LC Troubleshooting Essentials, Part III: The Peaks Don't Look Right

Sum LC bilanaleitarefni eru aldrei úrelt, þar sem það eru vandamál í LC æfingum, jafnvel þar sem tækitæknin batnar með tímanum. Það eru margar leiðir þar sem vandamál geta komið upp í LC kerfi og endað í lélegu toppformi. Þegar vandamál sem tengjast toppformi koma upp hjálpar stuttur listi yfir mögulegar orsakir fyrir þessum niðurstöðum að einfalda upplifun okkar við bilanaleit.
Það hefur verið gaman að skrifa þennan „LC Troubleshooting“ dálk og hugsa um efni í hverjum mánuði, vegna þess að sum efni fara aldrei úr tísku. Á sviði litskiljunarrannsókna verða ákveðin efni eða hugmyndir úrelt þar sem nýrri og betri hugmyndum er skipt út fyrir, á sviði bilanaleitar, þar sem fyrsta úrræðaleitargreinin birtist í þessu tímariti í LC Journal á þeim tíma (1) 983(1).Undanfarin ár hef ég einbeitt nokkrum LC bilanaleitarhlutum að nútímalegum straumum sem hafa áhrif á vökvaskiljun (LC) (til dæmis, hlutfallslegan samanburð á skilningi okkar á áhrifum þrýstings á varðveislu [2] New Advances) Túlkun okkar á LC niðurstöðum og hvernig á að leysa úr vandræðum með nútíma LC tækjum, sem byrjaði í þessari mánaðaruppsetningu,'20m. , sem beindist að sumum „lífi og dauða“ viðfangsefnum LC bilanaleitar — þættir sem eru frábærir fyrir hvaða bilanaleit sem er eru nauðsynlegir, sama á hvaða aldri kerfisins er sem við erum að nota. Kjarnaviðfangsefni þessarar seríu er mjög viðeigandi fyrir hið fræga „LC Troubleshooting Guide“ veggkort LCGC (4) sem hangir í mörgum rannsóknarstofum sem tengjast hámarki þessarar seríu. bly, veggkortið sýnir 44 mismunandi mögulegar orsakir lélegs hámarksforms! Við getum ekki íhugað öll þessi mál í smáatriðum í einni grein, svo í þessari fyrstu afborgun um efnið, mun ég einbeita mér að sumum af þeim sem ég sé oftast. Ég vona að ungir og gamlir LC notendur finni gagnlegar ábendingar og áminningar um þetta mikilvæga efni.
Mér finnst ég svara bilanaleitarspurningum í auknum mæli með „allt er mögulegt“. Þetta svar kann að virðast auðvelt þegar athuganir eru erfiðar að túlka, en mér finnst þær oft viðeigandi. Með mörgum mögulegum orsökum lélegs hámarksforms er mikilvægt að hafa opinn huga þegar hugað er að því hvað vandamálið gæti verið og til að geta forgangsraðað mögulegum orsökum til að hefja vandræðaleitina okkar, sem er mikilvægasti möguleikinn.
Lykilskref í hvaða bilanaleitaræfingu sem er - en ég held að sé vanmetin - er að viðurkenna að það er vandamál sem þarf að leysa. Að viðurkenna að það er vandamál þýðir oft að viðurkenna að það sem gerist við tólið er ólíkt væntingum okkar, sem mótast af kenningum, reynsluþekkingu og reynslu (5). „Tindarformið“ vísar ekki aðeins til sem slétt, slétt form, hér y, fremstu brún, skott, o.s.frv.), heldur einnig við breiddina. Væntingar okkar um raunverulegt toppform eru einfaldar. Kenning (6) styður vel væntingar kennslubókarinnar um að í flestum tilfellum ættu litskiljunartopparnir að vera samhverfðir og í samræmi við lögun Gaussdreifingar, eins og sýnt er á mynd 1a. Það sem við búumst við af flóknari breidd í framtíðargreininni og við munum fjalla um flóknara breidd í framtíðinni. s á mynd 1 sýna nokkra af öðrum möguleikum sem hægt er að fylgjast með - með öðrum orðum, nokkrar leiðir sem hlutirnir gætu farið úrskeiðis. Í restinni af þessari afborgun munum við eyða tíma í að ræða nokkur sérstök dæmi um aðstæður sem geta leitt til þessara formgerða.
Stundum sjást toppar alls ekki í litskiljuninni þar sem búist er við að þeir séu skolaðir út. Veggmyndin hér að ofan gefur til kynna að skortur á toppi (að því gefnu að sýnið innihaldi í raun markgreiniefnið í styrk sem ætti að gera skynjaraviðbragðið nægjanlegt til að sjá það fyrir ofan hávaðann) tengist yfirleitt einhverju tækisvandamáli eða röngum hreyfanlegum fasaaðstæðum (ef það sést við allar aðstæður).toppar, venjulega of „veik“). Stutt lista yfir hugsanleg vandamál og lausnir í þessum flokki er að finna í töflu I.
Eins og nefnt er hér að ofan er spurningin um hversu mikla útvíkkun toppa ætti að þola áður en athygli er vakin og reynt að laga það er flókið efni sem ég mun fjalla um í síðari grein. Mín reynsla er sú að marktæk breyting á toppaútvíkkun fylgir oft veruleg breyting á lögun toppsins, og toppur er algengari en fyrir topp eða klofning.
Fjallað hefur verið ítarlega um hvert þessara mála í fyrri tölublöðum Troubleshooting LC og lesendur sem hafa áhuga á þessum efnisatriðum geta vísað í þessar fyrri greinar til að fá upplýsingar um grunnorsakir og hugsanlegar lausnir á þessum málum.Nánari upplýsingar.
Hlutfall toppa, toppaframhlið og klofning geta allt stafað af efnafræðilegum eða eðlisfræðilegum fyrirbærum, og listi yfir hugsanlegar lausnir á þessum vandamálum er mjög mismunandi, eftir því hvort við erum að fást við efnafræðilegt eða eðlisfræðilegt vandamál. Oft, með því að bera saman mismunandi toppa í litskiljun, geturðu fundið mikilvægar vísbendingar um hver er sökudólgurinn, ef ekki er líklegt að sökudólgurinn sé í flestum tilfellum. Ef aðeins einn eða nokkrir toppar eru fyrir áhrifum, en restin lítur vel út, er orsökin líklega efnafræðileg.
Efnafræðilegar orsakir hámarksfalls eru of flóknar til að ræða stuttlega hér. Áhugasömum lesanda er vísað til nýlegs tölublaðs „LC Troubleshooting“ til að fá ítarlegri umfjöllun (10). Hins vegar er auðvelt að reyna að draga úr massa greiniefnisins sem sprautað er inn og sjá hvort toppformið batnar. Ef svo er, þá er þetta góð vísbending um að "meðalítið þarf að grípa til álags við magnið" í þessu tilfelli. , eða breyta verður skiljunarskilyrðum þannig að hægt sé að ná góðum toppformum jafnvel með stærri massa sem sprautað er inn.
Það eru líka margar mögulegar líkamlegar ástæður fyrir hámarki. Lesendum sem hafa áhuga á ítarlegri umfjöllun um möguleikana er vísað í annað nýlegt hefti af „LC Troubleshooting“ (11). Ein af algengari líkamlegum orsökum hámarksskots er léleg tenging á punkti milli inndælingartækisins og skynjarans (12). Öfgadæmi er sýnt á mynd 1d í þessu tilviki, sem við bjuggum til í nýrri viku í þessu kerfi. ve sem við höfðum ekki notað áður, og settum upp innspýtingarlykkju með litlu magni með hylki sem hafði verið mótað á háræða úr ryðfríu stáli. Eftir nokkrar fyrstu bilanaleitartilraunir komumst við að því að portdýptin í innspýtingarloka statornum var miklu dýpri en við áttum að venjast, sem leiddi til stórs dauðarúmmáls neðst á túpunni með því að skipta um lykkjuna með því að skipta um lykkjuna. í rétta stöðu til að útrýma dauðarúmmálinu neðst á portinu.
Toppframhliðar eins og þær sem sýndar eru á mynd 1e geta einnig stafað af eðlisfræðilegum eða efnafræðilegum vandamálum. Algeng eðlisfræðileg orsök frambrúnarinnar er sú að agnabeð súlunnar er ekki vel pakkað, eða að agnirnar hafa endurskipulagt sig með tímanum. Eins og með toppafgang af völdum þessa eðlisfræðilega fyrirbæri, er besta leiðin til að laga þetta að skipta um súlulögunina og halda áfram að vera efnafræðilega, sem við köllum oft ekki efnalínu. spennuskilyrði.Við kjöraðstæður (línulegar) er magn greiniefnis sem haldið er eftir í kyrrstöðu fasanum (þar af leiðandi varðveislustuðullinn) línulega tengt styrk greiniefnisins í súlunni. Litskiljunarfræðilega þýðir þetta að þegar massi greiniefnisins sem sprautað er í súluna eykst, verður toppurinn hærri, en ekki breiðari. Þetta samband er rofið þegar hámarkið er ekki-línulegt, heldur er það ekki aðeins breiðari hegðunin, en ekki aðeins meiri hegðun. ritstj.. Að auki ákvarða ólínuleg form lögun litskiljunartoppa, sem leiðir til fremstu eða aftari brúna. Eins og með ofhleðslu sem veldur hámarki (10), er einnig hægt að greina toppleið af völdum ólínulegrar varðveislu með því að draga úr inndældu greiniefnismassanum. Ef topplögun batnar, verður aðferðin ekki að vera meiri en hámarksgæði eða lágmarksgæði. herma þessa hegðun.
Stundum fylgjumst við með því sem virðist vera „klofinn“ toppur, eins og sýnt er á mynd 1f. Fyrsta skrefið við að leysa þetta vandamál er að ákvarða hvort lögun toppsins sé vegna samskolunar að hluta (þ.e. tilvist tveggja aðskilinna en náið skolandi efnasambönd). og augljósir „klofinir“ toppar eru tengdir líkamlegu. Frammistaða hefur ekkert með dálkinn sjálfan að gera.Oft er mikilvægasta vísbendingin um þessa ákvörðun hvort allir toppar í litskiljuninni sýni klofna lögun, eða bara einn eða tvo. Ef það er bara einn eða tveir, er það líklega vandamál með samskolun;ef allir toppar eru klofnir er það líklega líkamlegt mál, líklega tengt súlunni sjálfri.
Klofnir toppar sem tengjast eðliseiginleikum súlunnar sjálfrar eru venjulega vegna stíflaðra inntaks- eða úttakskorna að hluta, eða endurskipulagningar agna í súlunni, sem gerir hreyfanlegum fasa kleift að flæða hraðar en hreyfanlegur fasi á ákveðnum svæðum í súlurásarmynduninni .á öðrum svæðum (11). Stundum er hægt að hreinsa að hluta til stíflaðan fret með því að snúa flæðinu í gegnum súluna;Hins vegar, mín reynsla, er venjulega skammtímalausn frekar en langtímalausn. Þetta er oft banvænt með nútíma súlum ef agnirnar sameinast aftur innan súlunnar. Á þessum tímapunkti er best að skipta um súluna og halda áfram.
Toppurinn á mynd 1g, einnig frá nýlegu tilviki í eigin rannsóknarstofu minni, gefur venjulega til kynna að merkið sé svo hátt að það hafi náð hámarki svörunarsviðsins. Fyrir sjóngleypniskynjara (UV-vis í þessu tilfelli), þegar styrkur greiningarefnisins er mjög hár, gleypir greiningarefnið mest af því ljósi sem fer í gegnum skynjarafrennslisfrumuna, og skilur eftir sig mjög lítið ljós undir þessum aðstæðum sem myndast við mismunandi aðstæður. hávaðagjafar, eins og villuljós og „dökkur straumur“, sem gerir merkið mjög „óljóst“ í útliti og óháð styrk greiningarefna.Þegar þetta gerist er oft auðvelt að leysa vandamálið með því að minnka inndælingarrúmmál greiniefnisins - minnka inndælingarrúmmálið, þynna sýnið eða hvort tveggja.
In chromatography school, we use the detector signal (ie, the y-axis in the chromatogram) as an indicator of the analyte concentration in the sample.So it seems odd to see a chromatogram with a signal below zero, as the simple interpretation is that this indicates a negative analyte concentration – which of course is not physically possible.In my experience, negative peaks are most often observed when using optical absorbance detectors (eg, UV-vis).
Í þessu tilviki þýðir neikvæður toppur einfaldlega að sameindirnar sem skolast út úr súlunni gleypa minna ljós en hreyfanlegur fasinn sjálfur strax fyrir og eftir toppinn. Þetta getur td komið fram þegar notaðar eru tiltölulega litlar skynjunarbylgjulengdir (<230 nm) og hreyfanlegur fasaaukefni sem gleypa mest af ljósinu á þessum bylgjulengdum. Slík aukefni geta í raun verið hreyfanlegur fasa leysiefni eða stuðpúða asetatíhlutir. s að útbúa kvörðunarferil og fá nákvæmar magnupplýsingar, svo það er engin grundvallarástæða til að forðast þær í sjálfu sér (þessi aðferð er stundum kölluð „óbein UV uppgötvun“) (13). Hins vegar, ef við viljum alveg forðast neikvæða toppa með öllu, þegar um gleypnigreining er að ræða, er besta lausnin að nota aðra greiningarbylgjulengd, þannig að hreyfanlegur fasinn taki til sín meira en hreyfanlegur fasi greiningarfasans, þannig að þeir taki minna til sín en hreyfanlegur fasi greinisins. .
Neikvæðar toppar geta einnig komið fram þegar brotstuðull (RI) greining er notuð þegar brotstuðull annarra íhluta en greiniefnisins í sýninu, eins og leysiefnisfylkisins, er frábrugðinn brotstuðul farsímafasans. Þetta gerist líka við UV-vis uppgötvun, en þessi áhrif hafa tilhneigingu til að minnka miðað við RI greiningu. Í báðum tilfellum getur samsetning sýnisins jafnast mjög neikvæða við samsetningu sýnisins. farsímafasa.
Í þriðja hluta um grunnviðfangsefni LC bilanaleit, fjallaði ég um aðstæður þar sem toppformið sem sést er frábrugðið væntanlegu eða venjulegu hámarksformi. Árangursrík bilanaleit slíkra vandamála hefst með þekkingu á væntanlegum toppformum (byggt á kenningum eða fyrri reynslu af núverandi aðferðum), svo frávik frá þessum væntingum eru augljós. Í hámarkslögunarvandamálum, o.s.frv. í smáatriðum nokkrar af þeim ástæðum sem ég sé oftast. Að þekkja þessar upplýsingar gefur góðan stað til að hefja bilanaleit, en fangar ekki alla möguleika. Lesendur sem hafa áhuga á ítarlegri lista yfir orsakir og lausnir geta vísað í LCGC „LC Troubleshooting Guide“ veggtöfluna.
(4) LCGC „LC Troubleshooting Guide“ veggkort.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), bls. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.


Pósttími: 04-04-2022