Sum efni um bilanaleit í LC eru aldrei úrelt, þar sem vandamál geta komið upp í LC-starfshættu, jafnvel þótt tækni mælitækja batni með tímanum. Það eru margar leiðir sem vandamál geta komið upp í LC-kerfi og endað í slæmu toppformi. Þegar vandamál tengd toppformi koma upp, hjálpar stuttur listi yfir mögulegar orsakir þessara niðurstaðna til við að einfalda bilanaleitarferlið okkar.
Það hefur verið gaman að skrifa þennan dálk „Úrræðaleit í LC“ og hugsa um efni í hverjum mánuði, því sum efni fara aldrei úr tísku. Þó að á sviði litskiljunarrannsókna verði ákveðin efni eða hugmyndir úreltar þar sem þær eru teknar af nýrri og betri hugmyndum, þá á sviði bilanaleitar, síðan fyrsta greinin um bilanaleit birtist í þessu tímariti (LC Journal á þeim tíma) þar sem sum efni eru enn viðeigandi) árið 1983(1). Undanfarin ár hef ég einbeitt mér að nokkrum köflum um bilanaleit í LC á samtímaþróun sem hefur áhrif á vökvaskiljun (LC) (til dæmis hlutfallslegan samanburð á skilningi okkar á áhrifum þrýstings á varðveislu [2] Nýjar framfarir) Túlkun okkar á LC niðurstöðum og hvernig á að bilanaleita með nútíma LC tækjum. Í þessum mánuði held ég áfram með seríu mína (3), sem hófst í desember 2021, sem einbeitti sér að nokkrum af „lífs- og dauða“ efnum í bilanaleit í LC - þættir sem eru frábærir fyrir alla bilanaleitara eru nauðsynlegir, óháð aldri kerfisins sem við notum. Kjarnaefni þessarar seríu er mjög viðeigandi fyrir fræga veggspjaldið „LC Troubleshooting Guide“ frá LCGC (4) sem hangir á... margar rannsóknarstofur. Í þriðja hluta þessarar greinaröðar valdi ég að einbeita mér að málum sem tengjast lögun eða eiginleikum tinda. Ótrúlegt en satt, á veggspjaldinu eru 44 mismunandi mögulegar orsakir lélegrar lögun tinda! Við getum ekki fjallað um öll þessi atriði í smáatriðum í einni grein, svo í þessum fyrsta þætti um efnið mun ég einbeita mér að nokkrum af þeim sem ég sé oftast. Ég vona að ungir sem aldnir notendur LC finni gagnleg ráð og áminningar um þetta mikilvæga efni.
Ég tek eftir því að ég svara spurningum um bilanaleit í auknum mæli með því að segja „allt er mögulegt“. Þetta svar kann að virðast auðvelt þegar skoðaðar eru athuganir sem erfitt er að túlka, en mér finnst það oft viðeigandi. Þar sem margar mögulegar orsakir lélegrar toppforms eru mikilvægar að vera opinn fyrir því hver vandamálið gæti verið og að geta forgangsraðað mögulegum orsökum til að hefja bilanaleitarvinnu okkar, með áherslu á þá algengustu möguleika, þetta atriði er mjög mikilvægt.
Lykilatriði í hvaða bilanaleit sem er — en það sem ég tel vanmetið — er að viðurkenna að vandamál sé til staðar sem þarf að leysa. Að viðurkenna að vandamál sé til staðar þýðir oft að viðurkenna að það sem gerist við tólið er frábrugðið væntingum okkar, sem mótast af kenningum, reynslu og reynslu (5). „Toppformið“ sem hér er vísað til vísar í raun ekki aðeins til lögunar toppsins (samhverfur, ósamhverfur, sléttur, loftkenndur, fremstur brún, hala o.s.frv.), heldur einnig til breiddar. Væntingar okkar um raunverulegt toppform eru einfaldar. Kenning (6) styður vel væntingar kennslubókarinnar um að í flestum tilfellum ættu litskiljunartopparnir að vera samhverfir og í samræmi við lögun Gauss-dreifingar, eins og sýnt er á mynd 1a. Það sem við búumst við af toppbreiddum er flóknara mál og við munum ræða þetta efni í framtíðargrein. Hinar toppformin á mynd 1 sýna nokkra af öðrum möguleikum sem gætu komið í ljós — með öðrum orðum, nokkrar af þeim leiðum sem hlutirnir gætu farið úrskeiðis. Í restinni af þessum hluta munum við eyða tíma í að ræða nokkur sérstök dæmi um aðstæður sem geta leitt til... þessar gerðir af formum.
Stundum sjást toppar alls ekki í litrófinu þar sem búist er við að þeir losni. Veggritið hér að ofan gefur til kynna að fjarvera topps (að því gefnu að sýnið innihaldi í raun markgreiniefnið í styrk sem ætti að gera skynjarasvörun nægilega til að sjá það fyrir ofan suðið) tengist venjulega einhverju vandamáli með tækið eða röngum aðstæðum í hreyfanlegum fasa (ef þeir sjást yfirhöfuð). Toppar, venjulega of „veikir“). Stuttur listi yfir hugsanleg vandamál og lausnir í þessum flokki er að finna í töflu I.
Eins og áður hefur komið fram er spurningin um hversu mikla breikkun á toppi ætti að þola áður en maður gefur gaum að henni og reynir að laga hana flókið efni sem ég mun ræða í framtíðargrein. Reynsla mín er sú að veruleg breikkun á toppi fylgir oft veruleg breyting á lögun toppsins, og að topphali sé algengari en fyrir topp eða klofningur. Hins vegar eru nafnlega samhverfu topparnir einnig breikkaðir, sem getur stafað af nokkrum mismunandi ástæðum:
Hvert þessara mála hefur verið rætt ítarlega í fyrri tölublöðum Troubleshooting LC og lesendur sem hafa áhuga á þessum efnum geta vísað til þessara fyrri greina til að fá upplýsingar um rót vandans og mögulegar lausnir á honum. Nánari upplýsingar.
Topphalar, toppfrontar og klofningur geta öll stafað af efnafræðilegum eða eðlisfræðilegum fyrirbærum og listinn yfir mögulegar lausnir á þessum vandamálum er mjög breytilegur eftir því hvort um efnafræðilegt eða eðlisfræðilegt vandamál er að ræða. Oft er hægt að bera saman mismunandi toppa í litrófi til að finna mikilvægar vísbendingar um hver sé sökudólgurinn. Ef allir toppar í litrófi sýna svipaða lögun er orsökin líklega ekki eðlisfræðileg. Ef aðeins einn eða nokkrir toppar eru fyrir áhrifum en hinir líta vel út er orsökin líklega efnafræðileg.
Efnafræðilegar orsakir toppþekju eru of flóknar til að ræða stuttlega hér. Áhugasamum lesendum er bent á nýlega útgáfu af „LC Troubleshooting“ fyrir ítarlegri umfjöllun (10). Hins vegar er auðvelt að reyna að minnka massa sprautaðs greiningarefnis og sjá hvort toppformið batnar. Ef svo er, þá er þetta góð vísbending um að vandamálið sé „massaofhleðsla“. Í þessu tilfelli verður að takmarka aðferðina við að sprauta inn litlum massa greiningarefnis, eða breyta þarf litskiljunarskilyrðunum svo að hægt sé að fá góða toppform jafnvel með stærri massa sprautaðan.
Einnig eru margar mögulegar eðlisfræðilegar ástæður fyrir toppþrengingu. Lesendum sem hafa áhuga á ítarlegri umfjöllun um möguleikana er bent á annað nýlegt tölublað af „LC Troubleshooting“ (11). Ein algengasta eðlisfræðilega orsök toppþrengingar er léleg tenging á punkti milli inndælingartækisins og skynjarans (12). Öfgakennt dæmi er sýnt á mynd 1d, sem fékkst í rannsóknarstofu minni fyrir nokkrum vikum. Í þessu tilfelli smíðuðum við kerfi með nýjum inndælingarloka sem við höfðum ekki notað áður og settum upp litla inndælingarlykkju með ferrule sem hafði verið mótað á ryðfríu stáli háræðarrör. Eftir nokkrar upphaflegar bilanaleitartilraunir komumst við að því að opnunardýptin í stator inndælingarlokans var miklu dýpri en við vorum vön, sem leiddi til mikils dauðarýmis neðst á opnuninni. Þetta vandamál er auðveldlega leyst með því að skipta um inndælingarlykkjuna fyrir annað rör, við getum stillt ferrule-ið í rétta stöðu til að útrýma dauðarýminu neðst á opnuninni.
Toppframhliðar eins og þær sem sýndar eru á mynd 1e geta einnig stafað af eðlisfræðilegum eða efnafræðilegum vandamálum. Algeng eðlisfræðileg orsök fremstu brúnar er að agnalag dálksins er ekki vel pakkað eða að agnirnar hafa endurskipulagt sig með tímanum. Eins og með topphala sem orsakast af þessu eðlisfræðilega fyrirbæri, er besta leiðin til að laga þetta að skipta um dálkinn og halda áfram. Í grundvallaratriðum stafa toppform fremstu brúna af efnafræðilegum uppruna oft af því sem við köllum „ólínulegar“ varðveisluskilyrði. Við kjörskilyrði (línuleg) er magn greiningarefnis sem kyrrstæða fasinn heldur eftir (þess vegna varðveislustuðullinn) línulega tengt styrk greiningarefnisins í dálknum. Litskiljunarfræðilega þýðir þetta að þegar massi greiningarefnisins sem sprautað er inn í dálkinn eykst, verður toppurinn hærri en ekki breiðari. Þetta samband rofnar þegar varðveisluhegðunin er ólínuleg og topparnir verða ekki aðeins hærri heldur einnig breiðari eftir því sem meiri massi er sprautaður inn. Að auki ákvarða ólínuleg form lögun litskiljunartoppa, sem leiðir til fremstu eða aftari brúna. Eins og með massaofhleðslu sem veldur topphala (10), veldur fremsta toppur... Með ólínulegri varðveislu er einnig hægt að greina með því að minnka massa sprautaðs greiningarefnis. Ef lögun toppsins batnar verður að breyta aðferðinni þannig að hún fari ekki fram úr þeim innspýtingargæðum sem veldur fremstu brúninni, eða breyta þarf litskiljunarskilyrðum til að lágmarka þessa hegðun.
Stundum sjáum við það sem virðist vera „klofinn“ tind, eins og sést á mynd 1f. Fyrsta skrefið í að leysa þetta vandamál er að ákvarða hvort lögun tindsins stafar af að hluta til samútskolun (þ.e. nærveru tveggja aðgreindra en nátengdra efnasambanda). Ef það eru í raun tvær mismunandi greiningarefni sem skola saman nálægt hvort öðru, þá snýst það um að bæta upplausn þeirra (til dæmis með því að auka sértækni, varðveislu eða plötufjölda), og þessir sýnilegu „klofnu“ tindar tengjast eðlisfræðilegum eiginleikum. Afköst hafa ekkert með dálkinn sjálfan að gera. Oft er mikilvægasta vísbendingin um þessa ákvörðun hvort allir tindar í litrófinu sýna klofinn form, eða bara einn eða tveir. Ef það eru bara einn eða tveir, þá er það líklega samútskolunarvandamál; ef allir tindar eru klofnir, þá er það líklega eðlisfræðilegt vandamál, líklega tengt dálkinum sjálfum.
Skiptir toppar sem tengjast eðliseiginleikum súlunnar sjálfrar eru venjulega vegna að hluta til stíflaðra inntaks- eða úttaksfrita, eða endurskipulagningar agna í súlunni, sem gerir hreyfanlega fasanum kleift að flæða hraðar en hreyfanlega fasanum á ákveðnum svæðum í myndun súlunnarrásarinnar á öðrum svæðum (11). Að hluta til stíflað frit er stundum hægt að hreinsa með því að snúa flæðinu í gegnum súluna við; þó, að mínu mati, er þetta venjulega skammtímalausn frekar en langtímalausn. Þetta er oft banvænt með nútíma súlum ef agnirnar sameinast aftur innan súlunnar. Á þessum tímapunkti er best að skipta um súluna og halda áfram.
Toppurinn á mynd 1g, einnig frá nýlegu tilviki í minni eigin rannsóknarstofu, gefur venjulega til kynna að merkið sé svo hátt að það hafi náð efri mörkum svörunarbilsins. Fyrir ljósleiðara (útfjólubláa-sýnilega í þessu tilfelli), þegar styrkur greiningarefnisins er mjög hár, gleypir greiningarefnið mest af ljósinu sem fer í gegnum flæðisfrumu skynjarans, sem skilur eftir mjög lítið ljós til að greina. Við þessar aðstæður verður rafmagnsmerkið frá ljósnemanum fyrir miklum áhrifum af ýmsum hávaðagjöfum, svo sem villiljósi og „myrkrastraumi“, sem gerir merkið mjög „óskýrt“ í útliti og óháð styrk greiningarefnisins. Þegar þetta gerist er oft auðvelt að leysa vandamálið með því að minnka inndælingarrúmmál greiningarefnisins - minnka inndælingarrúmmálið, þynna sýnið eða hvort tveggja.
Í litskiljunarskóla notum við merki frá mælinum (þ.e. y-ásinn í litskiljunarmyndinni) sem vísbendingu um styrk greiningarefnisins í sýninu. Það virðist því skrýtið að sjá litskiljunarmynd með merki undir núlli, þar sem einfalda túlkunin er sú að þetta gefur til kynna neikvæðan styrk greiningarefnisins - sem er auðvitað ekki líkamlega mögulegt. Að mínu mati sjást neikvæðir toppar oftast þegar notaðir eru ljósleiðarar (t.d. UV-vis).
Í þessu tilviki þýðir neikvæður toppur einfaldlega að sameindirnar sem losna úr dálknum gleypa minna ljós en hreyfanlega fasinn sjálfur rétt fyrir og eftir toppinn. Þetta getur til dæmis gerst þegar notaðar eru tiltölulega lágar greiningarbylgjulengdir (<230 nm) og aukefni í hreyfanlega fasanum sem gleypa mest af ljósinu á þessum bylgjulengdum. Slík aukefni geta verið leysiefni í hreyfanlega fasanum eins og metanól eða stuðpúðaefni eins og asetat eða format. Hægt er að nota neikvæða toppa til að útbúa kvörðunarferil og fá nákvæmar megindlegar upplýsingar, þannig að það er engin grundvallarástæða til að forðast þá í sjálfu sér (þessi aðferð er stundum kölluð „óbein útfjólublá greining“) (13). Hins vegar, ef við viljum virkilega forðast neikvæða toppa alveg, í tilviki gleypnigreiningar, er besta lausnin að nota aðra greiningarbylgjulengd þannig að greiningarefnið gleypi meira en hreyfanlega fasinn, eða breyta samsetningu hreyfanlega fasans þannig að þeir gleypi minna ljós en greiningarefnin.
Neikvæðar toppar geta einnig komið fram þegar brotstuðull (RI) er notaður þegar brotstuðull annarra íhluta en greiningarefnisins í sýninu, svo sem leysiefnisgrunnefnisins, er frábrugðinn brotstuðli hreyfanlega fasans. Þetta gerist einnig við UV-vis greiningu, en þessi áhrif hafa tilhneigingu til að minnka miðað við RI greiningu. Í báðum tilvikum er hægt að lágmarka neikvæða toppa með því að para samsetningu sýnisgrunnefnisins betur við samsetningu hreyfanlega fasans.
Í þriðja hluta um grunnefnið í bilanaleit á LC fjallaði ég um aðstæður þar sem mæld toppform er frábrugðið væntanlegri eða eðlilegri toppformi. Árangursrík bilanaleit á slíkum vandamálum hefst með þekkingu á væntanlegri toppformi (byggt á kenningum eða fyrri reynslu af núverandi aðferðum), þannig að frávik frá þessum væntingum eru augljós. Vandamál með toppform hafa margar mismunandi mögulegar orsakir (of breið, hala, fremsta brún o.s.frv.). Í þessum hluta fjalla ég ítarlega um nokkrar af þeim ástæðum sem ég sé oftast. Að þekkja þessar upplýsingar veitir gott upphaf til að byrja bilanaleit, en nær ekki yfir alla möguleika. Lesendur sem hafa áhuga á ítarlegri lista yfir orsakir og lausnir geta vísað til veggspjaldsins „LC Troubleshooting Guide“ frá LCGC.
(4) Veggspjald LCGC „Leiðbeiningar um bilanaleit LC“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Gagnagreining og merkjavinnsla í litskiljun (Elsevier, New York, NY, 1998), bls. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.