Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Frjósemi fugla er háð getu þeirra til að geyma nægilega mörg lífvænleg sæðisfrumur í langan tíma í geymslupípum sæðisfrumna (SST). Nákvæmur ferill þess hvernig sæðisfrumur fara inn í, dvelja í og ​​fara úr SST er enn umdeildur. Sæðisfrumur úr sharkasi-hænum sýndu mikla tilhneigingu til kekkjunar og mynduðu hreyfanlega þráðlaga knippi sem innihéldu margar frumur. Vegna erfiðleika við að fylgjast með hreyfanleika og hegðun sæðisfrumna í ógegnsæjum eggjaleiðurum notuðum við örvökvamælitæki með örrásarþversniði svipað og sæðisfrumna til að rannsaka kekkjun og hreyfanleika sæðisfrumna. Þessi rannsókn fjallar um hvernig sæðisknippi myndast, hvernig þau hreyfast og mögulegt hlutverk þeirra í að lengja dvöl sæðisfrumna í SST. Við rannsökuðum hraða og seigjuhegðun sæðisfrumna þegar vökvaflæði myndaðist innan örvökvarásar með vatnsstöðuþrýstingi (flæðishraði = 33 µm/s). Sæðisfrumurnar hafa tilhneigingu til að synda á móti straumnum (jákvæð seigja) og hraði knippi sæðisfrumna er verulega minni samanborið við staka sæðisfrumur. Sæðisknippi hafa sést hreyfast í spíral og lengjast og þykkna eftir því sem fleiri sæðisfrumur eru teknar að sér. Sæðisknippi sáust nálgast og festast við hliðarveggi örvökvarásanna til að forðast að berast með vökvahraða > 33 µm/s. Sæðisknippi sáust nálgast og festast við hliðarveggi örvökvarásanna til að forðast að berast með vökvahraða > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Sæðisknippi hafa sést nálgast og festast við hliðarveggi örvökvarásanna til að forðast að vera sópað burt við vökvaflæðishraða >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速流速>/33 sek.33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, микрожидкостног избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Sæðisknippi hafa sést nálgast og festast við hliðarveggi örvökvarásarinnar til að forðast að vera sópað burt af vökvaflæði >33 µm/s.Skannandi rafeindasmásjá og rafeindasmásjá leiddu í ljós að sæðisknippin voru studd af miklu þéttu efni. Gögnin sem fengust sýna fram á einstaka hreyfanleika sæðisfrumna úr kjúklingum frá Sharkazi, sem og getu þeirra til að kekkjast og mynda hreyfanleg knippi, sem stuðlar að betri skilningi á langtímageymslu sæðisfrumna í rafeindasmásjá.
Til að frjóvgun eigi sér stað hjá mönnum og flestum dýrum verða sæði og egg að berast á frjóvgunarstað á réttum tíma. Þess vegna verður mökun að eiga sér stað fyrir eða á egglostíma. Hins vegar geyma sum spendýr, eins og hundar, sem og aðrar tegundir eins og skordýr, fiskar, skriðdýr og fuglar, sæði í æxlunarfærum sínum í langan tíma þar til eggin eru tilbúin til frjóvgunar (ósamstillt frjóvgun 1 ). Fuglar geta viðhaldið lífvænleika sæðisfrumna sem geta frjóvgað egg í 2-10 vikur 2 .
Þetta er einstakur eiginleiki sem greinir fugla frá öðrum dýrum, þar sem hann veitir mikla líkur á frjóvgun eftir eina sæðingu í nokkrar vikur án samtímis mökunar og egglos. Helsta geymslulíffæri sæðisfrumna, kallað geymslupípla sæðisfrumna (e. sperm storage tubule (SST)), er staðsett í innri slímhúðarfellingum við leg- og eggjaleiðaramót. Hingað til eru ferlarnir sem sæði fer inn í, geymist og fer út úr sæðisbankanum ekki að fullu skildir. Byggt á fyrri rannsóknum hafa margar tilgátur verið settar fram, en engin þeirra hefur verið staðfest.
Forman4 setti fram tilgátu um að sæðisfrumur héldu dvöl sinni í SST-holinu með stöðugri sveifluhreyfingu gegn stefnu vökvaflæðisins í gegnum próteingöng sem staðsett eru á SST-þekjufrumum (seigja). ATP tæmist vegna stöðugrar svipuvirkni sem þarf til að halda sæðinu í SST-holrýminu og hreyfanleiki minnkar að lokum þar til sæðið er flutt út úr sæðisbankanum með vökvaflæði og hefst nýtt ferðalag niður hækkandi eggjaleiðara til að frjóvga sæðið. Egg (Forman4). Þessi líkan af geymslu sæðis er studd af greiningu með ónæmisfrumuefnafræði á aquaporínum 2, 3 og 9 sem eru til staðar í SST-þekjufrumum. Til þessa vantar rannsóknir á seigju sæðis úr kjúklingum og hlutverki þess í geymslu SST, vali á sæði í leggöngum og samkeppni sæðis. Í kjúklingum fer sæði inn í leggöngin eftir náttúrulega mökun, en meira en 80% af sæðinu eru kastað út úr leggöngunum stuttu eftir mökun. Þetta bendir til þess að leggöngin séu aðalstaðurinn fyrir val á sæði hjá fuglum. Þar að auki hefur verið greint frá því að minna en 1% af sæðisfrumum sem frjóvgast er í leggöngum endi í SST-frumum2. Við gervifrjóvgun kjúklinga í leggöngum hefur fjöldi sæðisfrumna sem ná SST tilhneigingu til að aukast 24 klukkustundum eftir sæðingu. Hingað til er óljóst hvernig sæðisfrumur veljast í þessu ferli og hreyfanleiki sæðisfrumna gæti gegnt mikilvægu hlutverki í upptöku SST-sæðisfrumna. Vegna þykkra og ógegnsæja veggja eggjaleiðara er erfitt að fylgjast beint með hreyfanleika sæðisfrumna í eggjaleiðurum fugla. Þess vegna skortir okkur grunnþekkingu á því hvernig sæðisfrumur umbreytast í SST eftir frjóvgun.
Seigja hefur nýlega verið viðurkennd sem mikilvægur þáttur í að stjórna flutningi sæðis í kynfærum spendýra. Byggt á getu hreyfanlegra sæðisfrumna til að ferðast gagnstraums, notuðu Zaferani o.fl. corra örvökvakerfi til að einangra hreyfanleg sæðisfrumna óvirkt úr sæðissýnum sem voru geymd í sæðishólfi. Þessi tegund sæðisflokkunar er nauðsynleg fyrir læknisfræðilega meðferð við ófrjósemi og klínískar rannsóknir og er æskilegri fram yfir hefðbundnar aðferðir sem eru tíma- og vinnuaflsfrekar og geta haft áhrif á formgerð og uppbyggingu sæðisins. Hins vegar hafa engar rannsóknir verið gerðar til þessa á áhrifum seytingar frá kynfærum kjúklinga á hreyfanleika sæðisfrumna.
Óháð því hvernig sæðisfrumur eru geymdar í frumufrumnafrumunni (SST), hafa margir rannsakendur komist að því að þær kekkjast saman í frumufrumnafrumum kjúklinga 9, 10, vaktla 2 og kalkúna 11 og mynda kekkta sæðisknippi. Höfundarnir benda á að tengsl séu milli þessarar kekkjunar og langtímageymslu sæðisfruma í SST.
Tingari og Lake12 greindu frá sterkum tengslum milli sæðisfrumna í sæðistökukirtli kjúklinga og veltu fyrir sér hvort fuglasæði kekkjist á sama hátt og sæðisfrumna spendýra. Þeir telja að djúp tengsl milli sæðisfrumna í sáðrásinni gætu stafað af streitu sem stafar af nærveru mikils fjölda sæðisfrumna á litlu rými.
Þegar hegðun sæðisfrumna er metin á nýjum, hengjandi glerprentum má sjá tímabundin merki um kekkjun, sérstaklega á brúnum sæðisdropanna. Hins vegar var kekkjunin oft trufluð af snúningshreyfingum sem tengjast stöðugri hreyfingu, sem skýrir tímabundna eðli þessa fyrirbæris. Rannsakendurnir tóku einnig eftir því að þegar þynningarefnið var bætt út í sæðið birtust langar „þráðlaga“ frumusamþjöppur.
Fyrstu tilraunir til að líkja eftir sæðisfrumum voru gerðar með því að fjarlægja þunnan vír af dropa sem hangir, sem leiddi til þess að ílangur sæðislíkur blöðru stakk út úr sæðisdropunum. Sæðisfrumurnar raðuðu sér strax upp samsíða innan blöðrunnar, en öll einingin hvarf fljótt vegna þrívíddartakmörkunar. Þess vegna, til að rannsaka kekkjun sæðisfrumna, er nauðsynlegt að fylgjast með hreyfanleika og hegðun sæðisfrumna beint í einangruðum geymslupípum sæðisfrumna, sem er erfitt að ná. Þess vegna er nauðsynlegt að þróa tæki sem líkir eftir sæðisfrumum til að styðja rannsóknir á hreyfanleika og kekkjunarhegðun sæðisfrumna. Brillard o.fl.13 greindu frá því að meðallengd geymslupípla sæðisfrumna í fullorðnum kjúklingum sé 400–600 µm, en sumar geymslupípur sæðisfrumna geta verið allt að 2000 µm langar. Mero og Ogasawara14 skiptu sáðkirtlunum í stækkaðar og órafstæðar geymslupípur fyrir sæði, sem báðar voru jafnlangar (~500 µm) og jafnbreiddar að hálsi (~38 µm), en meðalþvermál geymslupíplanna var 56,6 og 56,6 µm, eða 11,2 µm, talið í sömu röð. Í þessari rannsókn notuðum við örvökvamælitæki með rásarstærð 200 µm × 20 µm (B × H), þar sem þversnið þess er nokkuð nálægt þversniði magnaða SST. Að auki skoðuðum við hreyfanleika og kekkjunarhegðun sæðisfrumna í rennandi vökva, sem er í samræmi við tilgátu Foreman um að vökvi sem myndast af SST þekjufrumum haldi sæðisfrumum í geymslurýminu í gagnstraumsátt (seigjufræðilegri) átt.
Markmið þessarar rannsóknar var að vinna bug á vandamálunum við að fylgjast með hreyfanleika sæðisfrumna í eggjaleiðurum og forðast erfiðleikana við að rannsaka seigju og hegðun sæðisfrumna í breytilegu umhverfi. Notað var örflæðitæki sem býr til vatnsþrýsting til að herma eftir hreyfanleika sæðisfrumna í kynfærum kjúklinga.
Þegar dropi af þynntu sæðissýni (1:40) var settur í örrásartækið, var hægt að greina tvenns konar hreyfanleika sæðisfrumna (einangrað sæði og bundið sæði). Að auki höfðu sæðisfrumurnar tilhneigingu til að synda á móti straumnum (jákvæð seigja; myndband 1, 2). Þótt sæðisknippi hafi haft lægri hraða en stakar sæðisfrumur (p < 0,001), þá juku þær hlutfall sæðisfruma sem sýndu jákvæða rheotaxis (p < 0,001; Tafla 2). Þótt sæðisknippi hafi haft lægri hraða en stakar sæðisfrumur (p < 0,001), þá juku þær hlutfall sæðisfruma sem sýndu jákvæða rheotaxis (p < 0,001; Tafla 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливцич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; töflu 2). Þótt sæðisknippin hafi haft lægri hraða en sæðisknippin einstök (p < 0,001), þá juku þau hlutfall sæðisfruma sem sýndu jákvæða rheotaxis (p < 0,001; Tafla 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 昧 倧徲 示 逳百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。））))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитиви сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Þótt hraði sæðisknippa væri lægri en hjá einstökum sæðisfrumum (p < 0,001), þá juku þeir hlutfall sæðisfruma með jákvæða seigju (p < 0,001; Tafla 2).Jákvæð seigjufræði fyrir staka sæðisfrumur og sáðbúta er áætluð um það bil 53% og 85%, í sömu röð.
Það hefur komið í ljós að sæðisfrumur Sharkashi-hænna mynda línulegar knippi strax eftir sáðlát, sem samanstanda af tugum einstaklinga. Þessir knippi aukast að lengd og þykkt með tímanum og geta haldist in vitro í nokkrar klukkustundir áður en þeir hverfa (myndband 3). Þessir þráðlaga knippi eru í laginu eins og sæðisfrumur úr myrtlingum sem myndast við enda eistnalyppunnar. Komið hefur í ljós að sæði Sharkashi-hænna hefur mikla tilhneigingu til að kekkjast og mynda netlaga knippi á innan við einni mínútu eftir söfnun. Þessir geislar eru kraftmiklir og geta fest sig við nálæga veggi eða kyrrstæða hluti. Þó að sæðisknippi dragi úr hraða sæðisfrumna er ljóst að þeir auka línuleika þeirra í stórsjá. Lengd knippanna er breytileg eftir fjölda sæðisfruma sem safnað er í knippunum. Tveir hlutar knippisins voru einangraðir: upphafshlutinn, þar á meðal frjálsa höfuð kekktra sæðisfrumanna, og endahlutinn, þar á meðal halinn og allan neðri enda sæðisins. Með því að nota háhraðamyndavél (950 rammar á sekúndu) voru lausir höfuð kekktra sæðisfruma sést í upphafi knippisins. Þessir höfuð bera ábyrgð á hreyfingu knippisins vegna sveifluhreyfinga þeirra og draga þau sem eftir eru inn í knippið með spíralhreyfingu (Myndband 4). Hins vegar hefur sést í löngum þúfum að sumir lausir höfuð sæðisfruma festast við líkamann og endi þúfunnar virkar sem vængir til að hjálpa til við að knýja þúfuna áfram.
Í hægum vökvaflæði hreyfast sæðisknippin samsíða hvor öðrum, en þau byrja að skarast og festast við allt sem er kyrrt, svo að straumurinn skoli ekki burt þeim þegar flæðishraðinn eykst. Knippin myndast þegar handfylli af sæðisfrumum nálgast hvor aðra, þær byrja að hreyfast samstillt og vefjast utan um hvor aðra og festast síðan við klístrað efni. Myndir 1 og 2 sýna hvernig sæðið nálgast hvor aðra og myndar samskeyti þegar halarnir vefjast utan um hvor annan.
Rannsakendurnir beittu vatnsþrýstingi til að skapa vökvaflæði í örrás til að rannsaka seigju sæðisfrumna. Örrás sem var 200 µm × 20 µm (B × H) að stærð og 3,6 µm að lengd var notuð. Örrásir voru notaðar á milli íláta með sprautum festum á endann. Matarlitur var notaður til að gera rásirnar sýnilegri.
Binðið tengisnúrur og fylgihluti við vegginn. Myndbandið var tekið með fasa andstæðusmásjá. Með hverri mynd eru sýndar myndir úr fasa andstæðusmásjá og kortlagningu. (A) Tengingin milli tveggja strauma stendur gegn flæðinu vegna helix hreyfingar (rauður ör). (B) Tengingin milli rörknippisins og rásarveggsins (rauðar örvar), á sama tíma og þeir eru tengdir tveimur öðrum knippum (gular örvar). (C) Sæðisknippi í örvökvarásinni byrja að tengjast hvert við annað (rauðar örvar) og mynda möskva af sæðisknippum. (D) Myndun nets af sæðisknippum.
Þegar dropi af þynntu sæði var settur í örvökvamælitækið og flæði myndaðist, sást að sæðisgeislinn hreyfðist gegn stefnu flæðisins. Knippin lögðust þétt að veggjum örrásanna og lausu höfuðin í upphafshluta knippanna lögðust þétt að þeim (myndband 5). Þau festast einnig við allar kyrrstæðar agnir í leið sinni, svo sem rusl, til að koma í veg fyrir að straumurinn sópi þeim burt. Með tímanum verða þessir þræðir að löngum þráðum sem fanga aðrar stakar sæðisfrumur og styttri þræði (myndband 6). Þegar flæðið byrjar að hægja á sér byrja langar raðir af sæðisfrumum að mynda net af sæðislínum (myndband 7; mynd 2).
Við mikinn flæðishraða (V > 33 µm/s) aukast spíralhreyfingar þráðanna í tilraun til að grípa marga einstaka sæðismyndandi knippi til að standast betur rekkraft flæðisins. Við mikinn flæðishraða (V > 33 µm/s) aukast spíralhreyfingar þráðanna í tilraun til að grípa marga einstaka sæðismyndandi knippi til að standast betur rekkraft flæðisins. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. Við mikinn rennslishraða (V > 33 µm/s) aukast helixhreyfingar þráðanna þegar þeir reyna að grípa margar einstakar sæðisfrumur og mynda knippi sem eru betur í stakk búnt til að standast rekkraft flæðisins.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缾 坟 形成 ​​坟 形从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захжение отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Við mikinn rennslishraða (V > 33 µm/s) eykst helixhreyfing þráðanna í tilraun til að fanga marga einstaka sæðisfrumur sem mynda knippi til að standast betur rekkrafta flæðisins.Þeir reyndu einnig að festa örrásir við hliðarveggina.
Sæðisknippi voru greind sem klasa af sæðishöfðum og krulluðum hala með ljóssmásjá (LM). Sæðisknippi með ýmsum samsöfnum hafa einnig verið greind sem snúin höfuð og svipukjarnasamsöfn, margir samrunaðir sæðishalar, sæðishöfðar festir við hala og sæðishöfðar með beygðum kjarna sem margir samrunaðir kjarnar. Rafeindasmásjárskoðun (TEM). Skannandi rafeindasmásjá (SEM) sýndi að sæðisknippin voru hulin samsöfn af sæðishöfðum og sæðisknippin sýndu fast net af vöfðum hölum.
Lögun og ómbygging sæðisfrumna, myndun sæðisknippa voru rannsökuð með ljóssmásjá (hálfum skurði), skannandi rafeindasmásjá (SEM) og gagnsæisraafnemasjá (TEM), sæðisstroksýni voru lituð með akridín appelsínugulu og skoðuð með flúrljómunarsmásjá.
Litun á sæðisfrumustroki með akridínappelsínu (mynd 3B) sýndi að höfuð sæðisfrumanna voru föst saman og þakin seytandi efni, sem leiddi til myndunar stórra hnúta (mynd 3D). Sæðisknippin samanstóðu af sæðisfrumusamþjöppum með neti af áföstum hala (mynd 4A-C). Sæðisknippin eru samsett úr hölum margra sæðisfruma sem eru föst saman (mynd 4D). Leyndarmál (mynd 4E,F) huldu höfuð sæðisfrumaknippanna.
Myndun sæðisfrumaknippisins Með því að nota fasaskilgreiningu og sæðisstrok litað með akridín appelsínugulu sýndi ég að höfuð sæðisfrumanna festast saman. (A) Snemma myndun sæðisþyrpinga hefst með einni sæðisfrumu (hvítur hringur) og þremur sæðisfrumum (gulur hringur), þar sem spíralinn byrjar við halann og endar við hausinn. (B) Smásjármynd af sæðisstroki litað með akridín appelsínugulu sem sýnir viðloðandi sæðishausa (örvar). Útferðin hylur höfuðið/hausana. Stækkun × 1000. (C) Þróun stórs geisla sem berst með flæði í örvökvarás (með því að nota háhraða myndavél við 950 ramma á sekúndu). (D) Smásjármynd af sæðisstroki litað með akridín appelsínugulu sem sýnir stóra þyrpinga (örvar). Stækkun: ×200.
Skannandi rafeindasmásjármynd af sæðisgeisla og sæðisstrok litað með akridín appelsínugulu. (A, B, D, E) eru stafrænar litskannandi rafeindasmásjármyndir af sæðisfrumum, og C og F eru smásjármyndir af akridín appelsínugulu lituðum sæðisstrokum sem sýna viðloðun margra sæðisfruma sem vefja halavef. (AC) Sæðisfrumusamstæður eru sýndar sem net af föstum hala (örvar). (D) Viðloðun nokkurra sæðisfruma (með límandi efni, bleikum útlínum, ör) sem vefja sig utan um halann. (E og F) Sæðishaussamstæður (vísar) þaktar límandi efni (vísar). Sæðisfrumurnar mynduðu knippi með nokkrum hvirfillíkum strúktúrum (F). (C) ×400 og (F) ×200 stækkun.
Með rafeindasmásjá komumst við að því að sæðisknippin höfðu festa hala (mynd 6A, C), höfuð fest við hala (mynd 6B) eða höfuð fest við hala (mynd 6D). Höfuð sæðisfrumanna í knippinu eru bogadregin og birtast í tveimur kjarnasvæðum í sneiðunum (mynd 6D). Í skurðknippinu höfðu sæðið snúnan höfuð með tveimur kjarnasvæðum og mörgum svipusvæðum (mynd 5A).
Stafræn lit rafeindasmásjármynd sem sýnir tengihalana í sæðisknippinu og kekkjandi efni sem tengir saman höfuð sæðisfrumanna. (A) Áfastur hali fjölda sæðisfruma. Takið eftir hvernig halinn lítur út bæði í skammsniðsmynd (ör) og láréttri mynd (ör). (B) Höfuð (ör) sæðisins er tengt við halann (ör). (C) Nokkrir sæðishalar (örvar) eru áfastir. (D) Kekkjandi efni (AS, blátt) tengir saman fjögur höfuð sæðisfruma (fjólublátt).
Skannandi rafeindasmásjá var notuð til að greina sæðishausa í sæðisknippum sem voru þaktir seytingu eða himnum (mynd 6B), sem bendir til þess að sæðisknippin væru tengd utanfrumuefni. Kekkjótta efnið safnaðist saman í sæðishausnum (marglyttuhauslík samsetning; mynd 5B) og þandist út á við, sem gaf skærgult útlit undir flúrljómunarsmásjá þegar það var litað með akridín appelsínugulum lit (mynd 6C). Þetta efni sést greinilega undir skannandi smásjá og er talið bindiefni. Hálfþunnar sneiðar (mynd 5C) og sæðisstrok litað með akridín appelsínugulum lit sýndu sæðisknippi með þéttpökkuðum hausum og krulluðum hala (mynd 5D).
Ýmsar smásjármyndir sem sýna samansafnað sæðishausa og brotna hala með ýmsum aðferðum. (A) Stafræn litraflæðissmásjármynd af þversniði sæðisknippis sem sýnir vafið sæðishaus með tveggja hluta kjarna (blár) og nokkrum svipuhlutum (grænn). (B) Stafræn litraflæðissmásjármynd sem sýnir klasa af marglyttulíkum sæðishausum (örvar) sem virðast vera þaktar. (C) Hálfþunnur sneið sem sýnir samansafnaða sæðishausa (örvar) og krullaða hala (örvar). (D) Smásjármynd af sæðisstroki litað með akridín appelsínugulu sem sýnir samansafnaða sæðishausa (örvar) og krullaða viðloðandi hala (örvar). Athugið að klístrað efni (S) hylur höfuð sæðisfrumunnar. (D) × 1000 stækkun.
Með rafeindasmásjá (mynd 7A) kom einnig í ljós að sæðishöfðin voru snúin og kjarnar þeirra spírallaga, eins og staðfest var með sæðisstroki lituðum með akridínappelsínugulu og skoðuð með flúrljómunarsmásjá (mynd 7B).
(A) Stafræn litrafðasmásjármynd og (B) akridín-appelsínugult sæðisstrok sem sýnir vefjaða höfuð og festingu sæðishausa og hala (örvar). (B) × 1000 stækkun.
Áhugaverð uppgötvun er sú að sæði Sharkazi safnast saman og myndar hreyfanlega þráðlaga knippi. Eiginleikar þessara knippa gera okkur kleift að skilja mögulegt hlutverk þeirra í upptöku og geymslu sæðisfrumna í frumufrumnafrumunni.
Eftir mökun fer sæðið inn í leggöngin og gengst undir ítarlegt úrvalsferli, sem leiðir til þess að aðeins takmarkaður fjöldi sæðis fer inn í súrefnissæðisrásina (SST)15,16. Hingað til eru ferlarnir sem sæði fer inn í og ​​út úr súrefnissæðisrásinni óljósir. Hjá alifuglum eru sæðisfrumur geymdar í súrefnissæðisrásinni í langan tíma, allt frá 2 til 10 vikur, allt eftir tegundum6. Deilur eru enn um ástand sæðisins meðan það er geymt í súrefnissæðisrásinni. Eru þau á hreyfingu eða í hvíld? Með öðrum orðum, hvernig halda sæðisfrumur stöðu sinni í súrefnissæðisrásinni svona lengi?
Forman4 lagði til að hægt væri að útskýra dvöl og útkast SST með tilliti til hreyfanleika sæðisfrumna. Höfundarnir setja fram tilgátu um að sæði haldi stöðu sinni með því að synda á móti vökvaflæðinu sem myndast af SST-þekju og að sæðisfrumur séu kastaðar út úr SST þegar hraði þeirra fellur niður fyrir þann punkt þar sem þær byrja að hreyfast aftur á bak vegna orkuskorts. Zaniboni5 staðfesti nærveru aquaporína 2, 3 og 9 í topphluta SST-þekjufrumna, sem gæti óbeint stutt sæðisgeymslulíkan Foreman. Í þessari rannsókn komumst við að því að næstum helmingur sæðisfrumna Sharkashi sýna jákvæða seigju í flæðandi vökvanum og að kekkjandi sæðisknippi auka fjölda sæðisfrumna sem sýna jákvæða seigju, þó að kekkjun hægi á þeim. Hvernig sæðisfrumur ferðast upp eggjaleiðara fuglsins að frjóvgunarstað er ekki að fullu skilið. Hjá spendýrum laðar follikularvökvinn að sér efnafræðilega sæðisfrumur. Hins vegar er talið að efnafræðilegir aðdráttarefni beini sæðisfrumum að langar vegalengdir7. Þess vegna eru aðrir ferlar ábyrgir fyrir flutningi sæðisfrumna. Greint hefur verið frá því að hæfni sæðisfrumna til að stefna og flæða gegn eggjaleiðaravökvanum sem losnar eftir mökun sé mikilvægur þáttur í því að beina sæðisfrumum að músum. Parker17 lagði til að sæðisfrumur færust yfir eggjaleiðara með því að synda gegn bifhárstraumnum í fuglum og skriðdýrum. Þó að það hafi ekki verið sýnt fram á tilraunakennt í fuglum, var Adolphi18 fyrstur til að uppgötva að fuglasæði gefur jákvæðar niðurstöður þegar þunnt lag af vökva milli hlífðarglers og glæru er búið til með ræmu af síupappír. Seigjufræði. Hino og Yanagimachi [19] settu eggjastokka-eiturleiðara-leg flókið músa í gegnflæðishring og sprautuðu 1 µl af bleki í eiðið til að sjá vökvaflæði í eggjaleiðurunum. Þeir tóku eftir mjög virkri samdráttar- og slökunarhreyfingu í eggjaleiðurunum, þar sem allar blekkúlurnar færðust jafnt og þétt í átt að ampullu eggjaleiðarans. Höfundarnir leggja áherslu á mikilvægi flæðis vökva úr eggjaleiðurum frá neðri til efri eggjaleiðurum fyrir upplyftingu og frjóvgun sæðisfrumna. Brillard20 greindi frá því að í kjúklingum og kalkúnum flytja sæðisfrumur sig með virkri hreyfingu frá leggangsopinu, þar sem þær eru geymdar, að leggangamótum þar sem þær eru geymdar. Hins vegar er þessi hreyfing ekki nauðsynleg á milli leg- og leggangamótanna og leggöngufundarins þar sem sáðfrumurnar eru fluttar með óvirkri tilfærslu. Með hliðsjón af þessum fyrri ráðleggingum og niðurstöðum sem fengust í þessari rannsókn má gera ráð fyrir að hæfni sæðisfrumna til að hreyfast uppstreymis (seigja) sé einn af eiginleikunum sem valferlið byggist á. Þetta ákvarðar ferð sæðisfrumna í gegnum leggöngin og inn í leggönguæðakerfið til geymslu. Eins og Forman4 lagði til getur þetta einnig auðveldað sæðisfrumur að komast inn í leggöngin og búsvæði þess um tíma og síðan fara út þegar hraði þeirra fer að hægja á sér.
Hins vegar bentu Matsuzaki og Sasanami 21 á að fuglasæði gangi í gegnum breytingar á hreyfanleika úr dvala í hreyfanleika í æxlunarfærum karla og kvenkyns. Hömlun á hreyfanleika sæðisfrumna í sáðfrumustofninum hefur verið sett fram sem skýringu á löngum geymslutíma sæðisfrumna og endurnýjunar eftir að þau yfirgefa sáðfrumustofninn. Við súrefnisskortsskilyrði greindu Matsuzaki o.fl. 1 frá mikilli framleiðslu og losun laktats í sáðfrumustofninum, sem getur leitt til hömlunar á hreyfanleika sæðisfrumna. Í þessu tilviki endurspeglast mikilvægi seigjufræði sæðisfrumna í vali og frásogi sæðisfrumna, en ekki í geymslu þeirra.
Kekkjunarmynstur sæðisfrumna er talið sennileg skýring á löngum geymslutíma sæðis í sáðrásinni (SST), þar sem þetta er algengt mynstur sæðisgeymslu hjá alifuglum2,22,23. Bakst o.fl.2 tóku eftir því að flestir sæðisfrumnarnir loddu saman og mynduðu þéttar sæðisfrumur og stakir sæðisfrumur fundust sjaldan í CCM vaktla. Hins vegar tóku Wen o.fl.24 eftir fleiri dreifðum sæðisfrumum og færri sæðisbútum í SST holrými kjúklinga. Byggt á þessum athugunum má gera ráð fyrir að tilhneiging til kekkjunar sæðisfruma sé mismunandi milli fugla og milli sæðisfruma í sama sáðláti. Að auki lögðu Van Krey o.fl.9 til að handahófskennd sundrun kekktra sæðisfruma sé ábyrg fyrir smám saman komist sæðisfruma inn í holrými eggjaleiðarans. Samkvæmt þessari tilgátu ætti fyrst að reka sæðisfrumur með minni kekkjunargetu úr SST. Í þessu samhengi gæti hæfni sæðisfrumna til að kekkjast verið þáttur sem hefur áhrif á niðurstöðu sæðissamkeppni hjá óhreinum fuglum. Þar að auki, því lengur sem kekkjuð sæði losnar, því lengur helst frjósemin.
Þó að samsöfnun sæðisfrumna og samsöfnun í knippi hafi sést í nokkrum rannsóknum2,22,24, hefur þeim ekki verið lýst í smáatriðum vegna flækjustigs hreyfifræðilegra athugana þeirra innan SST. Nokkrar tilraunir hafa verið gerðar til að rannsaka samsöfnun sæðisfrumna in vitro. Mikil en tímabundin samsöfnun sást þegar þunni vírinn var fjarlægður af dinglandi frædropunum. Þetta leiðir til þess að ílangur kúla stendur út úr dropanum og líkir eftir sáðkirtlinum. Vegna þrívíddartakmarkana og stutts þurrkunartíma í dropatíma féll allur blokkin fljótt í ólag9. Í þessari rannsókn, með því að nota Sharkashi kjúklinga og örvökvaflísar, gátum við lýst því hvernig þessir knippi myndast og hvernig þeir hreyfast. Sæðisknippi mynduðust strax eftir sæðissöfnun og reyndust hreyfast í spíral, sem sýnir jákvæða seigju þegar þeir eru til staðar í flæðinu. Ennfremur, þegar skoðað er makróskópískt, hefur sést að sæðisknippi auka línuleika hreyfanleika samanborið við einangraðar sæðisfrumur. Þetta bendir til þess að kekkjun sæðisfruma geti átt sér stað áður en SST komast í gegnum frumuhimnuna og að sæðisframleiðsla sé ekki takmörkuð við lítið svæði vegna álags eins og áður hefur verið bent á (Tingari og Lake12). Við myndun sáðfruma synda sáðfrumurnar samstilltar þar til þær mynda samskeyti, þá vefjast halar þeirra hvor um aðra og höfuð sáðfrumunnar helst frjáls, en halinn og neðri hluti sáðfrumunnar festast saman með klístruðu efni. Þess vegna er frjálsi höfuð liðbandsins ábyrgur fyrir hreyfingunni og dregur restina af liðbandinu. Skannandi rafeindasmásjárskoðun á sæðisknippunum sýndi festa sæðishausa þakta miklu klístruðu efni, sem bendir til þess að sæðishausarnir hafi verið festir í hvíldarknippum, sem gæti hafa gerst eftir að þeir komust á geymslustaðinn (SST).
Þegar sæðisstrok er litað með akridín appelsínugulu efni má sjá utanfrumulím í kringum sæðisfrumurnar undir flúrljómandi smásjá. Þetta efni gerir sæðisknippunum kleift að festast við nærliggjandi yfirborð eða agnir svo þær reki ekki með straumnum í kring. Þannig sýna athuganir okkar hlutverk viðloðunar sæðisfrumna í formi hreyfanlegra knippa. Hæfni þeirra til að synda á móti straumnum og festast við nærliggjandi yfirborð gerir sæðinu kleift að vera lengur í sæðisfrumunum.
Rothschild25 notaði blóðfrumumyndavél til að rannsaka dreifingu nautgripasæðis í dropa af sviflausn og tók smásjármyndir í gegnum myndavél með bæði lóðréttum og láréttum sjónás smásjárinnar. Niðurstöðurnar sýndu að sæðið laðast að yfirborði hólfsins. Höfundarnir benda til þess að hugsanlega sé vatnsfræðileg víxlverkun milli sæðisins og yfirborðsins. Með hliðsjón af þessu, ásamt getu Sharkashi kjúklingasæðis til að mynda klístraðar þúfur, gæti það aukið líkurnar á að sæðið festist við vegg nautgripasæðisins og verði geymt í langan tíma.
Bccetti og Afzeliu26 greindu frá því að glýkókalyx sæðisins væri nauðsynlegt fyrir kynfrumuþekkingu og kekkjun. Forman10 komst að því að vatnsrof α-glýkósíðtengja í glýkóprótein-glýkólípíð húðun með því að meðhöndla fuglasæði með neúramínidasa leiddi til minnkaðrar frjósemi án þess að hafa áhrif á hreyfanleika sæðisfrumna. Höfundarnir benda til þess að áhrif neúramínidasa á glýkókalyxið skerði bindingu sæðisfrumna á mótum legi og legganga og þar með minnki frjósemi. Athuganir þeirra geta ekki hunsað þann möguleika að meðferð með neúramínidasa geti dregið úr þekkingu sæðisfrumna og eggfrumna. Forman og Engel10 komust að því að frjósemi minnkaði þegar hænur voru sæðdar í leggöng með sæði sem meðhöndlað var með neúramínidasa. Hins vegar hafði glasafrjóvgun með neúramínidasa-meðhöndluðum sæðisfrumum ekki áhrif á frjósemi samanborið við samanburðarkjúklinga. Höfundarnir komust að þeirri niðurstöðu að breytingar á glýkóprótein-glýkólípíðhúðinni í kringum sæðishimnu minnkuðu getu sæðisfrumanna til frjóvgunar með því að skerða bindingu sæðisfruma á mótum legi og legganga, sem aftur jók sæðistap vegna hraðar mótanna, en hafði ekki áhrif á greiningu sæðisfruma og eggfruma.
Í kalkúnum fundu Bakst og Bauchan 11 litlar blöðrur og himnubrot í holrými sáðrásarinnar (SST) og komust að því að sumar þessara agna höfðu runnið saman við himnu sáðfrumnanna. Höfundarnir benda til þess að þessi tengsl geti stuðlað að langtímageymslu sáðfrumna í SST. Hins vegar tilgreindu vísindamennirnir ekki uppruna þessara agna, hvort þær eru seyttar af CCT þekjufrumum, framleiddar og seyttar af karlkyns æxlunarfærum eða framleiddar af sæðið sjálft. Einnig bera þessar agnir ábyrgð á kekkjun. Grützner o.fl.27 greindu frá því að þekjufrumur eistnalykla framleiða og seyta ákveðnu próteini sem er nauðsynlegt til myndunar einhola sáðrása. Höfundarnir greina einnig frá því að dreifing þessara knippa sé háð víxlverkun eistnalyklapróteina. Nixon o.fl.28 komust að því að viðhengin seyta próteini, súru cysteinríku beinnektíni; SPARC tekur þátt í myndun sáðkorna í stuttgogguðum myrtlingum og goggdýrum. Dreifing þessara geisla tengist tapi á þessu próteini.
Í þessari rannsókn sýndi órafbyggingargreining með rafeindasmásjá að sáðfrumurnar loddu við mikið magn af þéttu efni. Talið er að þessi efni beri ábyrgð á kekkjuninni sem þéttist á milli og í kringum höfðu þeirra, en í lægri styrk í halasvæðinu. Við gerum ráð fyrir að þetta kekkjandi efni skiljist út úr karlkyns æxlunarfærum (eistnalyppu eða sáðrás) ásamt sæði, þar sem við sjáum oft sæði aðskiljast frá sogæðavökva og sáðrás við sáðlát. Greint hefur verið frá því að þegar fuglasæði fer í gegnum eistnalyppu og sáðrás gangast þau undir þroskunartengdar breytingar sem styðja getu þeirra til að bindast próteinum og taka upp glýkóprótein sem tengjast plasmafóstri. Þrálátleiki þessara próteina á sæðishimnum í sáðrásinni bendir til þess að þessi prótein geti haft áhrif á öflun stöðugleika sæðishimnu 30 og ákvarðað frjósemi þeirra 31. Ahammad o.fl.32 greindu frá því að sæðisfrumur sem fengust úr ýmsum hlutum karlkyns æxlunarfæra (frá eistum til neðri sáðrásar) sýndu stigvaxandi aukningu í lífvænleika við geymsluskilyrði í vökva, óháð geymsluhita, og lífvænleiki hjá kjúklingum eykst einnig í eggjaleiðurum eftir tæknifrjóvgun.
Sæðisknippi Sharkashi-kjúklinga hafa aðra eiginleika og virkni en aðrar tegundir eins og mysar, goggdýr, skógarmýs, hreindýrarottur og naggrísir. Í Sharkashi-kjúklingum minnkaði myndun sæðisknippa sundhraða þeirra samanborið við staka sæðisfrumur. Hins vegar juku þessir knippar hlutfall seigfræðilega jákvæðra sæðisfrumna og juku getu þeirra til að stöðugast í breytilegu umhverfi. Þannig staðfesta niðurstöður okkar fyrri tillögu um að kekkjun sæðis í SST tengist langtímageymslu sæðis. Við setjum einnig fram tilgátu um að tilhneiging sæðisfruma til að mynda knippi geti stjórnað hraða sæðistaps í SST, sem getur breytt niðurstöðu sæðiskeppni. Samkvæmt þessari forsendu losa sæðisfrumur með litla kekkjunargetu SST fyrst, en sæðisfrumur með mikla kekkjunargetu framleiða flest afkvæmi. Myndun einholu sæðisknippa er gagnleg og hefur áhrif á hlutfall foreldra og barna, en notar annan feril. Í myrtlingum og goggdýrum eru sáðfrumurnar raðaðar samsíða hver annarri til að auka hraða geislans áfram. Knippi af myrtlingum hreyfast um þrisvar sinnum hraðar en stakar sáðfrumur. Talið er að myndun slíkra sáðbúta í myrtlingum sé þróunarleg aðlögun til að viðhalda yfirráðum, þar sem kvendýr eru lauslát og makast venjulega við nokkra karldýr. Þess vegna keppa sáðfrumur úr mismunandi sáðlátum harðlega um frjóvgun eggsins.
Auðvelt er að sjá kekkjuð sæði úr sharkasi-hænsnum með fasa-andstæðu smásjárskoðun, sem er talið kostur þar sem það gerir auðvelda rannsókn á hegðun sæðisfrumna in vitro. Sú aðferð sem myndun sæðisþúfa notar til að stuðla að æxlun í sharkasi-hænsnum er einnig frábrugðin því sem sést hjá sumum fylgjuspendýrum sem sýna samvinnuhegðun sæðisfrumna eins og skógarmúsa, þar sem sum sæðisfrumna ná til eggjanna og hjálpa öðrum skyldum einstaklingum að ná til og skemma egg sín. til að sanna sig. óeigingjörn hegðun. Sjálfsfrjóvgun 34. Annað dæmi um samvinnuhegðun í sæðisfrumna fannst í hreindýramúsum, þar sem sæðisfrumna gátu borið kennsl á og sameinast erfðafræðilega skyldustu sæðisfrumnunum og myndað samvinnuhópa til að auka hraða sinn samanborið við óskyld sæðisfrumna 35.
Niðurstöðurnar sem fengust í þessari rannsókn stangast ekki á við kenningu Fomans um langtímageymslu sæðisfrumna í SWS. Rannsakendurnir greina frá því að sæðisfrumur halda áfram að hreyfast í flæði þekjufrumna sem klæða SST í langan tíma og eftir ákveðinn tíma tæmast orkuforði sæðisfrumnanna, sem leiðir til minnkunar á hraða, sem gerir kleift að losa efna með litla sameindaþyngd. Orka sæðisfrumnanna með vökvaflæði frá holrými SST og holrými eggjaleiðarans. Í þessari rannsókn komumst við að því að helmingur einstakra sæðisfrumna sýndi getu til að synda á móti flæðandi vökva og viðloðun þeirra í knippinu jók getu þeirra til að sýna jákvæða seigju. Ennfremur eru gögn okkar í samræmi við gögn Matsuzaki o.fl. 1 sem greindu frá því að aukin laktatseyting í SST gæti hamlað hreyfanleika sæðisfrumna. Hins vegar lýsa niðurstöður okkar myndun hreyfanlegra liðbanda sæðisfrumna og seigjuhegðun þeirra í viðurvist kraftmikils umhverfis innan örrásar í tilraun til að skýra hegðun þeirra í SST. Framtíðarrannsóknir gætu beinst að því að ákvarða efnasamsetningu og uppruna kekkjandi efnisins, sem mun án efa hjálpa vísindamönnum að þróa nýjar leiðir til að geyma fljótandi sæði og auka frjósemistíma.
Fimmtán 30 vikna gamlir berhálsaðir karlkyns sharkasi (arfhreinir ríkjandi; NaNa) voru valdir sem sæðisgjafar í rannsókninni. Fuglarnir voru aldir upp á rannsóknaralifuglabúi landbúnaðardeildar Ashit-háskóla í Ashit-héraði í Egyptalandi. Fuglarnir voru hýstir í einstökum búrum (30 x 40 x 40 cm), látnir fá ljós (16 klukkustundir af ljósi og 8 klukkustundir af myrkri) og fóðraðir með fæði sem innihélt 160 g af hrápróteini, 2800 kcal af umbrotnanlegri orku, 35 g af kalsíum hver og 5 grömm af tiltæku fosfóri á hvert kílógramm af fæði.
Samkvæmt gögnum 36, 37 var sæði safnað úr körlum með kviðnudd. Alls voru 45 sæðissýni tekin úr 15 körlum á 3 dögum. Sæði (n = 15/dag) var strax þynnt 1:1 (v:v) með Belsville Poultry Semen Diluent, sem inniheldur kalíumdífosfat (1,27 g), mónónatríumglútamatmónóhýdrat (0,867 g), frúktósa (0,5 d), vatnsfrítt natríumasetat (0,43 g), tris(hýdroxýmetýl)amínómetan (0,195 g), kalíumsítratmónóhýdrat (0,064 g), kalíummónófosfat (0,065 g), magnesíumklóríð (0,034 g) og H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmólstyrkur 333 mOsm/kg38. Þynnt sæðissýni voru fyrst skoðuð undir ljóssmásjá til að tryggja góð gæði sæðisins (raka) og síðan geymd í vatnsbaði við 37°C þar til þau voru notuð innan hálftíma frá söfnun.
Hreyfifræði og seigjufræði sæðisfrumna er lýst með því að nota kerfi örvökvamælitækja. Sæðissýni voru þynnt frekar í 1:40 í Beltsville fuglasæðisþynningarefni, sett í örvökvamælitæki (sjá hér að neðan) og hvarfhraðabreytur voru ákvarðaðar með tölvustýrðu sæðisgreiningarkerfi (CASA) sem áður hafði verið þróað fyrir örvökvagreiningu á hreyfanleika sæðisfrumna í fljótandi miðli (vélaverkfræðideild, verkfræðideild, Assiut háskóli, Egyptaland). Hægt er að hlaða niður viðbótinni á: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kúrvuhraði (VCL, μm/s), línulegur hraði (VSL, μm/s) og meðalferilshraði (VAP, μm/s) voru mæld. Myndbönd af sæðisfrumunum voru tekin með öfugum Optika XDS-3 fasa andstæðusmásjá (með 40x hlutgleri) tengdum við Tucson ISH1000 myndavél á 30 fps í 3 sekúndur. Notið CASA hugbúnaðinn til að rannsaka að minnsta kosti þrjú svæði og 500 sæðisferla í hverju sýni. Upptöku myndbandsins var unnið með heimagerðu CASA hugbúnaði. Skilgreiningin á hreyfanleika í CASA viðbótinni byggist á sundhraða sæðisins samanborið við flæðishraða og inniheldur ekki aðra breytur eins og hreyfingu frá hlið til hliðar, þar sem þetta hefur reynst áreiðanlegra í vökvaflæði. Seigjufræðileg hreyfing er lýst sem hreyfing sæðisfrumna gegn stefnu vökvaflæðisins. Sæðisfrumur með seigjufræðilega eiginleika voru deilt með fjölda hreyfanlegra sæðisfruma; sæðisfrumur sem voru í hvíld og sæðisfrumur sem hreyfðust með sveigju voru útilokaðar frá talningunni.
Öll efni sem notuð voru voru fengin frá Elgomhoria Pharmaceuticals (Kaíró, Egyptalandi) nema annað sé tekið fram. Tækið var framleitt eins og lýst er af El-sherry o.fl. 40 með nokkrum breytingum. Efnið sem notað var til að búa til örrásirnar voru meðal annars glerplötur (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 neikvætt viðnám (MicroChem, Newton, CA), díasetónalkóhól (Sigma Aldrich, Steinheim, Þýskalandi) og pólýasetón. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Örrásirnar eru framleiddar með mjúkri litografíu. Fyrst var glær hlífðargríma með þeirri örrásarhönnun sem óskað var eftir prentara með mikilli upplausn (Prismatic, Kaíró, Egypt og Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterplöturnar voru gerðar með glerplötum sem undirlagi. Plöturnar voru hreinsaðar í asetoni, ísóprópanóli og afjónuðu vatni og síðan húðaðar með 20 µm lagi af SU8-25 með snúningshúðun (3000 snúningar á mínútu, 1 mínúta). SU-8 lögin voru síðan þurrkuð varlega (65°C, 2 mínútur og 95°C, 10 mínútur) og útsett fyrir útfjólubláum geislum í 50 sekúndur. Eftir útsetningu var vöfflurnar bakaðar við 65°C og 95°C í 1 mínútu og 4 mínútur til að þverbinda útsett SU-8 lög, og síðan framkallaðar í díasetónalkóhóli í 6,5 mínútur. Vöfflurnar voru hart bakaðar (200°C í 15 mínútur) til að storkna SU-8 lagið enn frekar.
PDMS var útbúið með því að blanda saman einliðu og herðiefni í þyngdarhlutfallinu 10:1, síðan afgasað í lofttæmisþurrkara og hellt yfir aðalgrind SU-8. PDMS var hert í ofni (120°C, 30 mínútur), síðan voru rásirnar skornar út, aðskildar frá aðalrammanum og götóttar til að gera kleift að festa rör við inntak og úttak örrásarinnar. Að lokum voru PDMS örrásir festar varanlega við smásjárgler með því að nota flytjanlegan kórónavinnsluvél (Electro-Technic Products, Chicago, IL) eins og lýst er annars staðar. Örrásin sem notuð var í þessari rannsókn mælist 200 µm × 20 µm (B × H) og er 3,6 cm löng.
Vökvaflæðið, sem veldur vatnsstöðuþrýstingi inni í örrásinni, næst með því að halda vökvastigi í inntaksgeyminum fyrir ofan hæðarmuninn Δh39 í úttaksgeyminum (Mynd 1).
þar sem f er núningstuðullinn, skilgreindur sem f = C/Re fyrir lagskiptan flæði í rétthyrndum rásum, þar sem C er fasti sem fer eftir hlutfallslegu hliðarhlutfalli rásarinnar, L er lengd örrásarinnar, Vav er meðalhraðinn innan örrásarinnar, Dh er vökvaþvermál rásarinnar, g – þyngdarhröðunin. Með þessari jöfnu er hægt að reikna út meðalhraða rásarinnar með eftirfarandi jöfnu: