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La morfogenesi dell'intestino umano stabilisce le caratteristiche della cripta-villo della microarchitettura epiteliale 3D e dell'organizzazione spaziale. Questa struttura unica è necessaria per mantenere l'omeostasi intestinale proteggendo la nicchia delle cellule staminali nella cripta basale dagli antigeni microbici esogeni e dai loro metaboliti. Inoltre, i villi intestinali e il muco secernente presentano cellule epiteliali funzionalmente differenziate con una barriera protettiva sulla superficie della mucosa intestinale. costruzione di modelli intestinali in vitro. In particolare, l'intestino mimetico organico su un chip può indurre la morfogenesi 3D spontanea dell'epitelio intestinale con funzioni fisiologiche potenziate e biomeccanica. piattaforma microfluidica, induzione della morfogenesi 3D e caratterizzazione degli epiteli 3D stabiliti utilizzando più modalità di imaging. Questo protocollo raggiunge la rigenerazione della microarchitettura funzionale dell'intestino controllando il flusso del fluido basolaterale per 5 d.Il nostro metodo di morfogenesi in vitro impiega lo stress di taglio fisiologicamente rilevante e il movimento meccanico e non richiede ingegneria o manipolazione cellulare complessa, che potrebbe superare altre tecniche esistenti. Strati epiteliali intestinali 3D in vitro per applicazioni biomediche, cliniche e farmaceutiche.
Gli esperimenti dimostrano che le cellule Caco-2 epiteliali intestinali coltivate in dispositivi microfluidici gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o a doppio strato6,7 possono subire una morfogenesi 3D spontanea in vitro senza una chiara comprensione del meccanismo sottostante. organoidi intestinali derivati.Le cellule epiteliali sono state convalidate. In questo studio, ci siamo concentrati in particolare sulla produzione cellulare e sulla distribuzione della concentrazione di un potente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), in gut-on-a-chip e dispositivi microfluidici modificati contenenti inserti Transwell, denominati "Hybrid Chip". p gut inibisce la morfogenesi o interrompe lo strato epiteliale 3D prestrutturato, suggerendo che lo stress antagonistico durante la coltura è responsabile della morfogenesi intestinale in vitro. Pertanto, un approccio pratico per ottenere una morfogenesi robusta all'interfaccia epiteliale è quello di rimuovere o mantenere minimamente i livelli di antagonisti Wnt nel compartimento basolaterale mediante lavaggio attivo (p. es., in piattaforme gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip) o diffusione. da Transwell si inserisce in grandi serbatoi basolaterali in pozzi).
In questo protocollo, forniamo un metodo dettagliato per fabbricare microdispositivi gut-on-a-chip e chip ibridi inseribili Transwell (passaggi 1-5) per coltivare cellule epiteliali intestinali su membrane porose a base di polidimetilsilossano (PDMS) (passaggi 6A, 7A, 8, 9) o membrane in poliestere di inserti Transwell (passaggi 6B, 7B, 8, 9) e morfogenesi 3D indotta in vitro ( passaggio 10). Abbiamo anche identificato le caratteristiche cellulari e molecolari indicative dell'istogenesi tessuto-specifica e della differenziazione cellulare dipendente dal lignaggio applicando più modalità di imaging (passaggi 11-24). Induciamo la morfogenesi utilizzando cellule epiteliali intestinali umane, come Caco-2 o organoidi intestinali, in due formati di coltura con dettagli tecnici tra cui la modifica della superficie delle membrane porose, la creazione di monostrati 2D e la biochimica intestinale e la riproduzione del microambiente biomeccanico in vitro. Morfogenesi 3D da monostrati epiteliali 2D, abbiamo rimosso gli antagonisti del morfogeno in entrambe le forme coltivate facendo scorrere il mezzo nel compartimento basolaterale della coltura. s.
Il nostro protocollo può essere utile a un'ampia gamma di scienziati di base (ad esempio, biologia della mucosa intestinale, biologia delle cellule staminali e biologia dello sviluppo) e ricerca applicata (ad esempio, test preclinici di farmaci, modellazione delle malattie, ingegneria dei tessuti e gastroenterologia). s. Inoltre, il nostro protocollo è utile per interrogare l'infezione sotto vari agenti infettivi come Norovirus 8, Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae.Utile anche il pubblico della patologia e della patogenesi della malattia. L'uso di un sistema di microfisiologia intestinale su chip può consentire la co-coltura longitudinale 10 e la successiva valutazione della difesa dell'ospite, delle risposte immunitarie e della riparazione delle lesioni correlate ai patogeni nel tratto gastrointestinale (GI) 11. Altri disturbi gastrointestinali associati a sindrome dell'intestino permeabile, celiachia, morbo di Crohn, colite ulcerosa, pouchite o sindrome dell'intestino irritabile possono essere simulati quando gli strati epiteliali intestinali 3D vengono preparati utilizzando il paziente 's strati epiteliali intestinali 3D, queste malattie includono atrofia dei villi, accorciamento della cripta, danno della mucosa o barriera epiteliale compromessa. Biopsia o organoidi intestinali derivati ​​da cellule staminali12,13.cellule immunitarie tessuto-specifiche, 5.
Poiché la microstruttura epiteliale 3D può essere fissata e visualizzata senza il processo di sezionamento, gli spettatori che lavorano sulla trascrittomica spaziale e sull'imaging ad alta risoluzione o super risoluzione potrebbero essere interessati alla nostra mappatura delle dinamiche spaziotemporali di geni e proteine ​​su nicchie epiteliali.Interessato alla tecnologia. Risposta a stimoli microbici o immunitari. Inoltre, la diafonia longitudinale ospite-microbioma 10, 14 che coordina l'omeostasi intestinale può essere stabilita nello strato della mucosa intestinale 3D co-coltivando varie specie microbiche, comunità microbiche o microbiota fecale, specialmente nell'intestino su un chip.nella piattaforma. Questo approccio è particolarmente interessante per il pubblico che studia l'immunologia della mucosa, la gastroenterologia, il microbioma umano, la culturomica e la microbiologia clinica che cercano di coltivare microbiota intestinale precedentemente non coltivato in laboratorio. o piattaforme di convalida per l'industria alimentare. Come prova di principio, abbiamo recentemente dimostrato la fattibilità di un sistema di morfogenesi multiplex ad alto rendimento scalabile in un formato di piastra da 24 pozzetti. Inoltre, sono stati commercializzati più prodotti organ-on-a-chip16,17,18. morfogenesi a livello trascrittomico per testare farmaci o bioterapici L'assorbimento e il trasporto di farmaci candidati è stato valutato utilizzando surrogati intestinali 3D o utilizzando modelli organ-on-a-chip personalizzati o commerciali per valutare la riproducibilità del processo di morfogenesi intestinale.
Un numero limitato di modelli sperimentali rilevanti per l'uomo è stato utilizzato per studiare la morfogenesi epiteliale intestinale, principalmente a causa della mancanza di protocolli implementabili per indurre la morfogenesi 3D in vitro. Infatti, gran parte delle attuali conoscenze sulla morfogenesi intestinale si basa su studi su animali (ad esempio, zebrafish20, topi21 o polli22). anche molto limitato nella loro capacità di essere testato in modo scalabile a più vie. Pertanto, il nostro protocollo per la rigenerazione di strutture tissutali 3D in vitro supera i modelli animali in vivo e altri modelli di coltura cellulare 2D statici tradizionali. nicchie ed evoluzione ecologica in risposta a fattori dell'ospite (p. es., strati mucosi interni ed esterni, secrezione di IgA e peptidi antimicrobici). Inoltre, la morfologia epiteliale 3D può permetterci di capire come il microbiota intestinale struttura le sue comunità e produce sinergicamente metaboliti microbici (p. es., acidi grassi a catena corta) che modellano l'organizzazione cellulare e le nicchie delle cellule staminali nelle cripte basali. stabilito in vitro.
Oltre al nostro metodo di creazione di strutture epiteliali intestinali 3D, esistono diversi metodi in vitro. La coltura organoide intestinale è una tecnica di ingegneria tissutale all'avanguardia basata sulla coltivazione di cellule staminali intestinali in condizioni morfogene specifiche23,24,25. o antigeni esogeni è limitato.L'accesso ai lumi organoidi può essere migliorato utilizzando un microiniettore,26,27 ma questo metodo è invasivo e laborioso e richiede conoscenze specialistiche per essere eseguito. Inoltre, le colture organoidi tradizionali mantenute in scaffold di idrogel in condizioni statiche non riflettono accuratamente la biomeccanica attiva in vivo.
Altri approcci impiegati da diversi gruppi di ricerca utilizzano impalcature di idrogel 3D prestrutturate per imitare la struttura epiteliale dell'intestino coltivando cellule intestinali umane isolate sulla superficie del gel. Realizzare impalcature di idrogel utilizzando stampi stampati in 3D, micro-macinati o fabbricati litograficamente. crosstalk includendo cellule stromali nello scaffold. Tuttavia, la natura degli scaffold prestrutturati può impedire la visualizzazione del processo morfogenetico spontaneo stesso. schemi intrecciati per formare strutture tubolari intestinali e il flusso del fluido intraluminale può essere ricapitolato utilizzando un modulo di microfluidica. Tuttavia, questo modello non mostra processi morfogenetici spontanei né include movimenti meccanobiologici dell'intestino. Le tecniche di stampa 3D dello stesso gruppo sono state in grado di creare tubi intestinali in miniatura con processi morfogenetici spontanei. il processo è completo, perturbando le condizioni sperimentali o le interazioni cellula-cellula. Invece, il nostro protocollo proposto fornisce morfogenesi intestinale spontanea, stress di taglio fisiologicamente rilevante, biomeccanica che imita la motilità intestinale, accessibilità di compartimenti apicali e basolaterali indipendenti e ricreazione di microambienti biologici complessi di modularità. Pertanto, il nostro protocollo di morfogenesi 3D in vitro può fornire un approccio complementare per superare le sfide dei metodi esistenti.
Il nostro protocollo è interamente focalizzato sulla morfogenesi epiteliale 3D, con solo cellule epiteliali in coltura e nessun altro tipo di cellule circostanti come cellule mesenchimali, cellule endoteliali e cellule immunitarie. ci consente di ricreare lo strato epiteliale 3D ondulato, ulteriori complessità biologiche come le interazioni epiteliale-mesenchimale33,34, la deposizione di matrice extracellulare (ECM)35 e, nel nostro modello, le caratteristiche cripta-villo che trasmettono le nicchie delle cellule staminali nelle cripte basali rimangono da considerare ulteriormente. Le cellule stromali (ad es. 35,37,38. L'aggiunta di cellule mesenchimali al nostro modello ha migliorato il processo morfogenetico e l'efficienza dell'attaccamento cellulare. Lo strato endoteliale (cioè capillari o vasi linfatici) svolge un ruolo importante nella regolazione del trasporto molecolare39 e del reclutamento delle cellule immunitarie40 nel microambiente intestinale. potrebbe essere necessario includere per modellare caratteristiche fisiologiche più accurate con risoluzione a livello di organo. Le cellule immunitarie derivate dal paziente sono anche essenziali per la visualizzazione di risposte immunitarie innate, presentazione dell'antigene, diafonia immunitaria adattativa innata e immunità tessuto-specifica nel contesto dell'imitazione della malattia intestinale.
L'uso di chip ibridi è più semplice di gut-on-a-chip perché la configurazione del dispositivo è più semplice e l'uso di inserti Transwell consente una coltura scalabile dell'epitelio intestinale. Tuttavia, gli inserti Transwell disponibili in commercio con membrane in poliestere non sono elastici e non possono simulare movimenti di tipo peristaltico. -cultura in chip ibridi. Sebbene possiamo indurre in modo robusto la morfogenesi 3D negli inserti Transwell quando si utilizzano chip ibridi, la carenza di biomeccanica fisiologicamente rilevante e flusso di fluido apicale può limitare la fattibilità delle piattaforme di chip ibridi per potenziali applicazioni.
Le ricostruzioni su vasta scala dell'asse cripta-villo umano nelle culture gut-on-a-chip e hybrid-on-a-chip non sono state completamente stabilite. Poiché la morfogenesi inizia da un monostrato epiteliale, le microarchitetture 3D non forniscono necessariamente somiglianza morfologica alle cripte in vivo. Sebbene i canali superiori più alti sul chip portino a una maggiore altezza dell'epitelio microingegnerizzato, l'altezza massima è ancora limitata a ~ 300–400 µm. La profondità effettiva delle cripte intestinali umane nell'intestino tenue e crasso è rispettivamente di ~ 135 µm e ~ 400 µm e l'altezza dei villi intestinali piccoli è di ~ 600 µm41.
Dal punto di vista dell'imaging, l'imaging a super risoluzione in situ di microarchitetture 3D può essere limitato all'intestino su un chip, poiché la distanza di lavoro richiesta dalla lente dell'obiettivo allo strato epiteliale è dell'ordine di pochi millimetri. Per superare questo problema, potrebbe essere necessario un obiettivo distante. ogni strato, è estremamente difficile aprire o rimuovere lo strato superiore per esaminare la struttura superficiale dello strato epiteliale. Ad esempio, utilizzando un microscopio elettronico a scansione (SEM).
L'idrofobicità del PDMS è stato un fattore limitante negli studi basati sulla microfluidica che si occupano di piccole molecole idrofobiche, poiché il PDMS può adsorbire in modo non specifico tali molecole idrofobiche. Le alternative al PDMS possono essere considerate con altri materiali polimerici.
Infine, il nostro metodo non è stato ben caratterizzato in termini di fornitura di uno screening ad alto rendimento o di una piattaforma sperimentale user-friendly "one-size-fits-all". Il protocollo attuale richiede una pompa a siringa per microdispositivo, che occupa spazio in un incubatore a CO2 e impedisce esperimenti su larga scala. Questa limitazione può essere significativamente migliorata dalla scalabilità di formati di coltura innovativi (ad esempio, inserti porosi a 24 pozzetti, a 96 pozzetti o a 384 pozzetti che consentono il rifornimento continuo e la rimozione dei supporti basolaterali).
Per indurre la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale umano in vitro, abbiamo utilizzato un dispositivo intestinale chip microfluidico contenente due microcanali paralleli e una membrana porosa elastica in mezzo per creare un'interfaccia lume-capillare. Dimostriamo anche l'uso di un dispositivo microfluidico a canale singolo (un chip ibrido) che fornisce un flusso basolaterale continuo sotto strati epiteliali polarizzati cresciuti su inserti Transwell. In entrambe le piattaforme, la morfogenesi di varie cellule epiteliali intestinali umane può essere dimostrata applicando la manipolazione direzionale del flusso a rimuovere gli antagonisti del morfogeno dal compartimento basolaterale. L'intera procedura sperimentale (Figura 1) è composta da cinque parti: (i) microfabbricazione del chip intestinale o chip ibrido inseribile Transwell (passaggi 1-5; riquadro 1), (ii) preparazione di cellule epiteliali intestinali (cellule Caco-2) o organoidi intestinali umani;box 2-5), (iii) coltura di cellule epiteliali intestinali su chip intestinali o chip ibridi (fasi 6-9), (iv) induzione della morfogenesi 3D in vitro (fase 10) e (v)) per caratterizzare la microstruttura epiteliale 3D (fasi 11-24). controlli spaziali, temporali, condizionali o procedurali.
Abbiamo utilizzato due diverse piattaforme di coltura: gut-on-a-chip con canali dritti o canali contorti non lineari, o chip ibridi contenenti inserti Transwell (TW) in un dispositivo microfluidico, fabbricato come descritto nel riquadro 1, e il passaggio 1-5. "Device Fabrication" mostra i passaggi principali nella realizzazione di un singolo chip o di un chip ibrido. vitro morphogenesis” mostra le fasi generali in cui le cellule epiteliali derivate da Caco-2 o organoidi vengono coltivate su un chip intestinale o su inserti Transwell di un chip ibrido, seguite dall'induzione della morfogenesi 3D e dalla formazione di una struttura epiteliale caratterizzata. Il numero della fase del programma o il numero della casella viene visualizzato sotto ogni freccia. s e modellazione della malattia. Immagini di immunofluorescenza in "Cell Differentiation" che mostrano nuclei, F-actina e MUC2 espressi nello strato epiteliale Caco-2 3D generato sul chip intestinale. La segnalazione di MUC2 è presente nelle cellule caliciformi e nel muco secreto dalle superfici della mucosa. in "Host-Microbe Co-Cultures" mostrano co-colture rappresentative del microbioma ospite nell'intestino su un chip. Il pannello di sinistra mostra la co-coltura di E. coli che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) con cellule epiteliali 3D Caco-2 microingegnerizzate. ). La modellazione della malattia illustra l'intestino sano rispetto a quello che perde nei chip di infiammazione intestinale sottoposti a sfida fisiologica con antigeni batterici (ad esempio, lipopolisaccaride, LPS) e cellule immunitarie (ad esempio, PBMC;verde). Le cellule Caco-2 sono state coltivate per stabilire uno strato epiteliale 3D. Barra della scala, 50 µm. Immagini nella riga inferiore: "Differenziazione delle cellule" adattate con il permesso del riferimento.2.La stampa dell'università di Oxford;Riprodotto con il permesso di Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" adattato con il permesso del ref.3.NAS;"Disease Modeling" adattato con il permesso del riferimento.5.NAS.
Entrambi i chip gut-on-chip e ibridi sono stati fabbricati utilizzando repliche PDMS che sono state sformate da stampi in silicone mediante litografia soft1,44 e modellate con SU-8. Il design dei microcanali in ciascun chip è determinato considerando l'idrodinamica come lo stress di taglio e la pressione idrodinamica1,4,12. -a-chip (Extended Data Fig. 1b) che include una coppia di microcanali curvi per indurre un aumento del tempo di residenza del fluido, modelli di flusso non lineare e deformazione multiassiale delle cellule in coltura (Fig. 2a-f) crescita thelial rispetto all'originale Gut-Chip, indipendentemente dal tipo di cellula in coltura. Pertanto, per indurre la morfogenesi 3D, i disegni di intestino su chip lineari e complessi sono intercambiabili. Le repliche PDMS curate su stampi in silicone con modelli SU-8 hanno fornito caratteristiche negative dopo la sformatura (Fig.2a). Per fabbricare l'intestino su un chip, lo strato PDMS superiore preparato è stato sequenzialmente legato a un film PDMS poroso e quindi allineato con lo strato PDMS inferiore mediante legame irreversibile utilizzando un trattamento corona (Fig. 2b-f). eseguito trattando le superfici della replica PDMS e del vetro con plasma di ossigeno o trattamento corona. Dopo la sterilizzazione del dispositivo microfabbricato attaccato al tubo di silicone, la configurazione del dispositivo era pronta per eseguire la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale (Figura 2g).
a, Illustrazione schematica della preparazione di parti PDMS da stampi in silicone modellati SU-8. La soluzione PDMS non polimerizzata è stata versata su uno stampo in silicone (a sinistra), polimerizzata a 60 ° C (al centro) e sformata (a destra). Il PDMS sformato è stato tagliato in pezzi e pulito per un ulteriore utilizzo. b, Fotografia dello stampo in silicio utilizzato per preparare lo strato superiore in PDMS. e componenti PDMS inferiori e il dispositivo intestinale su chip assemblato.e, Schema dell'allineamento dei componenti PDMS superiore, membrana e inferiore.Ogni strato è irreversibilmente legato dal trattamento al plasma o corona.f, Schema del dispositivo gut-on-a-chip fabbricato con microcanali contorti sovrapposti e camere a vuoto.g, Installazione di gut-on-a-chip per coltura cellulare microfluidica.L'intestino fabbricato su un chip assemblato con un tubo di silicone e una siringa è stato posto su un coprioggetto Il dispositivo chip è stato posizionato sul coperchio di una capsula Petri da 150 mm per l'elaborazione. Il legante viene utilizzato per chiudere il tubo di silicone. h, istantanee visive della fabbricazione di chip ibridi e morfogenesi 3D utilizzando chip ibridi. Inserti Transwell preparati in modo indipendente per coltivare monostrati 2D di cellule epiteliali intestinali sono stati inseriti nel chip ibrido per indurre la morfogenesi 3D intestinale. Ristampato con il permesso di riferimento.4.Altrove.
In questo protocollo, la linea cellulare Caco-2 e gli organoidi intestinali sono stati utilizzati come fonti epiteliali (Fig. 3a). Entrambi i tipi di cellule sono stati coltivati ​​in modo indipendente (Box 2 e Box 5) e utilizzati per seminare i microcanali rivestiti con ECM di intestino on-chip o inserti Transwell. sospensioni cellulari dissociate mediante liquido di tripsinizzazione (riquadro 2). Organoidi intestinali umani da biopsie intestinali o resezioni chirurgiche sono stati coltivati ​​in cupole di scaffold Matrigel in piastre da 24 pozzetti per supportare il microambiente strutturale. Mezzo contenente morfogeni essenziali (come Wnt, R-spondin e Noggin) e fattori di crescita preparati come descritto nel riquadro 3 è stato integrato a giorni alterni fino a quando gli organoidi sono cresciuti fino a ~ 500 µm di diametro. ids sono raccolti e dissociati in singole cellule per la semina su inserti intestinali o Transwell su un chip (Riquadro 5). Forniamo un protocollo ottimizzato nella casella 5 per la coltura di organoidi del colon (coloidi) che in genere richiedono concentrazioni più elevate di morfogeni rispetto ai piccoli organoidi intestinali.
a, Flusso di lavoro per l'induzione della morfogenesi intestinale nel chip intestinale. L'epitelio intestinale umano Caco-2 e gli organoidi intestinali sono utilizzati in questo protocollo per dimostrare la morfogenesi 3D. Le cellule epiteliali isolate sono state seminate nel dispositivo gut-on-a-chip preparato (preparazione del chip). (flusso, AP, D0-D2). Il flusso basolaterale (BL) viene avviato anche insieme a movimenti di allungamento ciclico (allungamento, flusso, AP e BL) quando si forma un monostrato 2D completo. La morfogenesi 3D intestinale si è verificata spontaneamente dopo 5 giorni di coltura microfluidica (morfogenesi, D5). le corrispondenti cascate della morfogenesi intestinale (in alto a destra). Le frecce tratteggiate nello schema rappresentano la direzione del flusso del fluido. b, immagine SEM che mostra la topologia superficiale dell'epitelio Caco-2 3D stabilito (a sinistra). Il riquadro che evidenzia l'area ingrandita (riquadro tratteggiato bianco) mostra i microvilli rigenerati sullo strato Caco-2 3D (a destra). membrane di confine etichettate F-actina (verde) e nuclei (blu) Visualizzazione confocale di immunofluorescenza delle cellule epiteliali sui chip intestinali. Le frecce che puntano allo schema centrale indicano la posizione del piano focale per ciascuna vista confocale. C fotomicrografia dell'epitelio organoide 3D stabilito nell'intestino su fetta presa il giorno 7.f, immagini di immunofluorescenza sovrapposte che mostrano marcatori per cellule staminali (LGR5;magenta), cellule caliciformi (MUC2; verde), F-actina (grigio) e nuclei (ciano) cresciuti su chip intestinali per 3 giorni, rispettivamente (a sinistra) e organoidi di 13 giorni (al centro) sullo strato epiteliale. membrana plasmatica con colorante CellMask (a destra) il giorno 13 della coltura. La barra della scala è di 50 μm se non diversamente specificato.b Ristampato con il permesso del riferimento.2.La stampa dell'università di Oxford;c Adattato con il permesso di Reference.2.La stampa dell'università di Oxford;e ed f adattati con permesso per riferimento.12 Con licenza Creative Commons CC BY 4.0.
Nell'intestino su un chip, è necessario modificare la superficie idrofobica della membrana porosa PDMS per il rivestimento ECM di successo. In questo protocollo, applichiamo due diversi metodi per modificare l'idrofobicità delle membrane PDMS. Funzionalizzazione della superficie a base chimica per ottenere una deposizione efficiente delle proteine ​​​​ECM applicando in sequenza polietileneimina (PEI) e glutaraldeide ai microcanali PDMS. Dopo la modifica della superficie, le proteine ​​​​ECM sono state depositate per coprire la superficie PDMS funzionalizzata e quindi introdotte nell'epitelio organoide isolato. il metodo per l'attivazione superficiale e il rivestimento ECM consente l'attacco dell'epitelio organoide per indurre la morfogenesi 3D sulla superficie PDMS.
Le colture transwell richiedono anche il rivestimento ECM prima della semina cellulare;tuttavia, le colture Transwell non richiedono complesse fasi di pretrattamento per attivare la superficie degli inserti porosi. Per far crescere le cellule Caco-2 sugli inserti Transwell, il rivestimento ECM sugli inserti porosi accelera l'attaccamento delle cellule Caco-2 dissociate (<1 ora) e la formazione di una barriera di giunzione stretta (<1-2 giorni). con integrità della barriera. Le colture Transwell vengono eseguite in piastre da 24 pozzetti senza l'uso di chip ibridi.
La morfogenesi 3D in vitro può essere avviata applicando il flusso di fluido all'aspetto basolaterale di uno strato epiteliale stabilito. Nell'intestino su un chip, la morfogenesi epiteliale è iniziata quando il mezzo è stato perfuso nei microcanali superiori e inferiori (Fig. 3a). stress di taglio luminale, in genere applichiamo il doppio flusso nell'intestino su un chip. Nei chip ibridi, gli inserti Transwell contenenti monostrati epiteliali sono stati inseriti nei chip ibridi. Quindi, il mezzo è stato applicato sotto il lato basolaterale dell'inserto poroso Transwell attraverso il microcanale. La morfogenesi intestinale si è verificata 3-5 giorni dopo l'inizio del flusso basolaterale in entrambe le piattaforme di coltura.
Le caratteristiche morfologiche degli strati epiteliali 3D microingegnerizzati possono essere analizzate applicando varie modalità di imaging, tra cui microscopia a contrasto di fase, microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC), SEM o microscopia confocale a immunofluorescenza (Figure 3 e 4). L'imaging a contrasto di fase o DIC può essere facilmente eseguito in qualsiasi momento durante la coltura per monitorare la forma e la protrusione degli strati epiteliali 3D. -chip e piattaforme di chip ibride possono fornire immagini in situ in tempo reale senza la necessità di sezionare o smontare il dispositivo. Quando si esegue l'imaging di immunofluorescenza (figure 1, 3c, f e 4b, c), le cellule vengono generalmente fissate con il 4% (peso/volume) di paraformaldeide (PFA), seguito da Triton X-100 e 2% (peso/volume) di albumina di siero bovino (BSA), in ordine. A seconda del tipo di cellula, fissativo diverso s, permeabilizzatori e agenti bloccanti. Gli anticorpi primari mirati a marcatori cellulari o regionali dipendenti dal lignaggio vengono utilizzati per evidenziare le cellule immobilizzate in situ sul chip, seguiti da anticorpi secondari insieme a un colorante di contrasto mirato al nucleo (p. es., 4 ′, 6-diamidino-2-fenilene) indolo, DAPI) o F-actina (p. es., falloidina marcata in modo fluorescente). .1, "Differenziazione cellulare" e "Fisiologia dell'intestino"), colonizzazione casuale di cellule microbiche (Fig. 1, "Co-coltura ospite-microbo"), reclutamento di cellule immunitarie (Fig. 1, "Modellazione della malattia") o contorni della morfologia epiteliale 3D (Fig. 3c, f e 4b, c). Fig. 2, la morfologia epiteliale 3D così come i microvilli sul bordo del pennello apicale possono essere visualizzati mediante SEM (Fig. 3b). L'espressione dei marcatori di differenziazione può essere valutata eseguendo la PCR5 quantitativa o il sequenziamento dell'RNA a cellula singola.
a, flusso di lavoro per l'induzione della morfogenesi intestinale in un chip ibrido. Caco-2 e organoidi intestinali sono utilizzati in questo protocollo per dimostrare la morfogenesi 3D in una piattaforma di chip ibrida. Le cellule epiteliali dissociate sono state seminate in inserti Transwell preparati (preparazione TW; vedi figura sotto). Il monostrato 2D di cellule epiteliali è stato integrato in un chip ibrido per introdurre un flusso basolaterale (Flow, BL), che alla fine ha portato alla generazione di uno strato epiteliale 3D (morfogenesi). Micrografie a contrasto di fase che mostrano le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali di organi umani derivate dal colon ascendente del donatore normale (linea C103) in ogni fase sperimentale o punto temporale. Gli schemi negli strati superiori illustrano la configurazione sperimentale per ogni fase. morfogenesi delle cellule epiteliali organoidi con viste al microscopio confocale dall'alto verso il basso prese in diverse posizioni Z (superiore, centrale e inferiore;vedi schema a destra e linee tratteggiate corrispondenti).ha mostrato evidenti caratteristiche morfologiche.F-actina (ciano), nucleo (grigio).c, Micrografie confocali a fluorescenza (vista angolata 3D) di cellule epiteliali derivate da organoidi coltivate in Transwell statico (TW; riquadro all'interno della casella tratteggiata bianca) rispetto al chip ibrido (il più grande scatto intero) confrontando rispettivamente la morfologia 2D rispetto a quella 3D. Un paio di viste trasversali verticali 2D (riquadro nell'angolo in alto a destra; "XZ") mostrano anche 2D e caratteristiche 3D. Barra della scala, 100 µm.c Ristampato con il permesso del riferimento.4.Altrove.
I controlli possono essere preparati coltivando le stesse cellule (Caco-2 o cellule epiteliali organoidi intestinali) in monostrati bidimensionali in condizioni di coltura statica convenzionali. In particolare, l'esaurimento dei nutrienti può risultare a causa della capacità di volume limitata dei microcanali (cioè ~ 4 µ l nel canale superiore sul design originale del chip intestinale). Pertanto, è possibile confrontare anche la morfologia epiteliale prima e dopo l'applicazione del flusso basolaterale.
Il processo di litografia morbida deve essere eseguito in una camera bianca. Per ogni strato sul chip (strati superiori e inferiori e membrane) e chip ibridi, sono state utilizzate diverse fotomaschere e fabbricate su wafer di silicio separati perché le altezze dei microcanali erano diverse. Le altezze target dei microcanali superiore e inferiore dell'intestino sul chip sono rispettivamente di 500 µm e 200 µm.
Posizionare un wafer di silicio da 3 pollici in un piatto con acetone. Agitare delicatamente la piastra per 30 secondi, quindi asciugare all'aria il wafer. Trasferire il wafer su una piastra con IPA, quindi ruotare la piastra per 30 s per pulirla.
Una soluzione piranha (miscela di perossido di idrogeno e acido solforico concentrato, 1:3 (vol/vol)) può essere facoltativamente utilizzata per massimizzare la rimozione dei residui organici dalla superficie del wafer di silicio.
La soluzione Piranha è estremamente corrosiva e genera calore. Sono necessarie ulteriori precauzioni di sicurezza. Per lo smaltimento dei rifiuti, lasciare raffreddare la soluzione e trasferirla in un contenitore per rifiuti pulito e asciutto. Utilizzare contenitori secondari ed etichettare correttamente i contenitori per rifiuti. Seguire le linee guida sulla sicurezza della struttura per procedure più dettagliate.
Disidratare i wafer ponendoli su una piastra calda a 200 °C per 10 min. Dopo la disidratazione, il wafer è stato agitato cinque volte all'aria per raffreddarlo.
Versare ~10 g di fotoresist SU-8 2100 al centro del wafer di silicio pulito.Utilizzare delle pinzette per distribuire uniformemente il fotoresist sul wafer.Occasionalmente posizionare il wafer su una piastra calda a 65°C per rendere il fotoresist meno appiccicoso e più facile da stendere.Non posizionare il wafer direttamente sulla piastra calda.
L'SU-8 è stato distribuito uniformemente sul wafer eseguendo lo spin coating. Programmare una rotazione in entrata dell'SU-8 per 5-10 s per propagarsi a 500 rpm con un'accelerazione di 100 rpm/s. Impostare lo spin principale per uno spessore di 200 µm a 1.500 rpm, o raggiungere uno spessore di 250 µm (facendo un'altezza di 500 µm per lo strato superiore dell'intestino sul chip; vedere "Passaggi critici" di seguito) impostato su un'accelerazione di 300 giri/s 30 secondi a 1.200 giri/min.
La velocità di rotazione principale può essere regolata in base allo spessore target del modello SU-8 sul wafer di silicio.
Per fabbricare modelli SU-8 di 500 µm di altezza per lo strato superiore dell'intestino sul chip, il rivestimento rotante e le fasi di cottura morbida di questa scatola (passaggi 7 e 8) sono stati ripetuti in sequenza (vedi passaggio 9) per produrre due strati di 250 µm Uno strato spesso di SU-8, che può essere stratificato e unito mediante esposizione ai raggi UV nel passaggio 12 di questa scatola, creando uno strato alto 500 µm.
Soft cuocere i wafer rivestiti SU-8 posizionando con cura i wafer su una piastra calda a 65 gradi centigradi per 5 min, quindi passare l'impostazione a 95 gradi centigradi e incubare per altri 40 min.
Per ottenere un'altezza di 500 μm del modello SU-8 nel microcanale superiore, ripetere i passaggi 7 e 8 per generare due strati SU-8 spessi 250 μm.
Utilizzando l'UV Mask Aligner, eseguire un test della lampada secondo le istruzioni del produttore per calcolare il tempo di esposizione del wafer. (tempo di esposizione, ms) = (dose di esposizione, mJ/cm2)/(potenza della lampada, mW/cm2).
Dopo aver determinato il tempo di esposizione, posizionare la fotomaschera sul supporto maschera dell'allineatore maschera UV e posizionare la fotomaschera sul wafer rivestito SU-8.
Posizionare la superficie stampata della fotomaschera direttamente sul lato rivestito di SU-8 del wafer di silicio per ridurre al minimo la dispersione UV.
Esporre verticalmente il wafer rivestito di SU-8 e la fotomaschera a 260 mJ/cm2 di luce UV per il tempo di esposizione predeterminato (vedere il passaggio 10 di questo riquadro).
Dopo l'esposizione ai raggi UV, i wafer di silicio rivestiti con SU-8 sono stati cotti a 65°C per 5 min e 95°C per 15 min su ciascuna piastra calda per fabbricare motivi con un'altezza di 200 μm.
Lo sviluppatore viene versato in un piatto di vetro e il wafer cotto viene posto nel piatto. Il volume dello sviluppatore SU-8 può variare a seconda delle dimensioni della lastra di vetro. Assicurarsi di utilizzare abbastanza sviluppatore SU-8 per rimuovere completamente l'SU-8 non esposto.
Risciacquare lo stampo sviluppato con ~ 10 mL di sviluppatore fresco seguito da IPA spruzzando la soluzione utilizzando una pipetta.
Posizionare il wafer in un pulitore al plasma ed esporre al plasma di ossigeno (gas atmosferico, pressione target 1 × 10-5 Torr, potenza 125 W) per 1,5 min.
Posizionare il wafer in un essiccatore sottovuoto con all'interno un vetrino. Wafer e vetrini possono essere affiancati. Se l'essiccatore sottovuoto è diviso in più strati da una piastra, posizionare i vetrini nella camera inferiore e i wafer nella camera superiore. Far cadere 100 μL di soluzione di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano su un vetrino e applicare il vuoto per la silanizzazione.
Scongelare una fiala di cellule Caco-2 congelate in un bagno d'acqua a 37°C, quindi trasferire le cellule scongelate in un pallone T75 contenente 15 mL di terreno Caco-2 preriscaldato a 37°C.
Per passare le cellule Caco-2 a circa il 90% di confluenza, prima riscaldare il mezzo Caco-2, PBS e 0,25% tripsina/1 mM EDTA in un bagno d'acqua a 37°C.
Aspirare il mezzo mediante aspirazione sotto vuoto. Lavare le cellule due volte con 5 mL di PBS caldo ripetendo l'aspirazione sotto vuoto e aggiungendo PBS fresco.