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L'evoluzione dei parassiti microbici comporta una contrapposizione tra la selezione naturale, che fa sì che i parassiti migliorino, e la deriva genetica, che fa sì che i parassiti perdano geni e accumulino mutazioni deleterie.Qui, per capire come si verifica questa controazione sulla scala di una singola macromolecola, descriviamo la struttura cryo-EM del ribosoma di Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariotico con uno dei genomi più piccoli in natura.L'estrema riduzione dell'rRNA nei ribosomi di E. cuniculi è accompagnata da cambiamenti strutturali senza precedenti, come l'evoluzione di linker rRNA fusi precedentemente sconosciuti e rRNA senza rigonfiamenti.Inoltre, il ribosoma di E. cuniculi è sopravvissuto alla perdita di frammenti e proteine ​​di rRNA sviluppando la capacità di utilizzare piccole molecole come imitazioni strutturali di frammenti e proteine ​​di rRNA degradati.Nel complesso, mostriamo che le strutture molecolari a lungo ritenute ridotte, degenerate e soggette a mutazioni debilitanti hanno una serie di meccanismi compensatori che le mantengono attive nonostante le contrazioni molecolari estreme.
Poiché la maggior parte dei gruppi di parassiti microbici dispone di strumenti molecolari unici per sfruttare i loro ospiti, spesso dobbiamo sviluppare terapie diverse per diversi gruppi di parassiti1,2.Tuttavia, nuove prove suggeriscono che alcuni aspetti dell'evoluzione dei parassiti sono convergenti e ampiamente prevedibili, indicando una potenziale base per ampi interventi terapeutici nei parassiti microbici3,4,5,6,7,8,9.
Il lavoro precedente ha identificato una tendenza evolutiva comune nei parassiti microbici chiamata riduzione del genoma o decadimento del genoma10,11,12,13.La ricerca attuale mostra che quando i microrganismi abbandonano il loro stile di vita libero e diventano parassiti intracellulari (o endosimbionti), i loro genomi subiscono metamorfosi lente ma sorprendenti nel corso di milioni di anni9,11.In un processo noto come decadimento del genoma, i parassiti microbici accumulano mutazioni deleterie che trasformano molti geni precedentemente importanti in pseudogeni, portando alla graduale perdita del gene e al collasso mutazionale14,15.Questo collasso può distruggere fino al 95% dei geni negli organismi intracellulari più antichi rispetto alle specie a vita libera strettamente imparentate.Pertanto, l'evoluzione dei parassiti intracellulari è un tiro alla fune tra due forze opposte: la selezione naturale darwiniana, che porta al miglioramento dei parassiti, e il collasso del genoma, che getta i parassiti nell'oblio.Non è chiaro come il parassita sia riuscito a emergere da questo tiro alla fune ea conservare l'attività della sua struttura molecolare.
Sebbene il meccanismo del decadimento del genoma non sia completamente compreso, sembra che si verifichi principalmente a causa della frequente deriva genetica.Poiché i parassiti vivono in popolazioni piccole, asessuate e geneticamente limitate, non possono eliminare efficacemente le mutazioni deleterie che a volte si verificano durante la replicazione del DNA.Ciò porta all'accumulo irreversibile di mutazioni dannose e alla riduzione del genoma del parassita.Di conseguenza, il parassita non solo perde i geni che non sono più necessari per la sua sopravvivenza nell'ambiente intracellulare.È l'incapacità delle popolazioni di parassiti di eliminare efficacemente sporadiche mutazioni deleterie che causa l'accumulo di queste mutazioni in tutto il genoma, compresi i loro geni più importanti.
Gran parte della nostra attuale comprensione della riduzione del genoma si basa esclusivamente sul confronto delle sequenze del genoma, con meno attenzione ai cambiamenti nelle molecole effettive che svolgono funzioni domestiche e fungono da potenziali bersagli farmacologici.Studi comparativi hanno dimostrato che il carico di mutazioni microbiche intracellulari deleterie sembra predisporre le proteine ​​e gli acidi nucleici a ripiegarsi male e ad aggregarsi, rendendoli più dipendenti da chaperone e ipersensibili al calore19,20,21,22,23.Inoltre, vari parassiti - evoluzione indipendente a volte separata da ben 2,5 miliardi di anni - hanno sperimentato una perdita simile di centri di controllo della qualità nella loro sintesi proteica5,6 e nei meccanismi di riparazione del DNA24.Tuttavia, si sa poco sull'impatto dello stile di vita intracellulare su tutte le altre proprietà delle macromolecole cellulari, compreso l'adattamento molecolare a un carico crescente di mutazioni deleterie.
In questo lavoro, al fine di comprendere meglio l'evoluzione delle proteine ​​e degli acidi nucleici dei microrganismi intracellulari, abbiamo determinato la struttura dei ribosomi del parassita intracellulare Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi è un organismo simile a un fungo appartenente a un gruppo di microsporidi parassiti che hanno genomi eucarioti insolitamente piccoli e sono quindi usati come organismi modello per studiare il decadimento del genoma25,26,27,28,29,30.Recentemente, la struttura del ribosoma cryo-EM è stata determinata per genomi moderatamente ridotti di Microsporidi, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3,2 Mb di genoma).Queste strutture suggeriscono che una certa perdita di amplificazione dell'rRNA è compensata dallo sviluppo di nuovi contatti tra proteine ​​ribosomiali vicine o dall'acquisizione di nuove proteine ​​ribosomiali msL131,32.Le specie Encephalitozoon (genoma ~ 2,5 milioni di bp), insieme al loro parente più stretto Ordospora, dimostrano il massimo grado di riduzione del genoma negli eucarioti: hanno meno di 2000 geni codificanti proteine ​​e si prevede che i loro ribosomi non solo siano privi di frammenti di espansione dell'rRNA (frammenti di rRNA che distinguono i ribosomi eucariotici dai ribosomi batterici) hanno anche quattro proteine ​​​​ribosomiali a causa della loro mancanza di omologhi nell'E genoma di cuniculi26,27,28.Pertanto, abbiamo concluso che il ribosoma di E. cuniculi può rivelare strategie precedentemente sconosciute per l'adattamento molecolare al decadimento del genoma.
La nostra struttura cryo-EM rappresenta il più piccolo ribosoma citoplasmatico eucariotico da caratterizzare e fornisce informazioni su come il grado massimo di riduzione del genoma influenzi la struttura, l'assemblaggio e l'evoluzione del macchinario molecolare che è parte integrante della cellula.Abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi viola molti dei principi ampiamente conservati del ripiegamento dell'RNA e dell'assemblaggio dei ribosomi e abbiamo scoperto una nuova proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta.Abbastanza inaspettatamente, dimostriamo che i ribosomi dei microsporidi hanno sviluppato la capacità di legare piccole molecole e ipotizziamo che i troncamenti nell'rRNA e nelle proteine ​​inneschino innovazioni evolutive che possono in definitiva conferire qualità utili al ribosoma.
Per migliorare la nostra comprensione dell'evoluzione delle proteine ​​e degli acidi nucleici negli organismi intracellulari, abbiamo deciso di isolare le spore di E. cuniculi da colture di cellule di mammifero infette per purificare i loro ribosomi e determinare la struttura di questi ribosomi.È difficile ottenere un gran numero di microsporidi parassiti perché i microsporidi non possono essere coltivati ​​in un mezzo nutritivo.Invece, crescono e si riproducono solo all'interno della cellula ospite.Pertanto, per ottenere la biomassa di E. cuniculi per la purificazione del ribosoma, abbiamo infettato la linea cellulare renale di mammifero RK13 con spore di E. cuniculi e abbiamo coltivato queste cellule infette per diverse settimane per consentire a E. cuniculi di crescere e moltiplicarsi.Utilizzando un monostrato di cellule infette di circa mezzo metro quadrato, siamo stati in grado di purificare circa 300 mg di spore di Microsporidi e utilizzarle per isolare i ribosomi.Abbiamo quindi interrotto le spore purificate con perle di vetro e isolato i ribosomi grezzi utilizzando il frazionamento graduale del polietilenglicole dei lisati.Questo ci ha permesso di ottenere circa 300 µg di ribosomi di E. cuniculi grezzi per l'analisi strutturale.
Abbiamo quindi raccolto immagini cryo-EM utilizzando i campioni di ribosomi risultanti ed elaborato queste immagini utilizzando maschere corrispondenti alla grande subunità ribosomiale, alla piccola testa della subunità e alla piccola subunità.Durante questo processo, abbiamo raccolto immagini di circa 108.000 particelle ribosomiali e immagini crio-EM calcolate con una risoluzione di 2,7 Å (Figure supplementari 1-3).Abbiamo quindi utilizzato le immagini cryoEM per modellare l'rRNA, la proteina ribosomiale e il fattore di ibernazione Mdf1 associati ai ribosomi di E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Struttura del ribosoma di E. cuniculi in complesso con il fattore di ibernazione Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mappa del fattore di ibernazione Mdf1 associato al ribosoma di E. cuniculi.c Mappa della struttura secondaria che confronta l'rRNA recuperato nelle specie microsporidiane con strutture ribosomiali note.I pannelli mostrano la posizione dei frammenti di rRNA amplificati (ES) e dei siti attivi del ribosoma, compreso il sito di decodifica (DC), l'ansa della sarcinicina (SRL) e il centro della peptidil transferasi (PTC).d La densità elettronica corrispondente al centro della peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo sito catalitico abbia la stessa struttura nel parassita di E. cuniculi e nei suoi ospiti, incluso H. sapiens.e, f La corrispondente densità elettronica del centro di decodifica (e) e la struttura schematica del centro di decodifica (f) indicano che E. cuniculi ha residui U1491 invece di A1491 (numerazione E. coli) in molti altri eucarioti.Questo cambiamento suggerisce che E. cuniculi può essere sensibile agli antibiotici che prendono di mira questo sito attivo.
Contrariamente alle strutture precedentemente stabilite dei ribosomi di V. necatrix e P. locustae (entrambe le strutture rappresentano la stessa famiglia di microsporidi Nosematidae e sono molto simili tra loro), 31,32 i ribosomi di E. cuniculi subiscono numerosi processi di frammentazione dell'rRNA e delle proteine.Ulteriore denaturazione (figure supplementari 4-6).Nell'rRNA, i cambiamenti più sorprendenti includevano la perdita completa del frammento di rRNA 25S amplificato ES12L e la degenerazione parziale delle eliche h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Fig. 4 supplementare).Tra le proteine ​​​​ribosomiali, i cambiamenti più sorprendenti includevano la completa perdita della proteina eS30 e l'accorciamento delle proteine ​​eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (Figure supplementari 4, 5).
Pertanto, l'estrema riduzione dei genomi delle specie Encephalotozoon/Ordospora si riflette nella loro struttura ribosomiale: i ribosomi di E. cuniculi sperimentano la più drammatica perdita di contenuto proteico nei ribosomi citoplasmatici eucariotici soggetti a caratterizzazione strutturale, e non hanno nemmeno quei frammenti di rRNA e proteine ​​che sono ampiamente conservati non solo negli eucarioti, ma anche nei tre domini della vita.La struttura del ribosoma di E. cuniculi fornisce il primo modello molecolare per questi cambiamenti e rivela eventi evolutivi che sono stati trascurati sia dalla genomica comparativa che dagli studi sulla struttura biomolecolare intracellulare (Figura 7 supplementare).Di seguito, descriviamo ciascuno di questi eventi insieme alle loro probabili origini evolutive e al loro potenziale impatto sulla funzione dei ribosomi.
Abbiamo quindi scoperto che, oltre a grandi troncamenti di rRNA, i ribosomi di E. cuniculi hanno variazioni di rRNA in uno dei loro siti attivi.Sebbene il centro della peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi abbia la stessa struttura di altri ribosomi eucariotici (figura 1d), il centro di decodifica differisce a causa della variazione di sequenza al nucleotide 1491 (numerazione di E. coli, figura 1e, f).Questa osservazione è importante perché il sito di decodifica dei ribosomi eucariotici contiene tipicamente residui G1408 e A1491 rispetto ai residui di tipo batterico A1408 e G1491.Questa variazione è alla base della diversa sensibilità dei ribosomi batterici ed eucariotici alla famiglia degli aminoglicosidi degli antibiotici ribosomiali e ad altre piccole molecole che colpiscono il sito di decodifica.Nel sito di decodifica del ribosoma di E. cuniculi, il residuo A1491 è stato sostituito con U1491, creando potenzialmente un'interfaccia di legame unica per piccole molecole mirate a questo sito attivo.La stessa variante A14901 è presente anche in altri microsporidi come P. locustae e V. necatrix, suggerendo che sia diffusa tra le specie di microsporidi (Fig. 1f).
Poiché i nostri campioni di ribosoma di E. cuniculi sono stati isolati da spore metabolicamente inattive, abbiamo testato la mappa cryo-EM di E. cuniculi per il legame del ribosoma precedentemente descritto in condizioni di stress o fame.Fattori di ibernazione 31,32,36,37, 38. Abbiamo abbinato la struttura precedentemente stabilita del ribosoma ibernato con la mappa cryo-EM del ribosoma di E. cuniculi.Per l'attracco, i ribosomi di S. cerevisiae sono stati utilizzati in complesso con fattore di ibernazione Stm138, ribosomi di locusta in complesso con fattore Lso232 e ribosomi di V. necatrix in complesso con fattori Mdf1 e Mdf231.Allo stesso tempo, abbiamo trovato la densità cryo-EM corrispondente al fattore di riposo Mdf1.Simile al legame Mdf1 al ribosoma V. necatrix, Mdf1 si lega anche al ribosoma E. cuniculi, dove blocca il sito E del ribosoma, contribuendo probabilmente a rendere disponibili i ribosomi quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive all'inattivazione del corpo (Figura 2).).
Mdf1 blocca il sito E del ribosoma, che sembra aiutare a inattivare il ribosoma quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive.Nella struttura del ribosoma di E. cuniculi, abbiamo scoperto che Mdf1 forma un contatto precedentemente sconosciuto con lo stelo del ribosoma L1, la parte del ribosoma che facilita il rilascio di tRNA deacilato dal ribosoma durante la sintesi proteica.Questi contatti suggeriscono che Mdf1 si dissocia dal ribosoma usando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, fornendo una possibile spiegazione di come il ribosoma rimuove Mdf1 per riattivare la sintesi proteica.
Tuttavia, la nostra struttura ha rivelato un contatto sconosciuto tra Mdf1 e la gamba del ribosoma L1 (la parte del ribosoma che aiuta a rilasciare il tRNA deacilato dal ribosoma durante la sintesi proteica).In particolare, Mdf1 utilizza gli stessi contatti del segmento del gomito della molecola di tRNA deacilata (Fig. 2).Questa modellazione molecolare precedentemente sconosciuta ha mostrato che Mdf1 si dissocia dal ribosoma utilizzando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, il che spiega come il ribosoma rimuove questo fattore di ibernazione per riattivare la sintesi proteica.
Durante la costruzione del modello di rRNA, abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi ha frammenti di rRNA piegati in modo anomalo, che abbiamo chiamato rRNA fuso (Fig. 3).Nei ribosomi che abbracciano i tre domini della vita, l'rRNA si ripiega in strutture in cui la maggior parte delle basi dell'rRNA si accoppiano e si ripiegano l'una con l'altra o interagiscono con le proteine ​​ribosomiali38,39,40.Tuttavia, nei ribosomi di E. cuniculi, gli rRNA sembrano violare questo principio di ripiegamento convertendo alcune delle loro eliche in regioni di rRNA non ripiegate.
Struttura dell'elica H18 25S rRNA in S. cerevisiae, V. necatrix ed E. cuniculi.Tipicamente, nei ribosomi che attraversano i tre domini della vita, questo linker si avvolge in un'elica di RNA che contiene da 24 a 34 residui.In Microsporidi, al contrario, questo linker rRNA viene gradualmente ridotto a due linker ricchi di uridina a singolo filamento contenenti solo 12 residui.La maggior parte di questi residui è esposta ai solventi.La figura mostra che i microsporidi parassiti sembrano violare i principi generali del ripiegamento dell'rRNA, dove le basi dell'rRNA sono solitamente accoppiate ad altre basi o coinvolte nelle interazioni rRNA-proteina.Nei microsporidi, alcuni frammenti di rRNA assumono una piega sfavorevole, in cui l'ex elica di rRNA diventa un frammento a singolo filamento allungato quasi in linea retta.La presenza di queste regioni insolite consente ai microsporidi rRNA di legare frammenti di rRNA distanti utilizzando un numero minimo di basi di RNA.
L'esempio più eclatante di questa transizione evolutiva può essere osservato nell'elica dell'rRNA H18 25S (Fig. 3).Nelle specie da E. coli all'uomo, le basi di questa elica di rRNA contengono 24-32 nucleotidi, formando un'elica leggermente irregolare.Nelle strutture ribosomiali precedentemente identificate da V. necatrix e P. locustae,31,32 le basi dell'elica H18 sono parzialmente srotolate, ma l'accoppiamento delle basi nucleotidiche è preservato.Tuttavia, in E. cuniculi questo frammento di rRNA diventa i linker più corti 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUU307.A differenza dei tipici frammenti di rRNA, questi linker ricchi di uridina non si avvolgono né entrano in contatto esteso con le proteine ​​ribosomiali.Invece, adottano strutture aperte al solvente e completamente dispiegate in cui i filamenti di rRNA sono estesi quasi diritti.Questa conformazione allungata spiega come E. cuniculi utilizzi solo 12 basi di RNA per colmare il divario di 33 Å tra le eliche di rRNA H16 e H18, mentre altre specie richiedono almeno il doppio delle basi di rRNA per colmare il divario.
Pertanto, possiamo dimostrare che, attraverso un ripiegamento energeticamente sfavorevole, i microsporidi parassiti hanno sviluppato una strategia per contrarre anche quei segmenti di rRNA che rimangono ampiamente conservati tra le specie nei tre domini della vita.Apparentemente, accumulando mutazioni che trasformano le eliche di rRNA in brevi linker poli-U, E. cuniculi può formare frammenti di rRNA insoliti contenenti il ​​minor numero possibile di nucleotidi per la ligazione dei frammenti distali di rRNA.Questo aiuta a spiegare come i microsporidi abbiano raggiunto una drastica riduzione della loro struttura molecolare di base senza perdere la loro integrità strutturale e funzionale.
Un'altra caratteristica insolita dell'rRNA di E. cuniculi è l'aspetto dell'rRNA senza ispessimenti (Fig. 4).I rigonfiamenti sono nucleotidi senza coppie di basi che escono dall'elica dell'RNA invece di nascondersi in essa.La maggior parte delle sporgenze di rRNA agisce come adesivo molecolare, contribuendo a legare le proteine ​​ribosomiali adiacenti o altri frammenti di rRNA.Alcuni dei rigonfiamenti fungono da cerniere, consentendo all'elica dell'rRNA di flettersi e piegarsi in modo ottimale per la sintesi proteica produttiva 41 .
a Una protrusione di rRNA (numerazione S. cerevisiae) è assente dalla struttura del ribosoma di E. cuniculi, ma presente nella maggior parte degli altri eucarioti b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e E. cuniculi ribosomi interni.i parassiti mancano di molti degli antichi rigonfiamenti di rRNA altamente conservati.Questi ispessimenti stabilizzano la struttura dei ribosomi;pertanto, la loro assenza nei microsporidi indica una ridotta stabilità del ripiegamento dell'rRNA nei parassiti dei microsporidi.Il confronto con gli steli P (steli L7/L12 nei batteri) mostra che la perdita di protuberanze di rRNA a volte coincide con la comparsa di nuove protuberanze accanto alle protuberanze perse.L'elica H42 nell'rRNA 23S/28S ha un antico rigonfiamento (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) che si stima abbia almeno 3,5 miliardi di anni a causa della sua protezione in tre domini della vita.Nei microsporidi, questo rigonfiamento viene eliminato.Tuttavia, un nuovo rigonfiamento è apparso accanto al rigonfiamento perduto (A1306 in E. cuniculi).
Sorprendentemente, abbiamo scoperto che i ribosomi di E. cuniculi mancano della maggior parte dei rigonfiamenti di rRNA trovati in altre specie, inclusi più di 30 rigonfiamenti conservati in altri eucarioti (Fig. 4a).Questa perdita elimina molti contatti tra le subunità ribosomiali e le eliche di rRNA adiacenti, a volte creando grandi vuoti cavi all'interno del ribosoma, rendendo il ribosoma di E. cuniculi più poroso rispetto ai ribosomi più tradizionali (Fig. 4b).In particolare, abbiamo scoperto che la maggior parte di questi rigonfiamenti erano stati persi anche nelle strutture ribosomali di V. necatrix e P. locustae precedentemente identificate, che erano state trascurate da precedenti analisi strutturali31,32.
A volte la perdita di rigonfiamenti di rRNA è accompagnata dallo sviluppo di nuovi rigonfiamenti accanto al rigonfiamento perduto.Ad esempio, il gambo P ribosomiale contiene un rigonfiamento U1208 (in Saccharomyces cerevisiae) che è sopravvissuto da E. coli all'uomo e quindi si stima che abbia 3,5 miliardi di anni.Durante la sintesi proteica, questo rigonfiamento aiuta lo stelo P a spostarsi tra conformazioni aperte e chiuse in modo che il ribosoma possa reclutare fattori di traduzione e consegnarli al sito attivo.Nei ribosomi di E. cuniculi questo ispessimento è assente;tuttavia, un nuovo ispessimento (G883) localizzato solo in tre paia di basi può contribuire al ripristino della flessibilità ottimale dello stelo P (Fig. 4c).
I nostri dati sull'rRNA senza rigonfiamenti suggeriscono che la minimizzazione dell'rRNA non è limitata alla perdita di elementi di rRNA sulla superficie del ribosoma, ma può anche coinvolgere il nucleo del ribosoma, creando un difetto molecolare specifico del parassita che non è stato descritto nelle cellule a vita libera.si osservano specie viventi.
Dopo aver modellato le proteine ​​​​ribosomiali canoniche e l'rRNA, abbiamo scoperto che i componenti ribosomiali convenzionali non possono spiegare le tre parti dell'immagine cryo-EM.Due di questi frammenti sono di piccole dimensioni (Fig. 5, Fig. 8 supplementare).Il primo segmento è inserito tra le proteine ​​ribosomiali uL15 ed eL18 in una posizione solitamente occupata dal C-terminale di eL18, che è accorciato in E. cuniculi.Sebbene non possiamo determinare l'identità di questa molecola, la dimensione e la forma di questa isola di densità è ben spiegata dalla presenza di molecole di spermidina.Il suo legame con il ribosoma è stabilizzato da mutazioni specifiche dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 (Asp51 e Arg56), che sembrano aumentare l'affinità del ribosoma per questa piccola molecola, poiché consentono a uL15 di avvolgere la piccola molecola in una struttura ribosomiale.Figura supplementare 2).8, dati aggiuntivi 1, 2).
Imaging Cryo-EM che mostra la presenza di nucleotidi al di fuori del ribosio legato al ribosoma di E. cuniculi.Nel ribosoma di E. cuniculi, questo nucleotide occupa lo stesso posto del nucleotide 25S rRNA A3186 (numerazione Saccharomyces cerevisiae) nella maggior parte degli altri ribosomi eucariotici.b Nella struttura ribosomiale di E. cuniculi, questo nucleotide si trova tra le proteine ​​ribosomiali uL9 e eL20, stabilizzando così il contatto tra le due proteine.analisi della conservazione della sequenza cd eL20 tra le specie di microsporidi.L'albero filogenetico delle specie di Microsporidi (c) e l'allineamento di sequenze multiple della proteina eL20 (d) mostrano che i residui di legame nucleotidico F170 e K172 sono conservati nella maggior parte dei Microsporidi tipici, ad eccezione di S. lophii, con l'eccezione di Microsporidi a ramificazione precoce, che hanno mantenuto l'estensione dell'rRNA ES39L.e Questa figura mostra che i residui di legame nucleotidico F170 e K172 sono presenti solo in eL20 del genoma dei microsporidi altamente ridotto, ma non in altri eucarioti.Nel complesso, questi dati suggeriscono che i ribosomi microsporidiani hanno sviluppato un sito di legame nucleotidico che sembra legare le molecole di AMP e utilizzarle per stabilizzare le interazioni proteina-proteina nella struttura ribosomiale.L'elevata conservazione di questo sito di legame in Microsporidi e la sua assenza in altri eucarioti suggerisce che questo sito può fornire un vantaggio di sopravvivenza selettivo per Microsporidi.Pertanto, la tasca di legame nucleotidico nel ribosoma dei microsporidi non sembra essere una caratteristica degenerata o una forma finale della degradazione dell'rRNA come descritto in precedenza, ma piuttosto un'utile innovazione evolutiva che consente al ribosoma dei microsporidi di legare direttamente piccole molecole, usandole come blocchi molecolari.elementi costitutivi dei ribosomi.Questa scoperta rende il ribosoma dei microsporidi l'unico ribosoma noto per utilizzare un singolo nucleotide come blocco strutturale.f Ipotetico percorso evolutivo derivato dal legame nucleotidico.
La seconda densità a basso peso molecolare si trova all'interfaccia tra le proteine ​​​​ribosomiali uL9 ed eL30 (figura 5a).Questa interfaccia è stata precedentemente descritta nella struttura del ribosoma di Saccharomyces cerevisiae come sito di legame per il nucleotide 25S dell'rRNA A3186 (parte dell'estensione dell'rRNA ES39L)38.È stato dimostrato che nei ribosomi ES39L di P. locustae degenerati, questa interfaccia lega un singolo nucleotide sconosciuto 31 e si presume che questo nucleotide sia una forma finale ridotta di rRNA, in cui la lunghezza dell'rRNA è ~ 130-230 basi.ES39L è ridotto a un singolo nucleotide 32.43.Le nostre immagini cryo-EM supportano l'idea che la densità possa essere spiegata dai nucleotidi.Tuttavia, la maggiore risoluzione della nostra struttura ha mostrato che questo nucleotide è una molecola extraribosomiale, possibilmente AMP (Fig. 5a, b).
Abbiamo quindi chiesto se il sito di legame del nucleotide apparisse nel ribosoma di E. cuniculi o se esistesse in precedenza.Poiché il legame nucleotidico è principalmente mediato dai residui Phe170 e Lys172 nella proteina ribosomiale eL30, abbiamo valutato la conservazione di questi residui in 4396 eucarioti rappresentativi.Come nel caso di uL15 sopra, abbiamo scoperto che i residui Phe170 e Lys172 sono altamente conservati solo nei Microsporidi tipici, ma assenti in altri eucarioti, inclusi Microsporidia Mitosporidium e Amphiamblys atipici, in cui il frammento di rRNA ES39L non è ridotto 44, 45, 46 (Fig. 5c).-e).
Presi insieme, questi dati supportano l'idea che E. cuniculi e possibilmente altri microsporidi canonici abbiano sviluppato la capacità di catturare in modo efficiente un gran numero di piccoli metaboliti nella struttura del ribosoma per compensare il declino dei livelli di rRNA e proteine.In tal modo, hanno sviluppato una capacità unica di legare i nucleotidi all'esterno del ribosoma, dimostrando che le strutture molecolari parassite compensano catturando abbondanti piccoli metaboliti e usandoli come imitazioni strutturali di frammenti di RNA e proteine ​​degradati..
La terza parte non simulata della nostra mappa cryo-EM, trovata nella grande subunità ribosomiale.La risoluzione relativamente alta (2,6 Å) della nostra mappa suggerisce che questa densità appartiene a proteine ​​con combinazioni uniche di grandi residui di catena laterale, il che ci ha permesso di identificare questa densità come una proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta che abbiamo identificato come chiamata msL2 (Microsporidi-proteina specifica L2) (metodi, figura 6).La nostra ricerca di omologia ha mostrato che msL2 è conservato nel clade Microsporidia del genere Encephaliter e Orosporidium, ma assente in altre specie, inclusi altri Microsporidi.Nella struttura ribosomiale, msL2 occupa uno spazio formato dalla perdita dell'rRNA ES31L esteso.In questo vuoto, msL2 aiuta a stabilizzare il ripiegamento dell'rRNA e può compensare la perdita di ES31L (Figura 6).
a Densità elettronica e modello della proteina ribosomiale specifica per Microsporidi msL2 trovata nei ribosomi di E. cuniculi.b La maggior parte dei ribosomi eucariotici, incluso il ribosoma 80S di Saccharomyces cerevisiae, hanno l'amplificazione dell'rRNA ES19L persa nella maggior parte delle specie microsporidiane.La struttura precedentemente stabilita del ribosoma di V. necatrix microsporidia suggerisce che la perdita di ES19L in questi parassiti è compensata dall'evoluzione della nuova proteina ribosomiale msL1.In questo studio, abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi ha anche sviluppato un'ulteriore proteina mimica dell'RNA ribosomiale come apparente compensazione per la perdita di ES19L.Tuttavia, msL2 (attualmente annotata come l'ipotetica proteina ECU06_1135) e msL1 hanno origini strutturali ed evolutive diverse.c Questa scoperta della generazione di proteine ​​​​ribosomiali msL1 e msL2 evolutivamente non correlate suggerisce che se i ribosomi accumulano mutazioni dannose nel loro rRNA, possono raggiungere livelli senza precedenti di diversità compositiva anche in un piccolo sottoinsieme di specie strettamente correlate.Questa scoperta potrebbe aiutare a chiarire l'origine e l'evoluzione del ribosoma mitocondriale, che è noto per il suo rRNA altamente ridotto e per la variabilità anormale nella composizione proteica tra le specie.
Abbiamo quindi confrontato la proteina msL2 con la proteina msL1 precedentemente descritta, l'unica proteina ribosomiale specifica per microsporidi nota trovata nel ribosoma di V. necatrix.Volevamo verificare se msL1 e msL2 sono evolutivamente correlati.La nostra analisi ha mostrato che msL1 e msL2 occupano la stessa cavità nella struttura ribosomiale, ma hanno strutture primarie e terziarie diverse, il che indica la loro origine evolutiva indipendente (Fig. 6).Pertanto, la nostra scoperta di msL2 fornisce la prova che gruppi di specie eucariotiche compatte possono evolvere in modo indipendente proteine ​​​​ribosomiali strutturalmente distinte per compensare la perdita di frammenti di rRNA.Questa scoperta è notevole in quanto la maggior parte dei ribosomi eucariotici citoplasmatici contengono una proteina invariante, inclusa la stessa famiglia di 81 proteine ​​​​ribosomiali.La comparsa di msL1 e msL2 in vari cladi di microsporidi in risposta alla perdita di segmenti estesi di rRNA suggerisce che il degrado dell'architettura molecolare del parassita induce i parassiti a cercare mutazioni compensatorie, che alla fine possono portare alla loro acquisizione in diverse popolazioni di parassiti.strutture.
Infine, quando il nostro modello è stato completato, abbiamo confrontato la composizione del ribosoma di E. cuniculi con quella prevista dalla sequenza del genoma.In precedenza si pensava che diverse proteine ​​ribosomiali, tra cui eL14, eL38, eL41 ed eS30, mancassero dal genoma di E. cuniculi a causa dell'apparente assenza dei loro omologhi dal genoma di E. cuniculi.La perdita di molte proteine ​​ribosomiali è prevista anche nella maggior parte degli altri parassiti intracellulari ed endosimbionti altamente ridotti.Ad esempio, sebbene la maggior parte dei batteri a vita libera contenga la stessa famiglia di 54 proteine ​​ribosomiali, solo 11 di queste famiglie di proteine ​​hanno omologhi rilevabili in ciascun genoma analizzato di batteri con restrizione dell'ospite.A sostegno di questa nozione, una perdita di proteine ​​ribosomiali è stata osservata sperimentalmente in V. necatrix e P. locustae microsporidi, che mancano delle proteine ​​eL38 e eL4131,32.
Tuttavia, le nostre strutture mostrano che solo eL38, eL41 ed eS30 sono effettivamente persi nel ribosoma di E. cuniculi.La proteina eL14 è stata conservata e la nostra struttura ha mostrato perché questa proteina non è stata trovata nella ricerca di omologia (Fig. 7).Nei ribosomi di E. cuniculi, la maggior parte del sito di legame eL14 viene persa a causa della degradazione dell'ES39L amplificato con rRNA.In assenza di ES39L, eL14 ha perso la maggior parte della sua struttura secondaria e solo il 18% della sequenza eL14 era identica in E. cuniculi e S. cerevisiae.Questa scarsa conservazione della sequenza è notevole perché anche Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens, organismi che si sono evoluti a 1,5 miliardi di anni di distanza, condividono più del 51% degli stessi residui in eL14.Questa anomala perdita di conservazione spiega perché E. cuniculi eL14 è attualmente annotato come proteina putativa M970_061160 e non come proteina ribosomiale eL1427.
e il ribosoma Microsporidi ha perso l'estensione dell'rRNA ES39L, che ha parzialmente eliminato il sito di legame della proteina ribosomiale eL14.In assenza di ES39L, la proteina microspora eL14 subisce una perdita di struttura secondaria, in cui l'ex α-elica legante l'rRNA degenera in un anello di lunghezza minima.b L'allineamento di sequenze multiple mostra che la proteina eL14 è altamente conservata nelle specie eucariotiche (identità di sequenza del 57% tra lievito e omologhi umani), ma scarsamente conservata e divergente nei microsporidi (in cui non più del 24% dei residui è identico all'omologo eL14).da S. cerevisiae o H. sapiens).Questa scarsa conservazione della sequenza e variabilità della struttura secondaria spiega perché l'omologo eL14 non è mai stato trovato in E. cuniculi e perché si pensa che questa proteina sia stata persa in E. cuniculi.Al contrario, E. cuniculi eL14 era stato precedentemente annotato come una proteina putativa M970_061160.Questa osservazione suggerisce che la diversità del genoma dei microsporidi è attualmente sovrastimata: alcuni geni attualmente ritenuti persi nei microsporidi sono in realtà conservati, sebbene in forme altamente differenziate;invece, si pensa che alcuni codifichino i geni dei microsporidi per proteine ​​specifiche del verme (ad esempio, l'ipotetica proteina M970_061160) in realtà codifica per le proteine ​​molto diverse che si trovano in altri eucarioti.
Questa scoperta suggerisce che la denaturazione dell'rRNA può portare a una drammatica perdita di conservazione della sequenza nelle proteine ​​ribosomiali adiacenti, rendendo queste proteine ​​non rilevabili per le ricerche di omologia.Pertanto, potremmo sovrastimare l'effettivo grado di degradazione molecolare negli organismi con piccoli genomi, poiché alcune proteine ​​che si pensava fossero perse in realtà persistono, sebbene in forme altamente alterate.
Come possono i parassiti mantenere la funzione delle loro macchine molecolari in condizioni di estrema riduzione del genoma?Il nostro studio risponde a questa domanda descrivendo la complessa struttura molecolare (ribosoma) di E. cuniculi, un organismo con uno dei più piccoli genomi eucarioti.
È noto da quasi due decenni che le molecole di proteine ​​e RNA nei parassiti microbici spesso differiscono dalle loro molecole omologhe nelle specie a vita libera perché mancano di centri di controllo della qualità, sono ridotte al 50% delle loro dimensioni nei microbi a vita libera, ecc.molte mutazioni debilitanti che compromettono il ripiegamento e la funzione.Ad esempio, si prevede che i ribosomi di piccoli organismi genomici, inclusi molti parassiti intracellulari ed endosimbionti, manchino di diverse proteine ​​ribosomiali e fino a un terzo dei nucleotidi di rRNA rispetto alle specie a vita libera 27, 29, 30, 49. Tuttavia, il modo in cui queste molecole funzionano nel parassita rimane in gran parte un mistero, studiato principalmente attraverso la genomica.
Il nostro studio mostra che la struttura delle macromolecole può rivelare molti aspetti dell'evoluzione che sono difficili da estrarre dai tradizionali studi genomici comparativi di parassiti intracellulari e altri organismi limitati dall'ospite (Figura 7 supplementare).Ad esempio, l'esempio della proteina eL14 mostra che possiamo sovrastimare l'effettivo grado di degradazione dell'apparato molecolare nelle specie parassite.Si ritiene ora che i parassiti encefalitici abbiano centinaia di geni specifici per i microsporidi.Tuttavia, i nostri risultati mostrano che alcuni di questi geni apparentemente specifici sono in realtà solo varianti molto diverse di geni che sono comuni in altri eucarioti.Inoltre, l'esempio della proteina msL2 mostra come trascuriamo le nuove proteine ​​ribosomiali e sottovalutiamo il contenuto delle macchine molecolari parassite.L'esempio delle piccole molecole mostra come possiamo trascurare le innovazioni più ingegnose nelle strutture molecolari parassite che possono dare loro nuova attività biologica.
Presi insieme, questi risultati migliorano la nostra comprensione delle differenze tra le strutture molecolari degli organismi con restrizione dell'ospite e le loro controparti negli organismi a vita libera.Mostriamo che le macchine molecolari, a lungo ritenute ridotte, degenerate e soggette a varie mutazioni debilitanti, hanno invece una serie di caratteristiche strutturali insolite sistematicamente trascurate.
D'altra parte, i frammenti di rRNA non ingombranti e i frammenti fusi che abbiamo trovato nei ribosomi di E. cuniculi suggeriscono che la riduzione del genoma può cambiare anche quelle parti del meccanismo molecolare di base che sono conservate nei tre domini della vita - dopo quasi 3,5 miliardi di anni.evoluzione indipendente delle specie.
I frammenti di rRNA privi di rigonfiamento e fusi nei ribosomi di E. cuniculi sono di particolare interesse alla luce di precedenti studi sulle molecole di RNA nei batteri endosimbiotici.Ad esempio, nell'afide endosimbionte Buchnera aphidicola, è stato dimostrato che le molecole di rRNA e tRNA hanno strutture sensibili alla temperatura a causa della distorsione della composizione A + T e un'alta percentuale di coppie di basi non canoniche20,50.Si pensa ora che questi cambiamenti nell'RNA, così come i cambiamenti nelle molecole proteiche, siano responsabili dell'eccessiva dipendenza degli endosimbionti dai partner e dell'incapacità degli endosimbionti di trasferire il calore 21, 23 .Sebbene l'rRNA dei microsporidi parassiti abbia cambiamenti strutturalmente distinti, la natura di questi cambiamenti suggerisce che la ridotta stabilità termica e una maggiore dipendenza dalle proteine ​​chaperone possono essere caratteristiche comuni delle molecole di RNA negli organismi con genomi ridotti.
D'altra parte, le nostre strutture mostrano che i microsporidi del parassita hanno sviluppato una capacità unica di resistere a rRNA e frammenti proteici ampiamente conservati, sviluppando la capacità di utilizzare piccoli metaboliti abbondanti e prontamente disponibili come imitazioni strutturali di rRNA degenerato e frammenti proteici.Degradazione della struttura molecolare..Questa opinione è supportata dal fatto che piccole molecole che compensano la perdita di frammenti proteici nell'rRNA e nei ribosomi di E. cuniculi si legano a residui specifici dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 ed eL30.Ciò suggerisce che il legame di piccole molecole ai ribosomi può essere un prodotto di selezione positiva, in cui le mutazioni specifiche di Microsporidi nelle proteine ​​​​ribosomiali sono state selezionate per la loro capacità di aumentare l'affinità dei ribosomi per le piccole molecole, il che può portare a organismi ribosomiali più efficienti.La scoperta rivela un'innovazione intelligente nella struttura molecolare dei parassiti microbici e ci dà una migliore comprensione di come le strutture molecolari dei parassiti mantengano la loro funzione nonostante l'evoluzione riduttiva.
Al momento, l'identificazione di queste piccole molecole rimane poco chiara.Non è chiaro perché l'aspetto di queste piccole molecole nella struttura ribosomiale differisca tra le specie di microsporidi.In particolare, non è chiaro perché il legame nucleotidico si osservi nei ribosomi di E. cuniculi e P. locustae, e non nei ribosomi di V. necatrix, nonostante la presenza del residuo F170 nelle proteine ​​eL20 e K172 di V. necatrix.Questa delezione può essere causata dal residuo 43 uL6 (situato adiacente alla tasca di legame del nucleotide), che è tirosina in V. necatrix e non treonina in E. cuniculi e P. locustae.La voluminosa catena laterale aromatica di Tyr43 può interferire con il legame nucleotidico a causa della sovrapposizione sterica.In alternativa, l'apparente delezione del nucleotide può essere dovuta alla bassa risoluzione dell'imaging cryo-EM, che ostacola la modellazione dei frammenti ribosomiali di V. necatrix.
D'altra parte, il nostro lavoro suggerisce che il processo di decadimento del genoma può essere una forza inventiva.In particolare, la struttura del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che la perdita di rRNA e frammenti proteici nel ribosoma dei microsporidi crea una pressione evolutiva che promuove i cambiamenti nella struttura del ribosoma.Queste varianti si verificano lontano dal sito attivo del ribosoma e sembrano aiutare a mantenere (o ripristinare) l'assemblaggio ottimale del ribosoma che altrimenti verrebbe interrotto dalla riduzione dell'rRNA.Ciò suggerisce che un'importante innovazione del ribosoma dei microsporidi sembra essersi evoluta nella necessità di tamponare la deriva genica.
Forse questo è meglio illustrato dal legame nucleotidico, che finora non è mai stato osservato in altri organismi.Il fatto che i residui di legame ai nucleotidi siano presenti nei tipici microsporidi, ma non in altri eucarioti, suggerisce che i siti di legame ai nucleotidi non sono solo relitti in attesa di scomparire, o il sito finale per il ripristino dell'rRNA nella forma di singoli nucleotidi.Invece, questo sito sembra una funzionalità utile che potrebbe essersi evoluta in diversi cicli di selezione positiva.I siti di legame dei nucleotidi possono essere un sottoprodotto della selezione naturale: una volta che ES39L è degradato, i microsporidi sono costretti a cercare una compensazione per ripristinare la biogenesi ottimale del ribosoma in assenza di ES39L.Poiché questo nucleotide può imitare i contatti molecolari del nucleotide A3186 in ES39L, la molecola nucleotidica diventa un elemento costitutivo del ribosoma, il cui legame è ulteriormente migliorato dalla mutazione della sequenza eL30.
Per quanto riguarda l'evoluzione molecolare dei parassiti intracellulari, il nostro studio mostra che le forze della selezione naturale darwiniana e la deriva genetica del decadimento del genoma non operano in parallelo, ma oscillano.In primo luogo, la deriva genetica elimina caratteristiche importanti delle biomolecole, rendendo estremamente necessaria la compensazione.Solo quando i parassiti soddisfano questa esigenza attraverso la selezione naturale darwiniana, le loro macromolecole avranno la possibilità di sviluppare i loro tratti più impressionanti e innovativi.È importante sottolineare che l'evoluzione dei siti di legame dei nucleotidi nel ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo modello di perdita-guadagno dell'evoluzione molecolare non solo ammortizza le mutazioni deleterie, ma a volte conferisce funzioni completamente nuove alle macromolecole parassite.
Questa idea è coerente con la teoria dell'equilibrio mobile di Sewell Wright, che afferma che un rigido sistema di selezione naturale limita la capacità degli organismi di innovare51,52,53.Tuttavia, se la deriva genetica interrompe la selezione naturale, queste derive possono produrre cambiamenti che non sono di per sé adattativi (o addirittura dannosi) ma portano a ulteriori cambiamenti che forniscono una maggiore fitness o una nuova attività biologica.Il nostro quadro supporta questa idea illustrando che lo stesso tipo di mutazione che riduce la piega e la funzione di una biomolecola sembra essere il principale innesco per il suo miglioramento.In linea con il modello evolutivo vantaggioso per tutti, il nostro studio mostra che il decadimento del genoma, tradizionalmente visto come un processo degenerativo, è anche un importante motore di innovazione, che a volte e forse anche spesso consente alle macromolecole di acquisire nuove attività parassitarie.può usarli.