Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Götóttar kísilagnir voru búnar til með sol-gel aðferð með nokkrum breytingum til að fá stórgötóttar agnir. Þessar agnir voru afleiddar með afturkræfri viðbótarbrotnunarkeðjuflutnings (RAFT) fjölliðun með N-fenýlmaleímíði-metýlvínýlísósýanati (PMI) og stýreni til að búa til N-fenýlmaleímíð innskot á pólýstýren (PMP) kyrrstöðufasa. Þröngir rásar ryðfríir stálsúlur (100 × 1,8 mm innra þvermál) voru pakkaðar með slurry pökkun. Metið var aðskilnað PMP dálks á peptíðblöndu sem samanstendur af fimm peptíðum (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) litskiljunargetu) og trypsín melting á mannasermisalbúmíni (HAS). Við bestu útskilnaðarskilyrði er fræðilegur plötufjöldi peptíðblöndunnar allt að 280.000 plötur/m². Samanburður á aðskilnaðargetu þróaðrar dálks við hefðbundna Ascentis Express dálkinn. RP-Amide dálkinn kom í ljós að aðskilnaðarárangur PMP dálksins var betri en hefðbundinnar dálks hvað varðar skilvirkni og upplausn.
Á undanförnum árum hefur líftækniiðnaðurinn orðið vaxandi alþjóðlegur markaður með verulegri aukningu í markaðshlutdeild. Með sprengilegri vexti líftækniiðnaðarins1,2,3 er greining á peptíðum og próteinum mjög eftirsóknarverð. Auk markpeptíðsins myndast ýmis óhreinindi við peptíðmyndun, sem krefst því litskiljunarhreinsunar til að fá peptíð með tilætluðum hreinleika. Greining og einkenni próteina í líkamsvökvum, vefjum og frumum er afar krefjandi verkefni vegna mikils fjölda hugsanlega greinanlegra tegunda í einu sýni. Þó að massagreining sé áhrifaríkt tæki til peptíð- og prótínraðgreiningar, ef slík sýni eru sprautuð inn í massagreininn í einni umferð, verður aðskilnaðurinn ekki tilvalinn. Þetta vandamál er hægt að draga úr með því að framkvæma vökvaskiljunaraðskilnað (LC) fyrir MS greiningu, sem mun draga úr fjölda greiniefna sem koma inn í massagreininn á gefnum tíma4,5,6. Að auki, við vökvafasaaðskilnað, er hægt að einbeita greiniefnum á þröng svæði, þannig að þessi greiniefni eru einbeitt og MS greiningarnæmi bætt. Vökvaskiljun (LC) hefur þróast verulega á síðasta áratug og hefur orðið vinsæl... tækni í próteómgreiningu7,8,9,10.
Öfug fasa vökvaskiljun (RP-LC) er mikið notuð til að hreinsa og aðskilja peptíðblöndur með því að nota oktadecýl-breytt kísil (ODS) sem kyrrstæðan fasa11,12,13. Hins vegar veita RP kyrrstæðar fasar ekki fullnægjandi aðskilnað peptíða og próteina vegna flókinnar uppbyggingar þeirra og amfífílísks eðlis14,15. Þess vegna þarf sérhannaða kyrrstæða fasa til að greina peptíð og prótein með pól- og ópólískum einingum til að hafa samskipti við og halda þessum greiningarefnum16. Blandað litskiljun, sem veitir fjölþátta víxlverkanir, getur verið valkostur við RP-LC til aðskilnaðar peptíða, próteina og annarra flókinna blöndu. Nokkrir blandaðir kyrrstæðir fasar hafa verið útbúnir og súlur pakkaðar með þessum fösum hafa verið notaðar til aðskilnaðar peptíða og próteina17,18,19,20,21. Blandaðir kyrrstæðir fasar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, pólinnskot/RPLC) eru hentugir til aðskilnaðar peptíða og próteina vegna nærveru bæði pól- og ópólískra eininga. hópar22,23,24,25,26,27,28. Á sama hátt sýna skautbundnir kyrrstöðufasar með samgildum tengdum skauthópum góðan aðskilnaðarmátt og einstaka sértækni fyrir skautbundin og óskautbundin greiningarefni, þar sem aðskilnaður er háður víxlverkun milli greiningarefnis og kyrrstöðufasa. Fjölþátta víxlverkanir29, 30, 31, 32. Nýlega útbjuggu Zhang o.fl.30 dódesýl-endaðan pólýamín kyrrstöðufasa og aðskildu með góðum árangri kolvetni, þunglyndislyf, flavonoíða, núkleósíð, estrógen og nokkur önnur greiningarefni. Skautbundinn millifasi hefur bæði skautbundna og óskautbundna hópa, þannig að hann er hægt að nota til að aðskilja peptíð og prótein sem hafa bæði vatnsfælin og vatnssækin efni. Skautbundnar súlur (t.d. amíðbundnar C18 súlur) eru fáanlegar undir vörumerkinu Ascentis Express RP-Amide súlur, en þessar súlur eru eingöngu notaðar til greiningar á amíni 33.
Í þessari rannsókn var pól-innfelldur kyrrstæður fasi (N-fenýlmaleímíð-innfelldur pólýstýren) útbúinn og metinn til aðskilnaðar peptíða og trypsínmeltinga úr HSA. Kyrrstæða fasinn var útbúinn með eftirfarandi aðferð. Götóttar kísilagnir voru útbúnar samkvæmt aðferðinni sem gefin er í fyrri útgáfu okkar með nokkrum breytingum á undirbúningsferlinu. Hlutfall þvagefnis, pólýetýlen glýkóls (PEG), TMOS, vatns og ediksýru var stillt til að útbúa kísilagnir með stórum porastærðum. Í öðru lagi var nýtt bindill, fenýlmaleímíð-metýl vínýl ísósýanat, myndaður og notaður til að afleiða kísilagnir til að útbúa pól-innfelldan kyrrstæðan fasa. Kyrrstæða fasinn sem myndaðist var pakkaður í ryðfrítt stálsúlu (100 × 1,8 mm innra þvermál) með því að nota fínstillta pökkunaraðferð. Pökkun súlunnar er aðstoðuð með vélrænum titringi til að tryggja að einsleitt rúm myndist innan súlunnar. Metið pakkaðan dálk aðskilnað peptíðblandna sem samanstanda af fimm peptíðum; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) og trypsínmelt úr albúmíni úr sermi manna (HAS). Peptíðblandan og trypsínmelt úr HSA aðskildust með góðri upplausn og skilvirkni. Aðskilnaðargeta PMP dálksins var borin saman við aðskilnaðargetu Ascentis Express RP-Amide dálksins. Bæði peptíð og prótein aðskildust vel og voru skilvirk á PMP dálknum, sem var skilvirkari en Ascentis Express RP-Amide dálkurinn.
PEG (pólýetýlen glýkól), þvagefni, ediksýra, trímetoxýortósílíkat (TMOS), trímetýlklórsílan (TMCS), trypsín, albúmín úr mannasermi (HSA), ammoníumklóríð, þvagefni, hexan metýldísílasan (HMDS), metakrýlýlklóríð (MC), stýren, 4-hýdroxý-TEMPO, bensóýlperoxíð (BPO), asetónítríl (ACN) af HPLC-gæðum, metanól, 2-própanól og aseton. Keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Bandaríkjunum).
Blanda af þvagefni (8 g), pólýetýlen glýkóli (8 g) og 8 ml af 0,01 N ediksýru var hrærð í 10 mínútur og síðan var 24 ml af TMOS bætt út í við ískaldar aðstæður. Hvarfblandan var hituð við 40°C í 6 klukkustundir og síðan við 120°C í 8 klukkustundir í ryðfríu stáli sjálfsofnsíláti. Vatninu var hellt frá og afgangsefnið þurrkað við 70°C í 12 klukkustundir. Þurrkaði mjúki massinn var malaður í ofni og brenndur við 550°C í 12 klukkustundir. Þrjár lotur voru útbúnar og einkenndar til að kanna endurtekningarhæfni í agnastærð, porastærð og yfirborðsflatarmáli.
Með yfirborðsbreytingu kísilagna með formynduðu bindiefni fenýlmaleímíð-metýlvínýlísósýanati (PCMP) og síðan geislafræðilegri fjölliðun með stýreni, var efnasamband sem innihélt pólhópa búið til. Kyrrstætt stig fyrir agnir og pólýstýrenkeðjur. Undirbúningsferlinu er lýst hér að neðan.
N-fenýlmaleímíð (200 mg) og metýlvínýlísósýanat (100 mg) voru leyst upp í þurru tólúeni og 0,1 ml af 2,2′-asóísóbútýrónítríli (AIBN) var bætt í hvarfflöskuna til að búa til fenýlmaleímíð-metýlvínýlísósýanat samfjölliðu (PMCP). Blandan var hituð við 60°C í 3 klukkustundir, síuð og þurrkuð í ofni við 40°C í 3 klukkustundir.
Þurrkaðar kísilagnir (2 g) voru dreifðar í þurru tólúeni (100 ml), hrærðar og hljóðbeittar í 500 ml kúlulaga kolbu í 10 mínútur. PMCP (10 mg) var leyst upp í tólúeni og bætt dropavis út í hvarfkolbu í gegnum trekt. Blandan var sjóðuð við bakflæði við 100°C í 8 klukkustundir, síuð og þvegin með asetoni og þurrkuð við 60°C í 3 klukkustundir. Síðan voru PMCP-bundnar kísilagnir (100 g) leystar upp í tólúeni (200 ml) og 4-hýdroxý-TEMPO (2 ml) var bætt við í viðurvist 100 µL af díbútýltín dílaurat sem hvata. Blandan var hrærð við 50°C í 8 klukkustundir, síuð og þurrkuð við 50°C í 3 klukkustundir.
Stýren (1 ml), bensóýlperoxíð BPO (0,5 ml) og kísilkorn tengd TEMPO-PMCP (1,5 g) voru dreift í tólúeni og hreinsuð með köfnunarefni. Fjölliðun stýrens var framkvæmd við 100°C í 12 klukkustundir. Niðurstöðuefnið var þvegið með metanóli og þurrkuð við 60°C yfir nótt. Heildarviðbragðsferlið er sýnt á mynd 1.
Sýnin voru afgasuð við 393 K í 1 klukkustund til að fá leifarþrýsting undir 10-3 Torr. Magn N2 sem aðsogað var við hlutfallsþrýsting P/P0 = 0,99 var notað til að ákvarða heildarrúmmál svitahola. Lögun berum og bindilbundnum kísilögnum var skoðuð með rafeindasmásjá (Hitachi High Technologies, Tókýó, Japan). Þurrkuð sýni (ber kísil og bindilbundnar kísilögnir) voru sett á álsúlu með límbandi. Gull var húðað á sýnin með Q150T sputterhúðunartæki og 5 nm Au lag var sett á sýnin. Þetta bætir skilvirkni ferlisins með lágum spennum og veitir fínkorna, kalda sputteringu. Thermo Electron (Waltham, MA, Bandaríkin) Flash EA1112 frumefnisgreiningartæki var notað til frumefnisgreiningar. Malvern (Worcestershire, Bretlandi) Mastersizer 2000 agnastærðargreiningartæki var notað til að fá agnastærðardreifingu. Bein kísilögnir og bindilbundnar kísilögnir (5 mg hvert) var dreift í 5 ml af ísóprópanóli, hljóðbeitt í 10 mínútur, hrært í vortex í 5 mínútur og sett á ljósbekk Mastersizer. Hitamæling var framkvæmd með hraða 5°C á mínútu yfir hitastigsbilið 30 til 800°C.
Glerfóðraðir þröngir súlur úr ryðfríu stáli með stærðinni (100 × 1,8 mm innra þvermál) voru pakkaðar með leðjupökkunaraðferðinni, þar sem beitt var sömu aðferð og í tilvísun. 31. Ryðfrítt stálsúla (glerfóðruð, 100 × 1,8 mm innra þvermál) með úttakstengi sem innihélt 1 µm fritta var tengd við slurrypakka (Alltech Deerfield, IL, Bandaríkin). Útbúið kyrrstæða slurry með því að blanda 150 mg af kyrrstæðum fasa í 1,2 ml af metanóli og senda það í geymsludálkinn. Metanól var notað sem leysiefni fyrir slurry og einnig sem drifefni. Fyllið dálkinn í röð með því að beita þrýstingi upp á 100 MP í 10 mínútur, 80 MP í 15 mínútur og 60 MP í 30 mínútur. Við pökkun var beitt vélrænum titringi með tveimur GC dálkhristurum (Alltech, Deerfield, IL, Bandaríkjunum) til að tryggja jafna pökkun dálksins. Lokið slurrypakkanum og sleppið þrýstingnum hægt til að koma í veg fyrir skemmdir innan dálksins. Aftengdu dálkinn frá slurrypökkunareiningunni og tengdu annan tengi við inntakið og við LC kerfið til að athuga virkni hans.
Smíðaður var LC-dæla (10AD Shimadzu, Japan), inndælingartæki (Valco (USA) C14 W.05) með 50nL inndælingarlykkju, himnuafgasari (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS háræðagluggi. Sérstakur µLC-skynjari (UV-2075) og glerfóðraðir örsúlur. Notaðar voru mjög þröngar og stuttar tengislöngur til að lágmarka áhrif auka breikkunar dálkbandsins. Eftir pökkun voru háræðar (50 μm innra þvermál 365) og háræðar með afoxunartengingu (50 μm) settar upp við 1/16″ úttak afoxunartengingarinnar. Gagnasöfnun og litskiljunarvinnsla fór fram með Multichro 2000 hugbúnaði. Eftirlit við 254 nm. Greiningarefni voru prófuð fyrir UV-gleypni. Litskiljunargögn voru greind með OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmín úr mannasermi, frostþurrkað duft, ≥ 96% (agarósagel rafgreining) 3 mg blandað saman við trypsín (1,5 mg), 4,0 M þvagefni (1 ml) og 0,2 M ammóníumbíkarbónat (1 ml). Lausnin var hrærð í 10 mínútur og geymd í vatnsbaði við 37°C í 6 klukkustundir, síðan kæfð með 1 ml af 0,1% TFA. Lausnin er síuð og geymd við lægri hita en 4°C.
Aðskilnaður peptíðblandna og trypsínmeltinga úr HSA var metinn sérstaklega á PMP dálkum. Athugið aðskilnað peptíðblöndunnar og trypsínmeltingarinnar úr HSA með PMP dálkinum og berið niðurstöðurnar saman við Ascentis Express RP-Amide dálkinn. Fræðileg plötufjöldi er reiknaður út á eftirfarandi hátt:
SEM myndir af berum kísilögnum og kísilögnum tengdum lígandum eru sýndar á mynd 2. SEM myndir af berum kísilögnum (A, B) sýna að, ólíkt fyrri rannsóknum okkar, eru þessar agnir kúlulaga þar sem agnirnar eru aflangar eða hafa óreglulega samhverfu. Yfirborð kísilagnanna tengdu lígandunum (C, D) er sléttara en yfirborð berum kísilagnanna, sem gæti stafað af húðun pólýstýrenkeðja á yfirborði kísilagnanna.
Rafeindasmásjármyndir af berum kísilögnum (A, B) og kísilögnum sem tengjast lígandum (C, D).
Dreifing agnastærða í berum kísilögnum og kísilögnum sem tengjast lígandum er sýnd á mynd 3(A). Rúmmálsbundnar dreifingarferlar agnastærða sýndu að stærð kísilögnanna jókst eftir efnafræðilega breytingu (mynd 3A). Gögn um dreifingu agnastærða í kísilögnum úr núverandi rannsókn og fyrri rannsókn eru borin saman í töflu 1(A). Rúmmálsbundin agnastærð, d(0,5), PMP er 3,36 μm, samanborið við fyrri rannsókn okkar með ad(0,5) gildi upp á 3,05 μm (pólýstýrenbundnar kísilögnir)34. Þessi lota hafði þrengri agnastærðardreifingu samanborið við fyrri rannsókn okkar vegna mismunandi hlutfölla PEG, þvagefnis, TMOS og ediksýru í hvarfblöndunni. Agnastærð PMP-fasans er örlítið stærri en í pólýstýrenbundna kísilögnafasanum sem við rannsökuðum áður. Þetta þýðir að yfirborðsvirkjun kísilögna með stýreni setti aðeins pólýstýrenlag (0,97 μm) á kísilyfirborðið, en í PMP-fasanum var lagþykktin... 1,38 µm.
Dreifing agnastærðar (A) og dreifing porustærðar (B) á berum kísilögnum og kísilögnum sem eru bundnar við lígand.
Porastærð, porarúmmál og yfirborðsflatarmál kísilagnanna í þessari rannsókn eru gefin upp í töflu 1(B). PSD snið berra kísilagna og bindilsbundinna kísilagna eru sýnd á mynd 3(B). Niðurstöðurnar eru sambærilegar við fyrri rannsókn okkar. Porastærðir berra og bindilsbundinna kísilagna eru 310 og 241, talið í sömu röð, sem bendir til þess að porastærðin minnki um 69 eftir efnafræðilega breytingu, eins og sýnt er í töflu 1(B), og breytingin á ferlinum er sýnd á mynd 3(B). Á sama hátt minnkaði porarúmmál kísilagnanna úr 0,67 í 0,58 cm3/g eftir efnafræðilega breytingu. Eðlisfræðilegt yfirborðsflatarmál kísilagnanna sem nú eru rannsakaðar er 116 m2/g, sem er sambærilegt við fyrri rannsókn okkar (124 m2/g). Eins og sýnt er í töflu 1(B) minnkaði yfirborðsflatarmál (m2/g) kísilagnanna einnig úr 116 m2/g í 105 m2/g eftir efnafræðilega breytingu. breyting.
Niðurstöður frumefnagreiningar á kyrrstöðufasanum eru sýndar í töflu 2. Kolefnishleðsla núverandi kyrrstöðufasa er 6,35%, sem er lægri en kolefnishleðslan í fyrri rannsókn okkar (pólýstýren bundnar kísil agnir, 7,93%35 og 10,21%, talið í sömu röð)42. Kolefnishleðslan í núverandi kyrrstöðufasa er lág, því við undirbúning núverandi SP voru, auk stýrens, notaðir nokkrir pólbundnir bindlar eins og fenýlmaleímíð-metýlvínýlísósýanat (PCMP) og 4-hýdroxý-TEMPO. Köfnunarefnisþyngdarprósenta núverandi kyrrstöðufasa er 2,21%, samanborið við 0,1735 og 0,85% miðað við þyngd köfnunarefnis í fyrri rannsóknum, talið í sömu röð. Þetta þýðir að þyngdarprósenta köfnunarefnis er hærri í núverandi kyrrstöðufasa vegna fenýlmaleímíðs. Á sama hátt var kolefnishleðsla afurða (4) og (5) 2,7% og 2,9%, talið í sömu röð, en kolefnishleðsla lokaafurðarinnar (6) var 6,35%, eins og sést í töflu 2. Þyngdartapið var kannað með PMP kyrrstöðufasa og TGA ferillinn er sýndur á mynd 4. TGA ferillinn sýnir 8,6% þyngdartap, sem er í góðu samræmi við kolefnishleðsluna (6,35%) þar sem bindlarnir innihalda ekki aðeins C heldur einnig N, O og H.
Fenýlmaleímíð-metýlvínýlísósýanat-lígandinn var valinn fyrir yfirborðsbreytingu kísilagna vegna þess að hann hefur skautaða fenýlmaleímíðhópa og vínýlísósýanathópa. Vínýlísósýanathópar geta frekar hvarfast við stýren með lifandi stakeindafjölliðun. Önnur ástæðan er að setja inn hóp sem hefur miðlungsmikla víxlverkun við greiningarefnið og enga sterka rafstöðuvirkni milli greiningarefnisins og kyrrstæða fasans, þar sem fenýlmaleímíðhlutinn hefur enga raunverulega hleðslu við eðlilegt pH. Pólun kyrrstæða fasans er hægt að stjórna með því að velja ákjósanlegt magn stýrens og viðbragðstíma sindurefnafjölliðunar. Síðasta skrefið í viðbrögðunum (sindurefnafjölliðun) er mikilvægt og getur breytt pólun kyrrstæða fasans. Frumefnisgreining var framkvæmd til að athuga kolefnishleðslu þessara kyrrstæða fasa. Kom í ljós að aukning á magni stýrens og viðbragðstíma jók kolefnishleðslu kyrrstæða fasans og öfugt. SP-efni sem eru framleidd með mismunandi styrk stýrens hafa mismunandi kolefnishleðslur. Aftur skal hlaða þessum kyrrstæðu fasum í ryðfríar stálsúlur og athuga litskiljunargetu þeirra (sértækni, upplausn, N2). gildi o.s.frv.). Byggt á þessum tilraunum var valin besta formúla til að undirbúa PMP kyrrstæða fasann til að tryggja stýrða pólun og góða varðveislu greiningarefnisins.
Fimm peptíðblöndur (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkefalín) voru einnig metnar með PMP dálki sem notar hreyfanlega fasa; 60/40 (v/v) asetónítríl/vatn (0,1% TFA) við rennslishraða 80 μL/mín. Við bestu útskilnaðarskilyrði er fræðilegur fjöldi platna (N) á hverja súlu (100 × 1,8 mm innra þvermál) 20.000 ± 100 (200.000 plötur/m²). Tafla 3 sýnir N gildi fyrir þrjár PMP dálka og litrófin eru sýnd á mynd 5A. Hraðgreining á PMP dálki við mikinn rennslishraða (700 μL/mín), fimm peptíð voru útskilin innan einnar mínútu, N gildi voru mjög góð, 13.500 ± 330 á hverja súlu (100 × 1,8 mm innra þvermál), samsvarar 135.000 plötum/m² (mynd 5B). Þrjár eins stórar dálkar (100 × 1,8 mm innra þvermál) voru pakkaðar með þremur mismunandi lotum af PMP kyrrstöðufasa til að athuga endurtekningarhæfni. Styrkur greiningarefnisins fyrir hverja súlu var skráður með því að nota bestu útskilnaðarskilyrði og fjölda fræðilegra platna N og geymslutíma til að aðskilja sömu prófunarblönduna á hverri súlu. Endurtekningarhæfni PMP-súlnanna er sýnd í töflu 4. Endurtekningarhæfni PMP-súlunnar samsvarar vel mjög lágum %RSD gildum, eins og sýnt er í töflu 3.
Aðskilnaður peptíðblöndu á PMP dálki (B) og Ascentis Express RP-Amide dálki (A); hreyfanleg fasi 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), stærðir PMP dálks (100 × 1,8 mm innra þvermál); greiningaraðferð. Útskilnaðarröð efnasambandanna: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucín) sýruenkefalín)).
PMP-súla (100 × 1,8 mm innra þvermál) var metin til að aðskilja tryptisk meltingarefni úr albúmíni úr sermi manna í háafköstu vökvaskiljun. Litrófið á mynd 6 sýnir að sýnið er vel aðskilið og upplausnin er mjög góð. HSA-meltingarefnin voru greind með flæðishraða 100 µL/mín., hreyfanlega fasa 70/30 asetónítríl/vatn og 0,1% TFA. Eins og sést á litrófinu (mynd 6) hefur HSA-meltingin verið skipt í 17 tinda sem samsvara 17 peptíðum. Aðskilnaðarhagkvæmni hvers tinda í HSA-meltingunni var reiknuð út og gildin eru gefin upp í töflu 5.
Tryptisk niðurbrotsefni úr HSA (100 × 1,8 mm innra þvermál) var aðskilið á PMP dálki; rennslishraði (100 µL/mín), hreyfanlegt fasi 60/40 asetónítríl/vatn með 0,1% TFA.
þar sem L er lengd súlunnar, η er seigja hreyfanlega fasans, ΔP er bakþrýstingur súlunnar og u er línulegur hraði hreyfanlega fasans. Gegndræpi PMP súlunnar var 2,5 × 10⁻⁴ m², rennslishraðinn var 25 μL/mín. og 60/40 v/v ACN/vatn var notað. Gegndræpi PMP súlunnar (100 × 1,8 mm innra þvermál) var svipað og í fyrri rannsókn okkar, tilv. 34. Gegndræpi súlunnar sem er pakkað með yfirborðslega gegndræpum ögnum er: 1,7 × 10⁻⁴ fyrir 1,3 μm agnir, 3,1 × 10⁻⁴ fyrir 1,7 μm agnir, 5,2 × 10⁻⁴ og 2,5 × 10⁻⁴ m² fyrir 2,6 μm agnir. Fyrir 5 μm agnir 43. Þess vegna er gegndræpi PMP fasans svipað og fyrir 5 μm kjarna-skel agnir.
þar sem Wx er þyngd súlunnar sem er pakkað með klóróformi, Wy er þyngd súlunnar sem er pakkað með metanóli og ρ er eðlisþyngd leysiefnisins. Eðlisþyngd metanóls (ρ = 0,7866) og klóróforms (ρ = 1,484). Heildargegndræpi KÍSILAGNA-C18 dálkanna (100 × 1,8 mm innra þvermál) 34 og C18-Þvagefnis dálkanna 31 sem við rannsökuðum áður var 0,63 og 0,55, talið í sömu röð. Þetta þýðir að nærvera þvagefnislíganda dregur úr gegndræpi kyrrstöðufasans. Hins vegar er heildargegndræpi PMP dálksins (100 × 1,8 mm innra þvermál) 0,60. Gegndræpi PMP dálka er lægra en í dálkum sem eru pakkaðar með C18-bundnum kísilögnum vegna þess að í C18-gerð kyrrstöðufösum eru C18-lígandarnir festir við kísilögnirnar sem línulegar keðjur, en í pólýstýren-gerð kyrrstöðufösum er tiltölulega þykkt fjölliðulag. myndast í kringum það. Í dæmigerðri tilraun er gegndræpi súlunnar reiknað sem:
Mynd 7A og B sýna PMP dálkinn (100 × 1,8 mm innra þvermál) og Ascentis Express RP-Amide dálkinn (100 × 1,8 mm innra þvermál) með sömu útskilnaðarskilyrðum (þ.e. 60/40 ACN/H2O og 0,1% TFA) og van Deemter grafið. Valdar peptíðblöndur (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) voru útbúnar í 20 µL/. Lágmarksrennslishraði fyrir báðar súlurnar er 800 µL/mín. Lágmarks HETP gildi við kjörrennslishraða (80 µL/mín) fyrir PMP súluna og Ascentis Express RP-Amide súluna voru 2,6 µm og 3,9 µm, talið í sömu röð. HETP gildin benda til þess að aðskilnaðarhagkvæmni PMP súlunnar (100 × 1,8 mm innra þvermál) sé mun betri en Ascentis Express RP-Amide súlunnar sem er fáanleg í verslunum (100 × 1,8 mm innra þvermál). Van Deemter grafið á mynd 7(A) sýnir að lækkun á N gildi með auknu rennsli er ekki marktæk samanborið við fyrri rannsókn okkar. Hærri aðskilnaðarhagkvæmni PMP súlunnar (100 × 1,8 mm id) samanborið við Ascentis Express RP-Amide dálkinn byggir á úrbótum á lögun og stærð agna og flóknum pökkunaraðferðum dálksins sem notaðar eru í núverandi vinnu34.
(A) van Deemter graf (HETP á móti línulegum hraða hreyfanlegs fasa) fengið með PMP dálki (100 × 1,8 mm innra þvermál) í 60/40 ACN/H2O með 0,1% TFA. (B) van Deemter graf (HETP á móti línulegum hraða hreyfanlegs fasa) fengið með Ascentis Express RP-Amide dálki (100 × 1,8 mm innra þvermál) í 60/40 ACN/H2O með 0,1% TFA.
Pólinnfelldur pólýstýren kyrrstæður fasi var útbúinn og metinn til aðskilnaðar á tilbúnum peptíðblöndum og trypsínmeltingu úr mannasermisalbúmíni (HAS) í háafköstu vökvaskiljun. Litskiljunargeta PMP-súlna fyrir peptíðblöndur er framúrskarandi hvað varðar skilvirkni og upplausn aðskilnaðar. Bætt aðskilnaðargeta PMP-súlna stafar af ýmsum ástæðum, svo sem agnastærð og porastærð kísilagnanna, stýrðri myndun kyrrstæðu fasans og flókinni súluþéttingu. Auk mikillar aðskilnaðarhagkvæmni er lágur bakþrýstingur í súlunni við mikinn rennslishraða annar kostur þessa kyrrstæða fasa. PMP-súlur sýna góða endurtekningarhæfni og er hægt að nota þær til greiningar á peptíðblöndum og trypsínmeltingu ýmissa próteina. Við ætlum að nota þessa súlu til aðskilnaðar á náttúruafurðum, lífvirkum efnasamböndum úr lækningajurtum og sveppaútdrætti í vökvaskiljun. Í framtíðinni verða PMP-súlur einnig metnar til aðskilnaðar á próteinum og einstofna mótefnum.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsóknir á peptíðaðskilnaðarkerfum með öfugum fasa litskiljun, 1. hluti: Þróun á súlueinkennisaðferð. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. o.fl. Bætt virk peptíð hönnuð til meðferðar á smitsjúkdómum. Biotechnology.Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Tilbúin meðferðarpeptíð: vísindi og markaður. lyfjauppgötvanir. 15 (1-2) í dag, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ítarleg próteinvökvaskiljun. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. o.fl. Ítarleg vökvaskiljun-massagreining gerir kleift að fella inn víðtækar efnaskipta- og próteómfræðigreiningar. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Hlutverk UHPLC í lyfjaþróun. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundvallaratriði og hagnýt atriði í vökvaskiljun með ofurháum þrýstingi fyrir hraða aðskilnað. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Notkun ofurháafkastavökvaskiljunar í lyfjaþróun. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. o.fl. Einlitar stórholóttar vatnsgelar gerðir úr olíu-í-vatni fleytum með háum innri fasa til skilvirkrar hreinsunar á enteroveirum. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Hlutverk vökvaskiljunar í próteómfræði. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Nýjar þróanir í aðskilnaði peptíða og próteina með öfugum fasa vökvaskiljun: kenning og notkun. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvívíddaraðskilnaður peptíða með RP-RP-HPLC kerfi með mismunandi pH-gildum í fyrstu og annarri aðskilnaðarvídd. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. o.fl. Rannsóknir voru gerðar á fjöldaflutningseiginleikum og hvarfhraða hávirkra litskiljunarsúlna sem pakkaðar voru með C18 undir-2 μm fullum og yfirborðslega gegndræpum ögnum. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. o.fl. Nýlegar þróanir og greiningaráskoranir í einangrun, auðkenningu og staðfestingu lífvirkra peptíða úr plöntum. anus.biological anus. Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB o.fl. Próteinfræðilegt landslag lífríkisins. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. o.fl. Vinnsla meðferðarpeptíða með undirbúningsvökvaskiljun. Molecule (Basel, Sviss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Blandað litskiljun og notkun hennar á líffjölliðum. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Tengiefni fyrir blandaða próteinkróteinkróteingreiningu: meginregla, einkenni og hönnun. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).