Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Þörf er á áreiðanlegu in vitro kerfi sem getur nákvæmlega endurskapað lífeðlisfræðilegt umhverfi hjartans fyrir lyfjaprófanir. Takmarkað framboð á vefjaræktarkerfum fyrir hjartavöðva úr mönnum hefur leitt til ónákvæmra túlkana á áhrifum lyfja á hjartað. Hér höfum við þróað vefjaræktarlíkan fyrir hjarta (CTCM) sem örvar hjartasneiðar með rafsegulfræðilegum hætti og gengst undir lífeðlisfræðilega teygju á slagbils- og þanbilsstigum hjartahringrásarinnar. Eftir 12 daga ræktun bætti þessi aðferð að hluta til lífvænleika hjartasneiðanna, en varðveitti ekki að fullu byggingarheild þeirra. Þess vegna, eftir skimun smásameinda, komumst við að því að viðbót 100 nM tríjoðtýróníns (T3) og 1 μM dexametasóns (Dex) við miðilinn okkar viðhélt örbyggingu sneiðanna í 12 daga. Í samsetningu við T3/Dex meðferð viðhélt CTCM kerfið umritunarferlum, lífvænleika, efnaskiptavirkni og byggingarheild á sama stigi og ferskur hjartavefur í 12 daga. Að auki veldur óhófleg teygja á hjartavef í ræktun þykknun hjartaboða, sem veitir vísbendingar um getu CTCM til að líkja eftir þykknunarástandi sem orsakast af hjartateygju. Að lokum má segja að CTCM geti líkt eftir lífeðlisfræði og sjúkdómsfræði hjartans í ræktun yfir langan tíma, sem gerir kleift að framkvæma áreiðanlega lyfjaskimun.
Áður en klínískar rannsóknir hefjast þarf áreiðanleg in vitro kerfi sem geta endurskapað nákvæmlega lífeðlisfræðilegt umhverfi mannshjartans. Slík kerfi ættu að líkja eftir breyttum vélrænum teygjum, hjartslætti og rafgreiningareiginleikum. Dýralíkön eru almennt notuð sem skimunarvettvangur fyrir hjartalífeðlisfræði en hafa takmarkaða áreiðanleika við að endurspegla áhrif lyfja á mannshjartað1,2. Í lokin er hugsjón hjartavefsræktunartilraunalíkanið (CTCM) mjög næmt og sértækt fyrir ýmsar meðferðar- og lyfjafræðilegar íhlutanir og endurskapar nákvæmlega lífeðlisfræði og sjúkdómsvaldandi þætti mannshjartans3. Fjarvera slíks kerfis takmarkar uppgötvun nýrra meðferða við hjartabilun4,5 og hefur leitt til þess að eituráhrif lyfja á hjarta eru aðalástæða fyrir því að hætta markaði6.
Á síðasta áratug hafa átta lyf sem ekki eru hjarta- og æðasjúkdómar verið tekin úr klínískri notkun vegna þess að þau valda lengingu á QT-bili sem leiðir til sleglatruflana og skyndidauða7. Því er vaxandi þörf fyrir áreiðanlegar forklínískar skimunaraðferðir til að meta virkni og eituráhrif hjarta- og æðakerfis. Nýleg notkun á hjartavöðvafrumnum, sem eru framleiddar af mönnum og unnin úr fjölhæfum stofnfrumum, í lyfjaskimun og eituráhrifaprófum veitir að hluta til lausn á þessu vandamáli. Hins vegar eru óþroskaður eðli hiPS-CM og skortur á fjölfrumuflækjustigi hjartavefs helstu takmarkanir þessarar aðferðar. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að hægt er að að hluta til að vinna bug á þessari takmörkun með því að nota hiPS-CM snemma til að mynda vetnisgel í hjartavef stuttu eftir að sjálfsprottnir samdrættir hefjast og auka smám saman raförvun með tímanum. Hins vegar skortir þessir hiPS-CM örvefir þroskaða raflífeðlisfræðilega og samdráttareiginleika fullorðinna hjartavöðva. Að auki hefur hjartavefur manna flóknari uppbyggingu, sem samanstendur af ólíkum frumugerðum, þar á meðal æðaþelsfrumum, taugafrumum og bandvefsfrumum, sem tengjast saman með sérstökum settum af utanfrumuefnispróteinum. Þessi ólíkleiki í stofnum annarra en hjartavöðvafrumna11,12,13 í hjarta fullorðinna spendýra er mikil hindrun við að líkja eftir hjartavef með því að nota einstakar frumugerðir. Þessar helstu takmarkanir undirstrika mikilvægi þess að þróa aðferðir til að rækta óskemmdan hjartavöðvavef við lífeðlisfræðilegar og sjúklegar aðstæður.
Ræktaðir þunnir (300 µm) sneiðar af mannshjarta hafa reynst vera efnileg fyrirmynd af óskemmdum hjartavöðva manna. Þessi aðferð veitir aðgang að fullkomnu þrívíddar fjölfrumukerfi svipað og hjartavefur manna. Hins vegar, fram til ársins 2019, var notkun ræktaðra hjartasneiða takmörkuð af stuttri (24 klst.) ræktunarlíftíma. Þetta er vegna fjölda þátta, þar á meðal skorts á eðlisfræðilegri-vélrænni teygju, loft-vökvaviðmóti og notkunar á einföldum miðlum sem styðja ekki þarfir hjartavefsins. Árið 2019 sýndu nokkrir rannsóknarhópar fram á að með því að fella vélræna þætti inn í hjartavefsræktarkerfi getur lengt ræktunarlíftíma, bætt tjáningu hjartans og líkt eftir sjúkdómsmyndum hjartans. Tvær glæsilegar rannsóknir 17 og 18 sýna að einása vélræn álag hefur jákvæð áhrif á hjartasvipgerð meðan á ræktun stendur. Hins vegar notuðu þessar rannsóknir ekki þrívíddar eðlisfræðilega-vélræna álag hjartahringrásarinnar, þar sem hjartasneiðarnar voru hlaðnar annað hvort með ísómetrískum togkrafti 17 eða línulegri auxótónískri álagi 18. Þessar aðferðir við vefjateygju leiddu til bælingar á mörgum hjartagenum eða ofurtjáningar gena sem tengjast óeðlilegum teygjuviðbrögðum. Athyglisvert er að Pitoulis o.fl. 19 þróuðu kraftmikið hjartasneiðarræktunarbað til að endurskapa hjartahringrás með því að nota kraftskynjaraviðbrögð og spennustýringar. Þó að þetta kerfi geri kleift að líkja eftir hjartahringrás nákvæmari in vitro, takmarkar flækjustig og lítill afköst aðferðarinnar notkun þessa kerfis. Rannsóknarstofa okkar hefur nýlega þróað einfaldað ræktunarkerfi með raförvun og fínstilltum miðli til að viðhalda lífvænleika sneiða af hjartavef úr svínum og mönnum í allt að 6 daga 20,21.
Í þessari handriti lýsum við hjartavefsræktunarlíkani (CTCM) sem notar sneiðar af svínahjarta sem innlimar vessabundnar vísbendingar til að endurskapa þrívíddarlífeðlisfræði hjartans og sjúkdómsvaldandi útþenslu á hjartahringrásinni. Þetta CTCM getur aukið nákvæmni forklínískra lyfjaspáa á stig sem aldrei hefur náðst áður með því að bjóða upp á hagkvæmt, meðalstórt hjartakerfi sem líkir eftir lífeðlisfræði/sjúkdómsvaldandi eðli spendýrahjartans fyrir forklínískar lyfjaprófanir.
Blóðaflfræðileg vélræn merki gegna mikilvægu hlutverki í að viðhalda starfsemi hjartavöðvakjarnans in vitro 22,23,24. Í þessari handriti höfum við þróað CTCM (mynd 1a) sem getur hermt eftir umhverfi fullorðinna hjartans með því að framkalla bæði raf- og vélræna örvun á lífeðlisfræðilegum tíðnum (1,2 Hz, 72 slög á mínútu). Til að forðast óhóflega teygju á vefnum meðan á slagbili stendur var notað þrívíddarprentunartæki til að auka vefjastærð um 25% (mynd 1b). Rafmagnsörvun sem C-PACE kerfið framkallaði var tímastillt til að hefjast 100 ms fyrir slagbil með því að nota gagnasöfnunarkerfi til að endurskapa hjartahringrásina að fullu. Vefjaræktunarkerfið notar forritanlegan loftknúinn stýribúnað (LB Engineering, Þýskalandi) til að víkka sveigjanlega kísillhimnu hringrásarlega til að valda útþenslu hjartasneiðanna í efri hólfinu. Kerfið var tengt við ytri loftleiðslu í gegnum þrýstimæli, sem gerði það mögulegt að stilla þrýstinginn (± 1 mmHg) og tímann (± 1 ms) nákvæmlega (mynd 1c).
a Festið vefjasniðinn við 7 mm stuðningshringinn, sem sýndur er blár, inni í ræktunarhólfi tækisins. Ræktunarhólfið er aðskilið frá lofthólfinu með þunnri sveigjanlegri sílikonhimnu. Setjið þéttingu á milli hvers hólfs til að koma í veg fyrir leka. Lok tækisins inniheldur grafít rafskaut sem veita raförvun. b Skýringarmynd af stóra vefjatækinu, leiðarhringnum og stuðningshringnum. Vefjasniðin (brún) eru sett á stóra tækið með leiðarhringnum settum í raufina á ytri brún tækisins. Með því að nota leiðarann ​​skal setja stuðningshringinn, sem er húðaður með vefjaakrýllími, varlega yfir hjartavefssniðinn. c Línurit sem sýnir tíma raförvunar sem fall af þrýstingi í lofthólfinu sem stjórnað er af forritanlegum loftþrýstingsstýri (PPD). Gagnasöfnunartæki var notað til að samstilla raförvun með þrýstiskynjurum. Þegar þrýstingurinn í ræktunarhólfinu nær stilltu þröskuldi er púlsmerki sent til C-PACE-EM til að virkja raförvun. d Mynd af fjórum CTCM settum á hillu í hitakassa. Fjögur tæki eru tengd við einn PPD í gegnum loftþrýstingsrás og þrýstiskynjarar eru settir í blóðstöðvunarlokann til að fylgjast með þrýstingnum í loftþrýstingsrásinni. Hvert tæki inniheldur sex vefjasneiðar.
Með því að nota einn loftknúinn stýribúnað gátum við stjórnað fjórum CTCM tækjum, sem hvert um sig gat rúmað 6 vefjasneiðar (Mynd 1d). Í CTCM er loftþrýstingurinn í lofthólfinu breytt í samstilltan þrýsting í vökvahólfinu og veldur lífeðlisfræðilegri útþenslu hjartasneiðarinnar (Mynd 2a og Viðbótarmynd 1). Mat á vefjateygju við 80 mm Hg. Art. sýndi 25% teygju á vefjasneiðum (Mynd 2b). Þessi prósentuteygjuhlutfall hefur reynst samsvara lífeðlisfræðilegri sarkómerlengd upp á 2,2–2,3 µm fyrir eðlilega samdráttarhæfni hjartasneiðarinnar17,19,25. Vefjahreyfingar voru metnar með sérsniðnum myndavélarstillingum (Viðbótarmynd 1). Sveifluvídd og hraði vefjahreyfingarinnar (Mynd 2c, d) samsvaraði teygju meðan á hjartahringrásinni stóð og tíma meðan á slagbili og þanbili stóð (Mynd 2b). Teygja og hraði hjartavefsins við samdrátt og slökun hélst stöðugur í 12 daga í ræktun (Mynd 2f). Til að meta áhrif raförvunar á samdráttarhæfni meðan á ræktun stóð, þróuðum við aðferð til að ákvarða virka aflögun með því að nota skuggareiknirit (viðbótarmynd 2a, b) og gátum greint á milli aflögunar með og án raförvunar. Sami hluti hjartans (mynd 2f). Í hreyfanlega svæðinu í skurðinum (R6-9) var spennan við raförvun 20% hærri en án raförvunar, sem bendir til framlags raförvunar til samdráttarhæfni.
Dæmigerðar mælingar á þrýstingi í lofthólfi, vökvahólfi og vefjahreyfingum staðfesta að þrýstingur í hólfinu breytir þrýstingi í vökvahólfi, sem veldur samsvarandi hreyfingu vefsneiðarinnar. b Dæmigerðar mælingar á prósentu teygju (bláar) vefjasneiða sem samsvara prósentu teygju (appelsínugult). c Mæld hreyfing hjartasneiðarinnar er í samræmi við mældum hreyfihraða. (d) Dæmigerðar brautir hringlaga hreyfingar (blá lína) og hraða (appelsínugult punktalína) í sneið af hjartanu. e Magnbundin ákvörðun á hringrásartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hópi, frá mismunandi grísum), samdráttartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hópi), slökunartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hópi, frá mismunandi grísum), vefjahreyfingu (n = 25 sneiðar)/hópi frá mismunandi grísum), hámarks slagbilshraða (n = 24(D0), 25(D12) sneiðar/hópur frá mismunandi grísum) og hámarks slökunartíðni (n=24(D0), 25(D12) sneiðar/hópur frá mismunandi grísum). Tvíhliða Student's t-próf ​​sýndi engan marktækan mun á neinum breytum. f Dæmigerðar álagsgreiningarspor vefjasneiða með (rauðum) og án (bláum) raförvunar, tíu svæðisbundin vefjasneiðar úr sama sneið. Neðri spjöldin sýna magngreiningu á prósentumun álags í vefjasneiðum með og án raförvunar á tíu svæðum úr mismunandi sneiðum. (n = 8 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 víxlar/hrúffur frá разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01,01. (n = 8 hlutar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða Student's t-próf; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 krónur/hrúppur, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 hlutar/hópur, frá mismunandi svínum, tvíhliða Student's t-próf; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Í fyrra kyrrstæða lífhermandi hjartasneiðarræktunarkerfi okkar [20, 21] héldum við lífvænleika, virkni og byggingarheilleika hjartasneiðanna í 6 daga með því að beita raförvun og fínstilla samsetningu miðilsins. Hins vegar, eftir 10 daga, lækkuðu þessar tölur skarpt. Við munum vísa til sneiða sem ræktaðar voru í fyrra kyrrstæða lífhermandi ræktunarkerfi okkar 20, 21 í samanburðarskilyrðum (Ctrl) og við munum nota fyrr fínstillta miðilinn okkar sem MC skilyrði og ræktun undir samtímis vélrænni og raförvun (CTCM). kallað . Fyrst komumst við að því að vélræn örvun án raförvunar var ófullnægjandi til að viðhalda lífvænleika vefja í 6 daga (Viðbótarmynd 3a, b). Athyglisvert er að með tilkomu lífeðlisfræðilegrar, vélrænnar og raförvunar með STCM, var lífvænleiki 12 daga hjartasneiða sá sami og í ferskum hjartasneiðum við MS skilyrði, en ekki við Ctrl skilyrði, eins og sést með MTT greiningu (Mynd 1). 3a). Þetta bendir til þess að vélræn örvun og hermun á hjartahringrás geti haldið vefjasneiðum lífvænlegum tvöfalt lengur en greint var frá í fyrra kyrrstæða ræktunarkerfi okkar. Hins vegar sýndi mat á byggingarheild vefjasneiða með ónæmismerkingu á hjarta-troponíni T og connexíni 43 að connexín 43 tjáning var marktækt meiri í MC vefjum á degi 12 en í samanburðarhópi sama dag. Hins vegar var einsleit connexín 43 tjáning og Z-diskmyndun ekki að fullu viðhaldið (Mynd 3b). Við notum gervigreindarramma (AI) til að magngreina byggingarheild vefja26, myndatengda djúpnámsleiðslu byggða á troponín-T og connexín litun43 til að magngreina sjálfkrafa byggingarheild og flúrljómun hjartasneiða hvað varðar staðsetningarstyrk. Þessi aðferð notar fellingartauganet (CNN) og djúpnámsramma til að magngreina áreiðanlega byggingarheild hjartavefs á sjálfvirkan og óhlutdrægan hátt, eins og lýst er í tilvísuninni.26. MC vefur sýndi betri byggingarlíkindi á degi 0 samanborið við kyrrstæðar samanburðarhópa. Að auki leiddi þrílitun Massons í ljós marktækt lægra hlutfall bandvefsmyndunar við MS aðstæður samanborið við samanburðarhópa á degi 12 í ræktun (Mynd 3c). Þó að CTCM hafi aukið lífvænleika hjartavefssneiðanna á 12. degi á svipað stig og í ferskum hjartavef, þá bætti það ekki marktækt uppbyggingu hjartasneiðanna.
Súlurit sýnir magnbundna ákvörðun á MTT lífvænleika ferskra hjartasneiða (D0) eða hjartasneiðarræktunar í 12 daga, annaðhvort í kyrrstöðurækt (D12 Ctrl) eða í CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl). Súlurit sýnir magnbundna ákvörðun á MTT lífvænleika ferskra hjartasneiða (D0) eða hjartasneiðarræktunar í 12 daga, annaðhvort í kyrrstöðurækt (D12 Ctrl) eða í CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl).Súluritið sýnir magnbundna ákvörðun á lífvænleika MTT ferskra hjartasneiða (D0) eða ræktunar hjartasneiða í 12 daga, annaðhvort í kyrrstöðurækt (D12 samanburður) eða CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 samanburður). ) ), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt;####p < 0,0001 á сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绐计AN，进进讐AN，进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与##p < 0.0001D， Ctrl相比，**p.)Súlurit sem sýnir magnbundið gildi MTT í ferskum hjartasneiðum (D0) eða hjartasneiðum sem ræktaðar voru í 12 daga í kyrrstöðuræktun (D12 samanburður) eða CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 samanburður)), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf;####p < 0,0001 á сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 samanborið við D0, **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl).b Troponin-T (grænt), connexin 43 (rautt) og DAPI (blátt) í nýeinangruðum hjartasneiðum (D0) eða hjartasneiðum ræktuðum við kyrrstæðar aðstæður (Ctrl) eða CTCM aðstæður (MC) í 12 daga) úr dæmigerðum ónæmisflúrljómunarmyndum (auður kvarði = 100 µm). Magnbundin ákvörðun á uppbyggingu hjartavefjar með gervigreind (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). Magnbundin ákvörðun á uppbyggingu hjartavefjar með gervigreind (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с 12), 7 (D12 с 12), пгов (D12 с 12), frá разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Magnbundin ákvörðun á byggingarheild hjartavefs með gervigreind (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópar úr mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópa hverja af mismunandi grísum, einhliða ANOVA próf .##0P .##0;##相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópa hverja af mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf <1#0#0p;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7) (D12 Ctrl), 7 (D12 Ctrl), срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Gervigreind til að magngreina byggingarheild hjartavefs (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópur af mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf; ####p<0,0001 á móti .D0 Til samanburðar ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). c Dæmigerðar myndir (vinstri megin) og magngreining (hægri megin) fyrir hjartasneiðar litaðar með tríkrómi litun frá Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c Dæmigerðar myndir (vinstri megin) og magngreining (hægri megin) fyrir hjartasneiðar litaðar með tríkrómi litun frá Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; #### p < 0,0001 samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) og количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонно подносторон <0,#00 p. сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Dæmigerðar myndir (vinstri megin) og magngreining (hægri megin) af hjartasneiðum lituðum með tríkrómi litun frá Masson (óhúðaður mælikvarði = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; #### p < 0,0001 samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=10Ｚn 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相***02D <0．***02D Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庣 裸庰庣 庰裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单# 向 A#nova 0.0001 与 D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) og количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Dæmigerðar myndir (vinstri megin) og magngreining (hægri megin) af hjartasneiðum lituðum með tríkrómi litun frá Masson (auða = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur, hver frá mismunandi svíni, prófaðar með einstefnu dreifingargreiningu; ### # p < 0,0001 samanborið við D0, ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Við settum fram þá tilgátu að með því að bæta litlum sameindum við ræktunarvökvann mætti ​​bæta heilleika hjartavöðvakrabbameina og draga úr bandvefsmyndun meðan á CTCM ræktun stóð. Við skimuðum því fyrir litlum sameindum með því að nota kyrrstæðar samanburðarræktanir okkar20,21 vegna fárra ruglingsþátta. Dexametason (Dex), tríjoðtýrónín (T3) og SB431542 (SB) voru valin fyrir þessa skimun. Þessar litlu sameindir hafa áður verið notaðar í hiPSC-CM ræktunum til að örva þroska hjartavöðvakrabbameina með því að auka lengd sarcomere, T-pípla og leiðnihraða. Að auki er vitað að bæði Dex (glúkókortikóíð) og SB bæla bólgu29,30. Þess vegna prófuðum við hvort innleiðing einnar eða samsetningar þessara litlu sameinda myndi bæta byggingarheilleika hjartasneiðanna. Fyrir upphafsskimun var skammtur hvers efnasambands valinn út frá þeim styrk sem almennt er notaður í frumuræktunarlíkönum (1 μM Dex27, 100 nM T327 og 2,5 μM SB31). Eftir 12 daga ræktun leiddi samsetning T3 og Dex til bestu mögulegu uppbyggingarheilleika hjartavöðvakrabbameins og lágmarks trefjaendurgerðar (viðbótarmyndir 4 og 5). Að auki hafði notkun tvöfalds eða tvöfalds þessara styrkja af T3 og Dex skaðleg áhrif samanborið við eðlilegan styrk (viðbótarmyndir 6a, b).
Eftir upphaflega skimun framkvæmdum við samanburð á fjórum ræktunarskilyrðum (mynd 4a): Ctrl: hjartasneiðar ræktaðir í okkar áður lýstu kyrrstöðuræktun með því að nota okkar besta ræktunarmiðil; 20.21 TD: T3 og Ctrl bætt við Dex á miðvikudag; MC: hjartasneiðar ræktaðir í CTCM með því að nota okkar áður besta ræktunarmiðil; og MT: CTCM með T3 og Dex bætt út í ræktunarmiðilinn. Eftir 12 daga ræktun var lífvænleiki MS og MT vefja sá sami og í ferskum vefjum sem metnir voru með MTT prófi (mynd 4b). Athyglisvert er að viðbót T3 og Dex í transwell ræktanir (TD) leiddi ekki til marktækrar bættrar lífvænleika samanborið við Ctrl aðstæður, sem bendir til mikilvægs hlutverks vélrænnar örvunar í að viðhalda lífvænleika hjartasneiðanna.
Skýringarmynd af tilraunahönnun sem sýnir fjórar ræktunaraðstæður sem notaðar voru til að meta áhrif vélrænnar örvunar og T3/Dex viðbótar á ræktunarvökva í 12 daga. b Súlurit sýnir magnbundna lífvænleika 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl). b Súlurit sýnir magnbundna lífvænleika 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. культивирования (контроль, TD, MC og MT) á сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MC 122 TD, D122 TD, og ​​D122 срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Súluritið sýnir magnbundna lífvænleika 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (viðmiðun, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 samanborið við D0 og **p < 0,01 samanborið við D12 Ctrl). b.和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.00001， 0##p < 0.0001，.0#相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC og MT) á сравнению со свежезими (0) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0 #,00п сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Súlurit sem sýnir allar 4 ræktunaraðstæður (viðmiðun, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), úr mismunandi svínum 12 (D12 MC) sneiðum/hópi, einhliða ANOVA próf; ####p<0,0001, ###p<0,001 á móti D0, **p<0,01 á móti viðmiðun D12). c Súlurit sýnir magngreiningu glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ###p < 0,001, samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c Súlurit sýnir magngreiningu glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ###p < 0,001, samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висованис культивирования (контроль, TD, MC og MT) fyrir neyðarástand með því að nota neyðarástand (D0) (n = 6 greiðslur/gráptímar, Выполняется тест ANOVA; c Súlurit sýnir magngreiningu glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunaraðstæður (viðmiðun, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; ###p < 0,001 samanborið við D0 og ***p < 0,001 samanborið við D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹兔弌吐12，吅天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 缉 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис 4для культивированис культивирования (контроль, TD, MC og MT). односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 á сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Súlurit sem sýnir magngreiningu glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun fyrir allar 4 ræktunaraðstæður (viðmiðun, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur, frá mismunandi svínum, einhliða þar sem ANOVA próf voru framkvæmd, ###p < 0,001 samanborið við D0, ***p < 0,001 samanborið við D12 (viðmiðun).d Stofngreiningarmyndir af ferskum (bláum), 12. degi MC (grænum) og 12. degi MT (rauðum) vefjum á tíu svæðisbundnum vefjasneiðum (n = 4 sneiðar/hópur, einstefnu ANOVA próf; enginn marktækur munur var á milli hópa). e Eldfjallamynd sem sýnir mismunandi tjáð gen í ferskum hjartasneiðum (D0) samanborið við hjartasneiðar sem ræktaðir voru við kyrrstæðar aðstæður (Ctrl) eða við MT aðstæður (MT) í 10-12 daga. f Hitakort af sarkómergenum fyrir hjartasneiðar sem ræktaðir voru við hverjar ræktunaraðstæður. Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Efnaskiptaháðni vegna breytinga frá fitusýruoxun yfir í glýkólýsu er aðalsmerki minnkunar á aðgreiningu hjartavöðvafrumna. Óþroskaðar hjartavöðvafrumur nota aðallega glúkósa til ATP-framleiðslu og hafa vanþroskaða hvatbera með fáum kristum5,32. Greining á glúkósanýtingu sýndi að við MC og MT aðstæður var glúkósanýting svipuð og í vefjum á degi 0 (Mynd 4c). Hins vegar sýndu Ctrl sýni marktæka aukningu á glúkósanýtingu samanborið við ferskan vef. Þetta bendir til þess að samsetning CTCM og T3/Dex eykur lífvænleika vefja og varðveitir efnaskiptaeiginleika í 12 daga ræktuðum hjartasneiðum. Að auki sýndi álagsgreining að álagsstig héldust þau sömu og í ferskum hjartavef í 12 daga við MT og MS aðstæður (Mynd 4d).
Til að greina heildaráhrif CTCM og T3/Dex á alþjóðlegt umritunarlandslag hjartavefs, framkvæmdum við RNAseq á hjartasneiðum frá öllum fjórum mismunandi ræktunarskilyrðum (Viðbótargögn 1). Athyglisvert er að MT sneiðar sýndu mikla umritunarlíkingu við ferskan hjartavef, þar sem aðeins 16 af 13.642 genum voru mismunandi tjáð. Hins vegar, eins og við sýndum fram á áður, sýndu Ctrl sneiðar 1229 mismunandi tjáð gen eftir 10–12 daga í ræktun (Mynd 4e). Þessum gögnum var staðfest með qRT-PCR á hjarta- og fibroblast genum (Viðbótarmynd 7a-c). Athyglisvert er að Ctrl sneiðarnar sýndu niðurstýringu á hjarta- og frumuhringsgenum og virkjun bólgugenaforrita. Þessi gögn benda til þess að afgreining, sem venjulega á sér stað eftir langtíma ræktun, sé alveg veikluð við MT aðstæður (Viðbótarmynd 8a,b). Nákvæm rannsókn á genum sarkómera sýndi að aðeins við MT-skilyrði eru genin sem kóða fyrir sarkómerinn (mynd 4f) og jónaganginn (viðbótarmynd 9) varðveitt, sem verndar þau gegn bælingu við Ctrl-, TD- og MC-skilyrði. Þessi gögn sýna að með blöndu af vélrænni og vessabundinni örvun (T3/Dex) getur umrit hjartasneiðarinnar haldist svipað og ferskar hjartasneiðar eftir 12 daga í ræktun.
Þessar niðurstöður varðandi umritun eru studdar af þeirri staðreynd að byggingarheild hjartavöðvakrabbameina í hjartasneiðum varðveitist best við MT-skilyrði í 12 daga, eins og sést af óskemmdu og staðbundnu connexíni 43 (Mynd 5a). Að auki minnkaði bandvefsmyndun í hjartasneiðum við MT-skilyrði marktækt samanborið við Ctrl og svipað og í ferskum hjartasneiðum (Mynd 5b). Þessi gögn sýna að samsetning vélrænnar örvunar og T3/Dex meðferðar varðveitir á áhrifaríkan hátt hjartabyggingu í hjartasneiðum í ræktun.
Dæmigerðar ónæmisflúrljómunarmyndir af troponin-T (grænt), connexin 43 (rautt) og DAPI (blátt) í nýeinangruðum hjartasneiðum (D0) eða ræktuðum í 12 daga við allar fjórar hjartasneiðar (kvarðastika = 100 µm). Magnbundin ákvörðun á uppbyggingu hjartavefjar með gervigreind (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og *p < 0,05, eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). Magnbundin ákvörðun á uppbyggingu hjartavefjar með gervigreind (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; #### p < 0,0001 samanborið við D0 og *p < 0,05, eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 Ctrl), (D12 Ctrl) MC og D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 á сравных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,0001 á сравнению с D12 Ctrl). Magnbundin ákvörðun á byggingarheild hjartavefs með gervigreind (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; #### p < 0,0001 samanborið við D0 og *p < 0,05 eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 帒*p < 0.0*p < 0.0*p < 0.0*p < 0,0*p 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t ， d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ；戈5****p < 0.05**** 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Magnbundin ákvörðun á byggingarheild hjartavefs með gervigreind í mismunandi svínum (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) hlutar/hópur) með einstefnu ANOVA prófi;#### p < 0,0001 á milli D0 og *p < 0,05 eða ****p < 0,0001 með D12 Ctrl). #### p < 0,0001 samanborið við D0 og *p < 0,05 eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 (Ctrl). b Dæmigerðar myndir og magngreining fyrir hjartasneiðar litaðar með tríkrómi litun frá Masson (kvarðastika = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ***p < 0,001, eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). b Dæmigerðar myndir og magngreining fyrir hjartasneiðar litaðar með tríkrómi litun frá Masson (kvarðastika = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og ***p < 0,001, eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным краснателем ( линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, весностолня ANOVA; ####p < 0,0001 á сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 á сравнению с D12 Ctrl). b Dæmigerðar myndir og magngreining á hjartasneiðum lituðum með tríkrómi litun frá Masson (kvarðastika = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, framkvæmd einstefnu ANOVA; ####p < 0,0001 á móti D0 og ***p < 0,001 eða ****p < 0,0001 á móti D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 01！D = 010（n Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垕因素方垐分，1.#0##0与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 ¼（n = 0（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分与00p <1 0##0D相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения = 5. janúar мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; #0посою с D0, ***p < 0,001 eða ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Dæmigerðar myndir og magngreining á hjartasneiðum lituðum með Masson-tríkrómi (kvarðastika = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar úr mismunandi svínum/hópi, ein ANOVA aðferð; ####p < 0,0001 samanborið við D0, ***p < 0,001 eða ****p < 0,0001 samanborið við D12 Ctrl).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Að lokum var hæfni CTCM til að líkja eftir þykknun hjartans metin með því að auka teygju hjartavefjar. Í CTCM jókst hámarksþrýstingur í loftklefanum úr 80 mmHg í 80 mmHg. Art. (venjuleg teygja) upp í 140 mmHg Art. (Mynd 6a). Þetta samsvarar 32% aukningu á teygju (Mynd 6b), sem áður hafði verið sýnt sem samsvarandi prósentuteygju sem þarf til að hjartasneiðar nái sarkómerlengd svipaðri og sést við þykknun. Teygja og hraði hjartavefsins við samdrátt og slökun hélst stöðugur í sex daga ræktun (Mynd 6c). Hjartavefur úr MT-skilyrðum var settur í eðlilega teygju (MT (venjuleg)) eða ofteygjuskilyrði (MT (OS)) í sex daga. Þegar eftir fjóra daga í ræktun var þykknunarmarkerinn NT-ProBNP marktækt hækkaður í miðlinum við MT (OS) skilyrði samanborið við MT (venjuleg) skilyrði (Mynd 7a). Að auki, eftir sex daga ræktun, jókst frumustærð í MT (OS) (mynd 7b) marktækt samanborið við sneiðar af MT-hjarta (eðlilegt). Að auki jókst NFATC4 kjarnaflutningur marktækt í ofteygðum vefjum (mynd 7c). Þessar niðurstöður sýna stigvaxandi þróun sjúklegrar endurgerðar eftir ofþenslu og styðja þá hugmynd að CTCM tækið geti verið vettvangur til að rannsaka teygju-framkallaða hjartastækkunarmerki.
Dæmigerðar mælingar á þrýstingi í lofthólfi, vökvahólfi og vefjahreyfingum staðfesta að þrýstingur í hólfinu breytir þrýstingi í vökvahólfinu, sem veldur samsvarandi hreyfingu vefjasneiðarinnar. b Dæmigerðar teygjuprósentu- og teygjuhraðakúrfur fyrir venjulega teygðar (appelsínugular) og ofteygðar (bláir) vefjasneiðar. c Súlurit sem sýnir hringrásartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hópi, frá mismunandi grísum), samdráttartíma (n = 18-19 sneiðar í hverjum hópi, frá mismunandi grísum), slökunartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hópi, frá mismunandi grísum)), sveifluvídd vefjahreyfingarinnar (n = 14 sneiðar/hópur, frá mismunandi grísum), hámarks slagbilshraða (n = 14 sneiðar/hópur, frá mismunandi grísum) og hámarks slökunarhraða (n = 14 (D0), 15 (D6)) sneiðar/hópar) frá mismunandi grísum), tvíhliða Student's t-próf ​​sýndi engan marktækan mun á neinum breytum, sem bendir til þess að þessir breytur héldust stöðugir í 6 daga ræktun með ofspennu. Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Magngreining á NT-ProBNP styrk í ræktunarmiðli úr hjartasneiðum sem ræktaðar voru við eðlilega teygju (Norm) eða ofteygju (OS) MT aðstæður (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða ANOVA er framkvæmd; **p < 0,01 samanborið við eðlilega teygju). Magngreining á NT-ProBNP styrk í ræktunarmiðli úr hjartasneiðum sem ræktaðar voru við eðlilega teygju (Norm) eða ofteygju (OS) MT aðstæður (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða ANOVA er framkvæmd; **p < 0,01 samanborið við eðlilega teygju).Megindleg súlurit af NT-ProBNP styrk í ræktunarmiðli úr hjartasneiðum ræktuðum við eðlilega MT teygju (norm) eða ofteygju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) sneiðar /hópur frá mismunandi svínum, tveggja þátta dreifnigreining er framkvæmd;**p < 0,01 á viðmiðunarmörkum). **p < 0,01 samanborið við eðlilega teygju). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. a Magngreining á styrk NT-ProBNP í hjartasneiðum sem ræktaðar eru við MT eðlilega teygju (Norm) eða yfirteygju (OS) aðstæður (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) frá mismunandi猪的切片/组，可以双向方方发发动 **samanborið við venjulegar teygjur, p < 0,01).Súlurit Magnbundin ákvörðun á NT-ProBNP styrk í hjartasneiðum ræktuðum við eðlilega MT teygju (norm) eða ofteygju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða dreifigreining;**p < 0,01 á viðmiðunarmörkum). **p < 0,01 samanborið við eðlilega teygju). b Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum lituðum með troponin-T og WGA (vinstri) og magngreiningu frumnastærðar (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001 samanborið við eðlilega teygju). b Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum lituðum með troponin-T og WGA (vinstri) og magngreiningu frumustærðar (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001 samanborið við eðlilega teygju). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количестолениногого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum lituðum með troponin-T og AZP (vinstri) og magngreining á frumustærð (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum, tvíhliða Student's t-próf ​​var framkvæmt; ****p < 0,0001 samanborið við eðlilegt álag). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尟学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum lituðum með calcarein-T og WGA (vinstri) og frumustærð (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 úr 10 mismunandi sneiðum (D6 MTNorm)). Frumur/frumur, mismunandi eftir frumulínu, samanborið við venjulega teygju, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количестравенная (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групюпа, Справа, Справа; ****p < 0,0001 fyrir neyðartilvik). b Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum lituðum með troponin-T og AZP (vinstri) og magnbundin frumustærðarákvörðun (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum) Frumur/hópur, tvíhliða viðmið Student's t; ****p < 0,0001 samanborið við eðlilegt álag). c Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum frá degi 0 og 6 með MTOS, ónæmismerktar fyrir troponín-T og NFATC4 og magnbundnar ákvarðanir á flutningi NFATC4 í kjarna CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​framkvæmt; *p < 0,05). c Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum frá degi 0 og 6 á MTOS, ónæmismerktar fyrir troponín-T og NFATC4 og magnbundnar ákvarðanir á flutningi NFATC4 í kjarna CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða Student t-próf ​​er framkvæmt; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 og 6 дней MTOS, иммуномеченых тропонина-Т и NFATC4, и ковочече транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) reikningar/spilunartölur frá разных свинстойней , выпусян t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Dæmigerðar myndir af hjartasneiðum við 0 og 6 daga MTOS, ónæmismerktar fyrir troponín-T og NFATC4, og magnbundin ákvörðun á NFATC4 flutningi í kjarna holfrumufrumna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum) framkvæmdar tvíhliða Student's t-prófi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀MT 匀4（n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Fullkomnar myndir af kalkanín-T og NFATC4 ónæmismerkingum 第0天和第6天MTOS hjartasneiðum og NFATC4 frá mismunandi NFATC4 易位至CM frumukjarnamagni化 (n = 4 (D0), 缇 刻 , 缇 , 缇 , 焇 , 缇时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS á 0 og 6 daga fyrir иммуномаркировки тропониностином-Т и NFATC4 og NFATC4 транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий t-критер;0). c Dæmigerðar myndir af MTOS hjartasneiðum á degi 0 og 6 fyrir troponín-T og NFATC4 ónæmismerkingu og magngreiningu á NFATC4 flutningi í kjarna CM frá mismunandi svínum (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur, tvíhliða t-viðmið Student's; *p < 0,05).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Rannsóknir á þýðingu hjarta- og æðakerfisins krefjast frumulíkana sem endurskapa nákvæmlega umhverfi hjartans. Í þessari rannsókn var CTCM tæki þróað og lýst sem getur örvað örsmáar sneiðar af hjartanu. CTCM kerfið felur í sér lífeðlisfræðilega samstillta rafsegulfræðilega örvun og T3 og Dex vökvaauðgun. Þegar svínahjartasneiðar voru útsettar fyrir þessum þáttum, var lífvænleiki þeirra, byggingarheilleiki, efnaskiptavirkni og umritunartjáning sú sama og í ferskum hjartavef eftir 12 daga ræktun. Að auki getur óhófleg teygja á hjartavef valdið ofstækkun hjartans af völdum ofréttingar. Í heildina styðja þessar niðurstöður mikilvægt hlutverk lífeðlisfræðilegra ræktunarskilyrða við að viðhalda eðlilegri hjartasvipgerð og veita vettvang fyrir lyfjaskimun.
Margir þættir stuðla að því að skapa kjörumhverfi fyrir starfsemi og lifun hjartavöðvakrabbameina. Augljósustu þessara þátta tengjast (1) millifrumuvíxlverkunum, (2) rafsegulfræðilegri örvun, (3) vessabundnum þáttum og (4) efnaskiptahvarfefnum. Lífeðlisfræðileg milliverkanir milli frumna krefjast flókinna þrívíddarneta margra frumugerða sem eru studd af utanfrumuefni. Slík flókin frumuvíxlverkun er erfitt að endurskapa in vitro með samræktun einstakra frumugerða, en er auðvelt að ná þeim fram með því að nota líffærafræðilega eðli hjartasneiðanna.
Vélræn teygja og raförvun hjartavöðvakrabbameina eru mikilvæg til að viðhalda hjartasvipgerð33,34,35. Þó að vélræn örvun hafi verið mikið notuð til að undirbúa og þroskast hiPSC-CM, hafa nokkrar glæsilegar rannsóknir nýlega reynt að örva hjartasneiðar í ræktun með einása álagi. Þessar rannsóknir sýna að tvívídd einása vélræn hleðsla hefur jákvæð áhrif á svipgerð hjartans meðan á ræktun stendur. Í þessum rannsóknum voru hlutar hjartans annað hvort hlaðnir með ísómetrískum togkrafti17, línulegri auxótónískri álagi18, eða hjartahringrásin var endurskapuð með því að nota kraftskynjaraendurgjöf og spennustýringu. Hins vegar nota þessar aðferðir einása vefjateygju án umhverfisbestunar, sem leiðir til bælingar á mörgum hjartagenum eða ofurtjáningar gena sem tengjast óeðlilegum teygjusvörunum. CTCM sem lýst er hér veitir þrívíddar rafvélrænan örvun sem líkir eftir náttúrulegum hjartahringrás hvað varðar hringrásartíma og lífeðlisfræðilega teygju (25% teygja, 40% slagbil, 60% þanbil og 72 slög á mínútu). Þó að þessi þrívíddar vélræna örvun ein og sér sé ekki nægjanleg til að viðhalda heilleika vefjar, er nauðsynlegt að nota samsetningu af vessabundinni og vélrænni örvun með T3/Dex til að viðhalda lífvænleika, virkni og heilleika vefjar á fullnægjandi hátt.
Húmorískir þættir gegna mikilvægu hlutverki í að stjórna svipgerð fullorðinna hjartans. Þetta kom fram í HiPS-CM rannsóknum þar sem T3 og Dex voru bætt við ræktunarmiðil til að flýta fyrir frumuþroska. T3 getur haft áhrif á flutning amínósýra, sykurs og kalsíums yfir frumuhimnur36. Að auki stuðlar T3 að tjáningu MHC-α og niðurstjórnun MHC-β, sem stuðlar að myndun hraðra vöðvaþráða í þroskuðum hjartavöðvafrumum samanborið við hægfara vöðvaþræði í fósturhjartafrumum. T3 skortur hjá sjúklingum með skjaldkirtilsbrest leiðir til taps á vöðvaþráðarböndum og minnkaðs hraða hjartansþroska37. Dex verkar á glúkókortikóíðviðtaka og hefur reynst auka samdráttargetu hjartavöðvans í einangruðum blóðflæðishjörtum;38 þessi framför er talin tengjast áhrifum á kalsíumútfellingardrifin innkoma (SOCE)39,40. Að auki binst Dex viðtökum sínum og veldur víðtækri innanfrumuviðbrögðum sem bæla niður ónæmisstarfsemi og bólgu30.
Niðurstöður okkar benda til þess að líkamleg vélræn örvun (MS) hafi bætt heildarafköst ræktunar samanborið við Ctrl, en ekki tekist að viðhalda lífvænleika, byggingarheilleika og hjartatjáningu í 12 daga í ræktun. Í samanburði við Ctrl bætti viðbót T3 og Dex við CTCM (MT) ræktanir lífvænleika og viðhélt svipuðum umritunarferlum, byggingarheilleika og efnaskiptavirkni með ferskum hjartavef í 12 daga. Að auki, með því að stjórna umfangi vefjateygju, var búið til líkan af ofþenslu-völdum hjartastækkunarferli með því að nota STCM, sem sýnir fjölhæfni STCM kerfisins. Það skal tekið fram að þó að endurgerð hjartans og bandvefsmyndun feli venjulega í sér óskemmd líffæri þar sem blóðrásarfrumur geta veitt viðeigandi frumuboðefni sem og frumuát og aðra endurgerðarþætti, geta hlutar hjartans samt hermt eftir bandvefsmyndunarferlinu sem svar við streitu og áverka. Í vöðvaþráðafrumum. Þetta hefur áður verið metið í þessu hjartasneiðarlíkani. Það skal tekið fram að hægt er að breyta CTCM breytum með því að breyta þrýstingi/rafmagnsvídd og tíðni til að líkja eftir mörgum aðstæðum eins og hraðslætti, hægslætti og vélrænum blóðrásarstuðningi (vélrænt óhlaðið hjarta). Þetta gerir kerfið að meðalafköstum fyrir lyfjaprófanir. Hæfni CTCM til að líkja eftir ofáreynsluvöldum hjartastækkunum ryður brautina fyrir prófanir á þessu kerfi fyrir persónulega meðferð. Að lokum sýnir þessi rannsókn fram á að vélræn teygja og vessabundin örvun eru mikilvæg til að viðhalda ræktun hjartavefssneiða.
Þó að gögnin sem hér eru kynnt bendi til þess að CTCM sé mjög efnilegur vettvangur til að líkja eftir óskemmdum hjartavöðva, þá hefur þessi ræktunaraðferð nokkrar takmarkanir. Helsta takmörkun CTCM-ræktunar er sú að hún leggur stöðugt kraftmikið vélrænt álag á sneiðarnar, sem útilokar getu til að fylgjast virkt með samdrætti hjartasneiða í hverri lotu. Þar að auki, vegna smæðar hjartasneiðanna (7 mm), er hæfni til að meta slagbilsstarfsemi utan ræktunarkerfa með því að nota hefðbundna kraftskynjara takmörkuð. Í núverandi handriti yfirstígum við að hluta til þessa takmörkun með því að meta ljósspennu sem vísbendingu um samdráttarstarfsemi. Hins vegar mun þessi takmörkun krefjast frekari vinnu og gæti verið tekin fyrir í framtíðinni með því að kynna aðferðir til ljósfræðilegrar eftirlits með virkni hjartasneiða í ræktun, svo sem ljóskortlagningu með því að nota kalsíum og spennunæm litarefni. Önnur takmörkun CTCM er að vinnulíkanið stjórnar ekki lífeðlisfræðilegri streitu (forálag og eftirálag). Í CTCM var þrýstingur framkallaður í gagnstæðar áttir til að endurskapa 25% lífeðlisfræðilega teygju í þanvirkni (full teygja) og slagbils (lengd samdráttar við raförvun) í mjög stórum vefjum. Þessari takmörkun ætti að fjarlægja í framtíðarhönnun CTCM með nægilegum þrýstingi á hjartavefinn frá báðum hliðum og með því að beita nákvæmlega þeim þrýstings-rúmmálshlutföllum sem eiga sér stað í hjartahólfunum.
Sú endurgerð sem greint er frá í þessari handriti takmarkast við að herma eftir ofvöxtar-ofvöxtarmerkjum. Þannig getur þetta líkan hjálpað við rannsóknir á ofvöxtarmerkjum sem valda teygju án þess að þörf sé á vessabundnum eða taugaþáttum (sem eru ekki til staðar í þessu kerfi). Frekari rannsókna eru nauðsynlegar til að auka fjölbreytni CTCM, til dæmis með samræktun með ónæmisfrumum, vessabundnum þáttum í blóðrásarplasma og taugun þegar samræktun með taugafrumum mun bæta möguleika á sjúkdómslíkönum með CTCM.
Þrettán grísir voru notaðir í þessari rannsókn. Allar dýratilraunir voru framkvæmdar í samræmi við leiðbeiningar stofnunarinnar og voru samþykktar af dýraverndarnefnd Háskólans í Louisville. Ósæðarboginn var klemmdur og hjartað var blásið með 1 lítra af dauðhreinsuðu hjartavöðvakvilla (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparín, pH allt að 7,4); Hjörtun voru geymd í ískaldri hjartavöðvalausn þar til þau voru flutt á ís á rannsóknarstofuna, sem tekur venjulega <10 mínútur. Hjörtun voru geymd í ískaldri hjartavöðvalausn þar til þau voru flutt á ís á rannsóknarstofuna, sem tekur venjulega <10 mínútur. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10m. Hjörtu voru geymd í ískaldri hjartavöðvalausn þar til þau voru flutt á rannsóknarstofu á ís, sem tekur venjulega <10 mínútur.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию á льду, ótímabært <10 mín. Haldið hjörtum á ís vegna hjartaþræðinga þar til þau eru flutt á rannsóknarstofu á ís, venjulega <10 mín.
CTCM tækið var þróað í tölvustýrðri hönnun (CAD) hugbúnaði frá SolidWorks. Ræktunarhólfin, skilrúmin og lofthólfin eru úr CNC glæru akrýlplasti. 7 mm þvermál bakhringurinn er úr háþéttni pólýetýleni (HDPE) í miðjunni og er með o-hringrás til að rúma sílikon-o-hringinn sem notaður er til að innsigla miðilinn fyrir neðan. Þunn kísilhimna aðskilur ræktunarhólfið frá aðskilnaðarplötunni. Sílikonhimnan er laserskorin úr 0,02" þykkri sílikonplötu og hefur 35A hörku. Neðri og efri sílikonþéttingarnar eru laserskornar úr 1/16" þykkri sílikonplötu og hafa 50A hörku. Skrúfur og vængmötur úr 316L ryðfríu stáli eru notaðar til að festa blokkina og skapa loftþétta innsigli.
Sérstök prentuð rafrásarplata (PCB) er hönnuð til að vera samþætt C-PACE-EM kerfinu. Tengipunktarnir fyrir svissneska vélina á prentplötunni eru tengdir við grafít rafskaut með silfurhúðuðum koparvírum og brons 0-60 skrúfum sem eru skrúfaðar í rafskautin. Prentaða rafrásarplatan er sett í lok þrívíddar prentarans.
CTCM tækið er stjórnað af forritanlegum loftþrýstingsstýri (PPD) sem býr til stýrðan blóðrásarþrýsting svipaðan og í hjartahringrás. Þegar þrýstingurinn inni í lofthólfinu eykst þenst sveigjanleg kísillhimna upp á við og þrýstir miðlinum undir vefjasvæðið. Vefjasvæðið teygist síðan við þessa vökvaútdrátt, sem líkir eftir lífeðlisfræðilegri útþenslu hjartans við þanvirkni. Við hámarksslökun var raförvun beitt með grafítelektrodum, sem dró úr þrýstingnum í lofthólfinu og olli samdrætti vefjasneiðanna. Inni í pípunni er blóðstöðvandi loki með þrýstiskynjara til að greina þrýstinginn í loftkerfinu. Þrýstingurinn sem þrýstiskynjarinn nemur er beitt á gagnasafnara sem er tengdur við fartölvuna. Þetta gerir kleift að fylgjast stöðugt með þrýstingnum inni í gashólfinu. Þegar hámarksþrýstingur í hólfinu var náð (staðlað 80 mmHg, 140 mmHg OS) var gagnasöfnunartækinu skipað að senda merki til C-PACE-EM kerfisins til að mynda tvíþætt spennumerki í 2 ms, stillt á 4 V.
Hjartasneiðar voru teknar og ræktunarskilyrði í 6 holum voru framkvæmd á eftirfarandi hátt: Hjörtun sem voru tekin voru færð úr flutningsílátinu í bakka með köldu (4°C) hjartavöðvakvilla. Vinstri slegli var einangraður með dauðhreinsuðu blaði og skorinn í bita, 1-2 cm3 að stærð. Þessir vefjablokkir voru festir við vefjastuðla með vefjalími og settir í titrandi míkrótómvefjabað sem innihélt Tyrode-lausn og var stöðugt súrefnismettað (3 g/L af 2,3-bútandíónmónóoxími (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glúkósa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml af 1 M lausn), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml af 1 M lausn), allt að 1 L af ddH2O). Titrandi örsneiðartækið var stillt á að skera 300 µm þykkar sneiðar við tíðnina 80 Hz, lárétta titringsvídd 2 mm og 0,03 mm/s hreyfihraða. Vefjabaðið var umkringt ís til að halda lausninni köldum og hitastiginu var haldið við 4°C. Vefjaskurðirnir voru færðir úr örsneiðartækinu í ræktunarbað sem innihélt stöðugt súrefnisríka Tyrode-lausn á ís þar til nægilega margir sneiðar voru fyrir eina ræktunarplötu. Fyrir transwell-ræktanir voru vefjaskurðirnir festir við dauðhreinsaða 6 mm breiða pólýúretan-stuðla og settir í 6 ml af bjartsýnismiðli (199 miðill, 1x ITS viðbót, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-basískt og 2x sýklalyf-sveppalyf). Raförvun (10 V, tíðni 1,2 Hz) var beitt á vefjaskurðina í gegnum C-Pace. Fyrir TD aðstæður var fersku T3 og Dex bætt við við 100 nM og 1 μM við hverja miðilsskipti. Miðillinn er mettaður með súrefni áður en hann er skipt út þrisvar á dag. Vefjaskurðir voru ræktaðir í ræktunarofni við 37°C og 5% CO2.
Fyrir CTCM-ræktanir voru vefjasneiðar settar á sérsmíðaðan 3D-prentara í Petri-skál sem innihélt breytta Tyrode-lausn. Tækið er hannað til að auka stærð hjartasneiðarinnar um 25% af flatarmáli stuðningshringsins. Þetta er gert til þess að hjartasneiðarnar teygist ekki eftir að þær hafa verið fluttar úr Tyrode-lausninni yfir í miðilinn og við þanbil. Með því að nota histoacryllím voru sneiðar, 300 µm þykkar, festar á stuðningshring sem var 7 mm í þvermál. Eftir að vefjasneiðarnar hafa verið festar við stuðningshringinn, voru umfram vefjasneiðarnar skornar af og festar vefjasneiðarnar settar aftur í baðið með Tyrode-lausninni á ís (4°C) þar til nægilega margir sneiðar hafa verið undirbúnir fyrir eitt tæki. Heildarvinnslutími fyrir öll tæki ætti ekki að fara yfir 2 klukkustundir. Eftir að 6 vefjasneiðar voru festar við stuðningshringina sína var CTCM-tækið sett saman. CTCM-ræktunarklefinn er forfylltur með 21 ml af súrefnisríkum miðli. Færið vefjasneiðarnar í ræktunarklefann og fjarlægið varlega allar loftbólur með pípettu. Vefjahlutinn er síðan leiddur inn í gatið og þrýst varlega á sinn stað. Að lokum er rafskautshettan sett á tækið og tækið fært í ræktunarofninn. Tengdu síðan CTCM við loftslönguna og C-PACE-EM kerfið. Loftþrýstingsstýringin opnast og loftlokinn opnar CTCM. C-PACE-EM kerfið var stillt til að gefa 4 V við 1,2 Hz við tvífasa gangráð í 2 ms. Skipt var um miðil tvisvar á dag og rafskautin einu sinni á dag til að forðast uppsöfnun grafíts á rafskautunum. Ef nauðsyn krefur er hægt að fjarlægja vefjahlutana úr ræktunarbrunnunum sínum til að losa sig við loftbólur sem kunna að hafa fallið undir þá. Fyrir meðferðarskilyrði fyrir MT var T3/Dex bætt við fersku við hverja miðilsskipti með 100 nM T3 og 1 μM Dex. CTCM tækin voru ræktuð í ræktunarofni við 37°C og 5% CO2.
Til að fá teygðar brautir hjartasneiða var sérstakt myndavélakerfi þróað. SLR myndavél (Canon Rebel T7i, Canon, Tókýó, Japan) var notuð með Navitar Zoom 7000 18-108mm macro linsu (Navitar, San Francisco, Kaliforníu). Myndvinnsla var framkvæmd við stofuhita eftir að miðillinn hafði verið skipt út fyrir nýjan. Myndavélin er staðsett í 51° horni og myndbandið er tekið upp á 30 römmum á sekúndu. Fyrst var opinn hugbúnaður (MUSCLEMOTION43) notaður með Image-J til að magngreina hreyfingu hjartasneiðanna. Gríman var búin til með MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Bandaríkjunum) til að skilgreina áhugasvæði fyrir hjartsneiðar sem slá til að forðast suð. Handvirkt sundurliðaðar grímur eru settar á allar myndir í rammaröð og síðan sendar í MUSCLEMOTION viðbótina. Muscle Motion notar meðalstyrk pixlanna í hverjum ramma til að magngreina hreyfingu hans miðað við viðmiðunarrammann. Gögn voru skráð, síuð og notuð til að magngreina hringrásartíma og meta vefjateygju meðan á hjartahringrás stendur. Upptöku myndbandsins var eftirvinnt með fyrsta stigs núllfasa stafrænu síu. Til að magngreina vefjateygju (topp-til-topps) var framkvæmd topp-til-topps greining til að greina á milli toppa og lægða í upptökumerkinu. Að auki er stefnubreyting framkvæmd með 6. stigs margliðu til að útrýma merkisdrifti. Forritskóði var þróaður í MATLAB til að ákvarða heildarhreyfingu vefja, hringrásartíma, slökunartíma og samdráttartíma (viðbótarforritskóði 44).
Til að greina álag, með því að nota sömu myndbönd og búin voru til fyrir vélræna teygjumat, drógum við fyrst upp tvær myndir sem sýna hreyfitoppa (hæstu (efri) og lægstu (neðri) hreyfingarpunkta) samkvæmt MUSCLEMOTION hugbúnaðinum. Við skiptum síðan vefjasvæðin í hluta og beitum skuggareiknirit á sundurliðaða vefinn (viðbótarmynd 2a). Sundurliðaða vefnum var síðan skipt í tíu undirflöt og álagið á hvert yfirborð var reiknað með eftirfarandi jöfnu: Álag = (Sup-Sdown)/Sdown, þar sem Sup og Sdown eru fjarlægðir lögunarinnar frá efri og neðri skuggum efnisins, talið í sömu röð (viðbótarmynd 2b).
Hjartasneiðar voru festar í 4% paraformaldehýði í 48 klukkustundir. Festir vefir voru þurrkaðir í 10% og 20% ​​súkrósa í 1 klukkustund og síðan í 30% súkrósa yfir nótt. Sneiðarnar voru síðan felldar inn í OCT-efnasamband (OCT-efnasamband) og smám saman frystar í ísópentan/þurrísbaði. Geymið OCT-fellingarblokkir við -80°C þar til þær aðskiljast. Sneiðarnar voru útbúnar sem sneiðar með þykkt 8 μm.
Til að fjarlægja OCT úr hjartasneiðum skal hita glærurnar á hitablokk við 95°C í 5 mínútur. Bætið 1 ml af PBS út í hvert glæru og ræktið í 30 mínútur við stofuhita, síðan er 0,1% Triton-X sett í PBS í gegndreypið í sneiðarnar í 15 mínútur við stofuhita. Til að koma í veg fyrir að ósértæk mótefni bindist sýninu skal bæta 1 ml af 3% BSA lausn út í glærurnar og ræktið í 1 klukkustund við stofuhita. BSA var síðan fjarlægt og glærurnar þvegnar með PBS. Merkið hvert sýni með blýanti. Frummótefni (þynnt 1:200 í 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) og troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) voru bætt við á 90 mínútum, síðan aukamótefnum (þynnt 1:200 í 1% BSA) gegn mús Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), gegn kanínu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) í 90 mínútur til viðbótar. Þvegið 3 sinnum með PBS. Til að greina á milli litunar á markhópnum og bakgrunnslitunar notuðum við aðeins aukamótefnið sem samanburð. Að lokum var DAPI kjarnalitun bætt við og glærurnar voru settar í Vectashield (Vector Laboratories) og innsiglaðar með naglalakki. -x stækkun) og Keyence smásjá með 40x stækkun.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) í styrk 5 μg/ml í PBS var notað til WGA litunar og sett á fastar sneiðar í 30 mínútur við stofuhita. Glærurnar voru síðan þvegnar með PBS og Sudan black var bætt við hverja glæru og ræktaðar í 30 mínútur. Glærurnar voru síðan þvegnar með PBS og Vectashield innfellingarmiðli var bætt við. Glærurnar voru skoðaðar með Keyence smásjá við 40 falda stækkun.
OCT var fjarlægt úr sýnunum eins og lýst er hér að ofan. Eftir að OCT hafði verið fjarlægt voru glærurnar dýftar í Bouins lausn yfir nótt. Glærurnar voru síðan skolaðar með eimuðu vatni í 1 klukkustund og síðan settar í Bibrich aloe sýru fúksín lausn í 10 mínútur. Síðan voru glærurnar þvegnar með eimuðu vatni og settar í lausn af 5% fosfómólýbden/5% fosfórwolframsýru í 10 mínútur. Glærurnar voru færðar beint yfir í anilínbláu lausnina í 15 mínútur án þess að skola. Síðan voru glærurnar þvegnar með eimuðu vatni og settar í 1% ediksýrulausn í 2 mínútur. Glærurnar voru þurrkaðar í 200 N etanóli og fluttar yfir í xýlen. Litaðar glærur voru skoðaðar með Keyence smásjá með 10x hlutgleri. Hlutfall vefjastrengjaflatarmáls var magngreint með Keyence Analyzer hugbúnaði.
CyQUANT™ MTT frumnalífvænleikapróf (Invitrogen, Carlsbad, Kaliforníu), vörulistanúmer V13154, samkvæmt verklagsreglum framleiðanda með nokkrum breytingum. Sérstaklega var notað skurðaðgerðarhnífur með 6 mm þvermál til að tryggja einsleita vefjastærð við MTT greiningu. Vefir voru settir hver fyrir sig í hol á 12 hols plötu sem innihélt MTT hvarfefni samkvæmt verklagsreglum framleiðanda. Sneiðarnar eru ræktaðar við 37°C í 3 klukkustundir og lifandi vefurinn umbrotnar MTT hvarfefnið til að mynda fjólublátt formazan efnasamband. Skiptið MTT lausninni út fyrir 1 ml af DMSO og ræktið við 37°C í 15 mínútur til að draga fjólublátt formazan úr hjartasneiðum. Sýnin voru þynnt 1:10 í DMSO í 96 hols glærum botnplötum og fjólublár litstyrkur mældist við 570 nm með Cytation plötulesara (BioTek). Mælingarnar voru staðlaðar miðað við þyngd hverrar sneiðar af hjartanu.
Hjartasneiðarmiðillinn var skipt út fyrir miðil sem innihélt 1 μCi/ml [5-3H]-glúkósa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Bandaríkin) fyrir glúkósanýtingarpróf eins og áður hefur verið lýst. Eftir 4 klukkustunda ræktun var 100 µl af miðli bætt í opið örskiljunarrör sem innihélt 100 µl af 0,2 N HCl. Síðan var rörið sett í sindurrör sem innihélt 500 µl af dH2O til að gufa upp [3H]2O í 72 klukkustundir við 37°C. Þá var örskiljunarrörið fjarlægt úr sindurrörinu og 10 ml af sindurvökva bætt við. Sindurtalningar voru framkvæmdar með Tri-Carb 2900TR vökvasindurgreiningartæki (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Bandaríkin). Glúkósanýting var síðan reiknuð með hliðsjón af [5-3H]-glúkósa sértækri virkni, ófullkomnu jafnvægi og bakgrunni, þynningu [5-3H]- í ómerktan glúkósa og skilvirkni sindurmælisins. Gögnin eru staðluð miðað við massa hjartasneiðanna.
Eftir að vefurinn var jafnframt gerður í Trizol var RNA einangrað úr hjartasneiðum með því að nota Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Undirbúningur RNAsec bókasafnsins, raðgreining og gagnagreining fór fram á eftirfarandi hátt:
1 μg af RNA í hvert sýni var notað sem upphafsefni fyrir undirbúning RNA bókasafnsins. Raðgreiningarbókasöfn voru búin til með því að nota NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit fyrir Illumina (NEB, Bandaríkin) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda og vísitölukóðar voru bætt við eigindaröðina fyrir hvert sýni. Í stuttu máli var mRNA hreinsað úr heildar RNA með því að nota segulperlur sem voru festar með poly-T oligonucleotíðum. Sundrunin er framkvæmd með því að nota tvígildar katjónir við hátt hitastig í NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Fyrsti þráður cDNA var myndaður með því að nota handahófskenndar hexamer praimera og M-MuLV öfuga umritun (RNase H-). Annar þráður cDNA er síðan myndaður með því að nota DNA pólýmerasa I og RNase H. Eftirstandandi yfirhangar eru breyttir í sljó enda með exonucleasa/pólýmerasa virkni. Eftir adenýleringu 3′ enda DNA brotsins er NEBNext millistykki með hárnálalykkjubyggingu fest við það til að undirbúa það fyrir blending. Til að velja cDNA brot af æskilegri lengd 150-200 bp. Brot úr bókasafninu voru hreinsuð með AMPure XP kerfinu (Beckman Coulter, Beverly, Bandaríkjunum). Síðan var notað 3 μl af USER ensími (NEB, Bandaríkjunum) með stærðarvöldu cDNA tengdu við millistykki í 15 mínútur við 37°C og síðan í 5 mínútur við 95°C fyrir PCR. PCR var síðan framkvæmt með Phusion High-Fidelity DNA pólýmerasa, alhliða PCR praimerum og Index (X) praimerum. Að lokum voru PCR afurðirnar hreinsaðar (AMPure XP kerfi) og gæði bókasafnsins metin á Agilent Bioanalyzer 2100 kerfi. cDNA bókasafnið var síðan raðgreint með Novaseq raðgreini. Óunnar myndskrár frá Illumina voru breytt í hráar lestrar með CASAVA Base Calling. Óunnin gögn eru geymd í FASTQ(fq) sniðsskrám sem innihalda lestraraðir og samsvarandi basaeiginleika. Veldu HISAT2 til að para síaðar raðgreiningarlestrar við Sscrofa11.1 viðmiðunarerfðamengið. Almennt séð styður HISAT2 erfðamengi af hvaða stærð sem er, þar á meðal erfðamengi stærri en 4 milljarðar basa, og sjálfgefin gildi eru stillt fyrir flestar breytur. Hægt er að samstilla splisunarlestur úr RNA raðgreiningargögnum á skilvirkan hátt með HISAT2, hraðasta kerfinu sem völ er á núna, með sömu eða betri nákvæmni en nokkur önnur aðferð.
Fjöldi umrita endurspeglar beint magn genatjáningar. Genatjáningarstig er metið út frá fjölda umrita (raðgreiningarfjölda) sem tengjast erfðamenginu eða exónunum. Fjöldi lestra er í réttu hlutfalli við genatjáningarstig, lengd gena og raðgreiningardýpt. FPKM (brot á hverja þúsund basapör af raðgreindum umriti á hverja milljón basapör) voru reiknuð og P-gildi mismunandi tjáningar voru ákvörðuð með DESeq2 pakkanum. Við reiknuðum síðan falska uppgötvunartíðni (FDR) fyrir hvert P-gildi með því að nota Benjamini-Hochberg aðferðina9 byggt á innbyggðu R-fallinu „p.adjust“.
RNA einangrað úr hjartasneiðum var breytt í cDNA í styrknum 200 ng/μl með því að nota SuperScript IV Vilo Master mix frá Thermo (Thermo, vörunúmer 11756050). Megindleg RT-PCR var framkvæmd með því að nota Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-hola gegnsæja hvarfplötu (Thermo, vörunúmer 4483319) og microamp ljósleiðaralím (Thermo, vörunúmer 4311971). Hvarfblandan samanstóð af 5 µl af Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, vörunúmer 4444557), 0,5 µl af Taqman Primer og 3,5 µl af H2O blöndu í hverjum holi. Staðlaðar qPCR hringrásir voru keyrðar og CT gildi mæld með Applied Biosystems Quantstudio 5 rauntíma PCR tæki (384-hola eining; vörunúmer A28135). Taqman-praimerar voru keyptir frá Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT-gildi allra sýna voru staðluð miðað við housekeeping-genið GAPDH.
Fjölmiðlalosun NT-ProBNP var metin með NT-ProBNP búnaðinum (svín) (vörunúmer MBS2086979, MyBioSource) samkvæmt verklagsreglum framleiðanda. Í stuttu máli voru 250 µl af hverju sýni og staðli bætt í tvítekningu í hvern brunn. Strax eftir að sýninu var bætt við skal bæta 50 µl af prófunarefni A í hvern brunn. Hristið plötuna varlega og innsiglið með þéttiefni. Síðan voru töflurnar ræktaðar við 37°C í 1 klukkustund. Síðan er lausnin soguð upp og brunnarnir þvegnir 4 sinnum með 350 µl af 1X þvottalausn, ræktað í 1-2 mínútur í hvert skipti. Síðan er 100 µl af prófunarefni B bætt við í hvern brunn og innsiglað með plötuþéttiefni. Taflan var varlega hrist og ræktuð við 37°C í 30 mínútur. Sogið upp lausnina og þvoið brunnana 5 sinnum með 350 µl af 1X þvottalausn. Bætið 90 µl af undirlagslausn í hvert brunn og lokið plötunni. Ræktið plötuna við 37°C í 10-20 mínútur. Bætið 50 µl af stöðvunarlausn í hvert brunn. Platan var mæld strax með Cytation (BioTek) plötulesara stilltan á 450 nm.
Aflsgreiningar voru framkvæmdar til að velja hópastærðir sem myndu veita >80% afl til að greina 10% algilda breytingu á breytunni með 5% villutíðni af gerð I. Aflsgreiningar voru framkvæmdar til að velja hópastærðir sem myndu veita >80% afl til að greina 10% algilda breytingu á breytunni með 5% villutíðni af gerð I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% móhnóstí fyrir frídaga 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Aflsgreining var framkvæmd til að velja hópastærðir sem myndu veita >80% afl til að greina 10% algildar breytubreytingar með 5% villutíðni af gerð I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности для обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Gerð var aflsgreining til að velja hópstærð sem myndi veita >80% afl til að greina 10% algildar breytubreytingar og 5% villutíðni af gerð I.Vefjaprófanir voru valdar af handahófi fyrir tilraunina. Allar greiningar voru ástandsblindar og sýnin voru ekki afkóðuð fyrr en öll gögn höfðu verið greind. GraphPad Prism hugbúnaður (San Diego, Kaliforníu) var notaður til að framkvæma allar tölfræðilegar greiningar. Fyrir allar tölfræðiupplýsingar voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05. Fyrir allar tölfræðiupplýsingar voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05. Для всей статистики <0,05. Fyrir allar tölfræðiupplýsingar voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики <0,05. Fyrir allar tölfræðiupplýsingar voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05.Tvíhliða Student's t-próf ​​var framkvæmt á gögnunum með aðeins tveimur samanburðum. Einhliða eða tvíhliða ANOVA var notuð til að ákvarða marktækni milli margra hópa. Þegar framkvæmdar voru eftiráprófanir var Tukey-leiðrétting beitt til að taka tillit til margra samanburða. RNAsec gögn hafa sérstök tölfræðileg atriði í huga við útreikning á FDR og p.adjust eins og lýst er í aðferðakaflanum.
Nánari upplýsingar um rannsóknarsnið er að finna í útdrætti Nature Research Report sem tengist þessari grein.