Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Angustifolius lúpína (NLL, Lupinus angustifolius L.) er belgjurt sem notuð er til matvælaframleiðslu og jarðvegsbóta. Alþjóðleg útbreiðsla NLL sem ræktunar hefur laðað að marga sjúkdómsvaldandi sveppi, þar á meðal lúpínu-antracnósu, sem veldur hræðilegum antraknósusjúkdómi. Tvær samsætur, Lanr1 og AnMan, sem veita aukið ónæmi, hafa verið notaðar í NLL-ræktun, en undirliggjandi sameindaferlar eru enn óþekktir. Í þessari rannsókn voru Lanr1 og AnMan merkin notuð til að skima fyrir evrópskum NLL-sýnum. Prófun á bóluefninu í stýrðu umhverfi staðfesti virkni beggja ónæmu gjafanna. Mismunandi genatjáningargreining var framkvæmd á dæmigerðum ónæmum og næmum línum. Antraknósuónæmi tengdist ofurtjáningu á erfðafræðilegu hugtökunum „GO:0006952 Defense Response“, „GO:0055114 Redox Process“ og „GO:0015979 Photosynthesis“. Að auki sýndi Lanr1(83A:476) línan verulega endurforritun umritunar hratt eftir ígræðslu, en hinar línurnar sýndu um 42 klukkustunda seinkun á þessu svari. Varnarviðbrögð tengjast TIR-NBS, CC-NBS-LRR og NBS-LRR genum, 10 próteinum sem taka þátt í meingerð, lípíðflutningspróteinum, endóglúkan-1,3-β-glúkósídasa, glýsínríkum frumuveggspróteinum og genum úr hvarfgjörnum súrefnisleiðum. Snemmbúin viðbrögð við 83A:476, þar á meðal vandleg bæling á genum sem tengjast ljóstillífun, féllu saman við farsæla vernd á gróðurstigi sveppalíffræðinnar, sem bendir til þess að áhrifavaldur virkjar ónæmi. Mandeloop-viðbrögðin eru hægfara, sem og heildar lárétta mótstöðunin.
Þröngblaðalúpína (NLL, Lupinus angustifolius L.) er próteinrík korntegund sem á uppruna sinn í vestanverðu Miðjarðarhafssvæðinu1,2. Hún er nú ræktuð sem matvæli fyrir dýr og menn. Hún er einnig talin græn áburður í ræktunarkerfum vegna köfnunarefnisbindingar með samlífis köfnunarefnisbindandi bakteríum og almennrar umbóta á jarðvegsbyggingu. NLL hefur gengist undir hraða tamningarferli á síðustu öld og er enn undir miklum ræktunarþrýstingi3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Með útbreiddri ræktun NLL þróaði framgangur sjúkdómsvaldandi sveppa nýjar landbúnaðar sess og olli nýjum sjúkdómum sem eyðileggja uppskeru. Það sem mest var áberandi fyrir lúpínubændur og ræktendur var tilkoma antraknósu, sem orsakast af sjúkdómsvaldandi sveppnum Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Það sem mest var áberandi fyrir lúpínubændur og ræktendur var tilkoma antraknósu, sem orsakast af sjúkdómsvaldandi sveppnum Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного lutu (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Það sem vakti mesta athygli lúpínubændur og ræktendur var tilkoma antraknósu af völdum sjúkdómsvaldandi sveppsins Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眀引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県(Bondar)嵵Haired。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемогот Collector lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Það sem hefur mest áhrif á lúpínubændur og ræktendur er tilkoma antraknósu af völdum sjúkdómsvaldandi sveppsins Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Fyrstu tilkynningar um sjúkdóminn komu frá Brasilíu og Bandaríkjunum, og einkennandi einkenni komu fram árið 1912 og 1929, talið í sömu röð. Hins vegar, eftir um 30 ár, var sjúkdómsvaldurinn skilgreindur sem Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf af Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld í markvissri formgerð. og H. Schrenk. og H. Schrenk.og H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.og H. Schlenk.Forgreining á sjúkdómum, sem gerð var um miðja 20. öld, sýndi fram á einhverja mótstöðu í afbrigðum af NLL og gulum lúpínu (L. luteus L.), en allar prófaðar afbrigði af hvítum lúpínu (L. albus L.) voru mjög viðkvæmar15,16. Rannsóknir hafa sýnt að þróun antrasnósu tengist aukinni úrkomu (loftrakastigi) og hitastigi (á bilinu 12-28°C), sem leiðir til brots á mótstöðu við hærra hitastig17, 18. Reyndar var tíminn sem það tók grófþörunga að spíra og sjúkdómurinn byrjaði fjórum sinnum styttri við 24°C (4 klukkustundir) en við 12°C (16 klukkustundir) við aðstæður með mikla raka19. Þannig hefur áframhaldandi hlýnun jarðar leitt til útbreiðslu antrasnósu. Hins vegar sást sjúkdómurinn í Frakklandi (1982) og Úkraínu (1983) sem fyrirboði um yfirvofandi ógn, en var greinilega hunsaður af lúpínuiðnaðinum á þeim tíma20,21. Fáeinum árum síðar breiddist þessi hrikalegi sjúkdómur út um allan heim og hafði einnig áhrif á helstu lúpínuræktarlönd eins og Ástralíu, Pólland og Þýskaland22,23,24. Í kjölfar antraknósafaraldurs um miðjan tíunda áratuginn leiddi ítarleg skimun til þess að nokkrir ónæmir gjafar fundust í NLL19 sýnum. Ónæmi NLL gegn antraknósa er stjórnað af tveimur aðskildum ríkjandi erfðabreytum sem finnast í mismunandi erfðamengjum: Lanr1 í ræktunarafbrigðinu Tanjil og Wonga og AnMan í ræktunarafbrigðinu Mandalay25,26. Þessi erfðabreyttir bæta upp sameindamerkin sem styðja val á ónæmum erfðamengjum í ræktunaráætlunum25,26,27,28,29,30. Ónæma ræktunarlínan 83A:476 sem bar Lanr1 erfðavísinn var krossuð við næmu villtu línuna P27255 til að fá RIL þýði sem aðgreindist fyrir antraknósaónæmi, sem gerði það mögulegt að tengja Lanr1 erfðavísinn við litninginn NLL-1131, 32, 33. Röðun tengikortamerkja frá hliðarónæmisstöðum við antraknósa með erfðafræðilegri ramma, NLL leiddi í ljós staðsetningu allra þriggja erfðavísanna á sama litningi (NLL-11), en á mismunandi stöðum29,34,35. Hins vegar, vegna fámennis RIL og mikillar erfðafræðilegrar fjarlægðar milli merkja og samsvarandi erfðavísa, er ekki hægt að draga áreiðanlegar ályktanir um undirliggjandi gen þeirra. Á hinn bóginn er notkun öfugrar erfðafræði í lúpínum erfið vegna mjög lítillar endurnýjunargetu þeirra, sem gerir erfðabreytingar fyrirhafnarmiklar37.
Þróun tamrar kímplasma sem ber tilætlaða erfðavísi í arfhreinu ástandi, eins og 83A:476 (Lanr1) og Mandelup (AnMan), hefur opnað dyrnar að því að rannsaka antraknósaónæmi í ljósi andstæðra samsetninga erfðavísa í villtum stofnum. Möguleikar á sameindaferlum. Berið saman varnarviðbrögð sem myndast af tilteknum erfðagerðum. Þessi rannsókn mat snemmbæra umritunarviðbrögð NLL við bólusetningu með C. lupini. Fyrst var evrópskt NLL kímplasmakerfi sem innihélt 215 línur skimað með sameindamerkjum sem merkja Lanr1 og AnMan erfðavísana. Svipgerðargreining á antraknósa var síðan framkvæmd á 50 NLL línum, sem áður höfðu verið valdar fyrir sameindamerki, undir stýrðum aðstæðum. Byggt á þessum tilraunum voru fjórar línur sem voru ólíkar í antraknósaónæmi og Lanr1/AnMan erfðavísasamsetningu valdar fyrir mismunandi varnargenatjáningarprófíl með því að nota tvær viðbótaraðferðir: háafköst RNA raðgreiningu og rauntíma PCR magngreiningu.
Skimun á NLL kímplasma (N = 215) með merkjunum Lanr1 (Anseq3 og Anseq4) og AnMan (Anseq4) og AnMan (AnManM1) sýndi að aðeins ein lína (95726, nálægt Salamanca-b) magnar „ónæmis“ allelið fyrir öll merki, en „Tilvist 'næmra' allela“ fann hlutfall allra merkja í 158 (~73,5%) línum. Þrettán línur framleiddu tvö „ónæmir“ allel af Lanr1 merkinu og 8 línur framleiddu „ónæmir“ allel af Lanr1 merkinu. „Ónæmis“ allelið af AnMan merkinu (viðbótartafla S1). Tvær línur voru arfblendnar fyrir Anseq3 merkið og ein arfblend fyrir AnManM1 merkið. 42 línur (19,5%) báru gagnstæða fasa Anseq3 og Anseq4 allelanna, sem bendir til mikillar tíðni endurröðunar milli þessara tveggja staðsetninga. Svipgerðir antraknósa undir stýrðum aðstæðum (viðbótartafla S2) sýndu breytileika í ónæmi prófaðra arfgerða, sem endurspeglaðist í alvarleika antraknósa. Mismunur á meðalskorum var á bilinu 1,8 (miðlungs ónæmi) til 6,9 (næm) og mismunur á þyngd plantna var á bilinu 0,62 (næm) til 4,45 g (ónæmi). Marktæk fylgni var milli gilda sem komu fram í tveimur endurtekningum tilraunarinnar (0,51 fyrir alvarleika sjúkdómsins, P = 0,00017 og 0,61 fyrir þyngd plantna, P < 0,0001) sem og milli þessara tveggja breyta (−0,59 og −0,77, P < 0,0001). Marktæk fylgni var milli gilda sem komu fram í tveimur endurtekningum tilraunarinnar (0,51 fyrir alvarleika sjúkdómsins, P = 0,00017 og 0,61 fyrir þyngd plantna, P < 0,0001) sem og milli þessara tveggja breyta (-0,59 og -0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента (0,51 lausum) болезни, P = 0,00017 og 0,61 fyrir массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59,0и <0,50, Р 0.0001). Marktæk fylgni fannst milli gildanna sem komu fram í tveimur endurtekningum tilraunarinnar (0,51 fyrir alvarleika sjúkdómsins, P = 0,00017 og 0,61 fyrir þyngd plantna, P < 0,0001), sem og milli þessara tveggja breyta (-0,59 og -0,77, P < 0,0001) 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︌P. 0,00017，植物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77。01)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 为（鈼（，（，，，，，，，，，，，＋. 0,59 和– 0,59 和– 0,59 á - 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколе тяжя, 5, 0, 5 = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 og -0,0001) 0,77, P <0,0001. Marktæk fylgni var milli gildanna sem mældust í tvítekningu (alvarleiki sjúkdóms 0,51, P = 0,00017 og þyngd plantna 0,61, P < 0,0001) og milli þessara tveggja breyta (-0,59 og -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Dæmigerð einkenni sem sjást í viðkvæmum plöntum eru meðal annars beygja og snúningur á stilknum sem líkist „hirðisboga“-byggingu, og síðan sporöskjulaga sár með appelsínugulum/bleikum grózoítum (viðbótarmynd 1). Ástralskar ættkvíslir sem bera Lanr1 (83A:476 og Tanjil) og AnMan (Mandelup) genin eru miðlungsónæmar, 0,0331 og 0,0036). Sumar línur sem einnig bera „ónæmar“ Lanr1 og/eða AnMan erfðavísa sýna einkenni sjúkdómsins.
Athyglisvert er að nokkrar NLL línur sem skorti neitt „ónæmt“ merkjasamsætu sýndu mikið magn af antraknósaónæmi (sambærilegt eða hærra en fyrir Lanr1 eða AnMan arfgerðir), eins og Boregine (P gildi < 0,0001 fyrir báða færibreytur), Bojar (P gildi < 0,0001 fyrir stig og 0,001 fyrir þyngd plantna) og þýði B-549/79b (P gildi < 0,0001 fyrir stig og ekki marktækt fyrir þyngd). Athyglisvert er að nokkrar NLL línur sem skorti neitt „ónæmt“ merkjasamsætu sýndu mikið magn af antraknósaónæmi (sambærilegt eða hærra en fyrir Lanr1 eða AnMan arfgerðir), eins og Boregine (P gildi < 0,0001 fyrir báða færibreytur), Bojar (P gildi < 0,0001 fyrir stig og 0,001 fyrir þyngd plantna) og þýði B-549/79b (P gildi < 0,0001 fyrir stig og ekki marktækt fyrir þyngd). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллеля, покасусаливый устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 eða AnMan), таких или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких или более высокий параметров), Bojar (síða P < 0,0001 fyrir оценки и 0,001 для массы растения) og популяции B-549/79b (síða P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Athyglisvert er að nokkrar NLL línur sem skorti neitt „ónæmt“ merkjagen sýndu mikið ónæmi gegn antraknósa (sambærilegt við eða hærra en fyrir Lanr1 eða AnMan arfgerðir), svo sem Boregine (P gildi < 0,0001 fyrir báða færibreytur), Bojar (P gildi < 0,0001 fyrir mat og 0,001 fyrir þyngd plantna) og þýði B-549/79b (P gildi < 0,0001 fyrir mat og ekki marktækt fyrir þyngd).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炧水平的瀅疽1或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0.0001，植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，逍昍昂一，重量 Það er áhugavert að sum NLL kerfi sem hafa engin „mótefnavaka“ merki sýna hátt lárétt viðnám (jafngildir Lanr1 eða AnMan genum eða hærra), eins og Boregine (báðir færibreytur P < 0,0001), Bojar (P gildi < 0,0001, þyngd plantna 0,001) og stofn B-549/79b (P gildi < 0,0001, þyngd ekki marktæk). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазаливи устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (значение P обрабоих,00рпаов), (árangur P <0,0001, hámarksstyrkur 0,001) og B-549/79b (útgáfa P-útgáfu <0,0001, масса незначительна). Athyglisvert er að sumar NLL línur sem skorti nein „ónæmis“ merkjasamsætur sýndu mikið magn af antraknósa ónæmi (sambærilegt við eða hærra en Lanr1 eða AnMan arfgerðir), svo sem Boregine (P gildi fyrir báða færibreytur <0,0001), Bojar (P-gildi < 0,0001, þyngd plantna 0,001) og þýði B-549/79b (P-gildi < 0,0001, þyngd ekki marktæk).Þetta fyrirbæri bendir til möguleikans á nýrri erfðafræðilegri uppsprettu ónæmis, sem skýrir þann skort á fylgni sem sést hefur milli erfðafræðilegra erfðabreyta og sjúkdómsgerða (p-gildi frá ~0,42 til ~0,98). Þannig sýndi Kolmogorov-Smirnov prófið að gögnin um ónæmi gegn antraknósa voru nokkurn veginn normaldreifð fyrir stig (p-gildi 0,25 og 0,11) og plöntumassa (p-gildi 0,47 og 0,55), sem bendir til þess að ég set fram tilgátu um að fleiri erfðafræðilegir samsætur en Lanr1 og AnMan séu viðriðnir.
Byggt á niðurstöðum skimunar fyrir antraknósaónæmi voru fjórar línur valdar til umritunargreiningar: 83A:476, Boregine, Mandelup og þýði 22660. Þessar línur voru endurprófaðar fyrir miltisbrandsónæmi í ígræðslutilraunum með RNA raðgreiningu, að því tilskildu að þær væru þær sömu og í fyrri prófun. Einkunnagildin voru sem hér segir: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) og þýði 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000 samskiptareglurnar náðu að meðaltali 40,5 Mread pörum á hvert sýni (29,7 til 54,4 Mreads) (viðbótartafla S3). Röðunargildi í viðmiðunarröðinni voru á bilinu 75,5% til 88,6%. Meðalfylgni lestrartölugagna milli tilraunaafbrigða milli líffræðilegra endurtekinna prófana var á bilinu 0,812 til 0,997 (meðaltal 0,959). Af þeim 35.170 genum sem greind voru, sýndu 2917 enga tjáningu og hin 4785 genin voru hverfandi tjáð (grunnmeðaltal < 5). Af þeim 35.170 genum sem greind voru, sýndu 2917 enga tjáningu og hin 4785 genin voru hverfandi tjáð (grunnmeðaltal < 5). Um 35 170 leigubílar 2917 ekki seldir, á 4785 leigubílar. уровне (базовое среднее <5). Af þeim 35.170 genum sem greind voru sýndu 2917 enga tjáningu og hin 4785 genin voru hverfandi tjáð (grunnmeðaltal <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35.170 Frá 35 170 stjörnur среднее значение <5). Af þeim 35.170 genum sem greind voru voru 2917 ekki tjáð og hin 4785 genin höfðu hverfandi tjáningu (grunnmeðaltal <5).Þannig var fjöldi gena sem talið var að væru tjáð (grunnmeðaltal ≥ 5) í tilrauninni 27.468 (78,1%) (viðbótartafla S4).
Frá fyrsta tímapunkti svöruðu allar NLL línur bóluefnisins C. lupini (stofn Col-08) með því að endurforrita umritið (Tafla 1), en marktækur munur sást á milli línanna. Þannig sýndi ónæmislínan 83A:476 (sem ber Lanr1 genið) marktæka endurforritun umritsins á fyrsta tímapunkti (6 hpi) með 31-69 falda aukningu á fjölda einangraðra upp- og niðurgena samanborið við aðra tímapunkta á þessum tímapunkti. Að auki var þessi hámarkslengd skammvinn, þar sem tjáning aðeins fárra gena var marktækt breytt á öðrum tímapunkti (12 hpi). Athyglisvert er að Boregine, sem einnig sýndi mikið ónæmi í ígræðsluprófinu, gekkst ekki undir jafn mikla umritunarendurforritun meðan á tilrauninni stóð. Hins vegar var fjöldi mismunandi tjáðra gena (DEG) sá sami fyrir Boregine og 83A:476 við 12 hpi. Bæði Mandelup og íbúafjöldi 22660 sýndu DEG-topp á síðasta tímapunkti (48 l/s), sem bendir til hlutfallslegrar seinkunar á varnarviðbrögðum.
Þar sem 83A:476 gekkst undir mikla endurforritun umritunar sem svar við C. lupini við 6 HPI samanborið við allar aðrar línur, voru ~91% af DEG sem sáust á þessum tímapunkti ættartengslasértæk (Mynd 1). Hins vegar var einhver skörun í fyrstu svörunum milli rannsóknarlína, þar sem 68,5%, 50,9% og 52,6% DEG í Boregine, Mandelup og þýði 22660, talið í sömu röð, sköruðust við þau sem fundust í 83A:476 á ákveðnum tímapunktum. Hins vegar voru þessir DEG aðeins lítill hluti (0,97–1,70%) af öllum DEG sem greindir eru með 83A:476. Að auki voru 11 DEG úr öllum línum samhangandi á þessum tíma (viðbótartöflur S4-S6), þar á meðal sameiginlegir þættir varnarviðbragða plantna: lipid transfer protein (TanjilG_32225), endóglúkan-1,3-β-glúkósíð ensím (TanjilG_23384), tvö streituörvandi prótein eins og SAM22 (TanjilG_31528 og TanjilG_31531), basískt latexprótein (TanjilG_32352) og tvö glýsínrík byggingarfrumuveggsprótein (TanjilG_19701 og TanjilG_19702). Einnig var tiltölulega mikil skörun í umritunarviðbrögðum milli 83A:476 og Boregine við 24 HPI (samtals 16-38% DEG) og milli Mandelup og þýðis 22660 við 48 HPI (samtals 14-20% DEG).
Venn-rit sem sýnir fjölda mismunandi tjáðra gena (DEG) í línum af þröngblaðalúpínu (NLL) sem voru bólusettar með Colletotrichum lupini (stofni Col-08 sem fenginn var úr lúpínuökrum í Wierzhenice, Póllandi, 1999). NLL-línurnar sem greindar voru voru: 83A:476 (ónæmar, bera Lanr1-genið), Boregine (ónæmar, erfðafræðilegur bakgrunnur óþekktur), Mandelup (miðlungsónæmar, bera AnMan-genið) og stofn 22660 (mjög næmar). Skammstöfunin hpi stendur fyrir klukkustundir eftir bólusetningu. Núllgildi hafa verið fjarlægð til að einfalda grafið.
Safn ofurtjáðra gena við 6 hpi var greint til að kanna nærveru hefðbundinna R genléna (viðbótartafla S7). Þessi rannsókn leiddi í ljós umritunarörvun klassískra sjúkdómsþolsgena með NBS-LRR lénum aðeins við 83A:476. Þetta safn samanstóð af einu TIR-NBS-LRR geni (tanjilg_05042), fimm CC-NBS-LRR genum (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 og tanjilg_16162), og fjórum NBS-LR, Tanjilg_16162), og fjórum NBS-LRRE (tanjilg_16162) sem og fjórum NBS-Lrr (tanjilg_16162) og fjórum NBS-LRR (TANJILG_16162). Öll þessi gen hafa hefðbundin lén raðað í varðveittar raðir. Auk NBS-LRR lénsgenanna voru nokkrir RLL kínasar virkjaðir við 6 hpi, þ.e. einn í Boregine (TanjilG_19877), tveir í Mandelup (TanjilG_07141 og TanjilG_19877) og í þýði 22660 (TanjilG_09014 og TanjilG_10361) og tveir í 83A 27:476.
Gen með marktækt breytta tjáningu sem svar við ígræðslu með C. lupini (stofni Col-08) voru gerð með erfðafræðilegri ontology (GO) auðgunargreiningu (viðbótartafla S8). Algengasta offramsetta hugtakið í líffræðilegum ferlum var „GO:0006952 varnarsvörun“ sem kom fyrir í 6 af 16 (tíma × lína) samsetningum með mikilli marktækni (P gildi < 0,001) (Mynd 2). Algengasta offramsetta hugtakið í líffræðilegum ferlum var „GO:0006952 varnarsvörun“ sem kom fyrir í 6 af 16 (tíma × lína) samsetningum með mikilli marktækni (P gildi < 0,001) (Mynd 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый», появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (síða P <0,001) (рис. 2). Algengasta offramsetta hugtakið í líffræðilegu ferli var „GO:0006952 varnarsvörun“, sem kom fyrir í 6 af 16 (tími × lína) samsetningum með mikilli marktækni (P gildi < 0,001) (Mynd 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）. Dæmigert hugtak fyrir líffræðilegt ferli er „GO:0006952 varnarsvörun“, sem kemur fyrir í 6 af 16 (时间×线) samsetningum, með mikilli marktækni (P gildi < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response», косторвя з 16 косторвя комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (útgáfa P <0,001) (рис. 2). Algengasta offramsetta hugtakið í líffræðilegu ferli var „GO:0006952 Defense Response“, sem kom fyrir í 6 af 16 samsetningum (tími × lína) með mikilli marktækni (P gildi < 0,001) (Mynd 2).Þetta hugtak var ofviða á tveimur tímapunktum í 83A: 476 og Boregine (6 og 24 hpi) og á einum tímapunkti í Mandelup og þýði 22660 (12 og 6 hpi, talið í sömu röð). Þetta er væntanleg niðurstaða, sem undirstrikar sveppaeyðandi svörun ónæmu línanna. Að auki brást 83A:476 við C. lupini með því að örva hratt gen sem tengjast oxunarsprengingunni sem hugtakið „GO:0055114 oxunarafritunarferli“ táknar, sem bendir til sértækrar varnarviðbragða, en Boregine sýndi sértæk varnarviðbrögð, tengd hugtakinu 'GO'. :0006950 Streitusvörun“. Þýði 22660 virkjaði lárétta viðnámssvörun sem felur í sér annars stigs umbrotsefni, sem undirstrikar óhóflegan fjölda hugtaka „GO:0016104 Ferli tríterpensmyndunar“ og „GO:0006722 Ferli tríterpens efnaskipta“ (bæði hugtökin tilheyra sama genamengi). Að teknu tilliti til niðurstaðna GO hugtakaauðgunargreiningarinnar var stöðugleiki Mandelup viðbragða á milli Boregine og Þýði 22660. Að auki innihalda snemmbær viðbrögð 83A:476 (6 hpi) og seinkuð viðbrögð Mandelup og Þýði 22660 hugtakið GO:0015979 'ljóstillífun' og önnur skyld líffræðileg ferli.
Hugtökin í genafræði lífferla sem valin voru í skýringum á mismunandi tjáðum genum við umritunarsvörun þröngblaðalúpínu (NLL) sem var bólusett með miltisbrandslúpínu (Col-08 stofn fenginn úr lúpínuökrum í Wierzhenice, Póllandi, árið 1999) eru mjög ýkt. NLL línurnar sem greindar voru voru: 83A:476 (ónæmir, ber arfhreina Lanr1 erfðavísinn), Boregine (ónæmir, óþekktur erfðafræðilegur bakgrunnur), Mandelup (miðlungsónæmir, ber arfhreina AnMan erfðavísinn) og þýði 22660 (næmir).
Þar sem markmið þessarar rannsóknar var að bera kennsl á gen sem stuðla að ónæmi gegn antraknósa, voru genin sem tengdust hugtökunum GO „GO: 0006952 Defensive responses“ og „GO: 0055114 Redox processes“ greind með viðmiðunarmörkum þar sem grunnlínumeðaltöl ≥ 30 með að minnsta kosti einni línu × tímapunkti sem sameinar tölfræðilega marktæk gildi log2 (földunarbreyting). Fjöldi gena sem uppfylltu þessi skilyrði var 65 fyrir GO:0006952 og 524 fyrir GO:0055114.
83A:476 leiddi í ljós tvo DEG-tinda merkta með hugtakinu GO:0006952, sá fyrri við 6 gen á tommu (64 gen, upp- og niðurstjórnun) og sá seinni við 24 gen á tommu (15 gen, aðeins uppstjórnun). Boregine sýndi einnig að GO:0006952 náði hámarki á sama tímapunkti, en með minni DEG (11 og 8) og forgangsvirkjun. Mandeloop sýndi tvo tinda af GO:0006952 við 12 og 48 HPI, bæði með 12 gen (sá fyrri með virkjandi gen og sá seinni með aðeins bælandi gen), en 22660 þýðið við 6 HPI (13 gen) hafði meiri yfirburði á aukinni stjórnun á hámarki. Það skal tekið fram að 96,4% af GO:0006952 DEG í þessum tindum höfðu sömu tegund svörunar (upp eða niður), sem bendir til verulegrar skörunar í varnarviðbrögðum þrátt fyrir mismunandi fjölda gena sem taka þátt. Stærsti hópurinn raða sem tengist hugtakinu GO:0006952 kóðar fyrir Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-líkt), sem tilheyrir próteinklæðu 10. flokks meingerðastengdra próteina (PR-10) og kjarnapróteinlatexinu. svipað (MLP-líkt) prótein) (Mynd 3). Þessir tveir hópar voru ólíkir í eðli tjáningar og stefnu svörunar. Genin sem kóða fyrir SAM22-líkum próteinum sýndu samræmda og marktæka örvun á fyrstu tímapunktum (6 eða 12 hpi) og voru almennt óviðráðanleg í lok tilraunarinnar (48 hpi), en MLP-lík prótein sýndu samhæfingu við 6 hpi. hpi. 83A:476 og Mandelup við 48 hpi/in, næstum allir aðrir gagnapunktar voru óviðráðanlegir. Að auki fylgdi munur á tjáningarferlum SAM22-líkra próteingena breytileika í antraknósaónæmi, þar sem ónæmari línur höfðu fleiri tímapunkta sem örvuðu þessi gen marktækt en næmari gen. Annað LlR18A/B-líkt PR-10 gen sýndi mjög svipað tjáningarmynstur og SAM22-líkt próteingen.
Helstu þættir líffræðilega ferlishugtaksins „GO:0006952 Defense Response“ og tjáningarmynstur frambjóðandi gena Lanr1 og AnMan erfðavísanna voru greindir. Log2 kvarðinn táknar log2 gildi (breytingar á margföldun) milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn úr lúpínuökrum, Wizhenica, Póllandi, 1999) og samanburðarplantna (sýndarsáðrar) á sama tímapunkti. Eftirfarandi þröngblaða lúpínulínur voru greindar: 83A:476 (ónæmir, ber arfhreina Lanr1 erfðavísinn), Boregine (ónæmir, erfðafræðilegur bakgrunnur óþekktur), Mandelup (miðlungsónæmir, ber arfhreina AnMan erfðavísinn) og þýði 22660 (næmir).
Að auki voru tjáningarmynstur RNA-raðgreiningargenanna Lanr1 (TanjilG_05042) og AnMan (TanjilG_12861) metin (Mynd 3). TanjilG_05042 genið sýndi marktæka svörun (virkjun) við 83A:476 aðeins á fyrsta tímapunktinum (6 hpi), en TanjilG_12861 var marktækt í Mandeloop aðeins á tveimur tímapunktum: 6 hpi (niðurstýring) og 24 hpi (6 hpi). Með stillanlegu gildi).
Genin sem voru mest ofurtjáð í GO:0055114 „redox ferlinu“ voru gen sem kóða fyrir cýtókróm P450 prótein og peroxidasa (Mynd 4). Fyrir sýni einangruð úr 83A:476 við 6 hpi, sáust almennt hámarks- eða lágmarks log2 gildi (fold change) (fyrir 86,6% gena) milli sáðra plantna og samanburðarplantna, sem undirstrikar hátt svar þessarar arfgerðar við sáð kyn. 83A:476 sýndi marktækasta GO: 0055114 DEG við 6 hpi (503 gen), en restin af línunum við 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gen; og Þýði 22660, 78 gen). Í flestum genum GO:0055114 fjölskyldunnar sáust tvenns konar svörun við bólusetningu (virkjun og hömlun). Athyglisvert er að allt að 97,6% af DEG-genunum sem greind voru fyrir hugtakið GO: 0055114 í Mandelupe við 48 hp. Þessar athuganir benda til þess að þrátt fyrir marktækt minni umfang (þ.e. fjöldi stökkbreyttra redox-gena, 85 á móti 503), sé mynstur seinkaðra umritunarviðbragða mandeloup við antracnósa svipað og snemma svörun 83A:476. Í Boregine og þýði 22660 er þessi samleitni lægri, eða 51,6% og 75,6%, í sömu röð.
Tjáningarmynstur helstu þátta hugtaksins í líffræðilega ferlinu „GO:0055114 Redox ferli“ voru afhjúpuð. Log2 kvarðinn táknar log2 gildi (breytingar á margföldun) milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn úr lúpínuökrum, Wizhenica, Póllandi, 1999) og samanburðarplantna (sýndarsáðrar) á sama tímapunkti. Eftirfarandi þröngblaða lúpínulínur voru greindar: 83A:476 (ónæmir, ber arfhreina Lanr1 erfðavísinn), Boregine (ónæmir, erfðafræðilegur bakgrunnur óþekktur), Mandelup (miðlungsónæmir, ber arfhreina AnMan erfðavísinn) og þýði 22660 (næmir).
83A:476 Umritunarviðbrögð við ígræðslu með C. lupini (stofni Col-08) fól einnig í sér samhæfða þöggun gena sem rekja má til hugtaksins GO:0015979 „ljóstillífunar“ og annarra skyldra líffræðilegra ferla (Mynd 5). Þetta GO:0015979 DEG mengi innihélt 105 gen sem voru marktækt bæld við 6 hpi við 83A:476. Í þessum undirhópi voru 37 gen einnig niðurstýrð í Mandelup við 48 HPI og 35 á sama tímapunkti í 22660 þýðinu, þar á meðal 19 DEG sem voru sameiginleg báðum arfgerðum. Engir DEG sem tengdust hugtakinu GO: 0015979 voru marktækt virkjaðir í neinum samsetningum (lína x tími).
Tjáningarmynstur helstu þátta hugtaksins í líffræðilega ferlinu „GO:0015979 Ljóstillífun“ voru afhjúpuð. Log2 kvarðinn táknar log2 gildi (breytingar á margföldun) milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn úr lúpínuökrum, Wizhenica, Póllandi, 1999) og samanburðarplantna (sýndarsáðrar) á sama tímapunkti. Eftirfarandi þröngblaða lúpínulínur voru greindar: 83A:476 (ónæmir, ber arfhreina Lanr1 erfðavísinn), Boregine (ónæmir, erfðafræðilegur bakgrunnur óþekktur), Mandelup (miðlungsónæmir, ber arfhreina AnMan erfðavísinn) og þýði 22660 (næmir).
Byggt á niðurstöðum úr greiningu á mismunandi tjáningu og líklega þátttöku í varnarviðbrögðum gegn sjúkdómsvaldandi sveppum, var þetta safn sjö gena valið til magngreiningar á tjáningarferlum með rauntíma PCR (viðbótartafla S9).
Hugsanlegt prótíngen TanjilG_10657 var marktækt örvað í öllum rannsakuðum línum og tímapunktum samanborið við samanburðarplöntur (eftirhermuplöntur) (viðbótartöflur S10, S11). Að auki sýndi tjáningarferill TanjilG_10657 vaxandi tilhneigingu eftir því sem tilraunin stóð yfir fyrir allar línur. Þýði 22660 sýndi mesta næmi TanjilG_10657 fyrir bólusetningu með 114-faldri virkjun og hæsta hlutfallslega tjáningarstig (4,4 ± 0,4) við 24 HPI (Mynd 6a). PR10 LlR18A prótíngenið TanjilG_27015 sýndi einnig virkjun í öllum línum og tímapunktum, með tölfræðilegri marktækni á flestum gagnapunktum (Mynd 6b). Líkt og TanjilG_10657 sást hæsta hlutfallslega tjáningarstig TanjilG_27015 í bólusetningarþýðinu með 22660 við 24 HPI (19,5 ± 2,4). Genið TanjilG_04706 fyrir sýruendókítínasa sýndi marktæka aukningu í öllum línum og á öllum tímapunktum nema í Boregine 6 hpi (Mynd 6c). Það var örvað mjög á fyrsta tímapunktinum (6 HPI) við 83A:476 (10,5 sinnum) og jókst lítillega í öðrum línum (6,6-7,5 sinnum). Meðan á tilrauninni stóð hélst tjáning TanjilG_04706 á svipuðu stigi í 83A:476 og Boregine, en í Mandelup og þýði 22660 jókst hún marktækt og náði tiltölulega háum gildum (5,9 ± 1,5 og 6,2 ± 1,5, talið í sömu röð). Genið TanjilG_23384 fyrir endóglúkan-1,3-β-glúkósídasa sýndi mikla virkjun á fyrstu tveimur tímapunktunum (6 og 12 hpi) í öllum línum nema þýði 22660 (Mynd 6d). Hæstu hlutfallslegu tjáningarstig TanjilG_23384 sáust á öðrum tímapunkti (12 hpi) í Mandelup (2,7 ± 0,3) og 83A:476 (1,5 ± 0,1). Við 24 HPI var tjáning TanjilG_23384 tiltölulega lág í öllum rannsakuðum línum (frá 0,04 ± 0,009 til 0,44 ± 0,12).
Tjáningarferlar valinna gena (ag) sýndir með megindlegri PCR. Tölurnar 6, 12 og 24 tákna klukkustundir eftir bólusetningu. Genin LanDExH7 og LanTUB6 voru notuð til staðlunar og LanTUB6 var notað til kvörðunar milli raða. Villustikur tákna staðalfrávik byggt á þremur líffræðilegum endurtekningum, sem hver um sig er meðaltal þriggja tæknilegra endurtekninga. Tölfræðileg marktækni mismunar á tjáningarstigum milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn árið 1999 úr lúpínurækt í Wierzenica í Póllandi) og samanburðarplantna (eftirlíkingarsáðrar) er merkt fyrir ofan gagnapunkta (*P gildi < 0,05, **P gildi ≤ 0,01, ***P gildi ≤ 0,001). Tölfræðileg marktækni mismunar á tjáningarstigum milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn árið 1999 úr lúpínurækt í Wierzenica í Póllandi) og samanburðarplantna (eftirlíkingarsáðrar) er merkt fyrir ofan gagnapunkta (*P gildi < 0,05, **P gildi ≤ 0,01, ***P gildi ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08 9 пгв Col-08. поля люпина в Верженице, Польша) og контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена надих точке (* 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Tölfræðilega marktækur munur á tjáningarstigi milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn árið 1999 úr lúpínuakri í Wierzhenice, Póllandi) og samanburðarplantna (sýndarsáðrar) er tilgreindur fyrir ofan gagnapunktana (*P gildi < 0,05, **P-gildi ≤ 0,01, ***P-gildi ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在繰（宰在繰（ 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤秉 缈水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤01) 0. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полусч люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмеченды (* snerta P < 0,05, ** P-símtal ≤ 0,01, ***P-gildi ≤ 0,001). Tölfræðilega marktækur munur á tjáningarstigi milli sáðra plantna (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn úr lúpínuökrum í Verzhenice, Póllandi, árið 1999) og samanburðarplantna (sýndarsáðrar) er tilgreindur fyrir ofan gagnapunktana (*P gildi < 0,05, **P-gildi ≤ 0,01, ***P-gildi ≤ 0,001).NLL-línurnar sem greindar voru voru: 83A:476 (ónæmar, bera arfhreina Lanr1-genið), Mandelup (miðlungsónæmar, bera arfhreina AnMan-genið), Boregine (ónæmar, óþekktur erfðafræðilegur bakgrunnur) og þýði 22660 (næmir).
Genið TanjilG_05042, sem er tilgreint í Lanr1 geni, sýndi greinilega frábrugðið tjáningarmynstri frá þeim sniðum sem fengust úr RNA-raðgreiningarrannsóknum (Mynd 6e). Marktæk virkjun þessa gens sást í Mandelup og 22660 þýðinu (allt að 39,7 og 11,7 sinnum, talið í sömu röð), sem leiddi til tiltölulega hárrar tjáningar (allt að 1,4 ± 0,14 og 7,2 ± 1,3, talið í sömu röð). 83A:476 leiddi einnig í ljós nokkra uppstýringu á TanjilG_05042 geninu (allt að 3,8-falt), en hlutfallsleg tjáningarstig sem náðust (0,044 ± 0,002) voru meira en 30-falt lægri en þau sem sáust í Mandelup og 22660 þýðinu. Greining með qPCR sýndi marktækan mun á tjáningarstigi milli arfgerða í bólusettum afbrigðum (viðmiðunarafbrigðum), sem náði 58-faldri mun á milli þýða 22660 og 83A:476, sem og á milli þýða 22660 og 22660. Tvöfaldur munur náðist á milli Boregine og Mandalup.
Genið sem hugsanlegt er í AnMan geninu, TanjilG_12861, virkjaðist við bólusetningu í 83A:476 og Mandelup, var hlutlaust í 22660 þýðinu og minnkaði í Boregine (Mynd 6f). Hlutfallsleg tjáning TanjilG_12861 gensins var hæst í bólusettu 83A:476 (0,14 ± 0,01). 17,4 kDa I. flokks hitasjokkpróteingenið TanjilG_05080 HSP17.4 sýndi lægri hlutfallslega tjáningu í öllum rannsökuðum stofnum og tímapunktum (Mynd 6g). Hæsta gildið sást við 24 HPI í 22660 þýðinu (0,14 ± 0,02, áttaföld aukning í svörun við bólusetningu).
Samanburður á genatjáningarferlum (mynd 7) leiddi í ljós mikla fylgni milli TanjilG_10657 og fjögurra annarra gena: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) og TanjilG_04706 (r = 0,79). Slíkar niðurstöður gætu bent til samstjórnunar þessara gena við varnarviðbrögð. Genin TanjilG_12861 og TanjilG_23384 sýndu mismunandi tjáningarferla með lægri Pearson fylgnistuðlum (frá 0,08 til 0,43 og -0,19 til 0,28, talið í sömu röð) samanborið við önnur gen.
Tengsl milli genatjáningarprófíla voru greind með megindlegri PCR. Eftirfarandi þröngblaða lúpínulínur voru greindar: 83A:476 (ónæmir, bera arfhreina Lanr1 erfðavísinn), Mandelup (miðlungsónæmir, bera arfhreina AnMan erfðavísinn), Boregine (ónæmir, erfðafræðilegur bakgrunnur óþekktur) og Þjóð 22660 (næmir). Þrír tímapunktar voru reiknaðir (6, 12 og 24 klukkustundum eftir ígræðslu), þar á meðal ígræðslur (Colletotrichum lupini, stofn Col-08, fenginn úr lúpínuökrum í Wierzhenice, Póllandi, árið 1999) og samanburðarplöntur (sýndarígræðslur). Kvarðinn sýnir gildi Pearson fylgnistuðulsins.
Byggt á gögnum sem fengust við 6 hestöfl á tommu, var WGCNA framkvæmt á 9981 DEG sem greint var með því að bera saman sýktar plöntur og samanburðarplöntur til að einbeita sér að snemmbúnum varnarviðbrögðum (viðbótartafla S12). Tuttugu og tvær genaeiningar (klasar) fundust með fylgni (jákvæð eða neikvæð) tjáningarferlum milli arfgerða og tilraunaafbrigða. Að meðaltali var genatjáningarstig lækkandi í röðinni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Stofn 22660 (í báðum afbrigðum var þessi tilhneiging þó sterkari í samanburðarplöntum). Að meðaltali var genatjáningarstig lækkandi í röðinni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Stofn 22660 (í báðum afbrigðum var þessi tilhneiging þó sterkari í samanburðarplöntum). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Mannfjöldi 22660 (в обоих вариантах, вариантах тенденция была сильнее у контрольных растений). Að meðaltali minnkaði genatjáning í röðinni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Stofn 22660 (í báðum afbrigðum var þessi tilhneiging þó sterkari í samanburðarplöntum).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Íbúafjöldi 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> íbúa 22660 的 顺序 下降 （， ， 県 平均在 在 植物 中 更）。。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Mannfjöldi 22660 (однако в обоианэтахтах была сильнее у контрольных растений). Að meðaltali minnkaði genatjáning í seríunni 83A:476 > Mandelup > Boregine > Stofn 22660 (þó var þessi þróun sterkari í samanburðarplöntunum í báðum afbrigðum).Bólusetning leiddi til uppstýringar á genatjáningu, sérstaklega í einingum 18, 19, 14, 6 og 1 (í lækkandi röð eftir áhrifum), neikvæðrar stýringar (t.d. einingar 9 og 20) eða með hlutlausum áhrifum (t.d. einingar 11, 22, 8 og 13). Greining á GO-liðum (viðbótartafla S13) leiddi í ljós „GO: 0006952 verndandi svör“ fyrir bólusetta einingu (18) með hámarksvirkjun, þar á meðal gen sem greind voru með qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015), sem og margar af bólusettu einingunum sem bældu ljóstillífunina mest (9). Þéttiefni einingar 18 (mynd 8) var greint sem TanjilG_26536 genið sem kóðar fyrir PR-10-líku LlR18B próteininu, og þéttiefni einingar 9 var greint sem TanjilG_28955 genið sem kóðar fyrir photosystem II PsbQ próteininu. Mögulegt antraknósaónæmisgen, Lanr1, TanjilG_05042, fannst í einingu 22 (mynd 9) og tengist hugtökunum „GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes“ og „GO:0006355 Nscriptional regulation, DNA templating“ sem ber TanjilG_01212 miðstöðina. Genið kóðar fyrir hitastreitu umritunarþátt A-4a (HSFA4a).
Vegin netgreining á genasamræmi í einingum með ofurfjölbreyttum líffræðilegum ferlishugtökum „GO: 0006952 Defense responses“. Límingin var einfölduð til að varpa ljósi á fjögur genin sem greind voru með qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015).
Vegin netgreining á samhliða tjáningu gena í einingu með ofurfjölbreyttan líffræðilegan ferlisheiti „GO: 0006355: Umritunarstjórnun, DNA sniðmát“ og ber mögulegan antraknósaónæmisgen, Lanr1 TanjilG_05042. Límingin var einfölduð til að einangra TanjilG_05042 genið og miðlæga TanjilG_01212 genið.
Skimun fyrir antraknósaónæmi í Ástralíu sýndi að flestar afbrigðin sem komu út snemma voru næm; Kalya, Coromup og Mandelup hafa verið lýst sem miðlungsónæmum, en Wonga, Tanjil og 83A:476 hafa verið lýst sem mjög ónæmir26,27,31. höfðu sama ónæmisgenið, nefnt Lanr1, og Coromup og Mandelup höfðu annað gen, nefnt AnMan10,26,39, en Kalya bar fram annað gen, Lanr2. Skimun fyrir antraknósaónæmi í Þýskalandi leiddi til þess að ónæma línan Bo7212 með öðru geni en Lanr1, nefnt LanrBo36, fannst.
Rannsókn okkar leiddi í ljós mjög lága tíðni (um 6%) Lanr1-gensins í prófuðu kímplasmanum. Þessi athugun er í samræmi við niðurstöður skimunar á austur-evrópskum kímplasma með því að nota Anseq3 og Anseq4 merkin, sem sýndu að Lanr1-genið er aðeins til staðar í tveimur hvítrússneskum línum. Þetta bendir til þess að Lanr1-genið sé ekki enn mikið notað í staðbundnum ræktunaráætlunum, ólíkt Ástralíu, þar sem það er eitt af lykilgenunum fyrir merkjastýrða ræktun. Þetta gæti stafað af lægra stigi ónæmis sem Lanr1-genið veitir við evrópskar vettvangsaðstæður samanborið við áströlsku skýrsluna. Að auki hafa rannsóknir á antraknósa á svæðum með mikla úrkomu í Ástralíu sýnt að ónæmissvörun miðluð af Lanr1-geninu gæti ekki verið áhrifarík í veðurskilyrðum sem stuðla að vexti og hraðri þróun sýkilsins19,42. Reyndar, í þessari rannsókn, sáust einnig sum einkenni antraknósa í arfgerðum sem bera Lanr1-genið, sem bendir til þess að ónæmi geti horfið við bestu aðstæður fyrir þróun C. lupini. Að auki eru falskt jákvæðar túlkanir á nærveru Anseq3 og Anseq4 merkjanna, sem eru um það bil 1 cM frá Lanr1 geni, mögulegar 28,30,43.
Rannsókn okkar sýndi að 83A:476, sem bar Lanr1 erfðamengið, svaraði C. lupini bólusetningu með stórfelldri endurforritun umritunar á fyrsta greinda tímapunktinum (6 klukkustundir á klukkustund), en í Mandelup, sem bar AnMan erfðamengið, sáust umritunarviðbrögð mun síðar (frá 24 til 48 klukkustundir á klukkustund). Þessir tímabundnu breytingar á varnarviðbrögðum tengjast mismunandi sjúkdómseinkennum, sem undirstrikar mikilvægi snemmbúinnar greiningar sýkla til að bregðast vel við mótstöðu. Til að smita plöntuvef verða miltisbrandsgró að fara í gegnum nokkur þroskastig á yfirborði hýsilsins, þar á meðal spírun, frumuskiptingu og myndun frumuhimnu (appressorium). Viðhengi er sýkingarbygging sem festist við yfirborð hýsilsins og auðveldar innkomu inn í vefi hýsilsins. Þannig sýndu gró af C. gloeosporioides í baunaþykkni fyrstu kjarnaskiptingu eftir 75-90 mínútna ræktun, myndun kímrörs eftir 90-120 mínútur og bælingu eftir 4 klukkustundir. Mangó af tegundinni C. gloeosporioides sýndi meira en 40% spírun í göngþráðum eftir 3 klukkustunda ræktun og um 20% myndun bælandi frumna eftir 4 klukkustundir. CAP20 genið í C. gloeosporioides, sem tengist eiturvirkni, sýndi umritunarvirkni í þekjumyndandi göngþráðum eftir 3,5 klukkustunda ræktun í avókadóvaxi með mikilli styrk CAP20 próteins eftir 4 klst. og 46 mínútur. Á sama hátt var virkni melanínmyndunargena í C. trifolii örvuð við 2 klukkustunda ræktun og síðan myndun appressorium eftir 1 klukkustund. Rannsóknir á laufvef hafa sýnt að jarðarber sem eru sáð með C. acutatum hafa fyrstu bælingu við 8 klukkustundir á dag, en tómatar sem eru sáð með C. coccodes hafa fyrstu bælingu við 4 klukkustundir á dag48,49, sem er að mestu leyti í samræmi við tímaramma sýkingarferlis Colletotrichum spp. Hröð varnarviðbrögð við 83A:476 benda til þátttöku plantnaónæmis og áhrifavaldandi ónæmisgena (ETI) í þessari línu, en seinkuð viðbrögð Mandelup styðja tilgátuna um örtengda sameindamynstur-virkjaða ónæmiskerfi (MTI) 50. Snemmbúin viðbrögð við 83A: 476 og Mandelup. Hluti af skörun milli upp- eða niðurstýrðra gena í seinkuðu viðbrögðum styður einnig þessa hugmynd, þar sem ETI er oft talið vera hraðað og aukið MTI viðbrögð sem endar með forrituðum frumudauða á sýkingarstað, þekkt sem bráðaofnæmislost 51,52.
Flest genin sem rekja má til offramsetts hugtaksins Gene Ontology GO:0006952 „Defense Response“ eru 11 samsvarandi prótein streituvaldandi föstuboðs 22 (svipað og SAM22) og sjö helstu latex próteinlíkra próteina (MLP). -lík prótein 31, 34, 43 og 423 sýndu raðlíkindi. SAM22-lík gen sýndu marktæka virkjun sem varði lengur og sýndi aukið magn antraknósaónæmis (83A:476 og Boregine). Hins vegar voru MLP-lík gen aðeins niðurstýrð í línum sem báru hugsanlega ónæmisallel (83A:476/Lanr1 við 6 hpi og Mandelup/AnMan við 24 hpi). Það skal tekið fram að allir greindir SAM22-líkir samsvarandi gen eiga uppruna sinn í genaklasa sem spannar um það bil 105 kb, en MLP-lík gen eiga uppruna sinn í aðskildum svæðum erfðamengisins. Samræmd virkjun slíkra SAM22-líkra gena fannst einnig í fyrri rannsókn okkar á ónæmi NLL gegn bólusetningu Diaporthetoxica, sem bendir til þess að þau taki þátt í láréttum þáttum varnarviðbragða. Þessi niðurstaða er einnig studd af skýrslum um jákvæða svörun SAM22-líkra gena við meiðslum eða meðferð með salisýlsýru, sveppaörvum eða vetnisperoxíði.
Sýnt hefur verið fram á að MLP-lík gen bregðast við ýmsum lífrænum og lífrænum álagi, þar á meðal bakteríu-, veiru- og sjúkdómsvaldandi sveppasýkingum í mörgum plöntutegundum55. Viðbrögð við ákveðnum milliverkunum plantna og sjúkdómsvalda voru allt frá því að aukast verulega (þ.e. við sýkingu af völdum Verticillium dahliae í bómull) til að minnka verulega (þ.e. eftir sýkingu af eplatré með Alternaria spp.)56,57. Marktæk lækkun á MLP-líku 423 geninu hefur sést við vörn avókadó gegn F. niger sýkingu og við sýkingu af eplatrénu Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola og Alternaria alternata eru sýklaeðli epla58,59. Að auki höfðu eplakallar sem ofurtjá MLP-líkt 423 genið lægri tjáningu á ónæmistengdum genum og voru viðkvæmari fyrir sveppasýkingum59. Eftir Fusarium oxysporum f var MLP-líkt 423 genið einnig bælt niður í ónæmum baunakímplasma. cn. Baunasýking 60.
Aðrir meðlimir PR-10 fjölskyldunnar sem greindir voru í RNA-seq rannsókn okkar voru genin LlR18A og LlR18B sem svörun við uppstýringu, sem og uppstýrt (1 gen) eða niðurstýrt (3 gen) gen fyrir lípíðflutningspróteinið DIR1. Að auki leggur WGCNA áherslu á LlR18B genið sem miðstöð í þessari einingu, sem er mjög næmt fyrir bólusetningu og ber nokkur verndandi svörunargen. LlR18A og LlR18B genin voru örvuð í gulum lúpínulaufum sem svörun við sjúkdómsvaldandi bakteríum, sem og í NLL stilkum eftir bólusetningu með D. toxica, en hrísgrjónahliðstæða þessara gena, RSOsPR10, var hratt örvað af sveppasýkingu sem líklega tengist jasmónsýruboðleiðinni53,61, 62. DIR1 genið kóðar fyrir ósértækum lípíðflutningspróteinum sem eru nauðsynleg fyrir upphaf kerfisbundinnar áunninnar ónæmis (SAR). Með þróun verndandi viðbragða er DIR1 próteinið flutt frá sýkingarstað í gegnum floemið til að örva SAR í fjarlægum líffærum. Athyglisvert er að TanjilG_02313 DIR1 genið var marktækt örvað í fyrsta skipti í línum 84A:476 og þýði 22660, en antraknósaónæmi þróaðist aðeins með góðum árangri í línu 84A:476. Þetta gæti bent til einhverrar undirvirkni DIR1 gensins í NLL, þar sem hinir þrír samsvarandi genarnir svöruðu aðeins ígræðslu í línunni 83A:476 við 6 hpi, og þessi svörun beinist niður á við.
Í rannsókn okkar voru algengustu þættirnir sem samsvara líffræðilega ferlinu sem kallast „GO:0055114 Redox ferli“ cýtókróm P450 prótein, peroxídasi, línólsýru 9S-/13S-lípoxýgenasi og 1-amínócyclopropan-1-karboxýlsýruoxídasi. Að auki skilgreinir WGCNA okkar HSFA4a hliðstæðuna sem miðstöð sem ber einingar eins og Lanr1 ónæmisgenið TanjilG_05042. HSFA4a er þáttur í redox-háðri stjórnun kjarnaumritunar í plöntum.
Cýtókróm P450 prótein eru oxídóredúktasar sem hvata NADPH og/eða O2-háð hýdroxýleringarviðbrögð í frum- og aukaefnaskiptum, þar á meðal efnaskiptum útlægra efna, svo og hormóna, fitusýra, steróla, frumuveggjaþátta, líffjölliða og lífefnamyndunar verndandi efnasambanda 69. Í rannsókn okkar minnkaði breytileiki í virkni cýtókróm P450 plantna úr -10,6 log2 (föld breyting) í 5,7 vegna mikils fjölda breyttra samsvarandi gena (37) og mismunandi svörunarmynstra milli tiltekinna gena, sem endurspeglar uppsveiflu. Að nota eingöngu RNA-raðgreiningargögn til að skýra hugsanlega líffræðilega virkni NLL-gena í svo stórri prótein-yfirfjölskyldu væri mjög vangaveltur. Hins vegar er vert að taka fram að sum cýtókróm P450 gen tengjast aukinni mótstöðu gegn sjúkdómsvaldandi sveppum eða bakteríum, þar á meðal framlagi til ofnæmisviðbragða 69,70,71.
Peroxidasar af III. flokki eru fjölnota plöntuensím sem taka þátt í fjölbreyttum efnaskiptaferlum við vöxt og þroska plantna, sem og í viðbrögðum við umhverfisálagi eins og seltu, þurrki, mikilli ljósstyrk og árásum sýkla72. Peroxidasar taka þátt í samspili nokkurra plantnategunda við Anthracis, þar á meðal Stylosanthes humilis og C. gloeosporioides, Lens culinaris og C. truncatum, Phaseolus vulgaris og C. lindemuthianum, Cucumis sativus og C. lagenarium73,74,75,76. Viðbrögðin eru mjög hröð, stundum jafnvel við 4 HPI, áður en sveppurinn kemst inn í plöntuvefinn73. Peroxidasagenið brást einnig við ígræðslu D. toxica NLL. Auk dæmigerðra hlutverka sinna til að stjórna oxunarsprengingu eða útrýma oxunarálagi, geta peroxidasar truflað vöxt sýkla með því að skapa líkamlegar hindranir byggðar á styrkingu frumuveggja við lignification, undireiningar- eða þvertengingu tiltekinna efnasambanda. Þessa virkni má rekja in silico til TanjilG_03329 gensins sem kóðar fyrir hugsanlegum lignínmyndandi anjónperoxidasa sem jókst verulega í rannsókn okkar í 83A:476 ónæmu línunni við 6 HPI, en ekki í öðrum stofnum og tímapunktum sem svöruðu ekki.
9S-/13S-lípoxýgenasi línólsýru er fyrsta skrefið í oxunarferli lípíðmyndunar78. Afurðir þessarar ferils gegna margvíslegum hlutverkum í vörn plantna, þar á meðal styrkingu frumuveggja með myndun kallósa- og pektínútfellinga og stjórnun oxunarálags með framleiðslu á hvarfgjörnum súrefnistegundum79,80,81,82,83. Í þessari rannsókn var tjáning línólsýru 9S-/13S-lípoxýgenasa breytt í öllum stofnum, en í viðkvæma hópnum 22660 ríkti uppstýring á mismunandi tímapunktum, en í stofnum sem bera ónæma Lanr1 og AnMan erfðamengið undirstrikar það fjölbreytni oxýlipínlagsins í verndandi miltisbrandsviðbrögðum milli þessara erfðagerða.
Hliðstæða 1-amínócyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) ensímið var marktækt uppstýrt (9 gen) eða niðurstýrt (2 gen) þegar það var bólusett með lúpínu. Með tveimur undantekningum áttu öll þessi svör sér stað við 6 hp. við 83A:476. Ensímhvörfin sem miðluð eru af ACO próteinum eru hraðatakmarkandi skref í etýlenframleiðslu og eru því mjög stjórnuð84. Etýlen er plöntuhormón sem gegnir fjölbreyttum hlutverkum í að stjórna þroska plantna og svörun við lífrænum og lífrænum streituskilyrðum. Örvun ACO umritunar og virkjun etýlen merkjaleiðarinnar taka þátt í að auka viðnám hrísgrjóna gegn hemibiotrophic sveppnum oryzae oryzae með því að stjórna framleiðslu á hvarfgjörnum súrefnistegundum og plöntualexínum. Mjög svipað sýkingarferli í laufblöðum sem fannst hjá M. oryzae og C. lupini88,89, á bakgrunni verulegrar uppstýringar á ACO-samsvörun í 83A:476 línunni sem greint var frá í þessari rannsókn, færir möguleikann á að veita ónæmi gegn NLL antracnósa etýleni, sem er miðlægt boðleið í sameindaferlum.
Í þessari rannsókn sást stórfelld bæling á mörgum genum sem tengjast ljóstillífun við 6 hpi í 83A:476 og við 48 hpi í Mandeloop og 22660 þýðinu. Umfang og framgangur þessara breytinga er í réttu hlutfalli við magn þeirra. Ónæmi gegn antraknósa sást í þessari tilraun. Nýlega hefur verið greint frá sterkri og snemmbúinni bælingu á umritum sem tengjast ljóstillífun í nokkrum líkönum af víxlverkunum plantna og sýkla, þar á meðal sýklabaktería og sveppa. Hraði (frá 2 HPI í sumum víxlverkunum) og alhliða bæling á genum sem tengjast ljóstillífun sem svar við sýkingu getur kallað fram ónæmi plantna byggt á dreifingu hvarfgjarnra súrefnistegunda og víxlverkun þeirra við salisýlsýruferilinn til að miðla ofnæmisviðbrögðum 90,94.
Að lokum má segja að varnarviðbragðsferlar sem lagðir eru til fyrir ónæmustu ættkvíslina (83A:476) feli í sér hraðvirka greiningu sýkla af R geninu (líklega TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) og ofnæmisviðbrögð með salisýlsýru og etýlen merkjagjöf, og síðan stofnun langdrægrar SAR. Verkunin er studd af DIR-1 próteininu. Það skal tekið fram að lífræktartímabilið fyrir C. lupini sýkingu er mjög stutt (u.þ.b. 2 dagar), og síðan drepvöxtur95. Skiptið milli þessara stiga gæti tengst drepi og tjáningu etýlen-örvandi próteina sem virka sem kveikjur fyrir ofnæmisviðbrögð í hýsilplöntum. Þess vegna er tímaramminn fyrir árangursríka fangst C. lupini á lífræktarstigi mjög þröngur. Endurforritun gena sem tengjast oxunar-afoxun og ljóstillífun sem sést í 83A:476 við 6 hpi er í samræmi við framgang sveppaþráða og boðar þróun farsællar verndarviðbragða á lífræktarstigi. Umritunarviðbrögð Mandelup og 22660 þýðisins gætu verið of sein til að fanga sveppinn áður en skipt er yfir í drepvöxt, en Mandelup gæti þó verið áhrifaríkara en 22660 þýðið vegna þess að tiltölulega hröð stjórnun PR-10 próteinsins stuðlar að láréttri mótstöðu.
Ónæmi gegn antraknósa (ETI), sem er knúið áfram af R-geninu, virðist vera algengur verkunarháttur fyrir baunaónæmi gegn antraknósa. Þannig er ónæmi gegn antraknósa veitt af RCT1 geninu, sem er meðlimur í R-genaflokknum í TIR-NBS-LRR97 plöntunni, í belgjurtinni Medicago truncatula. Þetta gen veitir einnig breiðvirkt antraknósaónæmi í lúpínu þegar það er flutt í viðkvæmar plöntur. Í bauninni (P. vulgaris) hafa meira en tveir tugir antraknósaónæmisgena verið greindir til þessa. Sum þessara gena finnast á svæðum sem skortir öll R-gen, en mörg önnur eru staðsett á jaðri litninga sem bera NBS-LRR genaklasann, þar á meðal TIR-NBS-LRRs99. Rannsóknin á erfðamengi SSR staðfesti einnig tengsl NBS-LRR gensins við antraknósaónæmi í bauninni. R-genið fannst einnig á erfðamengissvæðinu sem ber aðal antraknósaónæmisstaðinn í hvítum lúpínu 101.
Rannsókn okkar sýnir að tafarlaus viðnámsviðbrögð, sem virkjast snemma í sýkingu plantna (helst eigi síðar en 12 klukkustundir á viku), vernda á áhrifaríkan hátt mjóblaða lúpínu gegn miltisbrandi af völdum sjúkdómsvaldandi sveppsins Collelotrichum lupini. Með því að nota háafköstaröðun sýndum við fram á mismunandi tjáningarmynstur miltisbrandsónæmisgena í NLL plöntum sem miðluð eru af Lanr1 og AnMan ónæmisgenunum. Árangursrík vörn felur í sér vandlega hönnun genin fyrir prótein sem taka þátt í oxunar-afoxun, ljóstillífun og sjúkdómsmyndun innan nokkurra klukkustunda frá fyrstu snertingu plantunnar við sýkil. Svipaðar verndarviðbrögð, en seinkaðar í tíma, eru mun minna áhrifarík við að vernda plöntur gegn sjúkdómum. Miltisbrandsónæmi miðlað af Lanr1 geninu líkist dæmigerðri hraðri svörun R gensins (áhrifavaldandi ónæmi), en AnMan genið veitir líklega lárétt svar (ónæmi sem kveikt er á af örverutengdu sameindamynstri), sem veitir miðlungs sjálfbærni.
Þær 215 NLL línur sem notaðar voru til að skima fyrir antraknósa merkjum samanstóðu af 74 ræktunarafbrigðum, 60 línum sem fengust með krossun eða ræktun, 5 stökkbreyttum tegundum og 76 villtum eða upprunalegum kímplasmum. Línurnar komu frá 17 löndum, aðallega frá Póllandi (58), Spáni (47), Þýskalandi (27), Ástralíu (26), Rússlandi (19), Hvíta-Rússlandi (7), Ítalíu (5) og öðrum línum frá 10 löndum. Safnið inniheldur einnig viðmiðunarónæmar línur: 83A:476, Tanjil, Wonga sem ber Lanr1 samsætuna og Mandelup sem ber AnMan samsætuna. Línurnar voru fengnar úr evrópska erfðagagnagrunninum fyrir lúpínu sem Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Póllandi heldur úti (viðbótartafla S1).
Plönturnar voru ræktaðar við stýrðar aðstæður (ljóstími 16 klukkustundir, hitastig 25°C á daginn og 18°C ​​á nóttunni). Tvær líffræðilegar endurtekningar voru greindar. DNA var einangrað úr þriggja vikna gömlum laufblöðum með DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) samkvæmt aðferðafræðinni. Gæði og styrkur einangraða DNA-sins var metið með litrófsmælingum (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). AnManM1 merkið sem markar antraknósaónæmisgenið AnMan (fengið úr cv. Mandelup) og merkin Anseq3 og Anseq4 sem liggja að geninu Lanr1 (fengið úr cv. Tanjil) voru greind11,26,28. Arfhreinir einstaklingar fyrir ónæma erfðamengið voru metnir sem „1“, næmir einstaklingar – sem „0“ og arfhreinir einstaklingar – sem 0,5.
Byggt á niðurstöðum skimunar fyrir merkjunum AnManM1, AnSeq3 og AnSeq4 og framboði á fræjum fyrir loka eftirfylgnitilraunir, voru 50 NLL línur valdar til svipgerðargreiningar á antraknósaþoli. Greiningin var framkvæmd í tvíriti í tölvustýrðu gróðurhúsi með 14 klukkustunda ljóstímabili við hitastig á bilinu 22°C á daginn og 19°C á nóttunni. Fræin eru klóruð (fræhjúpurinn á gagnstæðri hlið fósturvísisins er skorinn af með beittum hníf) fyrir sáningu til að koma í veg fyrir að fræin leggist í dvala vegna þess að fræhjúpurinn er of harður og til að tryggja jafna spírun. Plönturnar voru ræktaðar í pottum (11 × 11 × 21 cm) með dauðhreinsuðum jarðvegi (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsjá, Pólland). Ígræðsla fór fram með Colletotrichum lupini Col-08 stofni, ræktað árið 1999 úr stilkum mjóblaða lúpínuplantna sem ræktaðar voru á akri í Verzhenitsa, Stór-Póllandi (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ A). Veldu svæði. Einangruðu stofnarnir voru ræktaðir í SNA ræktunarmiðli við 20°C undir svörtu ljósi í 21 dag til að örva grómyndun. Fjórum vikum eftir sáningu, þegar plönturnar höfðu náð 4-6 blaða stigi, var ígræðsla framkvæmd með því að úða með sviflausn af gróblöðrum í styrk 0,5 x 106 gróblöðum á ml. Eftir ígræðslu voru plönturnar geymdar í myrkri í 24 klukkustundir við um 98% rakastig og 25°C hitastig til að auðvelda spírun gróblaðanna og sýkingarferlið. Plönturnar voru síðan ræktaðar undir 14 klukkustunda ljóstímabili við 22°C á dag/19°C á nóttunni og 70% rakastig. Sjúkdómseinkunn var gerð 22 dögum eftir ígræðslu og var á bilinu 0 (ónæmir) til 9 (mjög viðkvæmir) eftir því hvort drepsóttir voru til staðar á stilkum og laufblöðum. Að auki, eftir einkunnagjöf, var þyngd plantnanna mæld. Tengsl milli arfgerða merkja og sjúkdómsgerða voru reiknuð sem punkta tveggja raða fylgni (fjarvera arfbera merkja í mengi lína til greiningar á antraknósaónæmisgerð).