roche).Kljúfa og hreinsaða (QIAquick, Qiagen) innskotið (T4 lígasa, New England Biolabs) var síðan tengt í ramma inn í fyrirfram klofna T7 ferju eftir amínósýru 348 af 10B kapsíðgeninu.Löndunarhvörf voru ræktuð við 16°C í 18 klukkustundir fyrir in vitro pökkun.Fatapökkun in vitro var framkvæmd í samræmi við leiðbeiningarnar sem fylgdu með T7Select 10-3b klónunarsettinu (Novagen) og pökkunarlausnin var mögnuð upp einu sinni til ljóss með því að nota Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysötin voru skilgreind, títruð og fryst við -80°C sem stofnlausn af glýseróli.
Bein PCR mögnun á breytilegum sviðum faga sem eru mögnuð í seyði eða plötu með því að nota sérsniðna 454/Roche-amplicon samruna grunna.Framsamruni grunnurinn inniheldur raðir sem liggja að hlið breytilegu svæðisins (NNK) 12 (sniðmátssértækt), GS FLX títan millistykki A og fjögurra grunna bókasafnslyklaröð (TCAG) (viðbótarmynd 1a):
Reverse fusion primerinn inniheldur einnig bíótín sem er tengt við fangaperlur og GS FLX títan millistykki B sem þarf til klónamögnunar meðan á fleyti PCR stendur:
Amplicons voru síðan látin fara í 454/Roche pyrosequencing samkvæmt 454 GS-FLX Titanium siðareglum.Fyrir handvirka Sanger raðgreiningu (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) var T7 fagur DNA magnað upp með PCR og raðgreint með eftirfarandi grunnpörum:
Innskot úr einstökum skellum voru látin fara í PCR mögnun með því að nota Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda).Framkvæma heita byrjun (10 mín við 95 °C) og 35 boostlotur (50 s við 95 °C, 1 mín við 50 °C og 1 mín við 72 °C).
Fagur úr bókasöfnum, villigerða fagur, fagur bjargað úr CSF og blóði, eða einstakir klónar voru magnaðir í Escherichia coli BL5615 í berklasoði (Sigma Aldrich) eða í 500 cm2 diska (Thermo Scientific) í 4 klst við 37°C.Fagur voru dreginn út úr plötunum með því að skola plöturnar með Tris-EDTA stuðpúða (Fluka Analytical) eða með því að safna veggskjöldunum með dauðhreinsuðum pípettuoddum.Fagur voru einangraðir úr ræktunarfljótandi vökva eða útdráttarjafnalausn með einni umferð af pólýetýlen glýkóli (PEG 8000) útfellingu (Promega) og endurleyst í Tris-EDTA jafnalausn.
Magnaða fögin var látin fara í 2-3 umferðir af endótoxínfjarlægingu með því að nota endotoxínfjarlægingarperlur (Miltenyi Biotec) fyrir inndælingu í bláæð (500 μl/dýr).Í fyrstu umferð voru 2×1012 fög kynntar;í öðru, 2×1010 fög;í þriðju og fjórðu valsumferð, 2×109 fög á dýr.Fatainnihald í CSF og blóðsýnum sem safnað var á tilgreindum tímapunktum var ákvarðað með skellutalningu samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (T7Select kerfishandbók).Fagurval var framkvæmt með því að sprauta hreinsuðum söfnum í bláæð í halaæð eða með því að sprauta aftur á fagur sem dreginn var úr CSF úr fyrri vallotunni, og síðari uppskeran var framkvæmd eftir 10 mín, 30 mín, 60 mín, 90 mín, 120 mín, 180 mín, og 240 mín blóðsýni, í sömu röð.Alls voru gerðar fjórar umferðir af in vivo pönnunni þar sem tvær valdar greinar voru geymdar aðskildar og greindar í fyrstu þremur umferðum valsins.Öll föguinnskot sem dregin var út úr CSF úr fyrstu tveimur vallotunum voru látin fara í 454/Roche pyrosequencing, á meðan allir klónar sem dregin voru út úr CSF úr síðustu tveimur vallotunum voru handvirkt raðgreindir.Öll blóðföt úr fyrstu umferð valsins voru einnig látin fara í 454/Roche pyrosequencing.Til inndælingar á fagklónum voru valdar fagur magnaðir upp í E. coli (BL5615) á 500 cm2 plötum við 37°C í 4 klukkustundir.Einstaklega valdir og handvirkt raðaðir klónum var fjölgað í berklamiðli.Eftir útdrætti á fögum, hreinsun og fjarlægingu endotoxins (eins og lýst er hér að ofan), var 2×1010 fögum/dýr í 300 μl sprautað í bláæð í eina haulæð.
Forvinnsla og eigindleg síun raðgagna.Hráum 454/Roche gögnum var breytt úr tvöföldu stöðluðu straumkortasniði (sff) í Pearson mannalæsilegt snið (fasta) með hugbúnaði söluaðila.Frekari vinnsla á núkleótíðröðinni var framkvæmd með því að nota sérstakt C forrit og forskriftir (óútgefinn hugbúnaðarpakki) eins og lýst er hér að neðan.Greining á frumgögnum felur í sér strangar fjölþrepa síunaraðferðir.Til að sía út lestur sem innihélt ekki gilda 12mera innskots DNA röð, voru lesin samræmd í röð við upphafsmerki (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stöðvunarmerki (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) og bakgrunnsinnskot (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) með því að nota alþjóðlega Needleman-Wunsch prófið.jöfnun sem leyfir allt að 2 ósamræmi í hverri jöfnun31.Þess vegna voru lestur án upphafs- og stöðvunarmerkja og lestur sem innihalda bakgrunnsinnskot, þ.e. röðun sem fer yfir leyfilegan fjölda misræmis, fjarlægðar úr safninu.Hvað varðar aflestraröðina, þá var N-mer DNA röðin sem nær frá upphafsmerkinu og endar áður en stöðvunarmerkið klippt út úr upprunalegu lesröðinni og unnin frekar (hér á eftir nefnd „insert“).Eftir þýðingu á innskotinu er hluturinn á eftir fyrsta stöðvunarkódonnum við 5′ enda grunnsins fjarlægður úr innskotinu.Að auki voru kirni sem leiða til ófullkominna kódona við 3′ enda grunnsins einnig fjarlægð.Til að útiloka innskot sem innihalda aðeins bakgrunnsraðir voru þýddar innskot sem byrja á amínósýrumynstrinu „PAG“ einnig fjarlægð.Peptíð með lengd eftir þýðingu minni en 3 amínósýrur voru fjarlægð úr safninu.Að lokum skaltu fjarlægja offramboð í innskotslauginni og ákvarða tíðni hvers einstaks innskots.Niðurstöður þessarar greiningar innihéldu lista yfir núkleótíðraðir (innskot) og (lesið) tíðni þeirra (viðbótarmyndir 1c og 2).
Flokkaðu N-mer DNA innskot eftir röð líkt: Til að útrýma 454/Roche sértækum raðgreiningarvillum (svo sem vandamál með raðgreiningu samfjölliða framlenginga) og fjarlægja minna mikilvægar offramboð, eru áður síuð N-mer DNA röð innskot (innskot) flokkuð eftir líkt.innsetningar (allt að 2 ósamsvarandi grunnar leyfðar) með því að nota endurtekið reiknirit sem er skilgreint á eftirfarandi hátt: innsetningar eru flokkaðar fyrst eftir tíðni þeirra (hæsta til lægsta), og ef þær eru eins, eftir aukaflokkun þeirra eftir lengd (lengst til styst) ).Þannig skilgreina algengustu og lengstu innsetningarnar fyrsta „hópinn“.Hóptíðni er stillt á lykiltíðni.Síðan var reynt að bæta hverri innsetningu sem eftir var á flokkaða listanum við hópinn með því að stilla saman Needleman-Wunsch pör.Ef fjöldi ósamræmis, innsetninga eða eyðingar í röðun fer ekki yfir viðmiðunarmörkin 2, bætist innsetning í hópinn og heildartíðni hópsins eykst um hversu oft innsetningunni var bætt við.Innskot sem bætt er við hóp eru merkt sem notuð og útilokuð frá frekari vinnslu.Ef ekki er hægt að bæta innsetningarröðinni við hóp sem þegar er til, er innsetningarröðin notuð til að búa til nýjan hóp með viðeigandi innskotstíðni og merkt sem notuð.Endurtekningunni lýkur þegar hver innsetningarröð hefur annað hvort verið notuð til að mynda nýjan hóp eða hægt er að taka með í hóp sem þegar er til.Þegar öllu er á botninn hvolft eru hópsett innskot sem samanstanda af núkleótíðum að lokum þýdd yfir í peptíðraðir (peptíðsöfn).Niðurstaða þessarar greiningar er sett af innsetningum og samsvarandi tíðni þeirra sem mynda fjölda lestra í röð (aukamynd 2).
Myndun mótífa: Byggt á lista yfir einstök peptíð var búið til safn sem inniheldur öll möguleg amínósýrumynstur (aa) eins og sýnt er hér að neðan.Hvert mögulegt mynstur af lengd 3 var dregið úr peptíðinu og öfugu mynstri þess var bætt við ásamt sameiginlegu mótífsafni sem inniheldur öll mynstur (þrípeptíð).Bókasöfn með mjög endurteknum myndefnum voru raðgreind og offramboð fjarlægð.Síðan, fyrir hvert þrípeptíð í mótífsafninu, könnuðum við hvort það væri í safninu með því að nota reikniverkfæri.Í þessu tilviki er tíðni peptíðsins sem inniheldur þrípeptíðið sem fannst mótíf bætt við og úthlutað við mótífið í mótífasafninu („fjöldi mótífa“).Afrakstur mótífmyndunar er tvívítt fylki sem inniheldur öll tilvik þrípeptíða (mótífa) og gildi þeirra, sem eru fjöldi raðgreiningarlestra sem leiða til samsvarandi myndefnis þegar lesturinn er síaður, flokkaður og þýddur.Mælingar eins og lýst er ítarlega hér að ofan.
Stöðlun fjölda mótífa og samsvarandi dreifimynda: Fjöldi mótífa fyrir hvert sýni var staðlað með því að nota
þar sem ni er fjöldi lestra sem innihalda efni i.Þannig táknar vi prósentutíðni lestra (eða peptíða) sem innihalda mótíf i í sýninu.P-gildi fyrir óstaðlaðan fjölda mótífa voru reiknuð út með því að nota nákvæmlega próf Fisher.Varðandi fylgni á fjölda hvata voru fylgni Spearmans reiknuð út með því að nota staðlaðan fjölda hvata við R.
Til að sjá innihald amínósýra í hverri stöðu í peptíðsafninu voru vefmerki 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) búin til.Fyrst er innihald amínósýra í hverri stöðu 12-mera peptíðsins geymt í 20×12 fylki.Síðan er sett af 1000 peptíðum sem innihalda sama hlutfallslega amínósýruinnihald í hverri stöðu myndað í fasta-röð sniði og gefið sem inntak í vefmerki 3, sem myndar myndræna framsetningu á hlutfallslegu amínósýruinnihaldi í hverri stöðu.fyrir tiltekið peptíðsafn.Til að sjá fjölvíð gagnapakka voru búin til hitakort með því að nota innra þróað tól í R (biosHeatmap, R pakki sem á eftir að gefa út).Dendrografin sem sýnd eru í hitakortunum voru reiknuð út með því að nota stigveldisþyrpingaaðferð Ward með Euclidian distance metric.Fyrir tölfræðilega greiningu á stigagögnum um mótíf voru P gildi fyrir óeðlileg stig reiknuð með því að nota Fishers nákvæma próf.P-gildi fyrir önnur gagnasafn voru reiknuð í R með t-prófi nemenda eða ANOVA.
Valdir fagklónar og fagur án innskots voru sprautaðir í bláæð um halaæð (2×1010 fagur/dýr í 300 μl PBS).Tíu mínútum fyrir gegnflæði og festingu í kjölfarið var sömu dýrum sprautað í bláæð með 100 μl af DyLight594-merktu lektíni (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 mínútum eftir inndælingu á fögum var rottum gefið í gegnum hjartað með 50 ml af PBS og síðan 50 ml af 4% PFA/PBS.Heilasýni voru að auki fest yfir nótt í 4% PFA/PBS og liggja í bleyti í 30% súkrósa yfir nótt við 4°C.Sýni eru snöggfryst í OCT blöndunni.Ónæmisvefjaefnafræðileg greining á frosnum sýnum var gerð við stofuhita á 30 µm frystiskurðum sem voru stíflaðir með 1% BSA og ræktaðir með fjölstofna FITC-merktum mótefnum gegn T7 fagi (Novus NB 600-376A) við 4 °C.Ræktað yfir nótt.Að lokum voru sneiðarnar þvegnar þrisvar sinnum með PBS og skoðaðar með confocal leysismásjá (Leica TCS SP5).
Öll peptíð með lágmarkshreinleika 98% voru mynduð af GenScript USA, lífrænt og frostþurrkað.Bíótín er bundið í gegnum þrefalda glýsín spacer til viðbótar við N-enda.Athugaðu öll peptíð með massagreiningu.
Streptavidin (Sigma S0677) var blandað saman við 5-falda jafnmóla umframmagn af biotinýleruðu peptíði, biotinyleruðu BACE1 hamlandi peptíði, eða samsetningu (3:1 hlutfall) af biotinýleruðu BACE1 hamlandi peptíð og BACE1 hamlandi peptíð í DMSOBS/10% peptíði í PSOBS/10% peptíði.1 klukkustund við stofuhita fyrir inndælingu.Streptavidín-tengd peptíð voru sprautuð í bláæð með 10 mg/kg skammti í eina af halaæðum rotta með heilahol.
Styrkur streptavidín-peptíðfléttna var metinn með ELISA.Nunc Maxisorp míkrótíterplötur (Sigma) voru húðaðar yfir nótt við 4°C með 1,5 μg/ml músa and-streptavidin mótefni (Thermo, MA1-20011).Eftir lokun (blokkandi stuðpúði: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatín, 1% BSA) við stofuhita í 2 klukkustundir, þvoðu plötuna með 0,05% Tween-20/PBS (þvottabuffi) í 3 Í öðru lagi, CSF og plasmapúði þynnt:0ma var bætt við CSF, 0ma og plasmapúðablanda 0ma. SF 1:115).Platan var síðan ræktuð yfir nótt við 4°C með greiningarmótefni (1 μg/ml, and-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Eftir þrjú þvottaskref var streptavidín greint með ræktun í TMB hvarfefnislausn (Roche) í allt að 20 mín.Eftir að litaþróun hefur verið hætt með 1M H2SO4 skal mæla gleypni við 450 nm.
Virkni streptavidin-peptíð-BACE1 hemla flókins var metin með Aβ(1-40) ELISA samkvæmt samskiptareglum framleiðanda (Wako, 294-64701).Í stuttu máli voru CSF sýni þynnt í staðlaða þynningarefni (1:23) og ræktuð yfir nótt við 4°C í 96-brunnu plötum húðaðar með BNT77 fangamótefni.Eftir fimm þvottaþrep var HRP-tengdu BA27 mótefni bætt við og ræktað í 2 klukkustundir við 4°C, fylgt eftir með fimm þvottaskrefum.Aβ(1–40) greindist með ræktun í TMB lausn í 30 mínútur við stofuhita.Eftir að litaþróun hefur verið stöðvuð með stöðvunarlausn skal mæla gleypni við 450 nm.Plasmasýni voru gerð í fastfasaútdrætti fyrir Aβ(1–40) ELISA.Plasma var bætt við 0,2% DEA (Sigma) í 96-brunn plötum og ræktað við stofuhita í 30 mínútur.Eftir að hafa þvegið SPE plöturnar (Oasis, 186000679) í röð með vatni og 100% metanóli, var plasmasýnum bætt við SPE plöturnar og allur vökvi fjarlægður.Sýni voru þvegin (fyrst með 5% metanóli síðan 30% metanóli) og skoluð með 2% NH4OH/90% metanóli.Eftir þurrkun á skolvatninu við 55°C í 99 mínútur við stöðugan N2 straum voru sýnin minnkað í stöðluðum þynningarefnum og Aβ(1–40) mæld eins og lýst er hér að ofan.
Hvernig á að vitna í þessa grein: Urich, E. o.fl.Sending farms til heilans með því að nota flutningspeptíð sem auðkennd eru in vivo.vísindin.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Afhending stórsameindalyfja til heilans með markvissri meðferð.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. og Martinez-Martinez, P. Afhending peptíðs og próteinalyfja yfir blóð-heilaþröskuldinn.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blóð-heila hindrunin: flöskuháls í þróun heilalyfja.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG og Byrd, A. Horfur á bættri lyfjagjöf og miðun til heilans um choroid plexus-CSF ferilinn.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nútímavæðing líflyfja með sameinda Trójuhestum fyrir heilafæðingu.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM viðtaka-miðlaður peptíðflutningur yfir blóð-heila þröskuldinn.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. o.fl.Auka heilaskyggni og virkni lækningamótefna með því að nota eingildar sameindaskutlur.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. o.fl.Flutningur transferrínviðtaka (TfR) ákvarðar upptöku í heila á sækniafbrigðum TfR mótefna.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).