Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Þú ert að nota vafraútgáfu með takmörkuðum CSS-stuðningi. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Til að tryggja áframhaldandi stuðning sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Sýnir hringekju með þremur glærum í einu. Notaðu hnappana Fyrri og Næsta til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu, eða notaðu rennihnappana í lokin til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu.
Götóttar kísilagnir voru búnar til með sol-gel aðferðinni með nokkrum breytingum til að fá agnir með breiðum götum. Þessar agnir voru afleiddar með N-fenýlmaleímíði-metýlvínýlísósýanati (PMI) og stýreni með öfugri keðjuflutnings-sundrun (RAFT) fjölliðun til að framleiða N-fenýlmaleímíð innfelld pólýamíð. Stýren (PMP) kyrrstæð fasi. Þröngir súlur úr ryðfríu stáli (100 × 1,8 mm innra þvermál) voru pakkaðar með leðjupakkningu. Litskiljunargeta PMP súlunnar var metin til að aðskilja blöndu af tilbúnum peptíðum sem samanstóðu af fimm peptíðum (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amínósýruenkefalín) og tryptínhýdrólýsu af mannasermisalbúmíni (HAS). Við bestu útskilnaðarskilyrði náði fræðilegur fjöldi platna með blöndu af peptíðum 280.000 plötum/fm. Þegar aðskilnaðarárangur þróaðu dálksins var borinn saman við hefðbundnu Ascentis Express RP-Amide dálkinn kom í ljós að aðskilnaðarhagkvæmni PMP dálksins var betri en hefðbundnu dálksins hvað varðar aðskilnaðarhagkvæmni og upplausn.
Líftækniiðnaðurinn hefur orðið vaxandi alþjóðlegur markaður með verulegri aukningu í markaðshlutdeild á undanförnum árum. Með sprengilegum vexti líftækniiðnaðarins1,2,3 er mikil þörf fyrir peptíð- og próteingreiningu. Auk markpeptíðsins myndast ýmis óhreinindi við peptíðmyndun, þannig að krómunarhreinsun er nauðsynleg til að ná fram æskilegum hreinleika peptíðsins. Greining og einkenni próteina í líkamsvökvum, vefjum og frumum er afar krefjandi verkefni vegna mikils fjölda hugsanlega greinanlegra tegunda sem eru til staðar í einu sýni. Þó að massagreining sé áhrifaríkt tæki til að raðgreina peptíð og prótein, ef slík sýni eru sett beint inn í massagreininn, verður aðskilnaðurinn ófullnægjandi. Þetta vandamál er hægt að leysa með því að framkvæma vökvaskiljun (LC) fyrir MS greiningu, sem mun draga úr magni greiniefna sem koma inn í massagreininn á gefnum tíma4,5,6. Að auki geta greiniefni safnast saman á þröngu svæði við vökvafasaaðskilnað, þar með safnað þessum greiniefnum og aukið næmi MS greiningarinnar. Vökvaskiljun (LC) hefur tekið miklum framförum á síðasta áratug og er orðin útbreidd aðferð til próteingreiningar7,8,9,10.
Öfug fasa vökvaskiljun (RP-LC) er mikið notuð til að hreinsa og aðskilja blöndur af peptíðum með því að nota oktadecýl-breytt kísil (ODS) sem kyrrstæðan fasa11,12,13. Hins vegar, vegna flókinnar uppbyggingar þeirra og tvíþátta eðlis,14,15 geta RP kyrrstæðar fasar ekki veitt fullnægjandi aðskilnað peptíða og próteina. Þess vegna krefst greining á peptíðum og próteinum með pólskum og ópólskum brotum sérhannaðra kyrrstæðra fasa til að hafa samskipti og halda þessum greiningarefnum16. Blandað litskiljun, sem býður upp á fjölþátta víxlverkanir, getur verið valkostur við RP-LC til að aðskilja peptíð, prótein og aðrar flóknar blöndur. Nokkrir blandaðir kyrrstæðir fasar voru útbúnir og súlur fylltar með þessum kyrrstæðu föstum voru notaðar til að aðskilja peptíð og prótein17,18,19,20,21. Vegna nærveru pól- og ópólhópa eru blandaðir kyrrstæðir fasar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, pólinnskot/RPLC) hentugir til aðskilnaðar peptíða og próteina22,23,24,25,26,27,28. , Pólinnskotaðir kyrrstæðir fasar með samgildum tengdum pólhópum sýna góða aðskilnaðargetu og einstaka sértækni fyrir pól- og ópólgreiningarefni þar sem aðskilnaður er háður víxlverkun milli greiningarefnisins og kyrrstæða fasans. Fjölþættar víxlverkanir29,30,31,32. Nýlega fengu Zhang o.fl.30 behenýl-enda kyrrstæða fasa af pólýamínum og aðskildu með góðum árangri kolvetni, þunglyndislyf, flavonoíða, núkleósíð, estrógen og nokkur önnur greiningarefni. Pólinnfellda kyrrstæða efnið hefur bæði pól- og ópólhópa, þannig að það er hægt að nota það til að aðskilja peptíð og prótein í vatnsfælna og vatnssækna hluta. Pólar innlínusúlur (t.d. C18 súlur með amíði innlínu) eru fáanlegar undir vörumerkinu Ascentis Express RP-Amide súlur, en þessar súlur hafa aðeins verið notaðar til greiningar á amíni 33.
Í þessari rannsókn var kyrrstæður fasi með pólskautum (N-fenýlmaleímíð, innfellt pólýstýren) útbúinn og metinn fyrir peptíðaðskilnað og tryptisk HSA klofning. Eftirfarandi aðferð var notuð til að útbúa kyrrstæðuna. Götóttar kísilagnir voru útbúnar samkvæmt aðferðum sem lýst er í fyrri ritum okkar, með nokkrum breytingum á undirbúningskerfum 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Hlutföll þvagefnis, pólýetýlen glýkóls (PEG), TMOS og vatnskenndrar ediksýru voru aðlöguð til að fá kísilagnir með stórum gatastærðum. Í öðru lagi var nýr fenýlmaleímíð-metýlvínýl ísósýanat bindill myndaður og afleiddar kísilagnir hans notaðar til að útbúa pólskautaða kyrrstæðu fasa. Kyrrstæðu fasinn sem fékkst var pakkaður í ryðfría stálsúlu (innra þvermál 100 × 1,8 mm) samkvæmt fínstilltu pökkunarkerfi. Pökkun súlunnar er aðstoðuð við vélrænan titring til að tryggja einsleitt lag innan súlunnar. Pakkaða dálkurinn var metinn til að aðskilja blöndu af peptíðum sem samanstóðu af fimm peptíðum (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefalín peptíði) og tryptískum vatnsrofsefnum úr albúmíni úr sermi manna (HSA). Kom í ljós að peptíðblandan og tryptískum melting HSA aðskildust með góðri upplausn og skilvirkni. Aðskilnaðarhagkvæmni PMP dálksins var borin saman við Ascentis Express RP-Amide dálkinn. Kom í ljós að peptíð og prótein höfðu góða upplausn og mikla aðskilnaðarhagkvæmni á PMP dálkinum, og aðskilnaðarhagkvæmni PMP dálksins er hærri en Ascentis Express RP-Amide dálksins.
PEG (pólýetýlen glýkól), þvagefni, ediksýra, trímetoxýortósílíkat (TMOS), trímetýlklórsílan (TMCS), trypsín, albúmín úr sermi manna (HSA), ammóníumklóríð, þvagefni, hexametýlmetakrýlóýldísílasan (HMDS), metakrýlóýlklóríð (MC), stýren, 4-hýdroxý-TEMPO, bensóýlperoxíð (BPO), asetónítríl (ACN) fyrir HPLC, metanól, 2-própanól og aseton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, Bandaríkin).
Blanda af þvagefni (8 g), pólýetýlen glýkóli (8 g) og 8 ml af 0,01 N ediksýru var hrærð í 10 mínútur og 24 ml af TMOS var bætt út í undir ískælingu. Hvarfblandan var hituð við 40°C í 6 klukkustundir og síðan við 120°C í 8 klukkustundir í ryðfríu stáli sjálfsofnskál. Vatninu var hellt frá og leifarnar þurrkuð við 70°C í 12 klukkustundir. Þurrkuðu mjúku blokkirnar voru malaðar slétt og brenndar í ofni við 550°C í 12 klukkustundir. Þrjár lotur voru útbúnar og einkenndar til að prófa endurtekningarhæfni agnastærða, porustærðar og yfirborðsflatarmáls.
Pólhópur og kyrrstæð fasi fyrir pólýstýrenkeðjur. Undirbúningsaðferðin er lýst hér að neðan.
N-fenýlmaleímíð (200 mg) og metýlvínýlísósýanat (100 mg) voru leyst upp í vatnsfríu tólúeni og síðan var 0,1 ml af 2,2′-asóísóbútýrónítríli (AIBN) bætt út í hvarfflöskuna til að fá samfjölliðu af fenýlmaleímíði og metýlvínýlísósýanati (PMCP). Blandan var hituð við 60°C í 3 klukkustundir, síuð og þurrkuð í ofni við 40°C í 3 klukkustundir.
Þurrkaðar kísilagnir (2 g) voru dreifðar í þurru tólúeni (100 ml), hrærðar og hljóðbeittar í 10 mínútur í 500 ml kúlulaga kolbu. PMCP (10 mg) var leyst upp í tólúeni og bætt dropavis út í hvarfkolbu í gegnum trekt. Blandan var sjóðuð við bakflæði við 100°C í 8 klukkustundir, síuð, þvegin með asetoni og þurrkuð við 60°C í 3 klukkustundir. Síðan voru kísilagnirnar sem tengdust PMCP (100 g) leystar upp í tólúeni (200 ml) og 4-hýdroxý-TEMPO (2 ml) var bætt við í viðurvist 100 μl af díbútýltín dílaurat sem hvata. Blandan var hrærð við 50°C í 8 klukkustundir, síuð og þurrkuð við 50°C í 3 klukkustundir.
Stýren (1 ml), bensóýlperoxíð BPO (0,5 ml) og kísilagnir sem tengdar voru við TEMPO-PMCP (1,5 g) voru dreift í tólúeni og hreinsað með köfnunarefni. Fjölliðun stýrens var framkvæmd við 100°C í 12 klukkustundir. Afurðin sem myndaðist var þvegin með metanóli og þurrkuð yfir nótt við 60°C. Almennt ferli hvarfsins er sýnt á mynd eitt.
Sýnin voru afgasuð við 393 K í 1 klst. þar til leifarþrýstingur undir 10–3 Torr náðist. Magn N2 sem aðsogað var við hlutfallsþrýsting P/P0 = 0,99 var notað til að ákvarða heildarrúmmál poru. Lögun hreinna og bindilsbundinna kísilagna var skoðuð með rafeindasmásjá (Hitachi High Technologies, Tókýó, Japan). Þurr sýni (hreint kísil og bindilsbundnar kísilagnir) voru sett á álstangir með kolefnislímbandi. Gull var sett á sýnið með Q150T spúttunartæki og 5 nm þykkt Au-lag var sett á sýnið. Þetta bætir skilvirkni lágspennuferlisins og veitir fína kaldúðun. Frumefnagreining var framkvæmd með Thermo Electron (Waltham, MA, Bandaríkjunum) Flash EA1112 frumefnasamsetningargreiningartæki. Malvern agnastærðargreiningartæki (Worcestershire, Bretlandi) Mastersizer 2000 var notað til að fá agnastærðardreifinguna. Óhúðaðar kísilagnir og lígandbundnar kísilagnir (5 mg hver) voru dreift í 5 ml af ísóprópanóli, hljóðbeittar í 10 mínútur, hrærðar í 5 mínútur og settar á Mastersizer ljósbekk. Hitamælingar eru framkvæmdar við hraðann 5°C á mínútu við hitastig á bilinu 30 til 800°C.
Súlur úr ryðfríu stáli, fóðraðar með glerþráðum og þröngum rifum, með málunum (innra þvermál 100 × 1,8 mm) voru pakkaðar með fyllingaraðferð fyrir leðju samkvæmt sömu aðferð og í tilvísun 31. Súla úr ryðfríu stáli (fóðruð með glerþráðum, innra þvermál 100 × 1,8 mm) og úttak með 1 µm fritta var tengd við leðjupökkunarvél (Alltech Deerfield, IL, Bandaríkin). Útbúið er sviflausn af kyrrstöðufasanum með því að leysa 150 mg af kyrrstöðufasanum upp í 1,2 ml af metanóli og setja það í geymissúlu. Metanól var notað sem leysiefni fyrir leðjuna og samanburðarleysiefni. Pökkið súluna með því að beita þrýstingaröðinni 100 MP í 10 mínútur, 80 MP í 15 mínútur og 60 MP í 30 mínútur. Í pökkunarferlinu voru notaðir tveir gasgreiningarsúlutitrarar (Alltech, Deerfield, IL, Bandaríkin) fyrir vélrænan titring til að tryggja jafna pökkun súlunnar. Lokið leðjupökkurunum og sleppið þrýstingnum hægt til að koma í veg fyrir skemmdir á strengnum. Súlan var aftengd frá stútnum fyrir leðjuna og önnur tengibúnaður festur við inntakið og tengdur við LC kerfið til að prófa virkni hennar.
Sérsmíðaður MLC var smíðaður með LC-dælu (10AD Shimadzu, Japan), sýnatökutæki með 50 nL innspýtingarlykkju (Valco (USA) C14 W.05), himnuafgasara (Shimadzu DGU-14A) og UV-VIS háræðaglugga. Skynjari (UV-2075) og emaljeruðum örsúlu. Notið mjög þröng og stutt tengirör til að lágmarka áhrif frekari útþenslu súlunnar. Eftir að súlan hefur verið fyllt skal setja upp háræð (50 µm innra lag 365) við úttak 1/16″ afoxunartengingarinnar og setja upp háræð (50 µm) á afoxunartengingunni. Gagnasöfnun og litrófsvinnsla er framkvæmd með Multichro 2000 hugbúnaðinum. Við 254 nm var UV-gleypni greiningarefnanna fylgst með við 0. Litrófsgögn voru greind með OriginPro8 (Northampton, MA).
Mannasermisalbúmín, frostþurrkað duft, ≥ 96% (agarósagel rafdráttur) 3 mg blandað saman við trypsín (1,5 mg), 4,0 M þvagefni (1 ml) og 0,2 M ammóníumbíkarbónat (1 ml). Lausnin var hrærð í 10 mínútur og geymd í vatnsbaði við 37°C í 6 klst., síðan kæfð með 1 ml af 0,1% TFA. Lausnin var síuð og geymd við lægri hita en 4°C.
Aðskilnaður blöndu af peptíðum og tryptískum HSA á PMP-súlu var metinn sérstaklega. Athugið tryptísk vatnsrof blöndu af peptíðum og HSA sem aðskilin voru með PMP-súlu og berið niðurstöðurnar saman við Ascentis Express RP-Amide-súlu. Fjöldi fræðilegra platna er reiknaður út með eftirfarandi jöfnu:
SEM myndir af hreinum kísilögnum og kísilögnum sem eru bundnar við bindilinn eru sýndar á mynd 2. SEM myndir af hreinum kísilögnum (A, B) sýna kúlulaga lögun þar sem agnirnar eru aflangar eða hafa óreglulega samhverfu samanborið við fyrri rannsóknir okkar. Yfirborð kísilagnanna sem eru bundnar við bindilinn (C, D) er sléttara en á hreinum kísilögnum, sem gæti verið vegna pólýstýrenkeðjanna sem þekja yfirborð kísilagnanna.
Skannandi rafeindasmásjármyndir af hreinum kísilögnum (A, B) og kísilögnum bundnum með bindlum (C, D).
Dreifing agnastærða hreinna kísilagna og kísilagna sem eru bundnar við bindil er sýnd á mynd 2.3(A). Rúmmálsdreifingarferlar agnastærða sýndu að stærð kísilagna jókst eftir efnafræðilega breytingu (mynd 3A). Gögn um dreifingu kísilagnastærða úr núverandi rannsókn og fyrri rannsókn eru borin saman í töflu 1(A). Rúmmáls agnastærð d(0,5) PMP var 3,36 µm, samanborið við ad(0,5) gildi upp á 3,05 µm í fyrri rannsókn okkar (pólýstýrenbundnar kísilagnir)34. Vegna breytinga á hlutfalli PEG, þvagefnis, TMOS og ediksýru í hvarfblöndunni var agnastærðardreifing þessarar lotu þrengri samanborið við fyrri rannsókn okkar. Agnastærð PMP-fasans er örlítið stærri en stærð pólýstýrenbundins kísilagnafasans sem við rannsökuðum fyrr. Þetta þýðir að yfirborðsvirkjun kísilagna með stýreni lagði aðeins pólýstýrenlag (0,97 µm) á kísilyfirborðið, en í PMP-fasanum var lagþykktin 1,38 µm.
Dreifing agnastærðar (A) og dreifing porustærðar (B) hreinna kísilagna og kísilagna sem eru bundnar við lígand.
Porastærð, porarúmmál og yfirborðsflatarmál kísilagnanna sem notaðar voru í þessari rannsókn eru sýnd í töflu 1 (B). PSD snið hreinna kísilagna og bindilsbundinna kísilagna eru sýnd á mynd 3 (B). Niðurstöðurnar voru sambærilegar við fyrri rannsókn okkar34. Porastærðir hreinna og bindilsbundinna kísilagna voru 310 Å og 241 Å, talið í sömu röð, sem bendir til þess að eftir efnafræðilega breytingu hafi porastærðin minnkað um 69 Å, eins og sýnt er í töflu 1 (B), og hliðrunarkúrfan er sýnd á mynd 3. Eðlisfræðilegt yfirborðsflatarmál kísilagna í núverandi rannsókn er 116 m2/g, sem er sambærilegt við fyrri rannsókn okkar (124 m2/g). Eins og sýnt er í töflu 1 (B), minnkaði yfirborðsflatarmál (m2/g) kísilagna eftir efnafræðilega breytingu einnig úr 116 m2/g í 105 m2/g.
Niðurstöður frumefnagreiningar á kyrrstöðufasanum eru kynntar í töflu 2. Kolefnisinnihald núverandi kyrrstöðufasa er 6,35%, sem er lægra en í fyrri rannsókn okkar (kísilagnir tengdar pólýstýreni, 7,93%35 og 10,21%, talið í sömu röð)42. Kolefnisinnihald núverandi kyrrstöðufasa er hér að neðan, þar sem sumir pólbundnir bindlar eins og fenýlmaleímíð metýlvínýl ísósýanat (PCMP) og 4-hýdroxý-TEMPO hafa verið notaðir auk stýrens við undirbúning SP. Þyngdarhlutfall köfnunarefnis í núverandi kyrrstöðufasa er 2,21% samanborið við 0,1735 og 0,85% í fyrri rannsóknum42. Þetta þýðir að núverandi kyrrstæða fasi hefur hátt þyngdarhlutfall köfnunarefnis vegna fenýlmaleímíðsins. Á sama hátt hafa afurðirnar (4) og (5) kolefnisinnihald upp á 2,7% og 2,9%, talið í sömu röð, en lokaafurðin (6) hefur 6,35% kolefnisinnihald, eins og sýnt er í töflu 2. Hitamælingargreining (TGA) var notuð á kyrrstöðufasa PMP til að prófa þyngdartap, og TGA ferillinn er sýndur á mynd 4. TGA ferillinn sýnir þyngdartap upp á 8,6%, sem er í góðu samræmi við kolefnisinnihaldið (6,35%), þar sem bindlarnir innihalda ekki aðeins C1, heldur einnig N2, O2 og H2.
Lígandiefnið fenýlmaleímíð-metýlvínýlísósýanat var valið til að breyta yfirborði kísilagnanna vegna skautbundinna fenýlmaleímíð- og vínýlísósýanathópa þess. Vínýlísósýanathópar geta frekar hvarfast við stýren með lifandi stakeindapolymeringu. Önnur ástæðan er að setja inn hóp sem hefur miðlungsmiklar víxlverkanir við greiningarefnið og engar sterkar rafstöðuvirkar víxlverkanir milli greiningarefnisins og kyrrstæða fasans, þar sem fenýlmaleímíðhlutinn hefur enga raunverulega hleðslu við eðlilegt pH. Pólun kyrrstæða fasans er hægt að stjórna með því að velja besta magn stýrens og viðbragðstíma stakeindapolymeringunnar. Síðasta skrefið í viðbrögðunum (stakefnapolymeringu) er mikilvægt þar sem það breytir pólun kyrrstæða fasans. Frumefnagreining var framkvæmd til að athuga kolefnisinnihald í þessum kyrrstæðu fösum. Það hefur komið í ljós að aukning á magni stýrens og viðbragðstíma eykur kolefnisinnihald kyrrstæða fasans og öfugt. Stafir sem eru búnir til með mismunandi styrk stýrens hafa mismunandi kolefnishleðslur. Á sama hátt voru þessir kyrrstöðufasar settir á súlur úr ryðfríu stáli og litskiljunareiginleikar þeirra (sértækni, upplausn, N-gildi o.s.frv.) voru kannaðir. Byggt á þessum tilraunum var valin besta samsetning fyrir undirbúning PMP kyrrstöðufasans til að tryggja stýrða pólun og góða varðveislu greiniefnisins.
PMP-súlan var einnig metin til greiningar á fimm blöndum af peptíðum (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefalín) með því að nota afkastagetu hreyfanlega fasans. 60/40 (v/v) ACN/vatn (0,1% TFA) við rennslishraða 80 µl/mín. Við bestu útskilnaðarskilyrði (200.000 plötur/m²) er fjöldi fræðilegra platna (N) á hverja súlu (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. N-gildin fyrir þrjár PMP-súlurnar eru sýnd í töflu 3 og litrófin eru sýnd á mynd 5A. Hraðgreining við mikinn rennslishraða (700 µl/mín.) á PMP-súlu, fimm peptíð skoluð út innan einnar mínútu, frábært N-gildi 13.500 ± 330 á súlu (100 x 1,8 mm í þvermál), sem jafngildir 135.000 plötum/m² (Mynd 5B). Þrjár súlur af sömu stærð (innra þvermál 100 x 1,8 mm) voru fylltar með þremur mismunandi skömmtum af PMP kyrrstöðufasa til að prófa endurtekningarhæfni. Greiningarefni voru skráð fyrir hverja súlu með því að aðskilja sömu prófunarblönduna á hverri súlu með því að nota bestu útskilnaðarskilyrði, fjölda fræðilegra platna N og varðveislutíma. Endurtekningarhæfnigögn fyrir PMP-súlurnar eru sýnd í töflu 4. Endurtekningarhæfni PMP-súlunnar samsvaraði vel mjög lágum %RSD gildum eins og sýnt er í töflu 3.
Aðskilnaður peptíðblandna á PMP dálki (B) og Ascentis Express RP-Amide dálki (A), hreyfanleg fasi 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), stærðir PMP dálks (100 x 1,8 mm innra þvermál), greining. Útskilnaðarröð efnasambanda: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucínsýruenkefalín).
PMP-súla (innra þvermál 100 x 1,8 mm) var metin til að aðskilja tryptínhýdrólýsat úr sermisalbúmíni manna með HPLC. Litrófið á mynd 6 sýnir að sýnin eru vel aðskilin með mjög góðri upplausn. HSA-lausnir voru greindar með rennslishraða 100 μl/mín., hreyfanlegum fasa 70/30 asetónítríl/vatni og 0,1% TFA. Kljúfnun HSA var skipt í 17 tinda, eins og sýnt er á litrófinu (mynd 6), sem samsvara 17 peptíðum. Aðskilnaðarhagkvæmni einstakra tinda frá HSA-hýdrólýsanum var reiknuð út og gildin eru sýnd í töflu 5.
HSA tryptín vatnsrofsefni voru aðskilin á PMP dálki (innra þvermál 100 x 1,8 mm), rennslishraði (100 μl/mín), ferðafasa 60/40 asetónítríl/vatn og 0,1% TFA.
þar sem L er lengd súlunnar, η er seigja hreyfanlega fasans, ΔP er bakþrýstingur súlunnar og u er línulegur hraði hreyfanlega fasans. Gegndræpi PMP súlunnar var 2,5 × 10–14 m2, rennslishraðinn var 25 µl/mín, 60/40 v/v var notað. ACN/vatn. Gegndræpi PMP súlunnar (ID 100 × 1,8 mm) var svipað og í fyrri Ref.34 rannsókn okkar. Gegndræpi súlunnar fylltrar með yfirborðslega gegndræpum ögnum er 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 fyrir 5 µm agnir43. Þess vegna er gegndræpi PMP fasans svipað og gegndræpi kjarna-skel agna með stærðina 5 µm.
Þar sem Wx er massi súlunnar sem er fyllt með klóróformi, Wy er massi súlunnar sem er fyllt með metanóli og ρ er eðlisþyngd leysiefnisins. Eðlisþyngd metanóls (ρ = 0,7866) og klóróforms (ρ = 1,484). Heildargegndræpi kísil-C18 agnasúlunnar (100 × 1,8 mm innra þvermál)34 og okkar áður rannsakaða C18-þvagefnis31 súlu var 0,63 og 0,55, talið í sömu röð. Þetta þýðir að nærvera þvagefnislíganda dregur úr gegndræpi kyrrstöðufasans. Hins vegar er heildargegndræpi PMP súlunnar (innra þvermál 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP súlur eru minna gegndræpar en súlur pakkaðar með C18 bundnum kísilögnum vegna þess að í C18 kyrrstöðufösum eru C18 lígandarnir tengdir kísilögnunum í línulegum keðjum, en í pólýstýren kyrrstöðufösum myndast tiltölulega þykk fjölliða í kringum agnirnar. lag A. Í dæmigerðri tilraun er gegndræpi súlunnar reiknað á eftirfarandi hátt:
Á mynd 7A og B eru sýnd Van Deemter-línurit fyrir PMP-súlu (innri þvermál 100 x 1,8 mm) og Ascentis Express RP-Amide-súlu (innri þvermál 100 x 1,8 mm) við sömu útskilnaðarskilyrði, 60/40 ACN/H2O og 0,1% TFA 20 µl/mín. til 800 µl/mín. á báðum súlum. Lágmarks HETP-gildi við kjörflæði (80 µl/mín.) voru 2,6 µm og 3,9 µm fyrir PMP-súluna og Ascentis Express RP-Amide-súluna, talið í sömu röð. HETP-gildin sýna að aðskilnaðarhagkvæmni PMP-súlunnar (100 x 1,8 mm innri þvermál) er mun hærri en hjá Ascentis Express RP-Amide-súlunni sem er fáanleg í verslunum (100 x 1,8 mm innri þvermál). Van Deemter-grafið á mynd 7(A) sýnir að lækkun á N-gildi er ekki marktækt meiri með auknu flæði samanborið við fyrri rannsókn okkar. Meiri skilvirkni aðskilnaðar PMP-súlunnar (innra þvermál 100 × 1,8 mm) samanborið við Ascentis Express RP-Amide-súluna byggist á bættri lögun og stærð agna og háþróaðri pökkunaraðferð súlunnar sem notuð er í núverandi rannsókn34.
(A) Van Deemter graf (HETP á móti línulegum hraða hreyfanlegs fasa) tekið á PMP dálki (innri stærð 100 x 1,8 mm) í 60/40 ACN/H2O með 0,1% TFA. (B) Van Deemter graf (HETP á móti línulegum hraða hreyfanlegs fasa) tekið á Ascentis Express RP-Amide dálki (innri stærð 100 x 1,8 mm) í 60/40 ACN/H2O með 0,1% TFA.
Pólfasi úr innfelldu pólýstýreni var útbúinn og metinn til aðskilnaðar á blöndu af tilbúnum peptíðum og tryptískum vatnsrofsefnum úr albúmíni úr sermi manna (HSA) í háafköstu vökvaskiljun. Skiljunargeta PMP-súlna fyrir peptíðblöndur er framúrskarandi hvað varðar skilvirkni og upplausn aðskilnaðar. Bætt skilvirkni aðskilnaðar PMP-súlna er vegna nokkurra ástæðna, svo sem stærð kísilagna og porastærðar, stýrðrar myndunar kyrrstæðra fasa og flókinna pakkningarefna í súlunni. Auk mikillar skilvirkni aðskilnaðar er annar kostur þessa kyrrstæða fasa lágur bakþrýstingur í súlunni við mikinn rennslishraða. PMP-súlur eru mjög endurtakanlegar og hægt er að nota þær til að greina blöndur af peptíðum og tryptískum meltingum á ýmsum próteinum. Við ætlum að nota þessa súlu til aðskilnaðar lífvirkra efnasambanda frá náttúruafurðum, útdrætti úr lækningajurtum og sveppum í vökvaskiljun. Í framtíðinni verða PMP-súlur einnig metnar til aðskilnaðar á próteinum og einstofna mótefnum.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskilnaðarkerfum með öfugum fasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar fyrir súlugreiningu. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskilnaðarkerfum með öfugum fasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar við greiningu súlna.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskiljunarkerfum með öfugfasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar fyrir súlugreiningu. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskilnaðarkerfum með öfugum fasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar fyrir eiginleika dálks. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskilnaðarkerfum með öfugum fasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar fyrir eiginleika dálks.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Rannsókn á peptíðaðskiljunarkerfum með öfugfasa litskiljun, 1. hluti: Þróun aðferðar fyrir súlugreiningu.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. o.fl. Aðferðir til að búa til bætt virk peptíð til meðferðar á smitsjúkdómum. Líftækni. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Tilbúin meðferðarpeptíð: Vísindi og markaður. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Tilbúin meðferðarpeptíð: Vísindi og markaður.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Chreschatyski M. Tilbúin meðferðarpeptíð: vísindi og markaður.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Khreschatsky M. Tilbúin meðferðarpeptíð: vísindi og markaður. lyfjaþróun. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ítarleg próteinvökvaskiljun. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ítarleg próteinvökvaskiljun.Sjá F., Smith RD og Shen Yu. Ítarleg próteinvökvaskiljun. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Háþróuð próteinsamsetning 液相色谱。Sjá F., Smith RD og Shen Yu. Ítarleg próteinvökvaskiljun.J. Litskiljun. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. o.fl. Ítarleg vökvaskiljun-massagreining getur sameinað víðtæka efnaskipta- og próteómfræði. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM og Salisbury, JJ Hlutverk UHPLC í lyfjaþróun. Chesnut, SM og Salisbury, JJ Hlutverk UHPLC í lyfjaþróun.Chesnut, SM og Salisbury, JJ Hlutverk UHPLC í lyfjaþróun.Chesnut, SM og Salisbury, JJ. Hlutverk UHPLC í lyfjaþróun. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundvallaratriði og hagnýt atriði í vökvaskiljun með ofurháum þrýstingi fyrir hraðar aðskilnaðaraðferðir. Wu, N. & Clausen, AM Grundvallaratriði og hagnýt atriði í vökvaskiljun með ofurháum þrýstingi fyrir hraðar aðskilnaðaraðferðir.Wu, N. og Clausen, AM. Grundvallaratriði og hagnýt atriði í háþrýstivökvaskiljun til hraðrar aðskilnaðar. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Grunnatriði og hagnýt atriði í vökvaskiljun með ofurháum þrýstingi til hraðrar aðskilnaðar.Wu, N. og Clausen, AM. Grundvallaratriði og hagnýt atriði í háþrýstivökvaskiljun til hraðrar aðskilnaðar.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Notkun ofurfljótandi litskiljunar í lyfjaþróun. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Notkun ofurfljótandi litskiljunar í lyfjaþróun.Ren, SA og Chelischeff, P. Notkun ofurháafkastavökvaskiljunar í lyfjaþróun. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA og Tchelitcheff, P.Ren, SA og Chelischeff, P. Notkun ofurfljótandi litskiljunar við lyfjaþróun.J. Litskiljun. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. o.fl. Einlitískt stórholótt vatnsgel unnið úr olíu-í-vatni fleyti með háu innra fasa fyrir skilvirka hreinsun á enteroveiru 71. Efnafræðilegt verkefni. Tímarit 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Hlutverk vökvaskiljunar í próteómfræði. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Hlutverk vökvaskiljunar í próteómfræði.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA Hlutverk vökvaskiljunar í próteómfræði. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. og Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA Hlutverk vökvaskiljunar í próteómfræði.J. Litskiljun. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nýjar þróanir í öfugum fasa vökvaskiljunaraðskilnaði á meðferðarpeptíðum og próteinum: Kenning og notkun. & Guillarme, D. Nýjar þróanir í öfugum fasa vökvaskiljunaraðskilnaði á meðferðarpeptíðum og próteinum: Kenning og notkun. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nýjar þróanir í aðskilnaði lækningalegra peptíða og próteina með öfugfasa vökvaskiljun: kenning og notkun. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.og Guillarmé, D. Nýjar þróanir í aðskilnaði lækningalegra peptíða og próteina með öfugfasa vökvaskiljun: kenning og notkun.J. Pharm. Líftækni. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvívíddaraðskilnaður peptíða með RP-RP-HPLC kerfi með mismunandi pH í fyrstu og annarri aðskilnaðarvídd. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvívíddaraðskilnaður peptíða með RP-RP-HPLC kerfi með mismunandi pH í fyrstu og annarri aðskilnaðarvídd.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Tvívíddaraðskilnaður peptíða með RP-RP-HPLC kerfinu með mismunandi sýrustigi í fyrstu og annarri aðskilnaðarvídd.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Tvívíddaraðskilnaður peptíða með mismunandi pH-gildum í fyrstu og annarri aðskilnaðarvídd með RP-RP-HPLC kerfinu. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. o.fl. Rannsókn á massaflutningi og hreyfifræðilegum eiginleikum háafkastaskiljunarsúlna sem eru pakkaðar með fullkomlega gegndræpum og yfirborðslega gegndræpum C18 ögnum sem eru minni en 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. o.fl. Nýlegar þróanir og greiningaráskoranir í einangrun, auðkenningu og staðfestingu lífvirkra peptíða plantna. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB o.fl. Próteómlandslag lífríkisins. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. o.fl. Eftirmeðferð á meðferðarpeptíðum með undirbúningsvökvaskiljun. Molecules (Basel, Sviss) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Blandað litskiljun og notkun hennar á líffjölliðum. Yang, Y. & Geng, X. Blandað litskiljun og notkun hennar á líffjölliðum.Yang, Yu. og Geng, X. Blandað litskiljun og notkun hennar á lífpólýmerum. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Blandað litskiljun og notkun hennar í lífpólýmerum.Yang, Yu. og Gene, X. Blandað litskiljun og notkun hennar á líffjölliðum.J. Litskiljun. A 1218(49), 8813–8825 (2011).