Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Það er þörf fyrir áreiðanlegt in vitro kerfi sem getur endurskapað lífeðlisfræðilegt umhverfi hjartans nákvæmlega fyrir lyfjapróf.Takmarkað framboð á hjartavefsræktunarkerfum manna hefur leitt til ónákvæmrar túlkunar á áhrifum hjartalyfja.Hér höfum við þróað hjartavefsræktunarlíkan (CTCM) sem örvar hjartasneiðar rafvélrænt og gangast undir lífeðlisfræðilega teygju á slagbils- og þanbilsfasa hjartahringsins.Eftir 12 daga ræktun bætti þessi aðferð að hluta til lífvænleika hjartahluta, en varðveitti ekki að fullu uppbyggingu heilleika þeirra.Þess vegna, eftir litla sameindaskimun, komumst við að því að viðbót 100 nM tríjodótýróníns (T3) og 1 μM dexametasóns (Dex) við miðilinn okkar hélt örbyggingu hlutans í 12 daga.Í samsettri meðferð með T3/Dex meðferð hélt CTCM kerfið uppskriftarsniði, lífvænleika, efnaskiptavirkni og uppbyggingu heilleika á sama stigi og ferskur hjartavefur í 12 daga.Að auki veldur of mikil teygja á hjartavef í ræktun ofstækkun hjartaboða, sem gefur vísbendingar um getu CTCM til að líkja eftir ofstækkun aðstæðum sem orsakast af hjartateygju.Að lokum getur CTCM líkan lífeðlisfræði og meinalífeðlisfræði hjartans í ræktun yfir langan tíma, sem gerir áreiðanlega lyfjaskimun kleift.
Fyrir klínískar rannsóknir þarf áreiðanleg in vitro kerfi sem geta endurskapað lífeðlisfræðilegt umhverfi mannshjartans nákvæmlega.Slík kerfi ættu að líkja eftir breyttum vélrænni teygju, hjartslætti og raflífeðlisfræðilegum eiginleikum.Dýralíkön eru almennt notuð sem skimunarvettvangur fyrir lífeðlisfræði hjartans með takmarkaðan áreiðanleika til að endurspegla áhrif lyfja í mannshjarta1,2.Að lokum er Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) líkan sem er mjög viðkvæmt og sértækt fyrir ýmsar lækninga- og lyfjafræðilegar inngrip, sem endurskapar nákvæmlega lífeðlisfræði og meinalífeðlisfræði mannshjartans3.Skortur á slíku kerfi takmarkar uppgötvun nýrra meðferða við hjartabilun4,5 og hefur leitt til eiturverkana á hjartalyf sem aðalástæða þess að fara af markaðnum6.
Á síðasta áratug hafa átta lyf sem ekki eru hjarta- og æðasjúkdómar verið tekin úr klínískri notkun vegna þess að þau valda lengingu QT-bils sem leiðir til sleglahjartsláttartruflana og skyndilegs dauða7.Þannig er aukin þörf fyrir áreiðanlegar forklínískar skimunaraðferðir til að meta verkun á hjarta og æðakerfi og eiturverkanir.Nýleg notkun fjölhæfra stofnfrumnaafleiddra hjartavöðvafrumna (hiPS-CM) af mannavöldum við lyfjaskimun og eiturhrifapróf gefur að hluta til lausn á þessu vandamáli.Hins vegar er óþroskað eðli hiPS-CMs og skortur á fjölfrumuflóknum hjartavef helstu takmarkanir þessarar aðferðar.Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að hægt er að yfirstíga þessa takmörkun að hluta með því að nota snemma hiPS-CM til að mynda hjartavefsvetnisgel stuttu eftir upphaf sjálfkrafa samdráttar og auka smám saman raförvun með tímanum.Hins vegar skortir þessar hiPS-CM örvefur þroskaða raflífeðlisfræðilega og samdrætti eiginleika fullorðins hjartavöðva.Að auki hefur hjartavefur manna flóknari uppbyggingu, sem samanstendur af ólíkri blöndu af mismunandi frumugerðum, þar á meðal æðaþelsfrumum, taugafrumum og stromal fibroblasts, samtengdum með sérstökum settum utanfrumu fylkispróteina.Þessi ólíkleiki hópa sem ekki eru hjartavöðvafrumur 11,12,13 í fullorðins spendýrahjarta er mikil hindrun í því að móta hjartavef með því að nota einstakar frumugerðir.Þessar helstu takmarkanir leggja áherslu á mikilvægi þess að þróa aðferðir til að rækta ósnortinn hjartavef við lífeðlisfræðilegar og meinafræðilegar aðstæður.
Ræktaðir þunnir (300 µm) hlutar af hjarta mannsins hafa reynst vænleg fyrirmynd að ósnortnu hjartavöðva manna.Þessi aðferð veitir aðgang að fullkomnu þrívíddar fjölfrumakerfi svipað og hjartavef manna.Hins vegar, þar til 2019, var notkun ræktaðra hjartahluta takmörkuð af stuttri (24 klst) ræktunarlifun.Þetta er vegna fjölda þátta, þar á meðal skortur á líkamlega-vélrænni teygju, loft-vökva tengi og notkun á einföldum miðlum sem styðja ekki þarfir hjartavefs.Árið 2019 sýndu nokkrir rannsóknarhópar fram á að innlimun vélrænna þátta í hjartavefsræktunarkerfi getur lengt líf ræktunar, bætt tjáningu hjartans og líkt eftir meinafræði hjartans.Tvær glæsilegar rannsóknir 17 og 18 sýna að einása vélræn hleðsla hefur jákvæð áhrif á svipgerð hjartans við ræktun.Hins vegar notuðu þessar rannsóknir ekki kraftmikla þrívídd eðlisfræðilega og vélrænni hleðslu á hjartahringnum, þar sem hjartahlutar voru hlaðnir annað hvort með ísómetrískum togkrafti 17 eða línulegri sjálfstýrðri hleðslu 18 .Þessar aðferðir við vefteygjur leiddu til bælingar á mörgum hjartagenum eða oftjáningu gena sem tengjast óeðlilegum teygjuviðbrögðum.Athyglisvert er að Pitoulis o.fl.19 þróaði kraftmikið hjartasneiðræktunarbað fyrir enduruppbyggingu hjartahringsins með því að nota kraftbreytiendurgjöf og spennudrif.Þó að þetta kerfi geri ráð fyrir nákvæmari in vitro hjartalotulíkönum, takmarkar flókið og lítið afköst aðferðarinnar beitingu þessa kerfis.Rannsóknarstofan okkar hefur nýlega þróað einfaldað ræktunarkerfi sem notar raförvun og fínstilltan miðil til að viðhalda lífvænleika hluta af svína- og hjartavef manna í allt að 6 daga20,21.
Í núverandi handriti lýsum við hjartavefsræktunarlíkani (CTCM) með því að nota hluta af svínahjarta sem inniheldur húmorsvísbendingar til að rifja upp þrívíddar lífeðlisfræði hjartans og meinalífeðlisfræðilega útþenslu meðan á hjartahringnum stendur.Þessi CTCM getur aukið nákvæmni forklínískrar lyfjaspár að því marki sem aldrei hefur verið náð með því að bjóða upp á hagkvæmt hjartakerfi með miðlungs afköst sem líkir eftir lífeðlisfræði/meinalífeðlisfræði spendýrahjarta fyrir forklíníska lyfjaprófun.
Blóðaflfræðileg vélræn merki gegna mikilvægu hlutverki við að viðhalda starfsemi hjartavöðvafruma in vitro 22,23,24.Í núverandi handriti höfum við þróað CTCM (Mynd 1a) sem getur líkt eftir hjartaumhverfi fullorðinna með því að framkalla bæði raf- og vélræna örvun við lífeðlisfræðilega tíðni (1,2 Hz, 72 slög á mínútu).Til að forðast of mikla vefjateygju á meðan á þanbili stóð var notað þrívíddarprentunartæki til að auka stærð vefja um 25% (mynd 1b).Rafmagnsgangur framkallaður af C-PACE kerfinu var tímasettur til að byrja 100 ms fyrir slagbil með því að nota gagnaöflunarkerfi til að endurskapa hjartahringinn að fullu.Vefræktunarkerfið notar forritanlegan pneumatic stýribúnað (LB Engineering, Þýskalandi) til að stækka sveigjanlega sílikonhimnu í hringrás til að valda stækkun hjartasneiðanna í efri hólfinu.Kerfið var tengt ytri loftlínu í gegnum þrýstimæli sem gerði það mögulegt að stilla þrýsting (± 1 mmHg) og tíma (± 1 ms) nákvæmlega (mynd 1c).
a Festið vefjahlutann við 7 mm stuðningshringinn, sýndan í bláu, inni í ræktunarhólf tækisins.Ræktunarhólfið er aðskilið frá lofthólfinu með þunnri sveigjanlegri sílikonhimnu.Settu þéttingu á milli hvers hólfs til að koma í veg fyrir leka.Lokið á tækinu inniheldur grafít rafskaut sem veita raförvun.b Skýringarmynd af stórvefjabúnaðinum, stýrihringnum og stuðningshringnum.Vefjahlutarnir (brúnir) eru settir á yfirstærða tækið með stýrihringnum í raufina á ytri brún tækisins.Notaðu leiðarvísirinn og settu stuðningshringinn sem er húðaður með vefjakrýllími varlega yfir hluta hjartavefsins.c Gröf sem sýnir tíma raförvunar sem fall af þrýstingi í lofthólfinu sem er stjórnað af forritanlegum pneumatic actuator (PPD).Gagnaöflunartæki var notað til að samstilla raförvun með þrýstingsskynjara.Þegar þrýstingurinn í ræktunarhólfinu nær settum þröskuldi er púlsmerki sent til C-PACE-EM til að koma af stað raförvun.d Mynd af fjórum CTCM settum á hitakassahillu.Fjögur tæki eru tengd við einn PPD í gegnum loftrás og þrýstingsskynjarar eru settir inn í blæðingarlokann til að fylgjast með þrýstingnum í loftrásinni.Hvert tæki inniheldur sex vefjahluta.
Með því að nota einn pneumatic stýribúnað, gátum við stjórnað 4 CTCM tækjum, sem hvert um sig gat haldið 6 vefjahlutum (mynd 1d).Í CTCM er loftþrýstingnum í lofthólfinu breytt í samstilltan þrýsting í vökvahólfinu og framkallar lífeðlisfræðilega stækkun hjartasneiðarinnar (Mynd 2a og viðbótarmynd 1).Mat á vefteygju við 80 mm Hg.gr.sýndu teygjur á vefjasneiðum um 25% (mynd 2b).Sýnt hefur verið fram á að þessi prósenta teygja samsvarar lífeðlisfræðilegri lengd sarkómera 2,2–2,3 µm fyrir eðlilega samdráttarhæfni hjartahluta17,19,25.Hreyfing vefja var metin með því að nota sérsniðnar myndavélarstillingar (aukamynd 1).Magn og hraði vefjahreyfingar (mynd 2c, d) samsvaraði teygju á hjartahringnum og tíma á slagbili og þanbili (mynd 2b).Teygja og hraði hjartavefs við samdrátt og slökun hélst stöðug í 12 daga í ræktun (mynd 2f).Til að meta áhrif raförvunar á samdrátt í ræktun, þróuðum við aðferð til að ákvarða virka aflögun með því að nota skyggingaralgrím (aukamynd 2a,b) og gátum greint á milli aflögunar með og án raförvunar.Sami hluti hjartans (mynd 2f).Í hreyfanlegu svæði skurðarins (R6-9) var spennan við raförvun 20% hærri en án raförvunar, sem gefur til kynna framlag raförvunar til samdráttarvirkni.
Fulltrúar ummerki um þrýsting í lofthólfinu, þrýstingi í vökvahólfinu og mælingar á hreyfingum vefja staðfesta að þrýstingur í hólfinu breytir þrýstingi vökvahólfsins, sem veldur samsvarandi hreyfingu á vefjasneiðinni.b Sýndar ummerki um prósenta teygju (blár) vefjahluta sem samsvara prósentu teygju (appelsínugult).c Mæld hreyfing hjartasneiðarinnar er í samræmi við mældan hreyfihraða.(d) Sýndarferlar hringlaga hreyfingar (blá lína) og hraða (appelsínugul punktalína) í sneið af hjartanu.e Magngreining á hringrásartíma (n = 19 sneiðar á hóp, frá mismunandi svínum), samdráttartími (n = 19 sneiðar í hóp), slökunartími (n = 19 sneiðar í hóp, frá mismunandi svínum), hreyfing vefja (n = 25 ).sneiðar)/hópur frá mismunandi svínum), hámarks slagbilshraði (n = 24(D0), 25(D12) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum) og hámarks slökunarhraði (n=24(D0), 25(D12) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum).Tvíhliða t-próf ​​nemenda sýndi engan marktækan mun á neinni breytu.f Fulltrúi stofngreiningar ummerki um vefjasneiðar með (rauðum) og án (bláar) raförvun, tíu svæðisbundin svæði vefjahluta frá sama hluta.Neðstu spjöldin sýna magngreiningu á hlutfallsmun á álagi í vefjasneiðum með og án raförvunar á tíu svæðum frá mismunandi skurðum. (n = 8 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, Tvíhliða nemenda t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, Tvíhliða nemenda t-próf ​​er framkvæmt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 víxlar/hrúffur frá разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01,01. (n = 8 hlutar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða t-próf ​​nemenda; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01＀0.5） (n = 8 krónur/hrúppur, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 hlutar/hópur, frá mismunandi svínum, tvíhliða t-próf ​​nemenda; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Í fyrra kyrrstæða lífhermikerfi hjartasneiðaræktunarkerfisins okkar [20, 21] héldum við lífvænleika, virkni og uppbyggingu heilleika hjartasneiða í 6 daga með því að beita raförvun og fínstilla miðlungssamsetninguna.Hins vegar, eftir 10 daga, lækkuðu þessar tölur verulega.Við munum vísa til hluta sem ræktaðir voru í fyrri kyrrstöðu lífhermiræktunarkerfi okkar 20, 21 stjórnunarskilyrðum (Ctrl) og við munum nota áður bjartsýni miðil okkar sem MC aðstæður og ræktun undir samtímis vélrænni og raförvun (CTCM).kallaði.Í fyrsta lagi komumst við að því að vélræn örvun án raförvunar væri ófullnægjandi til að viðhalda lífvænleika vefja í 6 daga (aukamynd. 3a, b).Athyglisvert er að með tilkomu líkamlegrar vélrænnar og raförvunar með því að nota STCM, hélst lífvænleiki 12 daga hjartahluta það sama og í ferskum hjartaköflum við MS aðstæður, en ekki við Ctrl aðstæður, eins og sýnt er með MTT greiningu (mynd 1).3a).Þetta bendir til þess að vélræn örvun og eftirlíking á hjartahringnum geti haldið vefjahlutum lífvænlegum í tvöfalt lengri tíma en greint var frá í fyrra kyrrstæða ræktunarkerfi okkar.Hins vegar, mat á uppbyggingu heilleika vefjasneiða með ónæmismerkingu á hjartatróponíni T og connexíni 43 sýndi að connexin 43 tjáning var marktækt meiri í MC vefjum á 12. degi en í samanburðarhópi sama dag.Hins vegar var samræmd connexin 43 tjáning og Z-diskur myndun ekki að fullu viðhaldið (mynd 3b).Við notum gervigreindarramma (AI) til að mæla skipulagsheilleika vefja26, myndbundin djúpnámsleiðsla sem byggir á troponin-T og connexin litun43 til að mæla sjálfkrafa uppbyggingu heilleika og flúrljómun hjartasneiða með tilliti til styrkleika staðsetningar.Þessi aðferð notar Convolutional Neural Network (CNN) og djúpnámsramma til að meta áreiðanlega uppbyggingu heilleika hjartavefs á sjálfvirkan og hlutlausan hátt, eins og lýst er í tilvísuninni.26. MC vefur sýndi bætta uppbyggingu líkt við dag 0 samanborið við köflum við truflanir.Að auki sýndi þríkróm litun Masson marktækt lægra hlutfall bandvefsmyndunar við MS aðstæður samanborið við samanburðarskilyrði á 12. degi ræktunar (mynd 3c).Þó að CTCM hafi aukið lífvænleika hjartavefshluta á degi 12 í svipað magn og fersks hjartavefs, bætti það ekki marktækt uppbyggingu heilleika hjartahlutanna.
súlurit sýnir magngreiningu á MTT lífvænleika ferskra hjartasneiða (D0) eða hjartasneiðaræktunar í 12 daga annaðhvort í kyrrstöðuræktun (D12 Ctrl) eða í CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur,#0 er framkvæmt á annan hátt ANO-svín/hópur,#0 er framkvæmt á annan hátt. 01 miðað við D0 og **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl). súlurit sýnir magngreiningu á MTT hagkvæmni ferskra hjartasneiða (D0) eða hjartasneiðaræktunar í 12 daga annaðhvort í kyrrstöðuræktun (D12 Ctrl) eða í CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) á einn hátt frá ANOs/Group,# prófun á annan hátt <0p VAs/#,# próf. 001 miðað við D0 og **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl).súluritið sýnir magngreiningu á hagkvæmni MTT ferskra hjartaskurða (D0) eða ræktunar hjartaskurða í 12 daga í annaðhvort kyrrstæðum ræktun (D12 viðmiðun) eða CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 viðmiðun). ) ), 12 (D12 MC) hlutar/hópur er gerður úr einni svíni/hóp;####p < 0,0001 á сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 miðað við D0 og **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心心脏切牄切 牄切 片(D2)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎D ４，测踎D#0p#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心不脏別片 片(D0脏切片) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**psúlurit sem sýnir magngreiningu á MTT lífvænleika í ferskum hjartaköflum (D0) eða hjartaköflum sem eru ræktaðir í 12 daga í kyrrstöðuræktun (D12 viðmiðun) eða CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 viðmiðunar)), 12 (D12 MC) hlutar/hópur úr mismunandi ANOVA-prófi;####p < 0,0001 á сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 miðað við D0, **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl).b Troponin-T (grænt), connexin 43 (rautt) og DAPI (blátt) í nýeinangruðum hjartaköflum (D0) eða hjartaköflum ræktaðir við kyrrstöðuskilyrði (Ctrl) eða CTCM skilyrði (MC) í 12 daga) af dæmigerðum ónæmisflúrljómunarmyndum (eyðukvarði = 100 µm). Gervigreindarmagn á uppbyggingu heilleika hjartavefsins (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 miðað við D0 og D100 p < 1 samanborið við 0 ****p < 0). Gervigreind magngreining á uppbyggingu heilleika hjartavefsins (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 miðað við D0 og D100p <10.Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 сого), 7 (D12 сого), прег (D12 сого), зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 á rás D0 og ****p < 0,0001 á D12ю). Magngreining á uppbyggingu heilleika hjartavefs með gervigreind (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hlutar/hópar frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; ####p < 0,0001 á móti D0 og D0201 borið saman við D0 og D****001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópa hverja af mismunandi grísum, einstefnu ANO#0P próf <1;## ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sneiðar/hópa hverja af mismunandi svínum, einhliða .#0#0VA próf .#0#D;#D; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl/MC) (D512 Ctrl) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравния). Gervigreind til að mæla byggingarheilleika hjartavefs (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hlutar/hópur hvers mismunandi svína, einhliða ANOVA próf; ####p<0.0001 vs .D0 < samanburður við D****0201 til samanburðar .****01). c Fulltrúarmyndir (vinstri) og magngreining (hægri) fyrir hjartasneiðar litaðar með Masson's trichrome bletti (Skala ber = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,0001 samanborið við D0 og D0.*** Ctrl). c Fulltrúarmyndir (vinstri) og magngreining (hægri) fyrir hjartasneiðar litaðar með Masson's trichrome bletti (Scale ber = 500 µm) (n = 10 sneiðar/hópur hver frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; #### p < 0,0001 samanborið við D0,010***p < D0 og D0. c Репрезентативные изображения (слева) og количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром штаб без покрытия = 500 mkm) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюний тевою тев ### ANOVA; D0 og ***p < 0,001 á сравнению с D12 Ctrl). c Sýndarmyndir (vinstri) og magngreining (hægri) af hjartahlutum lituðum með Masson's trichrome bletti (óhúðaður mælikvarði = 500 µm) (n = 10 hlutar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; #### p < 0 .0001 miðað við D0 og 100p Ctrl samanborið við D0 og 100p Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺剼（裸=尺剼切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，D0 相比，02 Ctrl <01***p. . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰 帺尺庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 0 # Anova 浵 0 # Anova .相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) og количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмный я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофоногоного ;### #p < 0,0001 með D0, ***p < 0,001 með D12 Ctrl). c Fulltrúarmyndir (vinstri) og magngreining (hægri) af hjartahlutum lituðum með Masson's trichrome bletti (autt = 500 µm) (n = 10 hlutar/hópur, hver frá öðru svíni, prófuð með einhliða dreifnigreiningu ;### # p < 0,0001 samanborið við D0, Ctrl***p < D0, Ctrl*** p < D0, Ctrl***).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Við gerðum þá tilgátu að með því að bæta litlum sameindum við ræktunarmiðilinn væri hægt að bæta heilleika hjartavöðvafrumna og draga úr bandvefsmyndun við CTCM ræktun.Við skimuðum því fyrir litlum sameindum með því að nota truflanir okkar 20,21 vegna þess hve fáir truflandi þættir eru.Dexametasón (Dex), trijodothyronine (T3) og SB431542 (SB) voru valin fyrir þessa skjámynd.Þessar litlu sameindir hafa áður verið notaðar í hiPSC-CM ræktun til að örva þroska hjartavöðvafrumna með því að auka lengd sarkómera, T-píplur og leiðnihraða.Að auki er vitað að bæði Dex (sykursteri) og SB bæla bólgu29,30.Þess vegna prófuðum við hvort innlimun einnar eða samsetningar þessara litlu sameinda myndi bæta uppbyggingu heilleika hjartahluta.Fyrir upphafsskimun var skammtur hvers efnasambands valinn út frá þeim styrk sem almennt er notaður í frumuræktunarlíkönum (1 μM Dex27, 100 nM T327 og 2,5 μM SB31).Eftir 12 daga ræktun leiddi samsetning T3 og Dex til ákjósanlegrar uppbyggingu hjartavöðvafruma og lágmarks endurgerð trefja (viðbótarmyndir 4 og 5).Að auki olli notkun á tvöföldum eða tvöföldum þessum styrk T3 og Dex skaðlegum áhrifum samanborið við venjulegan styrk (aukamynd. 6a,b).
Eftir fyrstu skimun gerðum við samanburð á 4 ræktunarskilyrðum (mynd 4a): Ctrl: Hjartahlutar ræktaðir í kyrrstöðuræktinni okkar sem áður var lýst með því að nota fínstillt miðil okkar;20.21 TD: T3 og Ctrl s Bætt við Dex á miðvikudag;MC: hjartahlutar ræktaðir í CTCM með því að nota áður bjartsýni miðil okkar;og MT: CTCM með T3 og Dex bætt við miðilinn.Eftir 12 daga ræktun hélst lífvænleiki MS og MT vefja sú sama og í ferskum vefjum sem metnir voru með MTT prófun (mynd 4b).Athyglisvert er að viðbót T3 og Dex við transwell ræktun (TD) leiddi ekki til marktækrar framförar á lífvænleika samanborið við Ctrl aðstæður, sem gefur til kynna mikilvægu hlutverki vélrænnar örvunar við að viðhalda lífvænleika hjartahluta.
skýringarmynd fyrir tilraunahönnun sem sýnir ræktunarskilyrðin fjögur sem notuð eru til að meta áhrif vélrænnar örvunar og T3/Dex viðbót á miðil í 12 daga. b Súlurit sýnir magngreiningu á hagkvæmni 12 dögum eftir ræktun í öllum 4 ræktunarskilyrðum (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur,# er framkvæmt á annan hátt ANOp 0,# prófun <NOp 0;#; 001, ###p < 0,001 miðað við D0 og **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl). b Súlurit sýnir magngreiningu á hagkvæmni 12 dögum eftir ræktun í öllum 4 ræktunarskilyrðum (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sneiðar/hópur,# er framkvæmt á annan hátt ANOp 0,# prófun <NOp 0;#; 001, ###p < 0,001 miðað við D0 og **p < 0,01 miðað við D12 stjórnun). b Гистограмма показывает количественную оценку. ования (контроль, TD, MC og MT) á сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12) поров (D12) сров (D0) т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 á сравнению с D0 og **p á 0, 01 p < 0,01). b Súluritið sýnir magngreiningu á hagkvæmni 12 dögum eftir ræktun í öllum 4 ræktunarskilyrðunum (viðmiðunaraðstæður, TD, MC og MT) samanborið við ferska hjartahluta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) frá mismunandi slóðum/# VA; 001, ###p < 0,001 á móti D0 og **p < 0,01 miðað við D12 Ctrl). b. MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，，##**#p < 0.0与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC og MT) á сравнению со свежезц (1) (1) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), frá разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #с###p <0,#0#0p <0,#01p <0,#0#0 с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Vísumynd sem sýnir allar 4 ræktunarskilyrðin (viðmið, TD, MC og MT) samanborið við ferska hjartahluta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), frá mismunandi grísum 12 (D12 MC) hlutum/hópi, einhliða ANOVAp1, #0##0, #.0##0, #.0#0 , **p<0,01 á móti stjórn D12). c Súlurit sýnir magn glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun í öllum 4 ræktunarskilyrðunum (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ###p < 0,001, samanborið við 10.200 p < D0 og 20*** p < D0 og D0.*** p < D0 og D0. c Súlurit sýnir magn glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun í öllum 4 ræktunarskilyrðunum (Ctrl, TD, MC og MT) samanborið við ferskar hjartasneiðar (D0) (n = 6 sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; ###p < 0,001, samanborið við 10.200 p < D0 og 20*** p < D0 og D0.*** p < D0 og D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висовис ания (контроль, TD, MC og MT). ся тест ANOVA; ###p < 0,001 á сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Vísumynd sýnir magn glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun við allar 4 ræktunarskilyrðin (viðmiðunaraðstæður, TD, MC og MT) samanborið við ferska hjartahluta (D0) (n = 6 hlutar/hópur frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf framkvæmt; ###p < 0,001 miðað við D0 og 102p <Ctrl borið saman við D0 og 102p <Ctrl). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与***D0 盌，与***D0 盌 ，与***D0 盌相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， Ｇ ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 定量 （ 养 后 后测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированив 4 для 4 дней после культивированивий рования (контроль, TD, MC og MT). роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 á сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Vísumynd sem sýnir magn glúkósaflæðis 12 dögum eftir ræktun fyrir allar 4 ræktunarskilyrðin (viðmiðunarskilyrði, TD, MC og MT) samanborið við ferska hjartahluta (D0) (n = 6 hlutar/hópur, frá mismunandi svínum, einhliða Voru ANOVA prófanir gerðar, ###p < 0,0,001 samanborið við D.***1 samanborið við D.***0 samanborið við D.***0).d Stofnagreiningarreitir af ferskum (bláum), 12 MC (grænum) og degi 12 MT (rauðum) vefjum á tíu svæðisbundnum vefjaskurðarstöðum (n = 4 sneiðar/hópur, einhliða ANOVA próf; enginn marktækur munur var á milli hópa).e Volcano plot sem sýnir misjafnlega tjáð gen í ferskum hjartaköflum (D0) samanborið við hjartahluta sem ræktaðir eru við kyrrstæðar aðstæður (Ctrl) eða við MT aðstæður (MT) í 10-12 daga.f Hitakort af sarkómergenum fyrir hjartahluta sem ræktaðir eru við hverja ræktunarskilyrði.Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Efnaskiptaháð því að skipta frá fitusýruoxun yfir í glýkólýsu er einkennisgrein hjartavöðvafrumna.Óþroskaðir hjartavöðvafrumur nota fyrst og fremst glúkósa til ATP framleiðslu og eru með vanþroska hvatbera með fáum kristum5,32.Glúkósanýtingargreiningar sýndu að við MC og MT aðstæður var glúkósanýting svipuð og í vefjum á degi 0 (Mynd 4c).Hins vegar sýndu Ctrl sýni marktæka aukningu á nýtingu glúkósa miðað við ferskan vef.Þetta gefur til kynna að samsetning CTCM og T3/Dex eykur lífvænleika vefja og varðveitir efnaskiptasvipgerð 12 daga ræktaðra hjartahluta.Að auki sýndi stofngreining að stofnmagn hélst það sama og í ferskum hjartavef í 12 daga við MT og MS aðstæður (mynd 4d).
Til að greina heildaráhrif CTCM og T3/Dex á alþjóðlegt umritunarlandslag hjartasneiðvefs, gerðum við RNAseq á hjartasneiðum frá öllum fjórum mismunandi ræktunarskilyrðum (viðbótargögn 1).Athyglisvert er að MT hlutar sýndu mikla umritunarlíkingu við ferskan hjartavef, með aðeins 16 mismunandi tjáningu af 13.642 genum.Hins vegar, eins og við sýndum áðan, sýndu Ctrl sneiðar 1229 mismunandi genum eftir 10-12 daga í ræktun (mynd 4e).Þessar upplýsingar voru staðfestar með qRT-PCR af hjarta- og trefjafrumugenum (viðbótarmynd 7a-c).Athyglisvert er að Ctrl hlutar sýndu niðurstjórnun á hjarta- og frumuhringsgenum og virkjun bólgugena.Þessar upplýsingar benda til þess að aðgreining, sem venjulega á sér stað eftir langvarandi ræktun, sé algjörlega veikt við MT aðstæður (aukamynd. 8a, b).Nákvæm rannsókn á sarkómerum genum sýndi að aðeins við MT aðstæður eru genin sem kóða sarkómerinn (mynd 4f) og jónarásin (aukamynd 9) varðveitt og vernda þau gegn bælingu við Ctrl, TD og MC aðstæður.Þessi gögn sýna að með blöndu af vélrænni og húmorískri örvun (T3/Dex) getur umritið hjartasneiðar haldist svipað og ferskar hjartasneiðar eftir 12 daga í ræktun.
Þessar umritunarniðurstöður eru studdar af þeirri staðreynd að uppbyggingarheilleiki hjartavöðvafrumna í hjartaskurðum er best varðveittur við MT aðstæður í 12 daga, eins og sést af ósnortnu og staðbundnu connexin 43 (mynd 5a).Að auki minnkaði bandvefsmyndun í hjartaköflum við MT aðstæður marktækt miðað við Ctrl og svipað og ferskum hjartaköflum (mynd 5b).Þessi gögn sýna að samsetning vélrænnar örvunar og T3/Dex meðferð varðveitir á áhrifaríkan hátt hjartabyggingu í hjartaköflum í ræktun.
a Fulltrúi ónæmisflúrljómunarmynda af troponin-T (grænt), connexin 43 (rautt) og DAPI (blátt) í nýeinangruðum hjartaköflum (D0) eða ræktað í 12 daga í öllum fjórum hjartahlutaræktunarskilyrðum (kvarðastika = 100 µm).). Gervigreindarmagn á uppbyggingu heilleika hjartavefsins (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sneiðar/hóp frá mismunandi svínum, einstefnu ANOVA próf er framkvæmt; ####p < 0,00001 samanborið við D0.0001 samanborið við D0.0001 samanborið við D0.0001 og D0.0001 samanborið við D0,0. 12 Ctrl). Gervigreindarmagn á uppbyggingu heilleika hjartavefsins (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sneiðar/hóp frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf er framkvæmt; #### p < 0,00001 samanborið við D0.0001 samanborið við D0.0001 samanborið við D0,0. 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12TD), и D12TD), и D12D, 5 (D12 Ctrl), 2 MT) rásir/spilarar frá разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 á сравнению с 0 и 0,01 ****p <0 и 0,01**** внению с D12 Ctrl). Magngreining á uppbyggingu heilleika hjartavefs með gervigreind (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) hlutar/hópur frá mismunandi svínum, einhliða ANOVA próf framkvæmt; #### p < 0,0001 p < 0,0001 samanborið við D02.0 og D01 p < 0 0,00 5 miðað við D02. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼片忇ﺛ衉缇忈ﺿ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，戔****p < 0,000 Ctrl对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 d12 mc 庄 缌 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 缌 0.0****D < 0.05 缌斔****相比）.Magngreining á uppbyggingu heilleika hjartavefs með gervigreind í mismunandi svínum (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) hluta/hóp) með einstefnu ANOVA prófi;#### p < 0,0001 á milli D0 og *p < 0,05 eða ****p < 0,0001 með D12 Ctrl). #### p < 0,0001 miðað við D0 og *p < 0,05 eða ****p < 0,0001 miðað við D12 Ctrl). b Fulltrúarmyndir og magngreining fyrir hjartasneiðar litaðar með Masson's trichrome blettum (Svarðarstöng = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, samanburður er gerður einhliða ANO.## próf <1NO.#0 og D1NO. p < 0,001, eða ****p < 0,0001 miðað við D12 Ctrl). b Fulltrúarmyndir og magngreining fyrir hjartasneiðar litaðar með Masson's trichrome blettum (Svarðarstöng = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, samanburður er gerður einhliða ANO.## próf <1NO.#0 og D1NO. p < 0,001, eða ****p < 0,0001 miðað við D12 Ctrl). b. = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0 #0, #0; 1 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Fulltrúarmyndir og magngreining á hjartaköflum litaðar með Masson's trichrome blettum (kvarðastikur = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) hlutar/hópur frá mismunandi svínum, framkvæmt einhliða D0#0pVA og #***0pVA, #0pVA og #0pVA. 01 eða ****p < 0,0001 á móti D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm！D）〼n（10（n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分且．渔；缛0#.***#p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 、d trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分︎差分#.0#0＼ 0#.0#0＼ ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения = (5) n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) rásir frá rásnum / leikjum, öðrum ANOVA; ####p < 0,0,0,01 *** 001 eða ****p < 0,0001 á сравнению с D12 Ctrl). b Sýndarmyndir og magngreining á hjartaköflum litaðar með Masson's trichrome (kvarðastöng = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) hlutar frá mismunandi svínum/hópi, ein ANOVA aðferð; 0#.00.1, 0.***0.***0,1,00,1 eða D****0. p < 0,0001 miðað við D12 Ctrl).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Að lokum var hæfni CTCM til að líkja eftir ofstækkun hjarta metin með því að auka teygjur í hjartavef.Í CTCM jókst hámarksþrýstingur í lofthólfinu úr 80 mmHg í 80 mmHg.gr.(venjuleg teygja) allt að 140 mmHg Art.(Mynd 6a).Þetta samsvarar 32% aukningu á teygju (mynd 6b), sem áður var sýnd sem samsvarandi prósenta teygja sem þarf til að hjartaskurðir nái svipaðri sarkómerlengd og sést við ofvöxt.Teygja og hraði hjartavefs meðan á samdrætti og slökun stóð var stöðug í sex daga ræktunar (mynd 6c).Hjartavefur frá MT-skilyrðum var beitt eðlilegum teygjuskilyrðum (MT (venjulegt)) eða ofstreygjuskilyrði (MT (OS)) í sex daga.Þegar eftir fjóra daga í ræktun var ofvaxandi lífmerkið NT-ProBNP marktækt hækkað í miðlinum við MT (OS) aðstæður samanborið við MT (eðlilegar) aðstæður (Mynd 7a).Að auki, eftir sex daga ræktun, jókst frumustærðin í MT (OS) (mynd 7b) marktækt miðað við hluta MT hjarta (eðlilegt).Að auki var NFATC4 kjarnaflutningur verulega aukin í ofteygðum vefjum (mynd 7c).Þessar niðurstöður sýna framsækna þróun meinafræðilegrar endurgerðar eftir ofþenslu og styðja þá hugmynd að CTCM tækið sé hægt að nota sem vettvang til að rannsaka teygjuvöldum hjartastækkunarmerkjum.
Fulltrúar ummerki um þrýsting í lofthólfinu, þrýstingi í vökvahólfinu og mælingar á hreyfingum vefja staðfesta að þrýstingur í hólfinu breytir þrýstingi vökvahólfsins, sem veldur samsvarandi hreyfingu á vefjasneiðinni.b Sýndarferlar teygjuprósentu og teygjuhraða fyrir venjulega teygða (appelsínugula) og of teygða (bláa) vefjahluta.c Súlurit sem sýnir hringrásartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hóp, frá mismunandi svínum), samdráttartíma (n = 18-19 sneiðar í hverjum hóp, frá mismunandi svínum), slökunartíma (n = 19 sneiðar í hverjum hóp, frá mismunandi svínum) ), amplitude vefjahreyfingar (n = 14 sneiðar/hópur, frá mismunandi sneiðum/grúppu, frá mismunandi sneiðum/hópi, frá mismunandi sneiðum/hópi, frá mismunandi sneiðum, mismunandi svínum) og hámarks slökunarhraða (n = 14 (D0), 15 (D6) ) hlutar/hópar) frá mismunandi svínum), sýndi tvíhliða t-próf ​​nemenda engan marktækan mun á neinni breytu, sem gefur til kynna að þessar breytur haldist stöðugar í 6 daga ræktun með ofspennu.Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
a Súlurit magngreining á styrk NT-ProBNP í ræktunarmiðlum úr hjartasneiðum sem ræktaðar eru við MT eðlilega teygju (Norm) eða yfirteygjuskilyrði (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, borið saman við tvenns konar teygjur, < 0NOpVA; súlurit magngreining á styrk NT-ProBNP í ræktunarmiðlum úr hjartasneiðum sem ræktaðar eru við MT eðlilega teygju (Norm) eða yfirteygjuskilyrði (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi A**pVA-svínum, borið saman við venjulegar teygjur.Magnbundið súlurit af styrk NT-ProBNP í ræktunarmiðli úr hjartasneiðum sem ræktaðar eru við eðlilega MT teygju (norm) eða yfirteygju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) sneiðar /hópur frá mismunandi svínum, tvíþætta greining er gerð á dreifileika;**p < 0,01 á viðmiðunarmörkum). **p < 0,01 miðað við venjulega teygju). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 絢序 浢序(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方与缛**析，p < 0.01）. a Magngreining á styrk NT-ProBNP í hjartasneiðum sem ræktaðar eru við MT eðlilega teygju (Norm) eða yfirteygju (OS) aðstæður (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) frá mismunandi 猪的切䉇/幏发廐弥发廐，动; **miðað við venjulega teygju, p < 0,01).súlurit Magngreining á styrk NT-ProBNP í hjartasneiðum sem ræktaðar eru við eðlilega MT teygju (norm) eða yfirteygju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) og D4 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, tvíhliða dreifnigreining;**p < 0,01 á viðmiðunarmörkum). **p < 0,01 miðað við venjulega teygju). b Fulltrúarmyndir fyrir hjartasneiðar litaðar með troponin-T og WGA (vinstri) og frumustærðarmæling (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum, Tvíhliða nemenda t-próf ​​er borið saman við eðlilegt teygjupróf 0; ****001). b Fulltrúarmyndir fyrir hjartasneiðar litaðar með troponin-T og WGA (vinstri) og frumustærðarmæling (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi sneiðum frá mismunandi svínum, Tví-hala nemenda t-próf ​​er borið saman við eðlilegt teygjupróf 0; ****0p01). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количестолествениногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохдий entа; ****p < 0,0001 fyrir neyðartilvik). b Fulltrúarmyndir af hjartaköflum litaðar með troponin-T og AZP (vinstri) og frumustærðarmælingu (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frumur/hópur úr 10 mismunandi hlutum frá mismunandi svínum, tvíhliða t-próf ​​nemenda í samanburði við eðlilegt t-próf ​​nemanda við 0; ****0p0s < 0; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性=3（徃），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鸎与季生比，****p < 0,0001）. b Fulltrúarmyndir af hjartasneiðum litaðar með calcarein-T og WGA (vinstri) og frumustærð (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 úr 10 mismunandi sneiðum (D6 MTNorm)) Frumur/组，两方法有埾学电４；p. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количестравенная (количественная (слева) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) frá 10 tímabilum frá разных свиней Клетки/группа, двустороСние критер,0p ****; сравнению с нормальным растяжением). b Fulltrúarmyndir af hjartaköflum litaðar með troponin-T og AZP (vinstri) og magngreining á frumustærð (hægri) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) úr 10 mismunandi hlutum frá mismunandi svínum) Frumur/hópur, tvíhliða viðmiðun Nemandi t;****p < 0,0001 miðað við venjulegan stofn). c Fulltrúarmyndir fyrir dag 0 og dag 6 MTOS hjartasneiðar ónæmismerktar fyrir troponin-T og NFATC4 og magngreining á flutningi NFATC4 yfir í kjarna CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, Tvíhliða Nemandi 0;5-ppróf er framkvæmt 0; c Fulltrúarmyndir fyrir dag 0 og dag 6 MTOS hjartasneiðar ónæmismerktar fyrir troponin-T og NFATC4 og magngreining á flutningi NFATC4 yfir í kjarna CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum, Tvíhliða nemandi .0p-próf ​​er framkvæmt .0p-). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 og 6 дней MTOS, иммуномеченых тропонина-Т и NFATC4, и косокаче ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выдуполняется та; *p < 0,05). c Fulltrúarmyndir fyrir hjartaskurð eftir 0 og 6 daga MTOS, ónæmismerkt fyrir troponin-T og NFATC4, og magngreining á NFATC4 flutningi í kjarna hellafrumna (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur frá mismunandi svínum) gerðu tvíhliða t-próf ​​Nemendur';*p < 0,05). c.的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟甪「t 检0)。 .*0) c Sýndarmyndir af kalkanín-T og NFATC4 ónæmismerkingum 第0天和第6天MTOS hjartasneiðum og NFATC4 frá mismunandi NFATC4 易位至CM frumukjarnamagni化 (n = 4 (D0), 缶 刄OS, 缇, 缇, 缇, 刻OS, 缇, 缇, 缌 刻尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS á 0 og 6 dögum fyrir иммуномаркировки тропониномаркировки тропонином-Т и NFATC4 коцичи ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюю Стью;5). c Fulltrúarmyndir af MTOS hjartasneiðum á 0. og 6. degi fyrir trópónín-T og NFATC4 ónæmismerkingu og magngreiningu á NFATC4 flutningi í kjarna CM frá mismunandi svínum (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sneiðar/hópur, tvíhliða <' -viðmiðun; 5p Nemandi).Villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik.
Þýðingarrannsóknir á hjarta- og æðasjúkdómum krefjast frumulíkana sem endurskapa hjartaumhverfið nákvæmlega.Í þessari rannsókn var CTCM tæki þróað og einkennt sem getur örvað ofurþunna hluta hjartans.CTCM kerfið inniheldur lífeðlisfræðilega samstillta rafvélræna örvun og T3 og Dex vökvaauðgun.Þegar hjartahlutar úr svínum voru útsettir fyrir þessum þáttum, hélst lífvænleiki þeirra, burðarvirki, efnaskiptavirkni og umritunartjáning sú sama og í ferskum hjartavef eftir 12 daga ræktun.Að auki getur of mikil teygja á hjartavef valdið ofvexti hjartans af völdum ofþenslu.Á heildina litið styðja þessar niðurstöður mikilvægu hlutverki lífeðlisfræðilegra ræktunarskilyrða við að viðhalda eðlilegri hjartasvipgerð og veita vettvang fyrir lyfjaskimun.
Margir þættir stuðla að því að skapa ákjósanlegt umhverfi fyrir starfsemi og lifun hjartavöðvafrumna.Augljósustu þessara þátta tengjast (1) millifrumusamskiptum, (2) rafvélrænni örvun, (3) húmorsþáttum og (4) hvarfefnum efnaskipta.Lífeðlisfræðileg samskipti milli fruma krefjast flókinna þrívíddar neta af mörgum frumugerðum sem studd eru af utanfrumu fylki.Slík flókin frumusamskipti er erfitt að endurgera in vitro með samræktun einstakra frumutegunda, en auðvelt er að ná fram með því að nota lífræna eðli hjartahluta.
Vélræn teygja og raförvun hjartavöðvafrumna eru mikilvæg til að viðhalda svipgerð hjartans33,34,35.Þó vélræn örvun hafi verið mikið notuð fyrir hiPSC-CM ástand og þroska, hafa nokkrar glæsilegar rannsóknir nýlega reynt vélrænni örvun á hjartasneiðum í ræktun með því að nota einása hleðslu.Þessar rannsóknir sýna að 2D einása vélræn hleðsla hefur jákvæð áhrif á svipgerð hjartans við ræktun.Í þessum rannsóknum voru hlutar hjartans annaðhvort hlaðnir með ísómetrískum togkrafti17, línulegri sjálfvirkri hleðslu18, eða hjartahringurinn var endurskapaður með því að nota krafttransducer endurgjöf og spennudrif.Hins vegar nota þessar aðferðir einása vefjateygju án umhverfishagræðingar, sem leiðir til bælingar á mörgum hjartagenum eða oftjáningar gena sem tengjast óeðlilegum teygjuviðbrögðum.CTCM sem lýst er hér veitir þrívíddar rafvélrænt áreiti sem líkir eftir náttúrulegum hjartahring með tilliti til hringrásartíma og lífeðlisfræðilegrar teygju (25% teygja, 40% slagbil, 60% diastola og 72 slög á mínútu).Þrátt fyrir að þessi þrívíddar vélrænni örvun ein og sér sé ekki nægjanleg til að viðhalda heilleika vefja, þarf sambland af húmoral og vélrænni örvun með T3/Dex til að viðhalda lífvænleika, virkni og heilleika vefja á fullnægjandi hátt.
Húmorískir þættir gegna mikilvægu hlutverki við að móta hjartasvipgerð fullorðinna.Þetta var undirstrikað í HiPS-CM rannsóknum þar sem T3 og Dex var bætt við ræktunarmiðla til að flýta fyrir þroska frumna.T3 getur haft áhrif á flutning amínósýra, sykurs og kalsíums yfir frumuhimnur36.Að auki stuðlar T3 að MHC-α tjáningu og MHC-β niðurstýringu, sem stuðlar að myndun hröðu kippi vöðvafrumna í þroskuðum hjartavöðvafrumum samanborið við hæga kippi vöðvafrumna í fósturs CM.Skortur á T3 hjá sjúklingum með vanstarfsemi skjaldkirtils leiðir til taps á vöðvabrjótum og minnkar tíðni tónmyndunar37.Dex virkar á sykursteraviðtaka og hefur verið sýnt fram á að það eykur samdráttarhæfni hjartavöðva í einangruðum hjörtum með gegnflæði;38 þessi framför er talin tengjast áhrifum á kalsíumútfellingardrifna innkomu (SOCE) 39,40.Að auki binst Dex viðtökum sínum, sem veldur víðtækri innanfrumu svörun sem bælir ónæmisvirkni og bólgu30.
Niðurstöður okkar benda til þess að líkamleg vélræn örvun (MS) hafi bætt heildarframmistöðu ræktunar samanborið við Ctrl, en tókst ekki að viðhalda lífvænleika, uppbyggingu heilleika og hjartatjáningu í 12 daga í ræktun.Í samanburði við Ctrl, bætti T3 og Dex við CTCM (MT) ræktun lífvænleika og hélt svipuðum umritunarsniðum, uppbyggingu heilleika og efnaskiptavirkni með ferskum hjartavef í 12 daga.Að auki, með því að stjórna hversu teygjanlegt vefja er, var búið til hjartastækkunarlíkan af völdum ofþenslu með því að nota STCM, sem sýnir fjölhæfni STCM kerfisins.Það skal tekið fram að þrátt fyrir að endurgerð hjarta og bandvefsmyndun feli venjulega í sér ósnortin líffæri þar sem frumur í blóðrásinni geta veitt viðeigandi frumufrumur auk átfrumna og annarra endurgerða þátta, geta hlutar hjartans samt líkt eftir trefjaferlinu til að bregðast við streitu og áverka.inn í vöðvafíbroblasta.Þetta hefur áður verið metið í þessu hjartasneiðarlíkani.Það skal tekið fram að CTCM breytur er hægt að stilla með því að breyta þrýstingi/rafmagni og tíðni til að líkja eftir mörgum aðstæðum eins og hraðtakti, hægsláttur og vélrænni blóðrásarstuðningi (vélrænt óhlaðið hjarta).Þetta gerir kerfið að miðlungs afköstum fyrir lyfjapróf.Hæfni CTCM til að líkja eftir ofáreynslu af völdum hjartastækkunar ryður brautina fyrir prófun á þessu kerfi fyrir persónulega meðferð.Að lokum sýnir þessi rannsókn að vélræn teygja og húmorsörvun eru mikilvæg til að viðhalda ræktun hjartavefshluta.
Þrátt fyrir að gögnin sem kynnt eru hér benda til þess að CTCM sé mjög efnilegur vettvangur til að móta ósnortið hjartavöðva, hefur þessi ræktunaraðferð nokkrar takmarkanir.Helstu takmörkun CTCM ræktunar er að hún setur stöðugt kraftmikið vélrænt álag á sneiðarnar, sem útilokar getu til að fylgjast með samdrætti hjartasneiða á virkan hátt í hverri lotu.Þar að auki, vegna smæðar hjartaskurða (7 mm), er getu til að meta slagbilsvirkni utan ræktunarkerfa með hefðbundnum kraftskynjara takmörkuð.Í núverandi handriti sigrum við að hluta til þessa takmörkun með því að meta sjónspennu sem vísbendingu um samdráttarvirkni.Hins vegar mun þessi takmörkun krefjast frekari vinnu og verður hugsanlega brugðist við í framtíðinni með því að innleiða aðferðir til sjónræns eftirlits með starfsemi hjartasneiða í ræktun, svo sem sjónkortlagningu með kalsíum og spennuviðkvæmum litarefnum.Önnur takmörkun á CTCM er að vinnulíkanið vinnur ekki með lífeðlisfræðilega streitu (forhleðslu og eftirhleðslu).Í CTCM var þrýstingur framkallaður í gagnstæðar áttir til að endurskapa 25% lífeðlisfræðilega teygju í diastole (fullur teygja) og slagbil (lengd samdráttar við raförvun) í mjög stórum vefjum.Þessa takmörkun ætti að fjarlægja í framtíðar CTCM hönnun með fullnægjandi þrýstingi á hjartavefinn frá báðum hliðum og með því að beita nákvæmlega þrýstingi og rúmmálssambandi sem eiga sér stað í hjartahólfunum.
Ofstreygjuframkallað endurgerð sem greint er frá í þessu handriti takmarkast við að líkja eftir ofþenslumerkjum.Þannig getur þetta líkan hjálpað til við rannsókn á teygjuvöldum ofstækkunarmerkjum án þess að þörf sé á húmors- eða taugaþáttum (sem eru ekki til í þessu kerfi).Frekari rannsókna er þörf til að auka fjölbreytni CTCM, til dæmis mun samræktun með ónæmisfrumum, blóðvökvaþættir í blóðvökva og inntaugun þegar samræktun með taugafrumum bætir möguleika á sjúkdómslíkönum með CTCM.
Þrettán svín voru notuð í þessari rannsókn.Allar dýraaðgerðir voru gerðar í samræmi við leiðbeiningar stofnana og voru samþykktar af háskólanum í Louisville dýraumönnunar- og notkunarnefnd.Ósæðarboginn var klemmdur og hjartað var gegnsætt með 1 L af dauðhreinsuðu hjartaþræðingu (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparín, pH allt að 7,4); hjörtun voru geymd í ísköldum hjartaþræðingarlausn þar til þau voru flutt á rannsóknarstofu á ís sem er venjulega <10 mín. hjörtun voru geymd í ísköldum hjartaþræðingarlausn þar til þau voru flutt á rannsóknarstofu á ís sem er venjulega <10 mín. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10m. hjörtu voru geymd í ísköldum hjartaþræðingarlausn þar til flutningur á rannsóknarstofu á ís, sem tekur venjulega <10 mín.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常</10。逛将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常</10。逛 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию á льду, ótímabært <10 mín. Haltu hjörtum á ís hjartaþræðingu þar til flutningur á rannsóknarstofu á ís, venjulega <10 mín.
CTCM tækið var þróað í SolidWorks tölvustýrðri hönnun (CAD) hugbúnaði.Ræktunarklefar, skilrúm og loftklefar eru úr CNC glæru akrýlplasti.Varahringurinn, sem er 7 mm í þvermál, er gerður úr háþéttni pólýetýleni (HDPE) í miðjunni og er með o-hringa gróp til að hýsa sílikon-o-hringinn sem notaður er til að innsigla miðilinn undir.Þunn kísilhimna skilur ræktunarhólfið frá aðskilnaðarplötunni.Kísilhimnan er laserskorin úr 0,02 tommu þykku sílikonplötu og hefur hörku 35A.Neðri og efstu sílikonþéttingarnar eru laserskornar úr 1/16 tommu þykku sílikonplötu og eru með hörku 50A.316L ryðfríu stáli skrúfur og vængjar eru notaðar til að festa blokkina og búa til loftþétta innsigli.
Sérstakt prentað hringrás (PCB) er hannað til að vera samþætt við C-PACE-EM kerfið.Svissnesku véltengiinnstungurnar á PCB eru tengdar við grafít rafskaut með silfurhúðuðum koparvírum og brons 0-60 skrúfum skrúfaðar í rafskautin.Prentað hringrásarborðið er komið fyrir í hlífinni á þrívíddarprentaranum.
CTCM tækinu er stjórnað af forritanlegum pneumatic actuator (PPD) sem skapar stýrðan blóðrásarþrýsting svipað og hjartahring.Þegar þrýstingurinn eykst inni í lofthólfinu stækkar sveigjanlega kísillhimnan upp og þvingar miðilinn undir vefjasvæðið.Vefsvæðið mun síðan teygjast með þessari útskilnaði vökva, sem líkir eftir lífeðlisfræðilegri stækkun hjartans meðan á þanbili stendur.Þegar slökun var sem hæst var raförvun beitt í gegnum grafít rafskaut sem minnkaði þrýstinginn í lofthólfinu og olli samdrætti vefjahluta.Inni í rörinu er hemostatic loki með þrýstiskynjara til að greina þrýstinginn í loftkerfinu.Þrýstingurinn sem þrýstingsneminn skynjar er settur á gagnasafnara sem er tengdur við fartölvuna.Þetta gerir stöðugt eftirlit með þrýstingnum inni í gasklefanum.Þegar hámarks hólfaþrýstingi var náð (venjulegt 80 mmHg, 140 mmHg OS), var gagnaöflunartækinu skipað að senda merki til C-PACE-EM kerfisins til að mynda tvífasa spennumerki í 2 ms, stillt á 4 V.
Hjartaskurðir voru fengnir og ræktunaraðstæður í 6 holum voru framkvæmdar sem hér segir: Flyttu uppskeru hjörtun úr flutningsílátinu í bakka sem inniheldur kalt (4°C) hjartaþræðingu.Vinstri slegillinn var einangraður með dauðhreinsuðu blaði og skorinn í 1-2 cm3 bita.Þessir vefjablokkir voru festir við vefjastoðir með vefjalími og settir í titrandi míkrótóma vefjabað sem innihélt Tyrode's lausn og stöðugt súrefnisbundin (3 g/L 2,3-bútanedíón mónóoxím (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM g), (0,6 gM lúkósi HES), (1 gM lúkósi HES), (1 gM lúkósi, 0,60 mM) 0,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M lausn), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M lausn), allt að 1 L ddH2O).Titrandi míkrótómurinn var stilltur til að skera 300 µm þykkar sneiðar með tíðninni 80 Hz, láréttan titringsmagn 2 mm og hraða 0,03 mm/s.Vefjabaðið var umkringt ís til að halda lausninni köldum og hitastigi var haldið við 4°C.Flytja vefjasneiðar úr míkrótómabaðinu yfir í ræktunarbað sem inniheldur stöðugt súrefnisríka Tyrode lausn á ís þar til nógu margir hlutar fást fyrir eina ræktunarplötu.Fyrir transwell ræktun voru vefjasneiðar festir við dauðhreinsaðar 6 mm breiðar pólýúretan burðarefni og settar í 6 ml af fínstilltu miðli (199 miðli, 1x ITS viðbót, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF basískt og 2X sýklalyf-sveppalyf).Raforvun (10 V, tíðni 1,2 Hz) var beitt á vefjahlutana í gegnum C-Pace.Fyrir TD aðstæður var ferskum T3 og Dex bætt við við 100 nM og 1 μM við hverja miðlungsbreytingu.Miðillinn er mettaður með súrefni áður en skipt er út þrisvar á dag.Vefjahlutar voru ræktaðir í hitakassa við 37°C og 5% CO2.
Fyrir CTCM ræktun voru vefjasneiðar settir á sérsmíðaðan þrívíddarprentara í Petri fat sem innihélt breytta Tyrode lausn.Tækið er hannað til að auka stærð hjartasneiðarinnar um 25% af flatarmáli stuðningshringsins.Þetta er gert til þess að hlutar hjartans teygist ekki eftir að hafa verið fluttir úr Tyrode lausninni yfir á miðilinn og meðan á þanbili stendur.Með því að nota histakrýllím voru 300 µm þykkir hlutar festir á stuðningshring sem var 7 mm í þvermál.Eftir að vefjahlutarnir hafa verið festir við stoðhringinn, skera umfram vefjahlutana af og setja áföstu vefjahlutana aftur í baðið með Tyrode lausn á ís (4°C) þar til nógu margir hlutar hafa verið útbúnir fyrir eitt tæki.Heildarvinnslutími fyrir öll tæki ætti ekki að fara yfir 2 klst.Eftir að 6 vefjasneiðar voru festir við stuðningshrina sína var CTCM tækið sett saman.CTCM ræktunarhólfið er forfyllt með 21 ml forsúrefnisbættum miðli.Flyttu vefjahlutana yfir í ræktunarhólfið og fjarlægðu allar loftbólur vandlega með pípettu.Vefjahlutanum er síðan stýrt inn í gatið og þrýst varlega á sinn stað.Að lokum skaltu setja rafskautslokið á tækið og flytja tækið í hitakassa.Tengdu síðan CTCM við loftrörið og C-PACE-EM kerfið.Pneumatic stýririnn opnast og loftventillinn opnar CTCM.C-PACE-EM kerfið var stillt til að skila 4 V við 1,2 Hz meðan á tvífasa skeiði stendur í 2 ms.Skipt var um miðil tvisvar á dag og skipt um rafskaut einu sinni á dag til að forðast uppsöfnun grafíts á rafskautunum.Ef nauðsyn krefur er hægt að fjarlægja vefjahluta úr ræktunarholum þeirra til að fjarlægja allar loftbólur sem kunna að hafa fallið undir þá.Fyrir MT meðferðaraðstæður var T3/Dex bætt við ferskum við hverja miðlungsbreytingu með 100 nM T3 og 1 μM Dex.CTCM tækin voru ræktuð í hitakassa við 37°C og 5% CO2.
Til að ná teygðum ferlum hjartasneiða var sérstakt myndavélakerfi þróað.SLR myndavél (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) var notuð með Navitar Zoom 7000 18-108mm macro linsu (Navitar, San Francisco, CA).Sýning var framkvæmd við stofuhita eftir að miðillinn var skipt út fyrir ferskan miðil.Myndavélin er staðsett í 51° horni og myndband er tekið upp á 30 römmum á sekúndu.Í fyrsta lagi var opinn hugbúnaður (MUSCLEMOTION43) notaður með Image-J til að mæla hreyfingu hjartasneiða.Grímurinn var búinn til með MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Bandaríkjunum) til að skilgreina áhugaverð svæði fyrir sláandi hjartasneiðar til að forðast hávaða.Handvirkt sundurliðaðar grímur eru settar á allar myndir í rammaröð og síðan sendar til MUSCLEMOTION viðbótarinnar.Muscle Motion notar meðalstyrk pixla í hverjum ramma til að mæla hreyfingu hans miðað við viðmiðunarrammann.Gögn voru skráð, síuð og notuð til að mæla hringrásartíma og meta vefjateygju meðan á hjartahringnum stóð.Myndbandið sem tekið var upp var eftirvinnið með því að nota fyrsta flokks núllfasa stafræna síu.Til að mæla vefjateygju (top-to-peak) var gerð topp-til-topp greining til að greina á milli toppa og lægða í skráðu merkinu.Þar að auki er afnám framkvæmt með því að nota 6. stigs margliðu til að útrýma merkjareki.Programkóði var þróaður í MATLAB til að ákvarða alþjóðlega vefjahreyfingu, lotutíma, slökunartíma og samdráttartíma (viðbótaráætlunarkóði 44).
Fyrir álagsgreiningu, með því að nota sömu myndbönd sem búin voru til fyrir vélrænt teygjumat, raktum við fyrst tvær myndir sem tákna hreyfistoppa (hæsta (efri) og lægsta (neðri) hreyfingarpunktinn) samkvæmt MUSCLEMOTION hugbúnaðinum.Við skiptum síðan vefjasvæðum í sundur og beittum form af skyggingaralgrími á skiptan vef (viðbótarmynd 2a).Sneiða vefnum var síðan skipt í tíu undirflöt og var álagið á hvern flöt reiknað með eftirfarandi jöfnu: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, þar sem Sup og Sdown eru fjarlægðir lögunarinnar frá efstu og neðri skugga efnisins, í sömu röð (aukamynd .2b).
Hjartahlutar voru festir í 4% paraformaldehýði í 48 klst.Fastir vefir voru þurrkaðir í 10% og 20% ​​súkrósa í 1 klst, síðan í 30% súkrósa yfir nótt.Hlutarnir voru síðan felldir inn í efnasamband við skurðhitastig (OCT efnasamband) og fryst smám saman í ísópentan/þurísbaði.Geymið OCT innfellingarkubba við -80 °C þar til aðskilnað er.Gler voru útbúnar sem hlutar með þykkt 8 μm.
Til að fjarlægja OKT úr hjartaköflum skaltu hita glærurnar á hitakubba við 95 °C í 5 mín.Bætið 1 ml af PBS við hverja glæru og ræktið í 30 mínútur við stofuhita, síðan gegnsýrðu hlutana með því að setja 0,1% Triton-X í PBS í 15 mínútur við stofuhita.Til að koma í veg fyrir að ósérhæfð mótefni bindist sýninu, bætið 1 ml af 3% BSA lausn við glærurnar og ræktið í 1 klukkustund við stofuhita.BSA var síðan fjarlægt og skyggnurnar skolaðar með PBS.Merktu hvert sýni með blýanti.Aðalmótefni (þynnt 1:200 í 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) og troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) var bætt við á 90 mínútum, síðan 200% mótefni gegn flensu (200) gegn flensu (200) eða 488 (Thermo Scientific; #A16079), á móti kanínu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) í 90 mínútur til viðbótar Þvegið 3 sinnum með PBS Til að greina marklitun frá bakgrunni notuðum við aðeins aukamótefnið sem viðmiðun. Að lokum var DAPI sett í kjarnaborinn og vökvastofninn settur í sjóinn með naglalakki.-x stækkun) og Keyence smásjá með 40x stækkun.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) við 5 μg/ml í PBS var notað fyrir WGA litun og sett á fasta hluta í 30 mínútur við stofuhita.Glerurnar voru síðan þvegnar með PBS og Sudan black var bætt við hverja glæru og ræktuð í 30 mínútur.Glerurnar voru síðan þvegnar með PBS og vectashield innfellingarmiðli var bætt við.Skyggnur voru sýndar á Keyence smásjá með 40x stækkun.
OKT var fjarlægt úr sýnunum eins og lýst er hér að ofan.Eftir að OCT hefur verið fjarlægt skaltu dýfa glærunum í Bouin's lausn yfir nótt.Glerurnar voru síðan skolaðar með eimuðu vatni í 1 klukkustund og síðan settar í Bibrich aloe sýru fuchsin lausn í 10 mínútur.Síðan voru glærurnar þvegnar með eimuðu vatni og settar í lausn af 5% fosfómólýbdeni/5% fosfówolframsýru í 10 mínútur.Án þess að skola, flyttu skyggnurnar beint í anilínbláu lausnina í 15 mínútur.Síðan voru glærurnar þvegnar með eimuðu vatni og settar í 1% ediksýrulausn í 2 mínútur.Gler voru þurrkaðar í 200 N etanóli og fluttar yfir í xýlen.Litaðar glærur voru sýndar með Keyence smásjá með 10x hlutlægu.Prósenta bandvefssvæðis var magnmælt með Keyence Analyzer hugbúnaði.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), vörulistanúmer V13154, samkvæmt samskiptareglum framleiðanda með nokkrum breytingum.Sérstaklega var skurðaðgerð með 6 mm þvermál notaður til að tryggja samræmda vefjastærð við MTT greiningu.Vefur voru hver fyrir sig húðaður í brunna á 12-brunn plötu sem innihélt MTT hvarfefni í samræmi við siðareglur framleiðanda.Hlutarnir eru ræktaðir við 37°C í 3 klukkustundir og lifandi vefur umbrotnar MTT hvarfefnið til að mynda fjólublátt formazan efnasamband.Skiptu um MTT lausnina með 1 ml DMSO og ræktaðu við 37 °C í 15 mínútur til að draga fjólublátt formazan úr hjartaköflum.Sýni voru þynnt 1:10 í DMSO í 96-brunn glærum botnplötum og fjólublár litastyrkur mældur við 570 nm með því að nota Cytation plötulesara (BioTek).Álestur var staðlaður að þyngd hverrar sneiðar hjartans.
Hjartasneiðum var skipt út fyrir miðli sem innihélt 1 μCi/ml [5-3H]-glúkósa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) fyrir glúkósanýtingarpróf eins og áður hefur verið lýst.Eftir 4 klukkustunda ræktun, bætið 100 µl af miðli í opið örskilvinduglas sem inniheldur 100 µl af 0,2 N HCl.Síðan var túpan sett í sindurrör sem innihélt 500 μl af dH2O til að gufa upp [3H]2O í 72 klukkustundir við 37°C.Fjarlægðu síðan örskilvinduglasið úr sindurrörinu og bætið við 10 ml af sindurvökva.Sýndartalningar voru framkvæmdar með því að nota Tri-Carb 2900TR vökvaskynsgreiningartæki (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, Bandaríkjunum).Glúkósanýting var síðan reiknuð út með hliðsjón af [5-3H]-glúkósa sértækri virkni, ófullkomnu jafnvægi og bakgrunni, þynningu á [5-3H]-í ómerktan glúkósa og skilvirkni glímuteljarans.Gögnin eru staðlað að massa hluta hjartans.
Eftir einsleitni vefja í Trizol var RNA einangrað úr hjartaskurðum með því að nota Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.Undirbúningur RNAsec bókasafns, raðgreining og gagnagreining voru framkvæmd sem hér segir:
1 μg af RNA í hvert sýni var notað sem upphafsefni við undirbúning RNA safnsins.Raðasöfn voru mynduð með því að nota NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit fyrir Illumina (NEB, BNA) í samræmi við tilmæli framleiðanda og vísitölukóðum var bætt við eiginleikaröðina fyrir hvert sýni.Í stuttu máli var mRNA hreinsað úr heildar-RNA með því að nota segulperlur tengdar með fjöl-T fákirni.Sundrun er framkvæmd með því að nota tvígildar katjónir við háan hita í NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Fyrsti strengur cDNA var myndað með því að nota handahófskennda hexamer primers og M-MuLV bakrit (RNase H-).Annar strengurinn cDNA er síðan myndaður með því að nota DNA pólýmerasa I og RNase H. Afganginum sem eftir eru er umbreytt í bita enda með exonukleasa/pólýmerasa virkni.Eftir adenýleringu á 3′ enda DNA brotsins er NEBNext millistykki með hárnálalykkjubyggingu fest við það til að undirbúa það fyrir blendingu.Fyrir val á cDNA brotum af æskilegri lengd 150-200 bp.bókasafnsbrot voru hreinsuð með því að nota AMPure XP kerfið (Beckman Coulter, Beverly, Bandaríkjunum).Síðan var 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) með stærðarvöldum cDNA bundið með millistykki notað í 15 mínútur við 37°C og síðan í 5 mínútur við 95°C fyrir PCR.PCR var síðan framkvæmt með því að nota Phusion High-Fidelity DNA pólýmerasa, universal PCR primers og Index (X) primers.Að lokum voru PCR vörur hreinsaðar (AMPure XP kerfi) og gæði safnsins metin á Agilent Bioanalyzer 2100 kerfi.cDNA safnið var síðan raðgreint með því að nota Novaseq raðgreiningartæki.Hráum myndskrám frá Illumina var breytt í óunnar lestur með því að nota CASAVA Base Calling.Hrágögn eru geymd á FASTQ(fq) sniði sem innihalda lesraðir og samsvarandi grunneiginleika.Veldu HISAT2 til að passa við síaða raðgreiningu við Sscrofa11.1 viðmiðunarerfðamengi.Almennt séð styður HISAT2 erfðamengi af hvaða stærð sem er, þar á meðal erfðamengi stærri en 4 milljarða basa, og sjálfgefin gildi eru stillt fyrir flestar breytur.Hægt er að samræma lestur úr RNA Seq gögnum á skilvirkan hátt með því að nota HISAT2, hraðasta kerfið sem nú er til, með sömu eða betri nákvæmni en nokkur önnur aðferð.
Mikið afrita endurspeglar beinlínis magn genatjáningar.Genatjáningarstig er metið út frá gnægð umrita (raðgreiningar) sem tengjast erfðamenginu eða exonum.Fjöldi lestra er í réttu hlutfalli við tjáningarstig gena, lengd gena og dýpt raðgreiningar.FPKM (brot á þúsund basapör af afriti raðað á milljón basapör) voru reiknuð út og P-gildi mismunatjáningar voru ákvörðuð með því að nota DESeq2 pakkann.Við reiknuðum síðan út falska uppgötvunarhlutfallið (FDR) fyrir hvert P gildi með því að nota Benjamini-Hochberg aðferðina9 byggt á innbyggðu R-fallinu „p.adjust“.
RNA einangrað úr hjartaköflum var breytt í cDNA í styrkleikanum 200 ng/μl með SuperScript IV Vilo Master blöndunni frá Thermo (Thermo, vörunúmer 11756050).Magnbundin RT-PCR var framkvæmd með því að nota Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brunn gagnsæja hvarfplötu (Thermo, vörunúmer 4483319) og microamp sjónlím (Thermo, vörunúmer 4311971).Hvarfblandan samanstóð af 5 µl Taqman Fast Advanced Master blöndu (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer og 3,5 µl H2O blandað í hverja brunn.Staðlaðar qPCR lotur voru keyrðar og CT gildi mæld með Applied Biosystems Quantstudio 5 rauntíma PCR tæki (384-brunnur mát; vara # A28135).Taqman primers voru keyptir frá Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_01s) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1 sýnisgildi af GDH)
Fjölmiðlaútgáfa NT-ProBNP var metin með því að nota NT-ProBNP settið (svín) (Vörunúmer MBS2086979, MyBioSource) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda.Í stuttu máli var 250 µl af hverju sýni og staðli bætt í tvítekningu í hvern brunn.Strax eftir að sýninu hefur verið bætt við skal bæta 50 µl af prófunarhvarfefni A í hvern brunn.Hristið plötuna varlega og innsiglið með þéttiefni.Síðan voru töflurnar ræktaðar við 37°C í 1 klst.Sogðu síðan upp lausnina og þvoðu holurnar 4 sinnum með 350 µl af 1X þvottalausn, ræktaðu þvottalausnina í 1-2 mínútur í hvert sinn.Bættu síðan við 100 µl af prófunarhvarfefni B í hverri brunn og lokaðu með plötuþéttiefni.Taflan var hrist varlega og ræktuð við 37°C í 30 mínútur.Sogðu lausnina og þvoðu brunnana 5 sinnum með 350 µl af 1X þvottalausn.Bætið 90 µl af hvarfefnislausn í hvern brunn og innsiglið plötuna.Ræktaðu plötuna við 37°C í 10-20 mínútur.Bætið 50 µl stöðvunarlausn í hvern brunn.Platan var strax mæld með því að nota Cytation (BioTek) plötulesara stilltan á 450 nm.
Aflgreiningar voru gerðar til að velja hópastærðirnar sem veita >80% kraft til að greina 10% algera breytingu á færibreytunni með 5% villuhlutfalli af gerð I. Aflgreiningar voru gerðar til að velja hópastærðirnar sem veita >80% kraft til að greina 10% algera breytingu á færibreytunni með 5% villuhlutfalli af gerð I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% móhnóstí fyrir frídag 10% áætlun тра с 5% частотой ошибок типа I. Kraftgreining var framkvæmd til að velja hópastærðir sem myndu veita >80% kraft til að greina 10% algera breytubreytingu með 5% villuhlutfalli af gerð I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚰嚻进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚰嚻 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Aflgreining var framkvæmd til að velja hópstærð sem myndi veita >80% afl til að greina 10% algera breytubreytingu og 5% villuhlutfall af tegund I.Vefjahlutar voru valdir af handahófi fyrir tilraunina.Allar greiningar voru ástandsblindar og sýni voru afkóða fyrst eftir að öll gögn höfðu verið greind.GraphPad Prism hugbúnaður (San Diego, CA) var notaður til að framkvæma allar tölfræðilegar greiningar. Fyrir alla tölfræði voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05. Fyrir alla tölfræði voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05. Для всей статистики <0,05. Fyrir alla tölfræði voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики <0,05. Fyrir alla tölfræði voru p-gildi talin marktæk við gildi <0,05.Tvíhliða t-próf ​​nemenda var gert á gögnunum með aðeins 2 samanburði.Einhliða eða tvíhliða ANOVA var notuð til að ákvarða mikilvægi milli margra hópa.Þegar framkvæmt var post hoc próf var leiðrétting Tukey beitt til að gera grein fyrir mörgum samanburði.RNAsec gögn hafa sérstakar tölfræðilegar athugasemdir við útreikning á FDR og p.adjust eins og lýst er í kaflanum Aðferðir.
Fyrir frekari upplýsingar um hönnun náms, sjá ágrip náttúrurannsóknaskýrslu sem tengist þessari grein.