Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Liquid biopsy (LB) er hugtak sem nýtur ört vaxandi vinsælda á lífeindasviði.Hugmyndin byggist aðallega á því að greina búta af utanfrumu-DNA (ccfDNA) í blóði sem losna aðallega sem smábrot eftir frumudauða í ýmsum vefjum.Lítill hluti þessara brota er upprunninn úr framandi (erlendum) vefjum eða lífverum.Í yfirstandandi vinnu höfum við beitt þessu hugtaki á krækling, gæludýrategund sem er þekkt fyrir mikla síunargetu sjós.Við notum hæfileika kræklingsins til að virka sem náttúrulegar síur til að fanga DNA brot úr umhverfinu frá ýmsum aðilum til að veita upplýsingar um líffræðilegan fjölbreytileika vistkerfa sjávarstranda.Niðurstöður okkar sýna að kræklingahemolymph inniheldur DNA brot sem eru mjög mismunandi að stærð, frá 1 til 5 kb.Haglabyssuröðun sýndi að mikill fjöldi DNA-búta er af erlendum örveruuppruna.Þar á meðal fundum við DNA brot úr bakteríum, fornbakteríum og vírusum, þar á meðal veirur sem vitað er að sýkja margs konar hýsil sem almennt er að finna í sjávarvistkerfum við ströndina.Að lokum sýnir rannsókn okkar fram á að hugtakið LB sem notað er á krækling táknar ríka en enn ókannaða uppsprettu þekkingar um fjölbreytileika örvera í vistkerfum sjávarstranda.
Áhrif loftslagsbreytinga (CC) á líffræðilegan fjölbreytileika vistkerfa sjávar er ört vaxandi rannsóknarsvæði.Hlýnun jarðar veldur ekki aðeins mikilvægu lífeðlisfræðilegu álagi heldur ýtir hún einnig á þróunarmörk varmastöðugleika sjávarlífvera, hefur áhrif á búsvæði fjölda tegunda og hvetur þær til að leita að hagstæðari skilyrðum [1, 2].Auk þess að hafa áhrif á líffræðilegan fjölbreytileika metazóa, truflar CC viðkvæmt jafnvægi milli hýsils og örvera.Þessi örverubakteríusýking er alvarleg ógn við vistkerfi sjávar þar sem hún gerir sjávarlífverur næmari fyrir smitandi sýkla [3, 4].Talið er að SS gegni mikilvægu hlutverki í fjöldadauða, sem er alvarlegt vandamál fyrir stjórnun á hnattrænum vistkerfum sjávar [5, 6].Þetta er mikilvægt mál í ljósi efnahagslegra, vistfræðilegra og næringarlegra áhrifa margra sjávartegunda.Þetta á sérstaklega við um samlokur sem búa á heimskautasvæðum, þar sem áhrif CK eru bráðari og alvarlegri [6, 7].Reyndar eru samlokur eins og Mytilus spp.eru mikið notaðar til að fylgjast með áhrifum CC á vistkerfi sjávar.Það kemur ekki á óvart að tiltölulega mikill fjöldi lífmerkja hefur verið þróaður til að fylgjast með heilsu þeirra, oft með tvíþættri nálgun sem felur í sér hagnýta lífmerki sem byggjast á ensímvirkni eða frumustarfsemi eins og frumulífvænleika og átfrumuvirkni [8].Þessar aðferðir fela einnig í sér mælingu á styrk tiltekinna þrýstingsvísa sem safnast upp í mjúkvef eftir frásog mikið magns af sjó.Hins vegar gefur mikil síunargeta og hálfopið blóðrásarkerfi samloka tækifæri til að þróa ný blóðmýfumerki með því að nota hugmyndina um fljótandi vefjasýni (LB), einföld og lágmarks ífarandi nálgun við meðferð sjúklinga.blóðsýni [9, 10].Þrátt fyrir að nokkrar tegundir af blóðrásarsameindum sé að finna í LB úr mönnum, byggist þetta hugtak fyrst og fremst á DNA raðgreiningu á utanfrumu-DNA (ccfDNA) brotum í blóði í blóði.Reyndar hefur tilvist DNA í blóði í blóði verið þekkt frá því um miðja 20. öld [11], en það er aðeins á síðustu árum sem tilkoma raðgreiningaraðferða með mikilli afköstum hefur leitt til klínískrar greiningar byggðar á ccfDNA.Tilvist þessara DNA brota sem dreifast er að hluta til vegna óvirkrar losunar erfðaefnis DNA (kjarna og hvatbera) eftir frumudauða. Hjá heilbrigðum einstaklingum er styrkur ccfDNA venjulega lágur (<10 ng/ml) en getur aukist um 5-10 sinnum hjá sjúklingum sem þjást af ýmsum sjúkdómum eða verða fyrir streitu, sem leiðir til vefjaskemmda. Hjá heilbrigðum einstaklingum er styrkur ccfDNA venjulega lágur (<10 ng/ml) en getur aukist um 5-10 sinnum hjá sjúklingum sem þjást af ýmsum sjúkdómum eða verða fyrir streitu, sem leiðir til vefjaskemmda. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 á 5. логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hjá heilbrigðu fólki er styrkur cccDNA venjulega lágur (<10 ng/ml) en hann getur aukist um 5-10 sinnum hjá sjúklingum með ýmsa sjúkdóma eða undir streitu sem leiðir til vefjaskemmda.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理戅嚄嚏萆或手加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刏 旅理 刏可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 мл. логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Styrkur ccfDNA er venjulega lágur (<10 ng/ml) hjá heilbrigðum einstaklingum, en getur aukist 5-10-falt hjá sjúklingum með ýmsa sjúkdóma eða streitu, sem leiðir til vefjaskemmda.Stærð ccfDNA brota er mjög mismunandi, en venjulega á bilinu 150 til 200 bp.[12].Greining á sjálffengnu ccfDNA, þ.e. ccfDNA frá venjulegum eða umbreyttum hýsilfrumum, er hægt að nota til að greina erfðafræðilegar og epigenetic breytingar sem eru til staðar í kjarna- og/eða hvatbera erfðamengi, og hjálpa þar með læknum að velja sértækar sameindamiðaðar meðferðir [13] .Hins vegar er hægt að fá ccfDNA frá erlendum aðilum eins og ccfDNA frá fósturfrumum á meðgöngu eða frá ígræddum líffærum [14,15,16,17].ccfDNA er einnig mikilvæg uppspretta upplýsinga til að greina tilvist kjarnsýra smitefnis (erlendu), sem gerir kleift að greina ekki ífarandi sýkingar sem ekki eru auðkenndar af blóðræktun og forðast ífarandi vefjasýni af sýktum vef [18].Nýlegar rannsóknir hafa sannarlega sýnt að blóð úr mönnum inniheldur ríka uppsprettu upplýsinga sem hægt er að nota til að bera kennsl á veiru- og bakteríusýkla og að um 1% af ccfDNA sem finnast í plasma manna er af erlendum uppruna [19].Þessar rannsóknir sýna að hægt er að meta líffræðilegan fjölbreytileika örveru lífveru í hringrás með ccfDNA greiningu.Hins vegar, þar til nýlega, var þetta hugtak eingöngu notað hjá mönnum og í minna mæli hjá öðrum hryggdýrum [20, 21].
Í þessari grein notum við LB möguleikana til að greina ccfDNA Aulacomya atra, suðlægrar tegundar sem almennt er að finna á Kerguelen-eyjum undir suðurskautinu, hópur eyja ofan á stóru hálendi sem myndaðist fyrir 35 milljón árum síðan.eldgos.Með því að nota in vitro tilraunakerfi komumst við að því að DNA bútar í sjó eru fljótt teknir upp af kræklingi og komast inn í hemolymph hólfið.Haglabyssuröðun hefur sýnt að kræklingahemolymph ccfDNA inniheldur DNA brot af eigin uppruna og uppruna, þar á meðal samlífisbakteríur og DNA brot úr lífverum sem eru dæmigerð fyrir köldu sjávarvistkerfi í köldum sjávarströndum.Hemolymph ccfDNA inniheldur einnig veiru raðir sem eru unnar úr vírusum með mismunandi hýsilsvið.Við fundum einnig DNA-búta úr fjölfrumudýrum eins og beinfiskum, sjóanemónum, þörungum og skordýrum.Að lokum sýnir rannsókn okkar að hægt er að beita LB hugmyndinni með góðum árangri á sjávarhryggleysingja til að búa til ríka erfðafræðilega efnisskrá í vistkerfum sjávar.
Fullorðnum (55-70 mm langir) Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) var safnað frá grýttum fjöruströndum Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Kerguelen-eyjar í desember 2018. Annar fullorðinn bláskel (Mytilus spp.) var fengin frá verslunarbirgi (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) og settur í hitastýrðan (4°C) loftblandaðan tank sem innihélt 10–20 L af 32‰ gervi saltvatni.(gervi sjávarsalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, Bandaríkjunum).Fyrir hverja tilraun var lengd og þyngd einstakra skelja mæld.
Ókeypis samskiptareglur fyrir opinn aðgang fyrir þetta forrit er fáanleg á netinu (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Í stuttu máli var LB hemolymph safnað úr brottnámsvöðvum eins og lýst er [22].Hemolymph var tært með skilvindu við 1200×g í 3 mínútur, flotið var frosið (-20°C) þar til það var notað.Til einangrunar og hreinsunar á cfDNA voru sýni (1,5-2,0 ml) þídd og unnin með NucleoSnap cfDNA settinu (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.ccfDNA var geymt við -80°C þar til frekari greiningu.Í sumum tilraunum var ccfDNA einangrað og hreinsað með því að nota QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Hreinsað DNA var magnmælt með stöðluðu PicoGreen prófi.Brotadreifing einangraða ccfDNA var greind með háræðarafnámi með því að nota Agilent 2100 lífgreiningartæki (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) með High Sensitivity DNA Kit.Greiningin var framkvæmd með því að nota 1 µl af ccfDNA sýninu samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Til raðgreiningar á hemolymph ccfDNA brotum útbjó Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) haglabyssusöfn með því að nota Illumina DNA Mix settið úr Illumina MiSeq PE75 settinu.Notað var staðlað millistykki (BioO).Hrágagnaskrár eru fáanlegar frá NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809).Grunngæði lestrar voru metin með FastQC [23].Trimmomatic [24] hefur verið notað til að klippa millistykki og aflestrar af lélegum gæðum.Haglabyssuaflestur með pöruðum endum var FLASH sameinuð í lengri staka lestur með að lágmarki 20 bp skörun til að forðast misræmi [25]. Sameinuð lestur var merktur með BLASTN með því að nota tvíloka NCBI flokkunarfræði gagnagrunn (e gildi < 1e-3 og 90% samsvörun) og gríma á lágflóknum raðir var framkvæmd með því að nota DUST [26]. Sameinuð lestur var merktur með BLASTN með því að nota tvíloka NCBI flokkunarfræði gagnagrunn (e gildi < 1e-3 og 90% samsvörun) og gríma á lágflóknum raðir var framkvæmd með því að nota DUST [26]. (Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорча 1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Samanlögð lestur var merktur með BLASTN með því að nota NCBI tvíloka flokkunargagnagrunninn (e gildi < 1e-3 og 90% samsvörun) og lágflækjustig var gerð með því að nota DUST [26].使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 读濹 2]行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данныхна двиNCов е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использ [26]. Samanlögð lestur var merktur með BLASTN með því að nota NCBI tvíloka flokkunarfræðilegan gagnagrunn (e gildi <1e-3 og 90% samsvörun) og lágflækjustig var gerð með því að nota DUST [26].Lesum var skipt í tvo hópa: tengdar samlokuröðum (hér kallaðar sjálflestur) og óskyldar (ekki sjálflestrar).Tveir hópar voru settir saman sérstaklega með því að nota MEGAHIT til að mynda samstæður [27].Á sama tíma var flokkunarfræðileg dreifing á framandi örveruaflestri flokkuð með Kraken2 [28] og myndrænt táknað með Krónu kökuriti á Galaxy [29, 30].Ákjósanlegur kmers var ákveðinn að vera kmers-59 út frá fortilraunum okkar. Sjálfsamstæður voru síðan auðkenndar með því að samræma við BLASTN (tvíloka NCBI gagnagrunn, e gildi <1e−10 og 60% samlíking) fyrir lokaskýring. Sjálfsamstæður voru síðan auðkenndar með því að samræma við BLASTN (tvíloka NCBI gagnagrunn, e gildi <1e−10 og 60% samlíking) fyrir lokaskýring. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатированы) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Sjálfsamstæður voru síðan auðkenndar með því að passa saman við BLASTN (NCBI samloka gagnagrunn, e gildi <1e-10 og 60% samsvörun) fyrir lokaskýringu.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BINC для BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Sjálfsamstæður voru síðan auðkenndar til lokaskýringar með því að passa við BLASTN (NCBI samloka gagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% samsvörun). Samhliða voru hópar sem ekki voru sjálfir skráðir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e−10 og 60% samlíking). Samhliða voru hópar sem ekki voru sjálfir skráðir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e−10 og 60% samlíking). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (ásamt NCBI, á milli 10% e. og 6%. Samhliða voru erlendir hópasamstæður merktir með BLASTN (NT NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (e. и гомология 60%). Samhliða voru samfelldir hópar sem ekki voru sjálfir merktir með BLASTN (nt NCBI gagnagrunnur, e gildi <1e-10 og 60% homology). BLASTX var einnig framkvæmt á non-self contigs með því að nota nr og RefSeq prótein NCBI gagnagrunna (e gildi <1e−10 og 60% homology). BLASTX var einnig framkvæmt á non-self contigs með því að nota nr og RefSeq prótein NCBI gagnagrunna (e gildi <1e−10 og 60% homology). BLASTX er notaður á несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (e. 1. 0. 20. %). BLASTX var einnig framkvæmt á non-self contigs með því að nota nr og RefSeq NCBI prótein gagnagrunna (e gildi < 1e-10 og 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 怉 吺 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧 怉 吺 吺 吺 Blastx таже ыолняли на несамос upp ьня контигах с иолованием баз данных бела nr и Refseq ncbi (значениare e <1e гissa-10 . BLASTX var einnig framkvæmt á non-self contigs með því að nota nr og RefSeq NCBI prótein gagnagrunna (e gildi <1e-10 og 60% homology).BLASTN- og BLASTX-samstæðurnar sem ekki eru sjálf-samstæður tákna lokasamstæðuna (sjá viðbótarskrá).
Primerarnir sem notaðir eru fyrir PCR eru taldir upp í töflu S1.Taq DNA pólýmerasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) var notaður til að magna upp ccfDNA markgenin.Eftirfarandi hvarfaðstæður voru notaðar: afeðlun við 95°C í 3 mínútur, 95°C í 1 mínútu, stillt hitastig í 1 mínútu, lenging við 72°C í 1 mínútu, 35 lotur og loks 72°C innan 10 mínútna..PCR afurðir voru aðskildar með rafdrætti í agarósagelum (1,5%) sem innihéldu SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) við 95 V.
Kræklingur (Mytilus spp.) var aðlagaður í 500 ml súrefnisríkum sjó (32 PSU) í 24 klukkustundir við 4°C.Plasmíð DNA sem innihélt innskot sem kóðar galectin-7 cDNA röð manna (NCBI aðgangsnúmer L07769) var bætt við hettuglasið í lokastyrknum 190 μg/μl.Kræklingur sem ræktaður var við sömu aðstæður án DNA-viðbótar voru viðmiðunarhópurinn.Þriðji stjórntankurinn innihélt DNA án kræklings.Til að fylgjast með gæðum DNA í sjó voru tekin sjósýni (20 μl; þrjár endurtekningar) úr hverjum tanki á tilgreindum tíma.Fyrir plasmíð DNA rekjanleika var LB kræklingur safnað á tilgreindum tímum og greindur með qPCR og ddPCR.Vegna mikils saltinnihalds sjávar voru skammtar þynntir í PCR gæðavatni (1:10) fyrir allar PCR prófanir.
Digital droplet PCR (ddPCR) var framkvæmd með BioRad QX200 samskiptareglum (Mississauga, Ontario, Kanada).Notaðu hitastigið til að ákvarða besta hitastigið (tafla S1).Dropar voru búnir til með því að nota QX200 dropagenerator (BioRad).ddPCR var framkvæmt sem hér segir: 95°C í 5 mínútur, 50 lotur af 95°C í 30 sekúndur og tiltekið hitastig í 1 mín og 72°C í 30 s, 4°C í 5 mínútur og 90°C innan 5 mínútna.Fjöldi dropa og jákvæðra viðbragða (fjöldi eintaka/µl) var mældur með QX200 dropalesara (BioRad).Sýnum með minna en 10.000 dropum var hafnað.Mynsturstýring var ekki framkvæmd í hvert sinn sem ddPCR var keyrt.
qPCR var framkvæmt með því að nota Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Ástralíu) og LGALS7 sértæka grunna.Allar megindlegar PCRs voru framkvæmdar í 20 µl með QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR var hafin með 15 mínútna ræktun við 95°C og fylgt eftir með 40 lotum við 95°C í 10 sekúndur og við 60°C í 60 sekúndur með einni gagnasöfnun.Bræðsluferlar voru búnir til með því að nota mælingar í röð við 95°C í 5 s, 65°C í 60 s og 97°C í lok qPCR.Hver qPCR var framkvæmd í þríriti, nema viðmiðunarsýni.
Þar sem kræklingur er þekktur fyrir háan síunarhraða, könnuðum við fyrst hvort hann gæti síað og haldið eftir DNA brotum sem eru til staðar í sjó.Við höfðum líka áhuga á því hvort þessi brot safnist fyrir í hálfopnu sogæðakerfinu.Við leystum þetta mál í tilraunaskyni með því að rekja örlög leysanlegra DNA brota sem bætt var við kræklingatanka.Til að auðvelda rakningu á DNA bútum notuðum við erlent (ekki sjálft) plasmíð DNA sem innihélt galektín-7 genið úr mönnum.ddPCR rekur plasmíð DNA brot í sjó og kræklingi.Niðurstöður okkar sýna að ef magn DNA-búta í sjó hélst tiltölulega stöðugt yfir tíma (allt að 7 daga) án kræklinga, þá hvarf þetta magn nánast alveg innan 8 klukkustunda í nærveru kræklings (Mynd 1a,b).Brot af utanaðkomandi DNA fundust auðveldlega innan 15 mínútna í ventulvökva og hemolymph (mynd 1c).Enn var hægt að greina þessi brot allt að 4 klukkustundum eftir útsetningu.Þessi síunarvirkni með tilliti til DNA-búta er sambærileg við síunarvirkni baktería og þörunga [31].Þessar niðurstöður benda til þess að kræklingur geti síað og safnað erlendu DNA í vökvahólf sín.
Hlutfallslegur styrkur plasmíðs DNA í sjó í nærveru (A) eða fjarveru (B) kræklinga, mældur með ddPCR.Í A eru niðurstöðurnar gefnar upp sem prósentur, þar sem rammar reitanna tákna 75. og 25. hundraðshluta.Logaritmísk ferillinn er sýndur í rauðu og svæðið sem er skyggt með gráu táknar 95% öryggisbilið.Í B táknar rauða línan meðaltalið og bláa línan táknar 95% öryggisbil styrksins.C Uppsöfnun plasmíðs DNA í hemolymph og lokuvökva kræklinga á mismunandi tímum eftir að plasmíð DNA hefur verið bætt við.Niðurstöður eru settar fram sem algild eintök greind/ml (±SE).
Næst könnuðum við uppruna ccfDNA í kræklingi sem safnað var úr kræklingabeðum á Kerguelen-eyjum, afskekktum hópi eyja með takmörkuð áhrif af mannavöldum.Í þessu skyni var cccDNA úr kræklingahemolymphs einangrað og hreinsað með aðferðum sem almennt eru notaðar til að hreinsa cccDNA úr mönnum [32, 33].Við komumst að því að meðalstyrkur hemolymph ccfDNA í kræklingi er á lágu míkrógrömmum á ml hemolymph bilinu (sjá töflu S2, viðbótarupplýsingar).Þetta styrkleikasvið er mun stærra en hjá heilbrigðu fólki (lágt nanógrömm á millilítra), en í mjög sjaldgæfum tilfellum, hjá krabbameinssjúklingum, getur magn ccfDNA náð nokkrum míkrógrömmum á millilítra [34, 35].Greining á stærðardreifingu hemolymph ccfDNA sýndi að þessi brot eru mjög mismunandi að stærð, allt frá 1000 bp til 1000 bp.allt að 5000 bp (mynd 2).Svipaðar niðurstöður fengust með því að nota QIAamp Investigator Kit sem byggir á kísil, aðferð sem almennt er notuð í réttarvísindum til að einangra og hreinsa erfðafræðilegt DNA hratt úr DNA sýnum með lágum styrk, þar á meðal ccfDNA [36].
Fulltrúi ccfDNA rafskaut af kræklingahemolymph.Tekið út með NucleoSnap Plasma Kit (efst) og QIAamp DNA Investigator Kit.B Fiðlurit sem sýnir dreifingu hemolymph ccfDNA styrks (±SE) í kræklingi.Svörtu og rauðu línurnar tákna miðgildið og fyrsta og þriðja fjórðungsmarkið, í sömu röð.
Um það bil 1% af ccfDNA í mönnum og prímötum hefur erlenda uppsprettu [21, 37].Í ljósi hálfopins blóðrásarkerfis samloka, örveruríks sjós og stærðardreifingar kræklinga ccfDNA, gerðum við tilgátu um að kræklingahemolymph ccfDNA gæti innihaldið ríkan og fjölbreyttan hóp af örveru-DNA.Til að prófa þessa tilgátu raðgreindum við hemolymph ccfDNA úr Aulacomya atra sýnum sem safnað var frá Kerguelen-eyjum, sem skilaði yfir 10 milljón lestum, þar af stóðust 97,6% gæðaeftirlit.Lestrarnir voru síðan flokkaðir eftir sjálfum og öðrum heimildum með því að nota BLASTN og NCBI bivalve gagnagrunna (mynd S1, viðbótarupplýsingar).
Hjá mönnum getur bæði kjarna- og hvatbera-DNA losnað út í blóðrásina [38].Hins vegar, í þessari rannsókn, var ekki hægt að lýsa í smáatriðum erfðamengi DNA kræklinga, þar sem A. atra erfðamengi hefur ekki verið raðgreint eða lýst.Hins vegar gátum við greint fjölda ccfDNA brota af eigin uppruna með því að nota bivalve bókasafnið (mynd S2, viðbótarupplýsingar).Við staðfestum einnig tilvist DNA brota af okkar eigin uppruna með stýrðri PCR mögnun á þeim A. atra genum sem voru raðgreind (mynd 3).Á sama hátt, í ljósi þess að hvatbera erfðamengi A. atra er aðgengilegt í opinberum gagnagrunnum, má finna vísbendingar um tilvist hvatbera ccfDNA brota í hemolymph A. atra.Tilvist hvatbera DNA búta var staðfest með PCR mögnun (mynd 3).
Ýmis hvatbera gen voru til staðar í hemolymph A. atra (rauðir punktar – stofnnúmer: SRX5705969) og M. platensis (bláir punktar – stofnnúmer: SRX5705968) mögnuð með PCR.Mynd aðlöguð frá Breton o.fl., 2011 B Mögnun á hemolymph supernatant frá A. atra Geymt á FTA pappír.Notaðu 3 mm kýla til að bæta beint í PCR túpuna sem inniheldur PCR blönduna.
Í ljósi mikils örveruinnihalds í sjó, einbeittum við okkur upphaflega að lýsingu á örveru-DNA röðum í hemolymph.Til að gera þetta notum við tvær mismunandi aðferðir.Fyrsta aðferðin notaði Kraken2, reiknirit byggt raðflokkunarforrit sem getur greint örveruraðir með sambærilegri nákvæmni og BLAST og önnur tæki [28].Ákveðið var að meira en 6719 lestir væru af bakteríuuppruna, en 124 og 64 voru frá fornleifum og veirum, í sömu röð (mynd 4).Algengustu DNA-bútar baktería voru Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) og Bacteroidetes (17%) (Mynd 4a).Þessi dreifing er í samræmi við fyrri rannsóknir á örveru blákræklingsins [39, 40].Gammaproteobacteria var aðalflokkur Proteobacteria (44%), þar á meðal margir Vibrionales (mynd 4b).ddPCR aðferðin staðfesti tilvist Vibrio DNA brota í ccfDNA A. atra hemolymph (mynd 4c) [41].Til að fá frekari upplýsingar um uppruna baktería ccfDNA var gripið til viðbótaraðferðar (mynd S2, viðbótarupplýsingar). Í þessu tilviki voru lesar sem skarast settar saman sem pöruðum enda lesum og voru flokkaðar sem af sjálfum sér (tómlokum) eða ekki sjálfum uppruna með því að nota BLASTN og e gildi 1e−3 og cutoff með >90% samlíkingu. Í þessu tilviki voru lesar sem skarast settar saman sem pöruðum enda lesum og voru flokkaðar sem af sjálfum sér (tómlokum) eða ekki sjálfum uppruna með því að nota BLASTN og e gildi 1e−3 og cutoff með >90% samlíkingu. (В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 og отсеченио с гогодения> гого. Í þessu tilviki var aflestri sem skarast safnað sem pöruðum lestum og voru þær flokkaðar sem innfæddar (tvílokur) eða óupprunalegar með því að nota BLASTN og e gildi 1e-3 og cutoff með >90% samlíkingu.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倌歧倢倢暒值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 使缄的 的 的 的 的 的 的 的和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 (В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицович ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 og порога гомолога. Í þessu tilviki var aflestri sem skarast safnað sem pöruðum lestum og flokkað sem eigin (tvílokur) eða óupprunalegt með því að nota e BLASTN og 1e-3 gildi og samheitaþröskuld >90%.Þar sem A. atra erfðamengi hefur ekki enn verið raðgreint, notuðum við de novo samsetningarstefnu MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Alls hafa 147.188 samfellur verið auðkenndar sem háðar (samlokur) uppruna.Þessar samstæður voru síðan sprengdar með e-gildum upp á 1e-10 með BLASTN og BLASTX.Þessi aðferð gerði okkur kleift að bera kennsl á 482 brot sem ekki eru tvíloka sem voru til staðar í A. atra ccfDNA.Meira en helmingur (57%) af þessum DNA bútum var fengin úr bakteríum, aðallega úr tálknum, þar á meðal súlfótrófískum samlífum, og úr tálknum Solemya velum (mynd 5).
Hlutfallsleg gnægð á tegundarstigi.B Örverufjölbreytileiki tveggja helstu ættflokka (Firmicutes og Proteobacteria).Fullkomin mögnun á ddPCR C Vibrio spp.A. Brot af 16S rRNA geninu (blátt) í þremur atra hemolymphs.
Alls voru 482 söfnuð söfn greind.Almennt snið á flokkunarfræðilegri dreifingu á metagenomic contig-skýringum (dreifkjörnunga og heilkjörnunga).B Ítarleg dreifing á DNA-bútum baktería sem auðkennd eru með BLASTN og BLASTX.
Kraken2 greining sýndi einnig að kræklinga ccfDNA innihélt fornleifa DNA brot, þar á meðal DNA brot af Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) og Thaurmarcheota (11%) (mynd 6a).Tilvist DNA-búta úr Euryarchaeota og Crenarchaeota, sem áður fannst í örverusamfélagi Kaliforníukræklinga, ætti ekki að koma á óvart [42].Þrátt fyrir að Euryarchaeota sé oft tengt við erfiðar aðstæður, er nú viðurkennt að bæði Euryarchaeota og Crearcheota eru meðal algengustu dreifkjörnunganna í sjávarumhverfinu [43, 44].Tilvist metanvaldandi örvera í kræklingi kemur ekki á óvart, miðað við nýlegar fregnir af víðtækum metanleka frá botnleka á Kerguelen hásléttunni [45] og mögulega örveruframleiðsla metans sem sést undan strönd Kerguelen-eyja [46].
Athygli okkar beindist þá að lestri frá DNA vírusum.Eftir því sem við best vitum er þetta fyrsta rannsókn utan marka á veiruinnihaldi kræklinga.Eins og við var að búast fundum við DNA brot af bakteríufrumum (Caudovirales) (mynd 6b).Hins vegar kemur algengasta veiru-DNA frá hópi kjarnafrumnaveira, einnig þekktur sem kjarnafrymi stór DNA veira (NCLDV), sem hefur stærsta erfðamengi allra veira.Innan þessarar fylkingar tilheyra flestar DNA-raðir fjölskyldurnar Mimimidoviridae (58%) og Poxviridae (21%), en náttúrulegir hýslar þeirra innihalda hryggdýr og liðdýr, en lítill hluti þessara DNA-raða tilheyrir þekktum veirufræðilegum þörungum.Sýkir heilkjörnunga sjávarþörunga.Raðirnar voru einnig fengnar úr Pandora veirunni, risastóru veirunni með stærstu erfðamengisstærð allra þekktra veiruættkvísla.Athyglisvert er að svið hýsla sem vitað er að eru sýktir af veirunni, eins og ákvarðað er með hemolymph ccfDNA raðgreiningu, var tiltölulega stór (Mynd S3, viðbótarupplýsingar).Það felur í sér vírusa sem sýkja skordýr eins og Baculoviridae og Iridoviridae, auk vírusa sem sýkja amöbu, þörunga og hryggdýr.Við fundum líka raðir sem passa við Pithovirus sibericum erfðamengi.Pítóveirur (einnig þekktar sem „uppvakningavírusar“) voru fyrst einangraðar úr 30.000 ára gömlum sífrera í Síberíu [47].Þannig eru niðurstöður okkar í samræmi við fyrri skýrslur sem sýna að ekki eru allar nútíma tegundir þessara vírusa útdauðar [48] og að þessar vírusar gætu verið til staðar í afskekktum sjávarvistkerfum undir norðurheimskautinu.
Að lokum prófuðum við hvort við gætum fundið DNA brot úr öðrum fjölfrumudýrum.Alls voru 482 erlendir contigs auðkenndir af BLASTN og BLASTX með nt, nr og RefSeq söfnum (erfðafræðileg og prótein).Niðurstöður okkar sýna að meðal erlendra búta af ccfDNA fjölfruma dýra er DNA beinbeina ríkjandi (mynd 5).Einnig hafa fundist DNA bútar úr skordýrum og öðrum tegundum.Tiltölulega stór hluti DNA-brotanna hefur ekki verið auðkenndur, hugsanlega vegna vantákn fjölda sjávartegunda í erfðafræðilegum gagnagrunnum samanborið við landbundnar tegundir [49].
Í þessari grein notum við LB hugtakið á krækling, með þeim rökum að hemolymph ccfDNA skot raðgreining geti veitt innsýn í samsetningu sjávarvistkerfa við strandlengju.Sérstaklega komumst við að því að 1) kræklingahemolymph inniheldur tiltölulega háan styrk (míkrógrömm) af tiltölulega stórum (~1-5 kb) DNA brotum í hringrás;2) þessi DNA brot eru bæði óháð og óháð 3) Meðal erlendra uppspretta þessara DNA brota fundum við bakteríu-, fornleifa- og veiru-DNA, auk DNA annarra fjölfruma dýra;4) Uppsöfnun þessara framandi ccfDNA brota í hemolymph á sér stað hratt og stuðlar að innri síunarvirkni kræklingsins.Niðurstaðan er sú að rannsókn okkar sýnir fram á að hugtakið LB, sem hingað til hefur aðallega verið beitt á sviði líflækninga, umritar ríka en órannsakaða uppsprettu þekkingar sem hægt er að nota til að skilja betur samspil eftirlitsdýrategunda og umhverfis þeirra.
Auk prímata hefur verið greint frá einangrun ccfDNA í spendýrum, þar á meðal músum, hundum, köttum og hestum [50, 51, 52].Hins vegar er rannsókn okkar sú fyrsta sem greinir frá greiningu og raðgreiningu ccfDNA í sjávartegundum með opið blóðrásarkerfi að því er við vitum.Þessi líffærafræðilegi eiginleiki og síunargeta kræklinga getur, að minnsta kosti að hluta, skýrt mismunandi stærðareiginleika DNA-búta í blóðrás samanborið við aðrar tegundir.Hjá mönnum eru flestir DNA-bútar sem dreifast í blóði lítil brot sem eru á bilinu 150 til 200 bp að stærð.með hámarks hámarki 167 bp [34, 53].Lítill en umtalsverður hluti af DNA brotum er á milli 300 og 500 bp að stærð og um 5% eru lengri en 900 bp.[54].Ástæðan fyrir þessari stærðardreifingu er sú að aðaluppspretta ccfDNA í plasma á sér stað vegna frumudauða, annaðhvort vegna frumudauða eða vegna dreps á blóðmyndandi frumum í blóðrás í heilbrigðum einstaklingum eða vegna frumudauða æxlisfrumna hjá krabbameinssjúklingum (þekkt sem blóðmyndandi DNA í blóðrásinni)., ctDNA).
Gögnin okkar benda til þess að raðgreining og greining á hemolymph ccfDNA brotum úr bakteríum geti veitt lykilupplýsingar um hýsilbakteríaflóru og bakteríur sem eru til staðar í vistkerfi hafsins í kring.Skotraðgreiningaraðferðir hafa leitt í ljós raðir af commensal bakteríunni A. atra tálknum sem hefði verið sleppt ef hefðbundnar 16S rRNA auðkenningaraðferðir hefðu verið notaðar, að hluta til vegna tilvísunarsafnsskekkju.Reyndar sýndi notkun okkar á LB gögnum sem safnað var frá M. platensis í sama kræklingalaginu við Kerguelen að samsetning tálknatengdra bakteríusamsetninga var sú sama fyrir báðar kræklingategundirnar (mynd S4, viðbótarupplýsingar).Þessi líkindi tveggja erfðafræðilega ólíkra kræklinga geta endurspeglað samsetningu bakteríusamfélaga í köldu, brennisteins- og eldfjallaútfellingum Kerguelen [55, 56, 57, 58].Hærra magni brennisteinsminnkandi örvera hefur verið vel lýst þegar kræklingur er tekinn frá lífrænum strandsvæðum [59], eins og strönd Port-au-France.Annar möguleiki er að kræklingaflóran geti orðið fyrir áhrifum af láréttri sendingu [60, 61].Frekari rannsókna er þörf til að ákvarða fylgni á milli sjávarumhverfis, yfirborðs sjávarbotns og samsetningar samlífisbaktería í kræklingi.Þessar rannsóknir standa nú yfir.
Þessi aðferð er sérstaklega áhrifarík til að einkenna veirusamfélög (víróma) í tilteknu vistkerfi [62, 63].Ólíkt bakteríum, archaea og heilkjörnungum, innihalda erfðamengi veiru ekki genafræðilega varðveitt gen eins og 16S röð.Þetta felur í sér vírusa sem vitað er að sýkja frumdýr, liðdýr, skordýr, plöntur og bakteríuveirur (td bakteríufrumur).Haglabyssuröðun ccfDNA er sannarlega ný nálgun sem fær skriðþunga í rannsóknum á veiru manna eða annarra tegunda [21, 37, 64].á sama hátt (sjá mynd S3, viðbótarupplýsingar).Þessi líking kemur ekki á óvart, þar sem hún getur endurspeglað skort á sértækni í upptöku DNA sem er til staðar í umhverfinu.Núna er þörf á framtíðarrannsóknum með hreinsuðu RNA til að einkenna RNA-vírusinn.
Í rannsókninni okkar notuðum við mjög stranga leiðslu sem var aðlöguð frá verkum Kowarski og samstarfsmanna [37], sem notuðu tveggja þrepa eyðingu á sameinuðum lestum og samfellum fyrir og eftir samsetningu innfædds ccfDNA, sem leiddi til hátt hlutfalls ókortlagðra lestra.Þess vegna getum við ekki útilokað að sumt af þessum ókortlögðu lestum geti enn átt sér uppruna, fyrst og fremst vegna þess að við höfum ekki viðmiðunarerfðamengi fyrir þessa kræklingategund.Við notuðum líka þessa leiðslu vegna þess að við höfðum áhyggjur af kvikindunum á milli sjálfs- og ósjálflestrar og lestrarlengdanna sem myndast af Illumina MiSeq PE75.Önnur ástæða fyrir meirihluta óþekktra lestra er sú að stór hluti sjávarörveranna, sérstaklega á afskekktum svæðum eins og Kerguelen, hefur ekki verið skráð.Við notuðum Illumina MiSeq PE75, miðað við lengd ccfDNA brota svipað og ccfDNA manna.Fyrir framtíðarrannsóknir, miðað við niðurstöður okkar sem sýna að hemolymph ccfDNA hefur lengri lestur en menn og/eða spendýr, mælum við með því að nota raðgreiningarvettvang sem hentar betur fyrir lengri ccfDNA brot.Þessi framkvæmd mun gera það mun auðveldara að bera kennsl á fleiri vísbendingar fyrir dýpri greiningu.Að fá fullkomna A. atra kjarnaerfðamengisröð sem nú er ekki tiltæk myndi einnig auðvelda mjög mismunun ccfDNA frá sjálfum og öðrum uppruna.vistkerfi sjávar.
Sem ekki ífarandi klínískt lífmerki tengist hækkuð plasmaþéttni ccfDNA í mönnum ýmsum sjúkdómum, vefjaskemmdum og streituskilyrðum [67,68,69].Þessi aukning tengist losun DNA-búta af eigin uppruna eftir vefjaskemmdir.Við tókum á þessu vandamáli með því að nota bráða hitaálag, þar sem kræklingur var í stutta stund útsettur fyrir hitastigi upp á 30 °C.Við gerðum þessa greiningu á þremur mismunandi tegundum af kræklingi í þremur sjálfstæðum tilraunum.Hins vegar fundum við enga breytingu á ccfDNA stigum eftir bráða hitaálag (sjá mynd S5, viðbótarupplýsingar).Þessi uppgötvun kann að skýra, að minnsta kosti að hluta, þá staðreynd að kræklingur er með hálfopið blóðrásarkerfi og safnar upp miklu magni af erlendu DNA vegna mikillar síunarvirkni.Á hinn bóginn getur kræklingur, eins og margir hryggleysingjar, verið ónæmari fyrir vefjaskemmdum af völdum streitu og takmarkað þar með losun ccfDNA í hemolymph þeirra [70, 71].
Hingað til hefur DNA-greining á líffræðilegum fjölbreytileika í vatnavistkerfum aðallega beinst að umhverfis-DNA (eDNA) metabarcoding.Hins vegar er þessi aðferð yfirleitt takmörkuð við líffræðilega fjölbreytileikagreiningu þegar grunnur er notaður.Notkun haglabyssuraðgreiningar sniðgengir takmarkanir PCR og hlutdrægu úrvali grunnsetta.Hins vegar eru nokkur grundvallaratriði sem greina LB frá stöðluðum eDNA aðferðum.Auðvitað er aðalmunurinn á eDNA og LB notkun náttúrulegra síuhýsla.Tilkynnt hefur verið um notkun sjávartegunda eins og svampa og samloka (Dresseina spp.) sem náttúrulega síu til að rannsaka eDNA [74, 75].Rannsókn Dreissena notaði hins vegar vefjasýni sem DNA var dregið úr.Greining á ccfDNA frá LB krefst ekki vefjasýnis, sérhæfðs og stundum dýrs búnaðar og flutninga í tengslum við eDNA eða vefjasýni.Útdráttur ccfDNA úr fljótandi vefjasýni er einnig einföld og veitir hágæða DNA fyrir haglabyssu raðgreiningu og PCR greiningu.Þetta er mikill kostur miðað við nokkrar af tæknilegum takmörkunum sem tengjast eDNA greiningu [77].Einfaldleiki og lítill kostnaður við sýnatökuaðferðina hentar einnig sérstaklega vel fyrir langtímavöktunaráætlanir.Auk mikillar síunargetu þeirra er annar vel þekktur eiginleiki samloka efnafræðileg slímfjölsykrusamsetning slímsins, sem stuðlar að frásogi veira [78, 79].Þetta gerir samlokur að tilvalinni náttúrusíu til að einkenna líffræðilegan fjölbreytileika og áhrif loftslagsbreytinga í tilteknu vatnavistkerfi.móti gestgjafi.Þetta felur í sér nærveru veiruraða sem eru samþættar í erfðamengi hýsilsins.Þetta er sérstaklega mikilvægt fyrir krækling, þar sem lárétt smitandi hvítblæðis retróveiru eru til staðar í samlokum [80, 81].Átfrumumyndun er aðalhlutverk blóðfrumna í samlokum [82].Að lokum nýtir aðferðin mikla síunargetu kræklinga (að meðaltali 1,5 l/klst. af sjó) og tveggja daga hringrás, sem eykur blöndun mismunandi laga af sjó, sem gerir kleift að fanga misleitt eDNA.[83, 84].Þannig er ccfDNA greining á kræklingi áhugaverð leið miðað við næringar-, efnahags- og umhverfisáhrif kræklingsins.Svipað og við greiningu á LB sem safnað er frá mönnum, opnar þessi aðferð einnig möguleika á að mæla erfðafræðilegar og epigenetic breytingar á DNA hýsils sem svar við utanaðkomandi efnum.Til dæmis er hægt að sjá fyrir sér þriðju kynslóðar raðgreiningartækni til að framkvæma metýleringargreiningu um allt erfðamengi í innfæddu ccfDNA með því að nota nanopore raðgreiningu.Þetta ferli ætti að auðvelda með þeirri staðreynd að lengd kræklinga ccfDNA brotanna er fullkomlega samhæfð við langlesna raðgreiningarpalla sem leyfa DNA-metýleringargreiningu um allt erfðamengi úr einni raðgreiningu án þess að þörf sé á efnabreytingum.85,86] Þetta er áhugaverður möguleiki, þar sem sýnt hefur verið fram á að DNA-metýlerunarmynstur við margs konar umhverfisáhrif endurspegla umhverfisálag.Þess vegna getur það veitt dýrmæta innsýn í undirliggjandi aðferðir sem stjórna viðbrögðum eftir útsetningu fyrir loftslagsbreytingum eða mengunarefnum [87].Hins vegar er notkun LB ekki án takmarkana.Það þarf varla að taka það fram að þetta krefst tilvistar vísbendingategunda í vistkerfinu.Eins og getið er hér að ofan, að nota LB til að meta líffræðilegan fjölbreytileika tiltekins vistkerfis krefst einnig strangrar lífupplýsingaleiðslna sem tekur tillit til tilvistar DNA-brota frá upprunanum.Annað stórt vandamál er framboð á viðmiðunarerfðamengi fyrir sjávartegundir.Vonast er til að frumkvæði eins og sjávarspendýra erfðamengiverkefnið og nýlega stofnað Fish10k verkefni [88] muni auðvelda slíka greiningu í framtíðinni.Notkun LB hugtaksins á lífverur sem fæða sjávarsíu er einnig í samræmi við nýjustu framfarir í raðgreiningartækni, sem gerir það vel til þess fallið að þróa multi-ohm lífmerki til að veita mikilvægar upplýsingar um heilsu sjávarbúsvæða til að bregðast við umhverfisálagi.
Erfðamengisraðgreiningargögnum hefur verið geymt í NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 undir Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Áhrif loftslagsbreytinga á lífríki sjávar og vistkerfi.Cole líffræði.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Skoðaðu samanlögð áhrif loftslagsbreytinga og annarra staðbundinna streituvalda á lífríki hafsins.almennt vísindaumhverfi.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Vísindi fyrsta mars.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Minni hitaþol við endurteknar hitaálagsaðstæður skýrir háan sumardauða blákræklinga.Vísindaskýrsla 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nýlegar breytingar á tíðni, orsökum og umfangi dýradauða.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, o.fl.Margir ótegunda-sértækir sýklar gætu hafa valdið fjöldadauða Pinna nobilis.Lífið.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Hugsanleg áhrif loftslagsbreytinga á dýrasjúkdóma á norðurslóðum.Int J Circumpolar heilsa.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. o.fl.Blákræklingur (Mytilus edulis spp.) sem merkjalífverur við vöktun strandmengunar: endurskoðun.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Samþætting fljótandi vefjasýnis í krabbameinsmeðferð.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Þroska á fljótandi vefjasýni: Leyfir DNA æxlis að streyma.Nat Rev krabbamein.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Kjarnsýrur í plasma manna.Fundargerðir dótturfélaga Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nýtt hlutverk fyrir frumufrítt DNA sem sameindamerki fyrir krabbameinsmeðferð.Magngreining á lífmólgreiningu.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Vökvasýni kemur inn á heilsugæslustöðina – innleiðingarvandamál og framtíðaráskoranir.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW og fleiri.DNA fósturs er til staðar í blóðvökva og sermi móður.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Rannsókn á meðgönguferli og fylgikvillum þess með notkun utanfrumu-RNA í blóði kvenna á meðgöngu.Lyfjalækningar.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Vökvasýni: gjafafrumulaust DNA er notað til að greina ósamgena sár í nýrnaígræðslu.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Nýjungar í fæðingargreiningu: erfðamengisraðgreining móður í plasma.Anna læknir.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Hröð uppgötvun sýkla með næstu kynslóðar metagenomic raðgreiningu á sýktum líkamsvökva.Nat Medicine.2021;27:115-24.