Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Genavigrar til meðferðar á slímseigjusjúkdómi í lungum ættu að miða á leiðandi öndunarvegi þar sem útlægur lungnaflutningur veitir ekki meðferðarlegan ávinning. Skilvirkni veiruflutnings er í beinu samhengi við dvalartíma veirunnar. Hins vegar dreifast afhendingarvökvar eins og genaflutningar náttúrulega inn í lungnablöðrurnar við innöndun og meðferðaragnir af hvaða formi sem er hreinsast hratt með slímhúðarflutningi. Að lengja dvalartíma genaflutninga í öndunarvegum er mikilvægt en erfitt að ná. Segulmagnaðir agnir sem tengjast genaflutninga og geta beint að yfirborði öndunarveganna geta bætt svæðisbundna markvissingu. Vegna áskorana við sjónræna sýn in vivo er hegðun slíkra lítilla segulmagnaðra agna á yfirborði öndunarvegarins í návist beitts segulsviðs illa skilin. Markmið þessarar rannsóknar var að nota samstillingarmyndgreiningu til að sjá in vivo hreyfingu röð segulmagnaðra agna í barkakýli svæfðra rotta til að kanna gangverk og mynstur hegðunar einstakra og magnagna in vivo. Við metum síðan einnig hvort afhending lentiveiru segulmagnaðra agna í návist segulsviðs myndi auka skilvirkni flutnings í rottum. barkakýli. Röntgenmyndgreining með samstilltum geislum sýnir hegðun segulmagnaðra agna í kyrrstæðum og hreyfanlegum segulsviðum in vitro og in vivo. Ekki er auðvelt að draga agnir eftir yfirborði lifandi öndunarvegar með seglum, en við flutning safnast útfellingarnar saman í sjónsviðinu þar sem segulsviðið er sterkast. Skilvirkni segulflutnings jókst einnig sexfalt þegar lentiveiru-segulmagnaðir agnir voru afhentar í návist segulsviðs. Saman benda þessar niðurstöður til þess að lentiveiru-segulmagnaðir agnir og segulsvið geti verið verðmætar aðferðir til að bæta markmiðun genavigera og auka umritunarstig í leiðandi öndunarvegum in vivo.
Blöðrusjúkdómur í blöðruvef (CF) orsakast af breytingu í einu geni sem kallast himnuleiðnistýrandi CF (CFTR). CFTR próteinið er jónagöng sem er til staðar í mörgum þekjufrumum um allan líkamann, þar á meðal í leiðni öndunarveginum, sem er aðal sjúkdómsmyndunarstaður CF. Gallar í CFTR leiða til óeðlilegs vatnsflutnings, sem veldur ofþornun á yfirborði öndunarvegarins og minnkar dýpt vökvalagsins á yfirborði öndunarvegarins (ASL). Þetta skerðir einnig getu slímhúðar- og flutningskerfisins (MCT) til að hreinsa innöndaðar agnir og sýkla úr öndunarveginum. Markmið okkar er að þróa genameðferð með lentiveiru (LV) til að skila réttu eintaki af CFTR geninu og bæta ASL, MCT og lungnaheilsu, og að halda áfram að þróa nýja tækni sem getur mælt þessa þætti in vivo1.
Venstreskeljavigrar eru einn helsti kosturinn í genameðferð við öndunarvegi CF, aðallega vegna þess að þeir geta varanlega samþætt meðferðargenið í grunnfrumur öndunarvegarins (stofnfrumur öndunarvegar). Þetta er mikilvægt vegna þess að þeir geta endurheimt eðlilega vökvagjöf og slímhreinsun með því að aðgreinast í virkar genaleiðréttar CF-tengdar yfirborðsfrumur öndunarvegar, sem leiðir til ævilangs ávinnings. Venstreskeljavigrar ættu að vera beint gegn leiðandi öndunarveginum, þar sem það er þar sem lungnasjúkdómur CF byrjar. Afhending vigursins dýpra í lungun getur leitt til lungnablöðruflutnings, en það hefur engin meðferðarleg ávinning í CF. Hins vegar flytjast vökvar eins og genaberar náttúrulega til lungnablaðra við innöndun eftir afhendingu3,4 og meðferðaragnir hreinsast hratt út í munnholið með MCT. Skilvirkni LV-flutnings er í beinu samhengi við þann tíma sem vigurinn er við hlið markfrumna til að leyfa frumuupptöku - „dvalartíminn“5 - sem er auðveldlega minnkaður með dæmigerðu svæðisbundnu loftstreymi sem og samhæfðri slímupptöku agna og MCT. Fyrir CF er hæfni til að lengja dvalartíma LV í öndunarveginum mikilvæg til að ná háu stigi flutnings á þessu svæði, en hefur hingað til verið krefjandi.
Til að yfirstíga þessa hindrun leggjum við til að segulagnir í vinstri slegilshluta (LV magnetic magnets, MPs) geti hjálpað á tvo vegu sem geta gagnast hvor öðrum. Í fyrsta lagi er hægt að stýra þeim með segulmagni að yfirborði öndunarvegarins til að bæta markmiðun og hjálpa genaflutningsagnunum að vera á viðkomandi svæði í öndunarvegi; og ASL) til að færast til frumulags 6. MPs hafa verið mikið notaðir sem markviss lyfjaflutningsleiðir þegar þeir bindast mótefnum, krabbameinslyfjum eða öðrum litlum sameindum sem festast við frumuhimnur eða bindast viðeigandi viðtökum á yfirborði frumu og safnast fyrir á æxlisstöðum í viðurvist stöðurafmagns. Segulsvið fyrir krabbameinsmeðferð 7. Aðrar „ofurhitaaðferðir“ miða að því að hita upp segulmagnaða frumuboðefni (MPs) þegar þau verða fyrir sveiflukenndum segulsviðum og eyðileggja þannig æxlisfrumur. Meginreglan um segulflutning, þar sem segulsvið er notað sem flutningsefni til að auka flutning DNA til frumna, er almennt notuð in vitro með því að nota fjölbreytt úrval af bæði veiru- og veiruerfðavísum fyrir frumulínur sem erfitt er að miðla. Árangur segulflutnings LV hefur verið staðfestur, þar sem LV-MPs eru afhendingar in vitro í berkjuþekjufrumulínu manna í viðurvist kyrrstætt segulsviðs, sem eykur skilvirkni flutnings um 186 falt samanborið við LV-vísitölu einn og sér. LV-MP hefur einnig verið notað í in vitro CF líkan, þar sem segulflutningur jók LV flutning í loft-vökva tengifletisræktunum um 20 falt í viðurvist CF slíms10. Hins vegar hefur in vivo segulflutningur líffæra fengið tiltölulega litla athygli og hefur aðeins verið metinn í fáeinum dýratilraunum. rannsóknir11,12,13,14,15, sérstaklega í lungum16,17. Engu að síður eru tækifærin til segulmagnaðrar innleiðingar í lungnameðferð með CF augljós. Tan o.fl. (2020) fullyrtu að „rannsókn sem sönnun á skilvirkri segulmagnaðri nanóagnagjöf í lungum muni ryðja brautina fyrir framtíðar innöndunaraðferðir með CFTR til að bæta klínískar niðurstöður hjá sjúklingum með CF“6.
Hegðun lítilla segulmagnaðra agna á yfirborði öndunarvegar í návist segulsviðs er erfið að sjá og rannsaka og því illa skilin. Í öðrum rannsóknum þróuðum við aðferð sem byggir á fasa-andstæðu röntgenmyndgreiningu með samstillingar-útbreiðslu og dreifingu öndunarvegar (PB-PCXI) til að sjá og magngreina, án inngrips, smávægilegar breytingar in vivo á dýpt ASL18 og hegðun MCT19,20 til að mæla beint rakastig í yfirborði gasgangar og nota sem vísbendingu um virkni meðferðar. Að auki notar MCT matsaðferð okkar agnir með þvermál 10–35 µm sem eru úr áloxíði eða gleri með háan ljósbrotsstuðul sem MCT merki sem sjást með PB-PCXI21. Báðar aðferðirnar henta til að sjá fjölbreytt úrval agnategunda, þar á meðal MP.
Vegna mikillar rúmfræðilegrar og tímaupplausnar henta PB-PCXI-byggðu ASL og MCT greiningartækni okkar vel til að skoða gangverk og mynstur hegðunar einstakra og magnagna in vivo til að hjálpa okkur að skilja og hámarka MP genaflutningstækni. Aðferðin sem við notum hér er fengin úr rannsóknum okkar með SPring-8 BL20B2 geislalínunni, þar sem við sýndum vökvahreyfingar eftir gjöf sýndarvektorskammts í nef- og lungnaöndunarveg músa til að hjálpa til við að útskýra óeinsleit genatjáningarmynstur sem komu fram í dýrarannsóknum okkar á genaflutningsskammti 3,4.
Markmið þessarar rannsóknar var að nota PB-PCXI samstillingartækið til að sjá hreyfingar röð af segulmögnunareiningum (MPs) in vivo í barkakýli lifandi rotta. Þessar PB-PCXI myndgreiningarrannsóknir voru hannaðar til að prófa fjölbreytt magn af segulmögnunareiningum, segulsviðsstyrk og staðsetningu til að ákvarða áhrif þeirra á hreyfingu MP. Við settum fram þá tilgátu að utanaðkomandi segulsvið myndi hjálpa afhentum MP að vera eða færa sig á marksvæðinu. Þessar rannsóknir gerðu okkur einnig kleift að bera kennsl á segulstillingar sem hámarka fjölda agna sem eftir eru í barkanum eftir útfellingu. Í annarri rannsóknaröð reyndum við að nota þessa bestu stillingu til að sýna fram á umritunarmynstur sem stafar af in vivo afhendingu LV-MPs í öndunarveg rottna, byggt á þeirri forsendu að afhending LV-MPs í samhengi við markvissa öndunarvegsmiðun myndi leiða til bættrar skilvirkni LV umritunar.
Allar dýrarannsóknir voru framkvæmdar samkvæmt samskiptareglum sem Háskólinn í Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og siðanefnd SPring-8 Synchrotron dýralækninga samþykktu. Tilraunirnar voru framkvæmdar samkvæmt leiðbeiningum ARRIVE.
Allar röntgenmyndatökur voru gerðar á BL20XU geislalínunni á SPring-8 samstillingarhringnum í Japan, með svipaðri uppsetningu og áður hefur verið lýst21,22. Í stuttu máli var tilraunakassi staðsettur 245 m frá geymsluhring samstillingarhringsins. Fjarlægð milli sýnis og skynjara er 0,6 m fyrir agnamyndgreiningarrannsóknir og 0,3 m fyrir in vivo myndgreiningarrannsóknir til að mynda fasaandstæðuáhrif. Notuð var einlita geislaorka upp á 25 keV. Myndir voru teknar með hágæða röntgenbreyti (SPring-8 BM3) tengdum sCMOS skynjara. Breytirinn breytir röntgengeislum í sýnilegt ljós með 10 µm þykkum sindurskynjara (Gd3Al2Ga3O12), sem síðan er beint að sCMOS skynjara með × 10 smásjárobjektiglu (NA 0.3). sCMOS skynjarinn var Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) með fylkisstærð 2048 × 2048 pixlar og hrá pixlastærð 6,5 × 6,5 µm. Þessi uppsetning gefur virka ísótrópíska pixlastærð upp á 0,51 µm og sjónsvið upp á um það bil 1,1 mm × 1,1 mm. Valin var útsetningarlengd upp á 100 ms til að hámarka merkis-til-hávaða hlutfall segulmagnaðra agna innan og utan öndunarvegarins og lágmarka hreyfitruflanir af völdum öndunar. Fyrir rannsóknir in vivo var hraðvirkur röntgenlokari settur í röntgengeislunarleiðina til að takmarka geislunarskammt með því að loka fyrir röntgengeislann á milli útsetninga.
LV-burðarefnið var ekki notað í neinum SPring-8 PB-PCXI myndgreiningarrannsóknum þar sem BL20XU myndgreiningarklefinn er ekki vottaður á líföryggisstigi 2. Í staðinn völdum við úrval vel greindra segulmagnaðra segulrofa frá tveimur birgjum — sem ná yfir fjölbreytt úrval af stærðum, efnum, járnstyrk og notkunarsviðum — fyrst til að skilja hvernig segulsvið hafa áhrif á hreyfingu segulmagnaðra segulrofa í glerháræðum og síðan í lifandi öndunarvegi. á yfirborðinu. Stærð segulmagnaðra agna er á bilinu 0,25 til 18 μm og er úr ýmsum efnum (sjá töflu 1), en samsetning hvers sýnis, þar á meðal stærð segulmagnaðra agna í segulmagnaða sýninu, er óþekkt. Byggt á umfangsmiklum MCT rannsóknum okkar 19, 20, 21, 23, 24, gerum við ráð fyrir að hægt sé að sjá segulmagnaða agna allt niður í 5 μm á yfirborði barkakýlis, til dæmis með því að draga frá samfellda ramma til að sjá aukna sýnileika á hreyfingu segulmagnaða agna. Einn 0,25 μm stór segulmagnaður agni er minni en upplausn myndgreiningartækisins, en búist er við að PB-PCXI greini rúmmálsandstæður þeirra og hreyfingu yfirborðsvökvans sem þeir eru settir á eftir útfellingu.
Sýni fyrir hvert MP í töflu 1 voru útbúin í 20 μl glerháræðum (Drummond Microcaps, PA, Bandaríkjunum) með innra þvermál upp á 0,63 mm. Líkamaragnir eru fáanlegar í vatni, en CombiMag agnir eru fáanlegar í séreignalausn framleiðanda. Hvert rör er hálffyllt með vökva (u.þ.b. 11 μl) og sett á sýnishornshaldarann ​​(sjá mynd 1). Glerhárarnir voru settir lárétt á sýnishornspallinn í myndgreiningarkassanum, hver um sig, og staðsettir á brúnum vökvans. 19 mm þvermál (28 mm löng) nikkelhjúps sjaldgæf jarð neodymium járn bór (NdFeB) segull (N35, vötn. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Ástralía) með leifsegulmögnun upp á 1,17 Tesla var festur við sérstakt þýðingarpall til að ná fram breytingu á staðsetningu sinni lítillega meðan á myndgreiningu stóð. Myndataka með röntgengeislum hefst þegar segullinn er staðsettur um það bil 30 mm fyrir ofan sýnið og myndir eru teknar með hraða 4 ramma á sekúndu. Við myndgreiningu var segullinn... fært nálægt glerháræðumörinni (um 1 mm frá) og síðan fært eftir rörinu til að meta áhrif sviðsstyrks og staðsetningar.
Uppsetning fyrir myndgreiningu in vitro sem inniheldur MP sýni í glerháræðum á xy-þýðingarstigi sýnisins. Leið röntgengeislans er merkt með rauðum strikalínu.
Þegar sýnileiki MPs hafði verið staðfestur in vitro var undirhópur þeirra prófaður in vivo í villtum kvenkyns albínó Wistar rottum (~12 vikna gamlar, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidín (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og 4 mg/kg bútorfanól (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotturnar voru svæfðar með blöndu af Pharma (Pharma), Japan) með inndælingu í kviðarhol. Eftir svæfingu voru þær undirbúnar fyrir myndgreiningu með því að fjarlægja feldinn í kringum barkann, setja inn barkaþræði (ET; 16 Ga iv kannula, Terumo BCT) og kyrrsetja þær á bakinu á sérsmíðuðum myndgreiningarplötu sem innihélt hitapoka til að viðhalda líkamshita 22. Myndgreiningarplatan var síðan fest við sýnisflutningspallinn í myndgreiningarkassanum í smá halla til að stilla barkann lárétt á röntgenmyndinni, eins og sýnt er á mynd. 2a.
(a) Uppsetning myndgreiningar in vivo í SPring-8 myndgreiningarkassanum, leið röntgengeislans er merkt með rauðri strikalínu. (b, c) Staðsetning seguls á barkanum var framkvæmd með fjarlægri fjarlægð með tveimur hornréttum IP-myndavélum. Vinstra megin á skjámyndinni sést vírlykkjan sem heldur höfðinu og afhendingarkanúluna á sínum stað í ET-rörinu.
Fjarstýrt sprautudælukerfi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, Flórída) með 100 μl glersprautu var tengd við PE10 slöngu (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) með 30 Ga nál. Merktu slönguna til að tryggja að oddurinn sé í réttri stöðu í barkanum þegar ET-slöngan er sett inn. Með ördælunni var sprautustimpillinn dreginn til baka á meðan oddur slöngunnar var sökkt í MP-sýnið sem átti að afhenda. Hlaðna afhendingarslöngan var síðan sett inn í barkaþröngina og oddurinn settur innan sterkasta hluta væntanlegs segulsviðs okkar. Myndataka var stjórnað með öndunarskynjara sem tengdur var við Arduino-byggða tímamælingarkassa okkar og öll merki (t.d. hitastig, öndun, opnun/lokun lokara og myndataka) voru skráð með Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Ástralía) 22. Þegar myndataka var gerð. Þegar girðingin var óaðgengileg voru tvær IP-myndavélar (Panasonic BB-SC382) staðsettar í um það bil 90° horni hvor við aðra og notaðar til að fylgjast með staðsetningu... segull miðað við barkann við myndgreiningu (Mynd 2b, c). Til að lágmarka hreyfitruflanir var ein mynd tekin fyrir hvern andardrætti á meðan á endaflóðflæðis jafnvægisstigi stóð.
Segul er festur við annað stig sem hægt er að staðsetja fjarri utanverðu myndgreiningarhússins. Ýmsar staðsetningar og stillingar segla voru prófaðar, þar á meðal: Festur í um það bil 30° horni fyrir ofan barkann (stillingar sýndar á myndum 2a og 3a); einn segull fyrir ofan dýrið og hinn fyrir neðan, með pólunum stilltum til að laða að sér (mynd 3b); einn segull fyrir ofan dýrið og hinn fyrir neðan, með pólunum stilltum til að hrinda frá sér (mynd 3c); og einn segull fyrir ofan og hornrétt á barkann (mynd 3d). Þegar dýrið og segullinn eru stilltir og sprautudælan sem á að prófa er sett í sprautudæluna, skal gefa 50 μl skammt á hraðanum 4 μl/sek á meðan myndir eru teknar. Segulinn er síðan færður fram og til baka eftir eða til hliðar yfir barkann á meðan haldið er áfram að taka myndir.
Segulstilling fyrir in vivo myndgreiningu (a) einn segull fyrir ofan barkann í um það bil 30° horni, (b) tveir seglar settir til að draga að sér, (c) tveir seglar settir til að hrinda frá sér, (d) einn segull fyrir ofan og hornréttur á barkann. Áhorfandinn horfði niður frá munninum að lungunum í gegnum barkann og röntgengeislinn fór í gegnum vinstri hlið rottunnar og út úr hægri hliðinni. Segulinn er annað hvort færður eftir öndunarveginum eða til vinstri og hægri fyrir ofan barkann í átt að röntgengeislanum.
Við reyndum einnig að ákvarða sýnileika og hegðun agna í öndunarvegum án truflunar á öndun og hjartahreyfingum. Því voru dýrin aflífuð á mannúðlegan hátt í lok myndgreiningartímabilsins vegna ofskömmtunar pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Bandaríkin; ~65 mg/kg í bláæð). Sum dýr voru látin vera á myndgreiningarpallinum og þegar öndun og hjartsláttur hættu var myndgreiningarferlið endurtekið, þar sem viðbótarskammtur af MP var bætt við ef enginn MP var sýnilegur á yfirborði öndunarvegarins.
Myndirnar sem teknar voru voru leiðréttar fyrir flatt sviði og dökkt sviði og síðan settar saman í kvikmynd (20 rammar á sekúndu; 15-25 × eðlilegur hraði eftir öndunartíðni) með því að nota sérsniðið forskrift skrifað í MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Allar rannsóknir á afhendingu LV-gena vektora voru gerðar í Dýrarannsóknarstöð Háskólans í Adelaide og markmiðið var að nota niðurstöður SPring-8 tilraunarinnar til að meta hvort afhending LV-MP í návist segulsviðs gæti aukið genaflutning in vivo. Til að meta áhrif MP og segulsviðs voru tveir hópar dýra meðhöndlaðir: annar hópurinn fékk LV-MP með segli og hinn hópurinn fékk samanburðarhóp með LV-MP án segils.
LV genaferjur voru búnar til með því að nota áður lýstar aðferðir 25, 26. LacZ vektorinn tjáir kjarnastaðbundið beta-galaktósídasa gen sem er knúið áfram af stöðugum MPSV hvata (LV-LacZ), sem framleiðir blátt hvarfefni í umbreyttum frumum, sýnilegt í lungnavefsframhliðum og vefjasneiðum. Títrun var framkvæmd í frumuræktunum með því að telja handvirkt fjölda LacZ jákvæðra frumna með blóðfrumumæli til að reikna títerinn í TU/ml. Burðarefnin eru fryst við -80°C, þiðin fyrir notkun og bundin við CombiMag með blöndun í hlutfallinu 1:1 og ræktun á ís í að minnsta kosti 30 mínútur fyrir afhendingu.
Venjulegar Sprague Dawley rottur (n = 3/hópur, ~2-3) voru svæfðar í kviðarhol með blöndu af 0,4 mg/kg af medetomidíni (Domitor, Ilium, Ástralíu) og 60 mg/kg af ketamíni (Ilium, Ástralíu) (mánaðargamlar) rottur (ip) sprautaðar og settar í munnhol án skurðaðgerðar með 16 Ga æð-kanúlu. Til að tryggja að barkakýlisvefurinn fengi vinstri slegils umbreytingu var hann meðhöndlaður með því að nota áður lýsta vélræna truflunaraðferðina okkar, þar sem yfirborð barkakýlisveggsins var nuddað áslægt með vírkörfu (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Bandaríkjunum) 30 sekúndur til 28. Gjöf LV-MP í barkakýli var síðan framkvæmd í líffræðilegum öryggisskáp um það bil 10 mínútum eftir truflunina.
Segulsviðið sem notað var í þessari tilraun var stillt á svipaðan hátt og í in vivo röntgenmyndgreiningarrannsókninni, þar sem sömu seglarnir voru haldnir fyrir ofan barkann með eimingarstentklemmum (mynd 4). 50 μl rúmmál (2 × 25 μl skammtar) af LV-MP var settur í barkann (n = 3 dýr) með pípettu með gelodd eins og áður hefur verið lýst. Samanburðarhópur (n = 3 dýr) fékk sömu LV-MP án þess að nota segul. Eftir að innrennslinu er lokið er kanúlan fjarlægð úr ET-rörinu og dýrið fjarlægt úr öndunarvél. Segulinn er á sínum stað í 10 mínútur og síðan fjarlægður. Rottur fengu meloxicam undir húð (1 ml/kg) (Ilium, Ástralía) og síðan var svæfingunni snúið við með inndælingu í bláæð af 1 mg/kg af atipamazole hýdróklóríði (Antisedan, Zoetis, Ástralía). Rottur voru haldnar hlýjar og fylgst var með þar til þær höfðu náð sér að fullu af svæfingunni.
LV-MP innspýtingartæki í líffræðilegum öryggisskáp. Ljósgráa Luer-tengið á ET-rörinu sést standa út úr munninum og geloddur pípettunnar sem sýndur er á myndinni er settur í gegnum ET-rörið niður í æskilega dýpt og inn í barkann.
Viku eftir LV-MP skömmtun voru dýrin aflífuð á mannúðlegan hátt með 100% CO2 innöndun og LacZ tjáning var metin með hefðbundinni X-gal meðferð okkar. Þrír brjóskþröngir neðstu hlutar voru fjarlægðir til að tryggja að vélrænir skemmdir eða vökvasöfnun frá staðsetningu barkaþræðinga væru ekki tekin með í greininguna. Hver barki var skorinn langsum til að búa til tvo helminga fyrir greiningu og þeir voru settir í skál sem innihélt sílikongúmmí (Sylgard, Dow Inc) með Minutien nál (Fine Science Tools) til að sjá yfirborð lungna. Dreifing og mynstur umbreyttra frumna var staðfest með framhliðarljósmyndun með Nikon smásjá (SMZ1500) með DigiLite myndavél og TCapture hugbúnaði (Tucsen Photonics, Kína). Myndir voru teknar með 20x stækkun (þar á meðal hæstu stillingu fyrir alla breidd barkans), þar sem allur lengd barkans var mynduð skref fyrir skref, sem tryggði nægilega skörun milli hverrar myndar til að leyfa myndasamsetningu. Myndir frá hverjum barka voru síðan settar saman í ... ein samsett mynd með Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) sem notar planar hreyfireiknirit. LacZ tjáningarsvæði í samsettum myndum af barkakýlinu frá hverju dýri voru magngreind með sjálfvirkri MATLAB forskrift (R2020a, MathWorks) eins og áður hefur verið lýst, með stillingum 0,35 < litbrigði < 0,58, mettun > 0,15 og gildi < 0,7. Með því að rekja útlínur vefjarins var gríma búin til handvirkt í GIMP v2.10.24 fyrir hverja samsetta mynd til að bera kennsl á vefjasvæðið og koma í veg fyrir falskar greiningar utan barkakýlisins. Lituðu svæðin úr öllum samsettu myndunum frá hverju dýri voru lögð saman til að fá heildarlitaða svæðið fyrir það dýr. Litaða svæðið var síðan deilt með heildargrímusvæðinu til að fá staðlaða svæðið.
Hver barki var settur í paraffín og 5 μm sneiðar voru skornar. Sneiðarnar voru mótlitaðar með hlutlausu rauðu í 5 mínútur og myndir voru teknar með Nikon Eclipse E400 smásjá, DS-Fi3 myndavél og NIS element capture hugbúnaði (útgáfa 5.20.00).
Allar tölfræðilegar greiningar voru framkvæmdar í GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Tölfræðileg marktækni var stillt á p ≤ 0,05. Eðlileiki var staðfestur með Shapiro-Wilk prófinu og munur á LacZ litun var metinn með óparaðri t-prófi.
Sex agnirnar sem lýst er í töflu 1 voru skoðaðar með PCXI og sýnileikinn er lýst í töflu 2. Tvær pólýstýren agnir (MP1 og MP2; 18 μm og 0,25 μm, talið í sömu röð) voru ekki sýnilegar undir PCXI, en restin af sýnunum var greinanleg (dæmi eru sýnd á mynd 5). MP3 og MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm og 0,9 μm, talið í sömu röð) eru dauflega sýnilegar. Þótt þær innihaldi nokkrar af minnstu ögnunum sem prófaðar voru, var MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) mest áberandi. CombiMag afurðin MP6 er erfið að koma auga á. Í öllum tilvikum jókst geta okkar til að greina MP verulega með því að færa segulinn fram og til baka samsíða háræðinni. Þegar seglarnir færðust frá háræðinni teygðust agnirnar í löngum strengjum, en þegar seglarnir komust nær og styrkur segulsviðsins jókst styttust agnastrengirnir þegar agnirnar færðust að efri yfirborði háræðarinnar (sjá viðbótarmyndband S1: MP4), sem jók The agnaþéttleiki yfirborðsins. Aftur á móti, þegar segullinn er fjarlægður úr háræðinni, minnkar sviðsstyrkurinn og segulkornin raðast upp í langar þræðir sem teygja sig frá efri yfirborði háræðarinnar (sjá viðbótarmyndband S2: MP4). Eftir að segullinn hættir að hreyfast halda agnirnar áfram að hreyfast í stuttan tíma eftir að þær ná jafnvægisstöðu. Þegar segulkornið færist að og frá efri yfirborði háræðarinnar draga segulkornin venjulega ruslið í gegnum vökvann.
Sýnileiki MP undir PCXI er mjög breytilegur milli sýna. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Allar myndir sem sýndar eru hér voru teknar með segli sem staðsettur er um það bil 10 mm beint fyrir ofan háræðarnar. Stóru hringirnir sem sjást eru loftbólur sem eru fastar í háræðunum, sem sýnir greinilega svarta og hvíta brúnina í fasaandstæðumyndgreiningu. Rauði kassinn inniheldur stækkunina sem eykur andstæðuna. Athugið að þvermál segulmyndanna á öllum myndunum er ekki í réttum hlutföllum og er um það bil 100 sinnum stærri en sýnt er.
Þegar segullinn færist til vinstri og hægri eftir efri hluta háræðar, breytist hornið á segulmagnaða strengnum til að samstilla sig við segulinn (sjá mynd 6), sem afmarkar þannig segulsviðslínurnar. Fyrir MP3-5, eftir að strengurinn nær þröskuldshorni, eru agnirnar dregnar eftir efri yfirborði háræðar. Þetta leiðir oft til þess að agnir safnast saman í stærri hópa nálægt þar sem segulsviðið er sterkast (sjá viðbótarmyndband S3:MP5). Þetta er einnig sérstaklega áberandi þegar myndgreining er gerð nálægt enda háræðar, sem veldur því að agnir safnast saman og safnast saman við snertiflöt vökva og lofts. Agnir í MP6, sem voru erfiðari að greina en MP3-5, voru ekki dregnar þegar segullinn færðist eftir háræðar, en agnirnar losnuðu og skildu agnirnar eftir í sjónsviðinu (sjá viðbótarmyndband S4:MP6). Í sumum tilfellum, þegar álagið á segulsviðið var minnkað með því að færa segulinn langt frá myndgreiningarstaðnum, féllu allar eftirstandandi agnir hægt niður á neðri yfirborð rörsins með þyngdaraflinu en héldu sig eftir í strengnum (sjá viðbótarmyndband S5: MP3).
Hornið á MP-strengnum breytist þegar segullinn færist til hægri fyrir ofan háræðarrörið. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6. Rauði kassinn inniheldur stækkunina sem eykur andstæður. Athugið að viðbótarmyndböndin eru fróðleg þar sem þau sýna mikilvægar upplýsingar um agnabyggingu og breytilegar breytingar sem ekki er hægt að sjá á þessum kyrrstæðu myndum.
Prófanir okkar sýndu að það að færa segulinn hægt fram og til baka eftir barkanum auðveldar sýnileika MP í samhengi við flóknar hreyfingar in vivo. In vivo prófanir voru ekki framkvæmdar þar sem pólýstýrenperlur (MP1 og MP2) voru ekki sýnilegar í háræðinni. Hver af hinum fjórum MP-perlunum var prófaður in vivo með langás segulsins stilltan fyrir ofan barkann í um 30° horni miðað við lóðrétta lögun (sjá myndir 2b og 3a), þar sem þetta leiddi til lengri MP-keðja og var áhrifaríkara en segulstillingin sem endaði. MP3, MP4 og MP6 greindust ekki í barka neinna lifandi dýra. Þegar öndunarvegir rotta voru myndaðir eftir að dýrin voru aflífuð á mannúðlegan hátt, voru agnirnar ósýnilegar jafnvel þegar viðbótarrúmmál var bætt við með sprautudælu. MP5 hafði hæsta járnoxíðinnihaldið og var eina sýnilega agnin og var því notuð til að meta og lýsa in vivo hegðun MP.
Þegar segullinn var settur yfir barkann við gjöf MP safnaðist margt, en ekki allt, af völdum segulmagnaðs efnis (MP) saman í sjónsviðinu. Agnir sem fara inn í barkann sjást best í dýrum sem hafa verið aflífuð á mannúðlegan hátt. Mynd 7 og viðbótarmyndband S6: MP5 sýnir hraða segulmagnaða upptöku og röðun agna á yfirborði kviðarhols barkans, sem bendir til þess að hægt sé að beina MP á tilætluð svæði í barkanum. Þegar leitað var lengra út eftir barkanum eftir gjöf MP fundust sum MP nær úlnliðnum, sem bendir til þess að segulsviðsstyrkurinn hafi ekki verið nægur til að safna og halda öllum MP, þar sem þeim var komið í gegnum svæðið með hámarks segulsviðsstyrk meðan á vökvaferlinu stóð. Engu að síður var styrkur MP eftir fæðingu hærri í kringum myndasvæðið, sem bendir til þess að margir MP héldust áfram í öndunarvegssvæðum þar sem segulsviðsstyrkurinn var mestur.
Myndir frá (a) fyrir og (b) eftir að MP5 var gefið í barkakýli nýlega aflífaðrar rottu með segulnum staðsettum beint fyrir ofan myndgreiningarsvæðið. Myndasvæðið er staðsett á milli brjóskhringjanna tveggja. Fyrir gjöf MP er vökvi í öndunarveginum. Rauði kassinn inniheldur stækkunarglerið sem eykur skuggaefni. Þessar myndir eru úr myndbandinu sem sýnt er í viðbótarmyndbandi S6:MP5.
Þegar segullinn færðist eftir barkanum in vivo breyttist horn agnakeðjunnar innan öndunarvegarins á svipaðan hátt og sést í háræðum (sjá mynd 8 og viðbótarmyndband S7:MP5). Hins vegar var ekki hægt að draga agnakeðjurnar eftir yfirborði lifandi öndunarvegar í rannsókn okkar eins og hægt var með háræðum. Í sumum tilfellum lengist agnakeðjan þegar segullinn færist til vinstri og hægri. Athyglisvert er að við komumst einnig að því að agnastrengurinn virðist breyta dýpt yfirborðsvökvalagsins þegar segullinn er færður langsum eftir barkanum og þenst út þegar segullinn er færður beint fyrir ofan og agnastrengurinn snýr í lóðrétta stöðu (sjá viðbótarmyndband S7). : MP5 klukkan 0:09, neðst til hægri). Einkennandi hreyfimynstur breyttist þegar segullinn var færður þvert yfir efri hluta barkans til hliðar (þ.e. til vinstri eða hægri við dýrið frekar en eftir endilöngu barkans). Agnirnar voru enn greinilega sýnilegar þegar þær hreyfðust, en þegar segullinn var fjarlægður úr barkanum urðu oddar agnastrengjanna sýnilegir (sjá viðbótarmyndband S8:MP5, byrjar klukkan 0:08). Þetta er í samræmi við hegðun MP sem við sáum undir segulsviði í glerháræðum.
Dæmi um myndir sem sýna MP5 í barkakýli lifandi, svæfðrar rottu. (a) Segulinn er notaður til að taka myndir fyrir ofan og vinstra megin við barkann, og síðan (b) eftir að segullinn er færður til hægri. Rauði kassinn inniheldur stækkunina sem eykur skuggaefnið. Þessar myndir eru úr myndbandinu sem sýnt er í viðbótarmyndbandi S7:MP5.
Þegar pólarnir tveir voru stilltir í norður-suður stefnu fyrir ofan og neðan barkann (þ.e. aðdráttarafl; mynd 3b), virtust MP-strengirnir lengri og voru staðsettir á hliðarvegg barkans frekar en á bakhlið barkakýlisins (sjá viðbótarmyndband S9:MP5). Hins vegar greindist ekki mikill styrkur agna á einum stað (þ.e. bakhlið barkakýlisins) eftir vökvagjöf þegar notaður var tvöfaldur segull, sem gerist venjulega þegar notaður er einn segull. Þegar einn segull var síðan stilltur til að hrinda frá sér pólunum öfugt (mynd 3c), virtist fjöldi agna sem sjást í sjónsviðinu ekki aukast eftir gjöf. Uppsetning beggja tvöfaldra segulstillinga er krefjandi vegna mikils segulsviðsstyrks sem togar eða ýtir á seglana, talið í sömu röð. Uppsetningunni var síðan breytt í einn segul samsíða öndunarveginum en liggur í gegnum öndunarveginn í 90 gráðum þannig að sviðslínurnar skerast hornrétt á barkakýlisvegginn (mynd 3d), stefnu sem er hönnuð til að ákvarða hvort agnasöfnun á hliðarveggnum gæti sést. Hins vegar, í Í þessari stillingu var engin greinanleg hreyfing á uppsöfnun MP eða segulhreyfingu. Byggt á öllum þessum niðurstöðum var valin stilling með einum segli með 30 gráðu stefnu (mynd 3a) fyrir in vivo rannsóknir á genaflutningsaðilum.
Þegar dýrið var endurtekið myndað strax eftir aflífun á mannúðarlegum grunni, þýddi fjarvera ruglingslegrar vefjahreyfingar að fínni og styttri agnalínur mátti greina í skýru millibrjóskssviði, „óstöðugar“ í takt við þýðingarhreyfingu segulsins. Engu að síður er samt ekki hægt að sjá greinilega nærveru og hreyfingu MP6 agna.
Títrinn á LV-LacZ var 1,8 × 108 TU/ml og eftir blöndun við CombiMag MP (MP6) í hlutföllunum 1:1 fengu dýrin 50 μl af barkakýlisskammti með 9 × 107 TU/ml af LV burðarefni (þ.e. 4,5 × 106 TU/rotta). Í þessum rannsóknum, í stað þess að færa segulinn á meðan á fæðingu stóð, festum við segulinn í einni stöðu til að ákvarða hvort hægt væri að bæta LV umbreytingu (a) samanborið við vektorgjöf án segulsviðs og (b) hvort hægt væri að beina öndunarvegsfrumum að segulmarksvæðum efri öndunarvega.
Tilvist segla og notkun CombiMag í samsetningu við LV-vigur virtist ekki hafa skaðleg áhrif á heilsu dýra, eins og staðlaða LV-vigurgjöfarferlið okkar gerði. Framhliðarmyndir af barkasvæðinu sem varð fyrir vélrænni truflun (viðbótarmynd 1) bentu til marktækt hærri umbreytingastigs í hópi dýra sem fengu LV-MP þegar segullinn var til staðar (mynd 9a). Aðeins lítið magn af bláum LacZ-litun var til staðar í samanburðarhópnum (mynd 9b). Magnbundin ákvörðun á eðlilegum X-Gal-lituðum svæðum sýndi að gjöf LV-MP í návist segulsviðs olli um það bil sexfaldri bata (mynd 9c).
Dæmi um samsettar myndir sem sýna barkakýlisflutning með LV-MP (a) í viðurvist segulsviðs og (b) án seguls. (c) Tölfræðilega marktæk framför í staðluðu LacZ-flutningsflatarmáli innan barkakýlisins þegar segullinn er notaður (*p = 0,029, t-próf, n = 3 á hvern hóp, meðaltal ± staðalfrávik).
Hlutlausar, rauðlitaðar sneiðar (dæmi sýnt í viðbótarmynd 2) sýndu LacZ-litaðar frumur til staðar í svipuðu mynstri og á svipuðum stað og áður hefur verið greint frá.
Lykiláskorun fyrir genameðferð í öndunarvegi er enn að staðsetja burðaragnir nákvæmlega á áhugaverð svæði og ná fram mikilli skilvirkni í lungum á hreyfingu í návist loftflæðis og virkrar slímhreinsunar. Fyrir vinstri slegils burðaragnir sem eru hannaðir til að meðhöndla CF öndunarvegssjúkdóm hefur það hingað til verið erfitt markmið að auka dvalartíma burðaragna í leiðandi öndunarvegum. Eins og Castellani o.fl. bentu á hefur notkun segulsviða til að bæta umbreytingu kosti samanborið við aðrar aðferðir við genaafhendingu eins og rafporeringu, þar sem hún getur sameinað einfaldleika, hagkvæmni, staðsetningu genaafhendingar, aukna skilvirkni og styttri ræktunartíma, og hugsanlega minni burðarskammt10. Hins vegar hefur útfellingu og hegðun segulagna í öndunarvegum in vivo undir áhrifum ytri segulkrafta aldrei verið lýst, né hefur í raun verið sýnt fram á að þessi aðferð sé möguleg in vivo til að auka tjáningu gena í óskemmdum lifandi öndunarvegum.
Tilraunir okkar með PCXI samstilltum pólýstýreni (in vitro) sýndu að allar agnir sem við prófuðum, fyrir utan pólýstýren MP, voru sýnilegar í myndgreiningaruppsetningunni sem við notuðum. Í viðurvist segulsviðs mynda MP strengi sem tengjast gerð agna og styrk segulsviðsins (þ.e. nálægð og hreyfingu segulsins). Eins og sést á mynd 10 myndast strengirnir sem við sjáum vegna þess að hver einstök agna er segulmögnuð og veldur sínu eigin staðbundna segulsviði. Þessi aðskildu svið valda því að aðrar svipaðar agnir safnast saman og tengjast, með hópstrengjalíkum hreyfingum vegna staðbundinna krafta frá staðbundnum aðdráttar- og fráhrindingarkrafti annarra agna.
Skýringarmynd sem sýnir (a, b) agnaþræði sem myndast í vökvafylltum háræðum og (c, d) loftfylltum barkakýli. Athugið að háræðarnar og barkinn eru ekki teiknuð í réttum hlutföllum. Mynd (a) inniheldur einnig lýsingu á fjölliðuþræðinum, sem inniheldur Fe3O4 agnir raðaðar í strengi.
Þegar segullinn var færður yfir háræðina náði horn agnastrengsins mikilvægum þröskuldi fyrir MP3-5 sem innihélt Fe3O4, eftir það hélt agnastrengurinn ekki lengur upprunalegri stöðu heldur færðist meðfram yfirborðinu í nýja stöðu. segull. Þessi áhrif eru líkleg til að eiga sér stað vegna þess að yfirborð glerháræðunnar er nógu slétt til að leyfa þessari hreyfingu að eiga sér stað. Athyglisvert er að MP6 (CombiMag) hagaði sér ekki þannig, hugsanlega vegna þess að agnirnar voru minni, höfðu mismunandi húðun eða yfirborðshleðslur, eða vegna þess að sérhannaður burðarvökvi hafði áhrif á hreyfifærni þeirra. Myndandstæður CombiMag agna eru einnig veikari, sem bendir til þess að vökvinn og agnirnar geti haft svipaða eðlisþyngd og því ekki auðveldlega færst hvor að annarri. Agnir geta einnig fest sig ef segullinn hreyfist of hratt, sem bendir til þess að segulsviðsstyrkurinn geti ekki alltaf yfirstigið núninginn milli agna í vökvanum, sem bendir til þess að það komi kannski ekki á óvart að segulsviðsstyrkurinn og fjarlægðin milli segulsins og marksvæðisins skiptir miklu máli. Samanlagt benda þessar niðurstöður einnig til þess að þó að seglar geti fangað marga MP sem flæða í gegnum marksvæðið, sé ólíklegt að hægt sé að treysta á að seglar hreyfist. CombiMag agnir meðfram yfirborði barkakýlis. Þess vegna drögum við þá ályktun að in vivo LV-MP rannsóknir ættu að nota kyrrstæð segulsvið til að miða líkamlega á ákveðin svæði öndunarvegarins.
Þegar agnir berast inn í líkamann er erfitt að bera kennsl á þær í samhengi við flókna líkamsvefi á hreyfingu, en hæfni til að greina þær jókst með því að færa segulinn lárétt fyrir ofan barkann til að „hreyfa“ fjölliðustrengina. Þó að lifandi myndgreining sé möguleg er auðveldara að greina hreyfingu agna eftir að dýrið hefur verið aflífað á mannúðlegan hátt. Þéttni fjölliðustrengja var almennt hæst á þessum stað þegar segullinn var staðsettur fyrir ofan myndgreiningarsvæðið, þó að sumar agnir fundust venjulega lengra eftir barkanum. Ólíkt in vitro rannsóknum er ekki hægt að draga agnir eftir barkanum með því að færa segulinn. Þessi niðurstaða er í samræmi við hvernig slímið sem þekur yfirborð barkans vinnur venjulega úr innönduðum ögnum, fangar þær í slíminu og hreinsar þær síðan með slímhúðarhreinsunarferlinu.
Við settum fram þá tilgátu að notkun segla til aðdráttarafls fyrir ofan og neðan barkann (mynd 3b) gæti leitt til einsleitara segulsviðs, frekar en segulsviðs sem er mjög einbeitt á einum stað, sem hugsanlega gæti leitt til einsleitari dreifingar agna. Hins vegar fann forrannsókn okkar engar skýrar sannanir sem styðja þessa tilgátu. Á sama hátt leiddi það ekki til meiri agnaútfellingar á myndasvæðinu að stilla tvö segul til að hrinda frá sér (mynd 3c). Þessar tvær niðurstöður sýna að tvöfaldur segull bætir ekki marktækt staðbundna stjórn á miðun á fjölliðuhreyfingum og að sterkir segulkraftar sem myndast eru erfiðir í stillingu, sem gerir þessa aðferð minna hagnýta. Á sama hátt jók stefnumörkun segulsins fyrir ofan og í gegnum barkann (mynd 3d) ekki heldur fjölda agna sem eftir voru á myndasvæðinu. Sumar af þessum valkostastillingum gætu ekki verið árangursríkar vegna þess að þær leiða til lægri segulsviðsstyrks innan útfellingarsvæðisins. Þess vegna er stakur 30 gráðu hornsegulstilling (mynd 3a) talin auðveldasta og skilvirkasta aðferðin fyrir prófanir in vivo.
LV-MP rannsóknin sýndi að þegar LV vektorar voru sameinaðir CombiMag og gefnir eftir líkamlega truflun í návist segulsviðs, jukust umbreytingarstig marktækt í barkanum samanborið við samanburðarhóp. Byggt á synchrotron myndgreiningarrannsóknum og niðurstöðum LacZ, virðist sem segulsviðið hafi getað varðveitt LV innan barkans og dregið úr fjölda vektoragna sem komust strax djúpt inn í lungun. Slíkar markvissari úrbætur geta leitt til meiri virkni en jafnframt dregið úr afhentum títrum, umbreytingum utan markmiðs, bólgu- og ónæmisfræðilegum aukaverkunum og kostnaði við genaflutning. Mikilvægt er að samkvæmt framleiðanda er hægt að nota CombiMag í tengslum við aðrar genaflutningsaðferðir, þar á meðal með öðrum veiru vektorum (eins og AAV) og kjarnsýrum.