L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano la ricerca di cibo degli insetti e le caratteristiche del ciclo vitale. Per compensare le carenze di nutrienti specifici nelle diverse fasi della vita, gli insetti possono ottenere questi nutrienti attraverso l'alimentazione supplementare, ad esempio nutrendosi di secrezioni di vertebrati in un processo noto come pozzanghere. La zanzara Anopheles arabiani sembra essere malnutrita e, pertanto, necessita di nutrienti sia per il metabolismo che per la riproduzione. Lo scopo di questo studio era valutare se l'agitazione di An. arabiensis sull'urina della mucca per l'acquisizione dei nutrienti migliora le caratteristiche del ciclo vitale.
Assicurati che sia sicuro. L'arabiensis è stata attratta dall'odore dell'urina fresca di mucca di 24, 72 e 168 ore, e le femmine in cerca di ospite e alimentate con sangue (48 ore dopo il pasto di sangue) sono state misurate in un olfattometro a tubo a Y, e le femmine gravide sono state valutate per il test di deposizione delle uova. È stata quindi utilizzata un'analisi chimica ed elettrofisiologica combinata per identificare i composti bioattivi nell'urina di mucca in tutte e quattro le classi di età. Miscele sintetiche di composti bioattivi sono state valutate in prove con tubo a Y e sul campo. Per studiare l'urina di mucca e il suo principale composto azotato, l'urea, come potenziali diete supplementari per i vettori della malaria, sono stati misurati i parametri di alimentazione e le caratteristiche del ciclo vitale. Sono state valutate la proporzione di zanzare femmine e la quantità di urina di mucca e urea assorbita. Dopo l'alimentazione, le femmine sono state valutate per sopravvivenza, volo vincolato e riproduzione.
Cercano il sangue e il nutrimento dell'ospite. Negli studi di laboratorio e sul campo, gli arabi sono stati attratti dall'odore naturale e sintetico dell'urina di mucca fresca e invecchiata. Le femmine gravide erano indifferenti alle risposte dell'urina di mucca nei siti di deposizione delle uova. Le femmine che cercano l'ospite e succhiano il sangue assorbono attivamente l'urina e l'urea della mucca e assegnano queste risorse in base ai compromessi del ciclo vitale in funzione dello stato fisiologico per la fuga, la sopravvivenza o la riproduzione.
Acquisizione e distribuzione di urina bovina da parte di Anopheles arabinis per migliorare le caratteristiche del ciclo vitale. L'integrazione alimentare con urina bovina influisce direttamente sulla capacità del vettore aumentando la sopravvivenza giornaliera e la densità del vettore e indirettamente modificando l'attività di volo e dovrebbe pertanto essere presa in considerazione nei modelli futuri.
L'acquisizione e la distribuzione dei nutrienti integrano la ricerca di cibo degli insetti e le caratteristiche della storia della vita [1,2,3]. Gli insetti sono in grado di selezionare e acquisire cibo e di eseguire un'alimentazione compensativa in base alla disponibilità di cibo e ai requisiti nutrizionali [1, 3]. La distribuzione dei nutrienti dipende dal processo della storia della vita e può portare a diversi requisiti per la qualità e la quantità della dieta nelle diverse fasi della vita degli insetti [1, 2]. Per compensare le carenze di nutrienti specifici, gli insetti possono ottenere questi nutrienti attraverso un'alimentazione supplementare, come il fango, vari escrementi e secrezioni di vertebrati e carogne, un processo noto come pozzanghere [2]. Sebbene siano descritte principalmente diverse specie di farfalle e falene, le pozze d'acqua si verificano anche in altri ordini di insetti e l'attrazione e l'alimentazione di questi tipi di risorse possono avere effetti significativi sulla salute e su altri tratti della storia della vita [2, 4, 5, 6], 7]. La zanzara della malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) emerge come un adulto "malnutrito" [8], quindi l'irrigazione può svolgere un ruolo un ruolo importante nelle caratteristiche del suo ciclo vitale, ma questo comportamento è stato finora trascurato. L'uso dell'agitazione come mezzo per aumentare l'assunzione di nutrienti in questo importante veicolo merita attenzione poiché potrebbe avere importanti conseguenze epidemiologiche.
L'assunzione di azoto nelle zanzare femmine adulte Anopheles è limitata a causa delle basse riserve caloriche assunte dallo stadio larvale e dell'utilizzo inefficiente del pasto di sangue [9]. Le femmine di Ann.gambiae sl in genere compensano questo problema integrando con pasti di sangue supplementari [10, 11], esponendo così più persone al rischio di contrarre la malattia e mettendo le zanzare a un rischio maggiore di predazione. In alternativa, le zanzare possono utilizzare l'alimentazione supplementare di escrementi di vertebrati per acquisire composti azotati che migliorano l'adattamento e la manovrabilità del volo, come dimostrato da altri insetti [2]. A questo proposito, è interessante la forte e distinta attrazione di una delle specie sorelle all'interno di An. Il complesso di specie gambiane sl, Anopheles arabinis, urina di mucca fresca e invecchiata [12,13,14]. Anopheles arabinis è opportunista nelle sue preferenze di ospite ed è noto che si associa e si nutre di bovini. L'urina di mucca è una risorsa ricca di composti azotati, con l'urea che rappresenta il 50-95% dell'azoto totale nell'urina fresca [15, 16]. Man mano che l'urina della mucca invecchia, i microrganismi utilizzano queste risorse per ridurre la complessità dei composti azotati entro 24 ore [15]. Con il rapido aumento dell'ammoniaca, associato a un calo dell'azoto organico, i microrganismi alcalofili (molti dei quali producono composti tossici per le zanzare) prosperano [15], che possono essere femmine. L'Ann.arabiensis è attratta preferibilmente dall'urina invecchiata 24 ore o meno [13, 14].
In questo studio, sono stati ricercati gli An ospiti e quelli alimentati con sangue. Durante il suo primo ciclo gonadotroponico, l'Arabensis è stata valutata per l'acquisizione di composti azotati, tra cui l'urea, tramite miscelazione con l'urina. Successivamente, è stata condotta una serie di esperimenti per valutare come le zanzare femmine allochino questa potenziale risorsa nutritiva per migliorare la sopravvivenza, la riproduzione e l'ulteriore foraggiamento. Infine, è stato valutato l'odore dell'urina bovina fresca e invecchiata per determinare se questi fornissero indizi affidabili per l'An ospite e alimentato con sangue. Nella loro ricerca di questa potenziale risorsa nutrizionale, l'Arabensis ha scoperto correlazioni chimiche alla base della diversa attrattività osservata. Le miscele di odori sintetici di composti organici volatili (COV) identificate nell'urina invecchiata nelle 24 ore sono state ulteriormente valutate in condizioni di campo, estendendo i risultati ottenuti in condizioni di laboratorio e dimostrando l'effetto dell'odore di urina bovina su diversi stati fisiologici. Attrazione per le zanzare. I risultati ottenuti confermano che l'An. arabiensis acquisisce e distribuisce composti azotati presenti nell'urina dei vertebrati, influenzando le caratteristiche del ciclo vitale. Questi risultati vengono discussi nel contesto delle potenziali conseguenze epidemiologiche e di come possono essere utilizzati per la sorveglianza e il controllo dei vettori.
Le Anopheles arabicans (ceppo Dongola) sono state mantenute a 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH e un ciclo luce:buio di 12:12 ore. Le larve sono state allevate in vassoi di plastica (20 cm × 18 cm × 7 cm) riempiti con acqua distillata e alimentati con cibo per pesci Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Le pupe sono state raccolte in tazze da 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) e quindi trasferite in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) per consentire l'emergenza degli adulti. Agli adulti è stata fornita una soluzione di saccarosio al 10% ad libitum fino a 4 giorni dopo l'emergenza (dpe), momento in cui alle femmine in cerca di ospite è stata offerta la dieta immediatamente prima dell'esperimento, o sono state lasciate a digiuno durante la notte con acqua distillata prima dell'esperimento, come descritto di seguito. Femmine utilizzate per il volo Gli esperimenti in provetta sono stati tenuti a digiuno solo per 4-6 ore con acqua a volontà. Per preparare le zanzare succhiasangue per i successivi biotest, 4 femmine dpe sono state alimentate con sangue di pecora defibrotico (Håtunalab, Bro, SE) utilizzando un sistema di alimentazione a membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Regno Unito). Le femmine completamente congestionate sono state quindi trasferite in gabbie individuali e alimentate direttamente con la dieta, come descritto di seguito, oppure con il 10% di saccarosio a volontà per 3 giorni prima degli esperimenti descritti di seguito. Queste ultime femmine sono state utilizzate per i biotest in provetta e trasferite in laboratorio, quindi hanno ricevuto acqua distillata a volontà per 4-6 ore prima dell'esperimento.
Sono stati utilizzati test di alimentazione per quantificare il consumo di urina e urea nelle femmine adulte di An.Arab. Alle femmine in cerca di ospite e alimentate con sangue è stata fornita una dieta contenente l'1% di urina di mucca fresca e invecchiata diluita, varie concentrazioni di urea e due controlli (10% di saccarosio e acqua) per 48 ore. Inoltre, il colorante alimentare (1 mg ml-1 di xilene cianuro FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stoccolma, SE) è stato aggiunto alla dieta e fornito in una matrice 4 × 4 in provette da microcentrifuga da 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figura 1A) Riempire fino al bordo (~300 µl). Per evitare la competizione tra le zanzare e i potenziali effetti del colore del colorante, posizionare 10 zanzare in una grande capsula Petri (12 cm di diametro e 6 cm di altezza; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) in completa oscurità a 25 ± 2 cm °C e 65 ± 5% di umidità relativa. Questi esperimenti sono stati ripetuti da 5 a 10 volte. Dopo l'esposizione alla dieta, le zanzare sono state poste a -20 °C fino a ulteriori analisi.
Cercare urina bovina e urea assorbite dall'ospite e dalla femmina ematofaga Anopheles arabianus. Nella prova di alimentazione (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di mucca fresca e stagionata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H₂O). Le femmine in cerca di ospite (B) e alimentate con sangue (C) hanno assorbito più saccarosio rispetto a qualsiasi altra dieta testata. Si noti che le femmine in cerca di ospite hanno assorbito urina di mucca di 72 ore meno di urina di mucca di 168 ore (B). Il contenuto medio di azoto totale (± deviazione standard) dell'urina è rappresentato nel riquadro. Le femmine in cerca di ospite (D, F) e ematofaghe (E, G) assorbono l'urea in modo dose-dipendente. I volumi medi inalati (D, E) con nomi di lettere diverse erano significativamente diversi tra loro (ANOVA a un fattore utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. (BE). La linea tratteggiata rappresenta la linea di regressione logaritmica lineare (F, G)
Per rilasciare il cibo assorbito, le zanzare sono state posizionate individualmente in provette da microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 230 µl di acqua distillata e il tessuto è stato disgregato utilizzando un pestello monouso e un motore senza fili (VWR International, Lund, SE), seguito da centrifugazione a 10 krpm per 10 min. Il surnatante (200 µl) è stato trasferito in una micropiastra a 96 pozzetti (Sigma-Aldrich) e l'assorbanza (λ620) è stata determinata utilizzando un lettore di micropiastre basato su spettrofotometro (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). In alternativa, le zanzare sono state macinate in 1 ml di acqua distillata, 900 µl della quale sono stati trasferiti in una cuvetta per analisi spettrofotometrica (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Per quantificare l'assunzione alimentare, è stata preparata una curva standard mediante diluizione seriale per produrre Da 0,2 µl a 2,4 µl di 1 mg ml-1 di cianuro di xilene. Quindi, è stata utilizzata la densità ottica di concentrazioni note di colorante per determinare la quantità di cibo ingerita da ciascuna zanzara.
I dati sul volume sono stati analizzati utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dai confronti a coppie post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989-2007). Le analisi di regressione lineare hanno descritto l'assunzione di urea dipendente dalla concentrazione e hanno confrontato le risposte tra zanzare che cercano l'ospite e zanzare succhiasangue (GraphPad Prism v8.0.0 per Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Circa 20 µl di campioni di urina di ogni fascia d'età sono stati legati su Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) e incapsulati in capsule di stagno (8 mm × 5 mm). Le capsule sono state inserite nella camera di combustione di un analizzatore CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per determinare il contenuto di azoto nelle urine fresche e invecchiate secondo il protocollo del produttore. L'azoto totale (g N l-1) è stato quantificato in base alle concentrazioni note di urea utilizzate come standard.
Per valutare l'effetto della dieta sulla sopravvivenza delle femmine che cercano l'ospite e che succhiano il sangue, le zanzare sono state poste individualmente in grandi piastre Petri (12 cm di diametro e 6 cm di altezza; Semadeni) con un foro coperto da una rete nel coperchio (3 cm di diametro) con Per la ventilazione e la fornitura di cibo. Le diete sono state fornite direttamente dopo 4 dpe e ​​includevano urina di mucca fresca e invecchiata diluita all'1%, quattro concentrazioni di urea e due controlli, saccarosio al 10% e acqua. Ogni dieta è stata pipettata su un tampone dentale (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserito in una siringa da 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), lo stantuffo rimosso e posizionato sopra una piastra Petri (figura 1).1A). Cambia la tua dieta ogni giorno. Mantieni il laboratorio come descritto sopra. Le zanzare sopravvissute sono state contate due volte al giorno, mentre le zanzare morte sono state scartate fino alla morte dell'ultima zanzara (n = 40 per trattamento). Sopravvivenza delle zanzare alimentati con diete diverse è stato analizzato statisticamente utilizzando le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meyer e i test dei ranghi logaritmici per confrontare le distribuzioni di sopravvivenza tra le diete (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Un mulino volante per zanzare personalizzato basato su Attisano et al.[17], realizzato con pannelli in acrilico trasparente spessi 5 mm (10 cm di larghezza x 10 cm di lunghezza x 10 cm di altezza) senza pannelli anteriore e posteriore (Fig. 3: in alto). Un gruppo perno con un tubo verticale costituito da una colonna per cromatografia gassosa (0,25 mm di diametro interno; 7,5 cm di lunghezza) con estremità incollate a un ago per insetti sospeso tra una coppia di magneti al neodimio distanti 9 cm. Un tubo orizzontale realizzato con lo stesso materiale (6,5 cm di lunghezza) divideva in due il tubo verticale per formare un braccio ancorato e un braccio che trasportava un piccolo pezzo di foglio di alluminio come segnale di interruzione della luce.
Alle femmine rimaste a digiuno per 24 ore è stata somministrata la dieta di cui sopra per 30 minuti prima del contenimento. Le zanzare femmine completamente nutrite sono state quindi anestetizzate individualmente sul ghiaccio per 2-3 minuti e attaccate a spilli per insetti con cera d'api (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) e quindi legate ai bracci dei tubi orizzontali. Mulino volante. I giri per volo sono stati registrati da un data logger personalizzato, quindi memorizzati e visualizzati utilizzando il software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Il mulino volante è stato posizionato in una stanza con temperatura regolata (12 h:12 h, luce: buio, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Per visualizzare il modello dell'attività di volo, la distanza totale percorsa (m) e il numero totale di attività di volo consecutive sono stati calcolati all'ora in un periodo di 24 ore. Inoltre, le distanze medie percorse dalle singole femmine sono state confrontate tra i trattamenti e analizzate utilizzando l'ANOVA unidirezionale e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), dove la distanza media è stata considerata una variabile dipendente, mentre il trattamento è un fattore indipendente. Infine, il numero medio di round è calcolato in incrementi di 10 minuti.
Per valutare l'effetto della dieta sulle prestazioni riproduttive di An.arabiensis, sei femmine (4 dpe) sono state trasferite direttamente in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) dopo il prelievo del sangue e quindi hanno ricevuto la dieta sperimentale per 48 ore come descritto sopra. Le diete sono state quindi rimosse e sono state fornite tazze per la deposizione delle uova (30 ml; Nolato Hertila) riempite con 20 ml di acqua distillata il terzo giorno per 48 ore, cambiandole ogni 24 ore. Ripetere ogni regime dietetico 20-50 volte. Le uova sono state contate e registrate per ogni gabbia sperimentale. Sono stati utilizzati sottocampioni di uova per valutare la variazione media delle dimensioni e della lunghezza delle singole uova (n ≥ 200 per dieta) utilizzando un microscopio Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) dotato di una Leica Camera (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Le uova rimanenti sono state conservate in una stanza a temperatura controllata in condizioni di allevamento standard per 24 ore ed è stato misurato un sottocampione di larve di 1° stadio appena emerse (n ≥ 200 per dieta), come descritto sopra. Il numero di uova e le dimensioni delle uova e delle larve sono stati confrontati tra i trattamenti e utilizzando l'ANOVA unidirezionale e l'analisi post hoc di Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I volatili dello spazio di testa provenienti da campioni di urina fresca (1 ora dopo il campionamento), di 24 ore, 72 ore e di 168 ore sono stati raccolti da campioni di bovini Zebù, razze Arsi. Per comodità, i campioni di urina sono stati raccolti la mattina presto, mentre le mucche erano ancora nella stalla. I campioni di urina sono stati raccolti da 10 individui e 100-200 ml di ciascun campione sono stati trasferiti in sacchetti per cottura individuali in poliammide (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) in poliammide da 3 l con coperchio in fusti di plastica in cloruro di vinile. I volatili dello spazio di testa di ciascun campione di urina bovina sono stati raccolti direttamente (fresca) o dopo maturazione a temperatura ambiente per 24 ore, 72 ore e 168 ore, ovvero ciascun campione di urina era rappresentativo di ciascun gruppo di età.
Per la raccolta dei volatili dello spazio di testa, è stato utilizzato un sistema a circuito chiuso per far circolare un flusso di gas filtrato con carbone attivo (100 ml min-1) attraverso un sacchetto di poliammide fino alla colonna di adsorbimento per 2,5 ore utilizzando una pompa da vuoto a membrana (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Come controllo, la raccolta dello spazio di testa è stata eseguita da un sacchetto di poliammide vuoto. La colonna di adsorbimento era realizzata con un tubo in Teflon (5,5 cm x 3 mm di diametro interno) contenente 35 mg di Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) tra tappi di lana di vetro. Prima dell'uso, la colonna è stata lavata con 1 ml di n-esano ridistillato (Merck, Darmstadt, DE) e 1 ml di pentano (solvente puro al 99,0% di grado GC, Sigma Aldrich). I volatili adsorbiti sono stati eluiti con 400 μl di pentano. Raccolte dello spazio di testa sono stati raccolti e poi conservati a -20°C fino al momento dell'utilizzo per ulteriori analisi.
Risposte comportamentali di An che cerca l'ospite e si nutre di sangue. Gli estratti volatili dello spazio di testa raccolti da urina fresca, invecchiata di 24 ore, 72 ore e 168 ore sono stati analizzati per estratti volatili da zanzare Arabidopsis utilizzando un olfattometro a tubo di vetro dritto [18]. Gli esperimenti sono stati condotti durante ZT 13-15, il periodo di picco dell'attività di ricerca di casa di An. Arabo [19]. Un olfattometro a tubo di vetro (80 cm × 9,5 cm id) è stato illuminato con 3 ± 1 lx di luce rossa dall'alto. Il flusso d'aria filtrato e umidificato al carbone (25 ± 2 °C, 65 ± 2% di umidità relativa) ha superato il biotest a 30 cm s-1. L'aria viene fatta passare attraverso una serie di reti in acciaio inossidabile, creando un flusso laminare e una struttura a pennacchio uniforme. Dispenser di tamponi dentali (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), sospeso da una bobina di 5 cm sull'estremità sopravento dell'olfattometro, con cambi di stimolatore ogni 5 minuti. Per l'analisi, 10 μl di ciascun estratto di headspace, diluito 1:10, sono stati utilizzati come stimolo. Una quantità uguale di pentano è stata utilizzata come controllo. Singole zanzare in cerca di ospite o succhiasangue sono state posizionate in gabbie di rilascio individuali 2-3 ore prima dell'inizio dell'esperimento. La gabbia di rilascio è stata posizionata sul lato sottovento dell'olfattometro e alle zanzare è stato permesso di acclimatarsi per 1 minuto, quindi la valvola a farfalla della gabbia è stata aperta per il rilascio. L'attrazione verso il trattamento o il controllo è stata analizzata come la proporzione di zanzare entrate in contatto con la fonte entro 5 minuti dal rilascio. Ogni estratto volatile di headspace e controllo sono stati replicati almeno 30 volte e, per evitare gli effetti di un singolo giorno, lo stesso numero di trattamenti e controlli è stato testato in ogni giorno sperimentale. Cercare risposte dall'ospite e dalle zanzare succhiasangue Risposta. I set arabi rispetto a quelli headspace sono stati analizzati utilizzando la regressione logistica nominale seguita da confronti a coppie per i rapporti dispari (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Risposta alla deposizione delle uova di An. Gli estratti di spazio di testa da urina di mucca fresca e invecchiata sono stati analizzati in gabbie Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Bicchieri di plastica (30 mL; Nolato Hertila) riempiti con 20 mL di acqua distillata hanno fornito il substrato per la deposizione delle uova e sono stati posizionati negli angoli opposti della gabbia, a 24 cm di distanza l'uno dall'altro. I bicchieri di trattamento sono stati regolati con 10 μl di ciascun estratto di spazio di testa a una diluizione 1:10. Una quantità uguale di pentano è stata utilizzata per regolare il bicchiere di controllo. I bicchieri di trattamento e di controllo sono stati scambiati tra ogni esperimento per controllare gli effetti della posizione. Dieci femmine alimentate con sangue sono state rilasciate in gabbie sperimentali a ZT 9-11 e le uova nei bicchieri sono state contate 24 ore dopo. La formula per calcolare l'indice di deposizione delle uova è: (il numero di uova deposte nel bicchiere di trattamento - il numero di uova deposte nel bicchiere di controllo) / (il numero totale di uova deposte). Ogni trattamento è stato ripetuto 8 volte.
L'analisi del gascromatografo e del rilevamento del pattern dell'antenna elettronica (GC-EAD) delle femmine di An.arabiensis è stata eseguita come precedentemente descritto [20]. In breve, gli estratti volatili freschi dello spazio di testa sono stati separati utilizzando un GC Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, CA, USA) dotato di una colonna HP-5 (30 m × 0,25 mm id, 0,25 μm di spessore del film, Agilent Technologies). e urina invecchiata. L'idrogeno è stato utilizzato come fase mobile con una portata lineare media di 45 cm s-1. Ogni campione (2 μl) è stato iniettato per 30 secondi in modalità splitless con una temperatura di ingresso di 225 °C. La temperatura del forno GC è stata programmata da 35 °C (3 minuti di attesa) a 300 °C (10 minuti di attesa) a 10 °C min-1. Nello splitter dell'effluente GC, sono stati aggiunti 4 psi di azoto e divisi 1:1 in una croce a basso volume morto Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) tra il rivelatore a ionizzazione di fiamma e l'EAD. Il capillare dell'effluente GC per EAD è stato fatto passare attraverso una linea di trasferimento Gerstel ODP-2, che traccia la temperatura del forno GC più 5 °C, in una provetta di vetro (10 cm × 8 mm), dove è stato miscelato con aria umidificata e filtrata al carbone (1,5 l min−1). L'antenna è stata posizionata a 0,5 cm dall'uscita del tubo. Ogni singola zanzara è stata oggetto di una replica e, per le zanzare in cerca di ospite, sono state eseguite almeno tre repliche su campioni di urina di ciascuna età.
Identificazione di composti bioattivi in ​​raccolte di spazio di testa di urina bovina fresca e invecchiata utilizzando un GC combinato e uno spettrometro di massa (GC-MS; 6890 GC e 5975 MS; Agilent Technologies) per suscitare risposte antennali nell'analisi GC-EAD, operando in modalità di ionizzazione a impatto elettronico a 70 eV. Il GC era dotato di una colonna capillare in silice fusa rivestita con UI HP-5MS (diametro interno 60 m × 0,25 mm, spessore del film 0,25 μm) utilizzando elio come fase mobile con una portata lineare media di 35 cm s-1. Un campione di 2 μl è stato iniettato utilizzando le stesse impostazioni dell'iniettore e la stessa temperatura del forno dell'analisi GC-EAD. I composti sono stati identificati in base al loro tempo di ritenzione (indice di Kovát) e agli spettri di massa rispetto alla libreria personalizzata e alla libreria NIST14 (Agilent). I composti identificati sono stati confermati iniettando standard autentici (file aggiuntivo 1: Tabella S2). Per la quantificazione, è stato iniettato come standard esterno l'acetato di eptile (10 ng, purezza chimica del 99,8%, Aldrich).
Valutazione dell'efficacia di una miscela di odori sintetici composta da composti bioattivi identificati in urina fresca e invecchiata per attrarre Ans. arabiensis che cercano l'ospite e che succhiano il sangue, utilizzando lo stesso olfattometro e protocollo di cui sopra. Le miscele sintetiche imitavano la composizione e le proporzioni dei composti negli estratti volatili misti dello spazio di testa di urina fresca, invecchiata di 24 ore, 48 ore, 72 ore e 168 ore (Figura 5D-G; File aggiuntivo 1: Tabella S2). Per l'analisi, utilizzare 10 μl di una diluizione 1:100 della miscela completamente sintetica, con una velocità di rilascio complessiva compresa tra circa 140 e 2400 ng h-1, per valutare l'attrattiva per l'ospite e le zanzare succhiatrici di sangue. Successivamente, il test viene eseguito su miscele complete, in cui vengono rimosse le miscele sottrattive dei singoli composti della miscela completa. Cercare le risposte dall'ospite e dalle zanzare succhiatrici di sangue rispetto alle miscele sintetiche e sottrattive è stato analizzati utilizzando la regressione logistica nominale seguita da confronti a coppie per i rapporti dispari (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Per valutare se l'urina di mucca potesse fungere da indicatore di habitat ospite per le zanzare della malaria, l'urina di mucca fresca e invecchiata, raccolta come descritto sopra, e l'acqua sono state poste in secchi a maglie da 3 l (100 ml) e inserite in trappole con esca per ospiti. (versione BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dieci trappole sono state posizionate a 50 m di distanza l'una dall'altra nel pascolo, a 400 m dalla comunità del villaggio (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) e senza bovini, su aree di riproduzione permanenti e villaggi. Cinque trappole sono state riscaldate per simulare la presenza di un ospite, mentre cinque trappole sono state lasciate non riscaldate. Ogni postazione di trattamento viene ruotata ogni notte per un totale di cinque notti. Il numero di zanzare catturate nelle trappole con esca con urina di età diverse è stato confrontato utilizzando la regressione logistica con una distribuzione binomiale beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
In un villaggio endemico per la malaria vicino alla città di Maki, regione di Oromia, Etiopia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). Lo studio è stato condotto tra metà agosto e metà settembre prima dell'annuale irrorazione residua indoor, insieme a una lunga stagione delle piogge. Per lo studio sono state selezionate cinque coppie di case (distanti 20–50 m) situate alla periferia del villaggio (Fig. 6A). I ​​criteri utilizzati per selezionare le case erano: nessun animale consentito in casa, non era consentito cucinare in casa (attizzare legna o carbone) (almeno durante il periodo di prova) e case con un massimo di due abitanti, che dormivano in ambienti privi di insetticidi. sotto la zanzariera trattata. L'approvazione etica è stata concessa dall'Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) della Facoltà di Scienze Naturali (CNS-IRB) dell'Università di Addis Abeba, in conformità con le linee guida stabilite dalla Dichiarazione di Helsinki dell'Associazione Medica Mondiale. Il consenso di ciascun capofamiglia è stato ottenuto con l'assistenza del personale sanitario. L'intero processo è approvato dalle amministrazioni locali a livello di distretto e reparto ("kebele"). Il disegno sperimentale ha seguito uno schema a quadrato latino 2 × 2, in cui miscele sintetiche e controlli sono stati assegnati a case accoppiate la prima notte e scambiati tra le case la successiva notte sperimentale. Questo processo è stato ripetuto dieci volte. Inoltre, per stimare l'attività delle zanzare in case selezionate, le trappole del CDC sono state impostate per funzionare per cinque notti consecutive all'inizio, a metà e alla fine della prova sul campo alla stessa ora del giorno.
Una miscela sintetica contenente sei composti bioattivi è stata disciolta in eptano (grado GC solvente al 97,0%, Sigma Aldrich) e rilasciata a 140 ng h-1 utilizzando un erogatore di stoppino di cotone [20]. L'erogatore di stoppino ha consentito il rilascio di tutti i composti in proporzioni costanti durante l'esperimento di 12 ore. L'eptano è stato utilizzato come controllo. La fiala è stata sospesa accanto al punto di ingresso della trappola luminosa dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Figura 6A). Le trappole sono state appese a 0,8 – 1 m dal suolo, vicino ai piedi del letto, e un volontario ha dormito sotto una zanzariera non trattata e ha funzionato tra le 18:00 e le 06:30. Le zanzare catturate in base al sesso e allo stato fisiologico (non nutrite, nutrite, semi-gravide e gravide [21] sono state successivamente selezionate utilizzando l'analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) per identificare le specie morfologicamente identificate come A. gambiae sl. Membri del complesso [23]. Nello studio sul campo, la cattura tramite trappola di case accoppiate è stata analizzata utilizzando un modello di adattamento logistico nominale, in cui l'attrazione era la variabile dipendente e il trattamento (miscela sintetica vs controllo) era l'effetto fisso (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). Qui, riportiamo i valori χ2 e p dal test del rapporto di verosimiglianza.
Valutare se è sicuro. arabiensis è stato in grado di ottenere urina, la sua principale fonte di azoto, l'urea, tramite alimentazione diretta, entro 48 ore dalla somministrazione per 4 giorni dopo (dpe) prove di alimentazione di femmine in cerca di ospite e alimentate con sangue (Fig. 1A). Sia le femmine in cerca di ospite che quelle che succhiavano sangue hanno assorbito significativamente più saccarosio rispetto a qualsiasi altra dieta o acqua (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 e F(5,299) = 56,00, p < 0,0001, rispettivamente; Fig. 1B,C). Inoltre, le femmine in cerca di ospite hanno mangiato meno con l'urina a 72 ore rispetto all'urina a 168 ore (Fig. 1B). Quando è stata offerta una dieta contenente urea, le femmine in cerca di ospite hanno assorbito una quantità significativamente maggiore di urea a 2,69 mM rispetto a tutte le altre concentrazioni e acqua, mentre indistinguibile da 10% di saccarosio (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Figura 1D). Ciò era in contrasto con la risposta delle femmine alimentate con sangue, che in genere assorbivano significativamente più diete contenenti urea rispetto all'acqua, sebbene significativamente meno del 10% di saccarosio (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Figura 1).1E). Inoltre, quando si confrontavano i due stati fisiologici, le femmine flebotomizzate assorbivano più urea rispetto alle femmine in cerca di ospite alle concentrazioni più basse e queste femmine assorbivano quantità simili di urea a concentrazioni più elevate (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Fig. 1F, G). Mentre l'assunzione da una dieta contenente urea sembrava avere valori ottimali (Fig. 1D,E), le femmine in entrambi gli stati fisiologici erano in grado di modulare la quantità di urea assorbita nell'intero intervallo di concentrazioni di urea in modo logaritmico-lineare (Fig. 1F,G). Allo stesso modo, le zanzare sembrano controllare il loro assorbimento di azoto regolando la quantità di urina assorbita, poiché la quantità di azoto nell'urina si riflette nella quantità assorbita (Figura 1B, inserti C e B).
Per valutare gli effetti dell'urina e dell'urea sulla sopravvivenza delle zanzare che cercano l'ospite e che succhiano il sangue, le femmine sono state alimentate con urina di tutte e quattro le età (fresca, 24 h, 72 h e 168 h dopo la deposizione) e una gamma di concentrazioni di urea, così come acqua distillata e saccarosio al 10% sono serviti come controllo (Figura 2A). Questa analisi di sopravvivenza ha mostrato che la dieta ha avuto un effetto significativo sulla sopravvivenza complessiva nelle femmine che cercano l'ospite (urina: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) e nelle femmine alimentate con sangue (urina: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figura 2D,E). In tutti gli esperimenti, le femmine alimentate con una dieta a base di urina, urea e acqua hanno avuto tassi di sopravvivenza significativamente inferiori rispetto alle femmine alimentate con una dieta a base di saccarosio (Figura 2B-E). Le femmine in cerca di ospite alimentate con urina fresca e stantia hanno mostrato diversi tassi di sopravvivenza, con quelle alimentate con urina stantia delle 72 ore (p = 0,016) che avevano la più bassa probabilità di sopravvivenza (Fig. 2B). Inoltre, le femmine in cerca di ospite alimentate con 135 mM di urea sono sopravvissute più a lungo rispetto ai controlli in acqua (p < 0,04) (Fig. 2C). Rispetto all'acqua, le donne alimentate con urina fresca e urina delle 24 ore sono sopravvissute più a lungo (rispettivamente p = 0,001 e p = 0,012; Figura 2D), mentre le donne alimentate con urina delle 72 ore sono sopravvissute più a lungo rispetto a quelle alimentate con urina fresca corta femminile e urina invecchiata delle 24 ore (p < 0,0001 e p = 0,013, rispettivamente; Figura 2D). Quando alimentate con 135 mM di urea, le femmine alimentate con sangue sono sopravvissute più a lungo rispetto a tutte le altre concentrazioni di urea e acqua (p < 0,013; Figura 2E).
Sopravvivenza dell'ospite e delle femmine ematofaghe di Anopheles arabinis che si nutrono di urina di mucca e urea. Nel biotest (A), alle zanzare femmine è stata fornita una dieta composta da urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O). La sopravvivenza delle zanzare che cercavano l'ospite (B, C) e succhiavano il sangue (D, E) è stata registrata ogni 12 ore fino alla morte di tutte le femmine che si nutrivano di urina (B, D) e urea (C, E) e dei controlli, saccarosio e acqua.
La distanza totale e il numero di giri determinati nel test del mulino di volo in un periodo di 24 ore differivano tra le zanzare in cerca di ospite e quelle succhiasangue, che mostravano complessivamente una minore attività di volo (Fig. 3). Le zanzare in cerca di ospite che fornivano urina fresca e invecchiata o saccarosio e acqua mostravano schemi di volo distinti (Fig. 3), con le femmine che si nutrivano di urina fresca più attive all'alba, mentre quelle nutrite di 24 e 168 ore. Le zanzare che si nutrivano di urina mostravano schemi di volo diversi ed erano principalmente diurne. Le zanzare femmine che fornivano saccarosio o urina di 72 ore mostravano attività per tutto il periodo di 24 ore, mentre le femmine che fornivano acqua erano più attive nel periodo intermedio. Le zanzare nutrite di saccarosio mostravano i livelli più elevati di attività a tarda notte e nelle prime ore del mattino, mentre quelle che ingerivano urina di 72 ore sperimentavano un costante calo di attività nell'arco di 24 ore (Figura 3).
Prestazioni di volo di femmine di Anopheles arabinis che cercano l'ospite e si nutrono di urina di mucca e urea. Nel test del mulino di volo, le zanzare femmine si nutrivano di urina di mucca fresca e stagionata, diverse concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H₂O) e venivano legate a bracci orizzontali che ruotavano liberamente (sopra). Per le femmine che cercano l'ospite (sinistra) e che succhiano il sangue (destra), sono stati registrati la distanza totale e il numero di voli all'ora per ciascuna dieta in un periodo di 24 ore (scuro: grigio; chiaro: bianco). La distanza media e il numero medio di voli sono mostrati a destra del grafico dell'attività circadiana. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Per l'analisi statistica, vedere il testo.
In generale, l'attività di volo complessiva delle femmine in cerca di ospite ha seguito un modello simile a quello della distanza di volo in un periodo di 24 ore. La distanza di volo media è stata significativamente influenzata dalla dieta ingerita (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), e le femmine in cerca di ospite che hanno ingerito 72 ore di urina hanno volato distanze significativamente più lunghe rispetto a tutte le altre diete (p < 0,0001), e le zanzare alimentate con saccarosio hanno volato più a lungo delle zanzare alimentate con urina fresca (p = 0,022) e con urina di 24 ore (p = 0,022). In contrasto con il modello di attività di volo descritto dalla dieta a base di urina, le femmine in cerca di ospite alimentate con urea hanno mostrato un'attività di volo persistente in un periodo di 24 ore, con un picco durante la seconda metà della fase oscura (Fig. 3). Sebbene i modelli di attività fossero simili, le femmine in cerca di ospite alimentate con urea hanno aumentato significativamente la distanza di volo media a seconda della concentrazione assorbita (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Le femmine in cerca di ospite alimentate con qualsiasi concentrazione di urea volavano più a lungo rispetto alle femmine alimentate con acqua o saccarosio (p < 0,03).
L'attività di volo complessiva delle zanzare succhiasangue è rimasta stabile e mantenuta per 24 ore con tutte le diete, con un aumento dell'attività dell'urina durante la seconda metà del periodo di buio per le femmine nutrite con acqua e per le femmine nutrite con acqua fresca e di 24 ore (immagine 3). Mentre la dieta a base di urina ha influenzato significativamente la distanza di volo media nelle femmine nutrite con sangue (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), la dieta a base di urea non lo ha fatto (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) con altre urine e dieta di controllo (acqua fresca, p = 0,0091; 72 ore, p = 0,0022; 168 ore, p = 0,001; saccarosio, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Gli effetti dell'alimentazione con urina e urea sui parametri riproduttivi sono stati valutati in biotest di deposizione delle uova (Figura 4A) e sono stati studiati in base al numero di uova deposte da ciascuna femmina, alle dimensioni delle uova e alle larve del primo stadio appena schiuse. Il numero di uova deposte. Le femmine arabe alimentate con urina variavano a seconda della dieta (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Fig. 4B). Le femmine alimentate con un pasto di sangue e urina delle 24 ore deponevano significativamente più uova rispetto alle femmine alimentate con altre diete a base di urina ed erano simili a quelle alimentate con saccarosio (Fig. 4B). Allo stesso modo, le dimensioni delle uova deposte dalle femmine alimentate con urina variavano a seconda della dieta (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), con le femmine alimentate con urina e saccarosio delle 24 ore che deponevano uova significativamente più grandi rispetto alle femmine alimentate con acqua, mentre le uova delle femmine alimentate con 168 ore di urina erano significativamente più piccole (Fig. 4C). Inoltre, la dieta a base di urina ha influenzato significativamente le dimensioni delle larve (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), con larve significativamente più grandi che emergevano dalle uova deposte da femmine alimentate con urina di 24 e 72 ore rispetto alle uova deposte da femmine alimentate con acqua e urina di 168 ore (Figura 4D).
Prestazioni riproduttive di femmine di Anopheles arabinis che si nutrono di urina di mucca e urea. Le zanzare femmine alimentate con sangue sono state alimentate con diete composte da urina di mucca fresca e invecchiata, varie concentrazioni di urea, saccarosio (10%) e acqua distillata (H2O) per 48 ore prima di essere sottoposte a biotest e ottenere substrati per la deposizione delle uova. 48 ore (A). Il numero di uova (B, E), la dimensione delle uova (C, F) e la dimensione delle larve (D, G) sono stati significativamente influenzati dalla dieta fornita (urina di mucca: BD; urea: EG). Le medie per ciascun parametro misurato utilizzando nomi di lettere diverse erano significativamente diverse l'una dall'altra (ANOVA unidirezionale utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media.
In quanto principale componente azotato dell'urina, l'urea, quando fornita come dieta a femmine alimentate con sangue, ha influenzato significativamente i parametri riproduttivi in ​​tutti gli studi. Il numero di uova deposte dalle femmine alimentate con urea, dopo un pasto di sangue, a seconda della concentrazione di urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), le femmine alimentate con concentrazioni di urea comprese tra 134 µM e 1,34 mM hanno deposto più uova (Figura 4E). Le femmine alimentate con concentrazioni di urea pari o superiori a 134 µM hanno deposto uova più grandi rispetto alle femmine alimentate con acqua (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figura 4F) e le dimensioni delle larve, sebbene influenzate da concentrazioni simili di urea nelle madri (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) erano più variabili (Figura 4G).
Attrattività complessiva per gli estratti volatili dello spazio di testa dell'urina bovina in cerca di ospiti. L'Arabensis valutato nell'olfattometro a tubo di vetro (Fig. 5A) è stato significativamente influenzato dall'età dell'urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). L'analisi post hoc ha mostrato che l'odore di urina stantia a 24 ore ha causato livelli significativamente più elevati di attrattività rispetto a tutti gli altri trattamenti (72 ore: p = 0,0060, 168 ore: p = 0,012, pentano: p = 0,00070), ad eccezione dell'odore di urina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Sebbene l'attrazione complessiva delle zanzare succhiasangue per l'odore di urina non fosse significativamente diversa (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Fig. 5C), queste femmine si sono rivelate significativamente più attraenti per gli estratti volatili dello spazio di testa rispetto a Urina invecchiata di 72 ore rispetto ai controlli (p = 0,0066; Figura 5C).
Risposte comportamentali agli odori di urina bovina naturale e sintetica nella ricerca di Anopheles arabianus ospite e infettato da sangue. Schema dell'olfattometro a tubo di vetro (A). Attrazione di estratti volatili dello spazio di testa da urina bovina fresca e invecchiata su zanzare ospite (B) e succhiasangue (C). Individuare la reazione tentacolare dell'Anomalia di Lord An. Sono mostrati gli estratti dello spazio di testa isolati da urina bovina fresca (D), invecchiata per 24 ore (E), 72 ore (F) e 168 ore (G). Le tracce di rilevamento dell'antenna elettronica (EAD) mostrano variazioni di tensione in risposta ai composti bioattivi nello spazio di testa eluiti dal gascromatografo e rilevati da un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). La barra della scala rappresenta l'ampiezza della risposta (mV) rispetto al tempo di ritenzione (s). Sono mostrate le proprietà e le velocità di rilascio (µg h-1) dei composti biologicamente attivi. Un singolo asterisco (*) indica una risposta costante a bassa ampiezza. Doppi asterischi (**) indicano risposte non riproducibili. Trova l'ospite (H) e il succhiasangue (I) An.arabiensis ha diverse attrattive per miscele sintetiche di odori di urina di mucca fresca e invecchiata. Le proporzioni medie di zanzare attratte da nomi di lettere diverse erano significativamente diverse tra loro (ANOVA unidirezionale utilizzando l'analisi post hoc di Tukey; p < 0,05). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della scala
Nelle femmine di Ann.arabiensis, 72 e 120 ore dopo il pasto di sangue, durante la deposizione delle uova, non è stata evidenziata alcuna preferenza per gli estratti volatili dello spazio di testa provenienti dall'urina di vacca fresca e invecchiata rispetto ai controlli di pentano (χ2 = 3,07, p > 0,05; File aggiuntivo 1: Fig. S1).
Per le femmine di Ann.arabiensis, le analisi GC-EAD e GC-MS hanno identificato otto, sei, tre e tre composti bioattivi (Figura 5D-G). Sebbene siano state osservate differenze nel numero di composti che hanno provocato risposte elettrofisiologiche, la maggior parte di questi composti era presente in ciascun estratto volatile dello spazio di testa raccolto da urina fresca e invecchiata. Pertanto, per ciascun estratto, solo i composti che hanno prodotto una risposta fisiologica dalle antenne femminili al di sopra della soglia sono stati inclusi in ulteriori analisi.
La velocità di rilascio volatile totale dei composti bioattivi nella raccolta dello spazio di testa è aumentata da 29 µg h-1 nelle urine fresche a 242 µg h-1 nelle urine invecchiate di 168 ore, principalmente a causa dell'aumento del p-cresolo e della m-formaldeide. Oltre al fenolo, anche il tasso di rilascio di altri composti, come il 2-cicloesen-1-one e il decanale, è diminuito con l'aumentare dell'età delle urine, il che è correlato alla diminuzione osservata nell'intensità del segnale (abbondanza) nel cromatogramma (Fig. 5D-G pannello sinistro) e alle risposte fisiologiche a questi composti (Fig. 5D-G pannello destro).
Nel complesso, la miscela sintetica presentava un rapporto naturale simile di composti bioattivi identificati negli estratti volatili di spazi di testa di urina fresca e invecchiata (Fig. 5D–G) e non sembrava suscitare un'attrattiva significativa nella ricerca di un ospite (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) o di zanzare succhiasangue (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Fig. 5I). Tuttavia, i confronti a coppie post hoc tra i trattamenti hanno mostrato che le zanzare in cerca di ospite erano significativamente attraenti per la miscela sintetica di urina invecchiata di 24 ore rispetto ai controlli di pentano (p = 0,0086; Figura 5H).
Per valutare il ruolo dei singoli componenti nelle miscele sintetiche di urina invecchiata 24 ore, sei miscele sottrattive sono state valutate rispetto alle miscele complete nel test Y-tube, in cui i singoli composti sono stati rimossi. Per le zanzare in cerca di ospite, la sottrazione di singoli composti dalla miscela completa ha avuto un effetto significativo sulle risposte comportamentali (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; File aggiuntivo 1: Figura S2A), tutte le miscele sottrattive erano più attraenti di quelle completamente mescolate. Al contrario, la rimozione dei singoli composti dalla miscela completamente sintetica non ha influenzato le risposte comportamentali delle zanzare succhiasangue (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), ad eccezione del decanale, che ha prodotto livelli di attrazione inferiori rispetto alla miscela completa (p = 0,022; File aggiuntivo 1: Figura S2B).
In un villaggio endemico della malaria in Etiopia, l'efficacia di una miscela sintetica di urina di mucca delle 24 ore nell'attrarre zanzare in condizioni di campo è stata valutata per dieci notti (Fig. 6A). Sono state catturate e identificate 4.861 zanzare, di cui il 45,7% erano Anthropus.gambiae sl, il 18,9% erano Anopheles pharoensis e il 35,4% erano Culex spp. (File aggiuntivo 1: Tabella S1). Anopheles arabinis è l'unico membro del complesso di specie An.Gambian identificato tramite analisi PCR. In media, sono state catturate 320 zanzare a notte, durante le quali le trappole con esche di miscela sintetica hanno catturato più zanzare rispetto alle trappole accoppiate senza miscela (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Le trappole senza esca sono state posizionate in ciascuna delle cinque notti di controllo all'inizio, a metà e alla fine del prova. Un numero simile di zanzare è stato catturato in ogni coppia di trappole, indicando che non vi è stata alcuna distorsione tra le case (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) e nessun calo della popolazione durante il periodo di studio. Rispetto alle trappole di controllo, il numero di zanzare catturate nelle trappole contenenti la miscela sintetica è aumentato significativamente: ricerca dell'ospite (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), recente poppata di sangue (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) e gravidanza (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; File aggiuntivo 1: Tabella S1). Ciò si riflette anche nel numero totale di zanzare catturate: ricerca dell'ospite > succhiasangue > gravide > semi-gravide > maschio.
Valutazione sul campo dell'efficacia di una miscela sintetica di odori di urina di mucca per 24 ore. Sono state condotte prove sul campo nell'Etiopia centro-meridionale (mappa), vicino alla città di Maki (inserto), utilizzando una trappola luminosa dei Centers for Disease Control (CDC) (a destra) in capannoni appaiati, con un disegno a quadrato latino (immagine aerea) (A). Le fototrappole sintetiche CDC con esche odorose attraggono e catturano le femmine di Anopheles arabesque (B), ma non le Anopheles farroes (C), in modo diverso, un effetto dipendente dallo stato fisiologico. Inoltre, queste trappole hanno catturato un numero significativamente maggiore di zanzare ospiti Culex. (D) Rispetto al controllo. Le barre a sinistra rappresentano l'indice di selezione medio delle zanzare catturate in coppie di trappole con esche odorose (verde) e di controllo (aperte) (N = 10), mentre le barre a destra rappresentano l'indice di selezione medio in coppie di trappole di controllo (aperte; N = 5). ).Gli asterischi indicano i livelli di significatività statistica (*p = 0,01 e ***p < 0,0001)
Le tre specie sono state catturate in modo diverso in trappole contenenti miscele sintetiche. Cercando l'ospite (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), alimentandosi di sangue (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) e gravidanza (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) una .arabiensis è stata intrappolata nella trappola rilasciando la miscela sintetica (Fig. 6B), mentre la quantità di An non differiva. Sono state trovate Pharoensis in diversi stati fisiologici (Fig. 6C). Per Culex, è stato riscontrato solo un aumento significativo del numero di zanzare in cerca di ospiti nelle trappole innescate con la miscela sintetica (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Fig. 6D), rispetto alle trappole di controllo.
Sono state utilizzate trappole per esche ospiti posizionate all'esterno dei potenziali ospiti tra i siti di riproduzione e le comunità rurali in Etiopia per valutare se le zanzare della malaria utilizzano l'odore di urina di mucca come indicatore dell'habitat dell'ospite. In assenza di indicatori dell'ospite, calore e con o senza presenza di odore di urina di mucca, non è stata catturata alcuna zanzara (File aggiuntivo 1: Figura S3). Tuttavia, in presenza di alte temperature e odore di urina di mucca, le zanzare della malaria femmine sono state attratte e catturate, sebbene in piccole quantità, indipendentemente dall'età dell'urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; File aggiuntivo 1: Figura S3). Al contrario, i controlli dell'acqua non hanno catturato zanzare della malaria ad alte temperature (File aggiuntivo 1: Figura S3).
Le zanzare della malaria acquisiscono e distribuiscono composti contenenti azoto attraverso l'alimentazione compensatoria di urina di mucca (ad esempio, pozzanghere) per migliorare i tratti della storia della vita, simili ad altri insetti [2, 4, 24, 25, 26]. L'urina di mucca è una risorsa rinnovabile facilmente disponibile strettamente associata ai luoghi di riposo dei vettori della malaria, come stalle e vegetazione alta vicino alle case rurali e ai siti di deposizione delle uova. Le zanzare femmine individuano questa risorsa tramite l'olfatto e sono in grado di regolare l'assorbimento di composti azotati nell'urina, inclusa l'urea, il principale componente azotato nell'urina [15, 16]. A seconda dello stato fisiologico della zanzara femmina, i nutrienti nell'urina vengono allocati per migliorare l'attività di volo e la sopravvivenza delle zanzare femmine in cerca di ospite, nonché la sopravvivenza e le caratteristiche riproduttive degli individui nutriti di sangue durante il primo ciclo gonadotropico. Pertanto, la miscelazione dell'urina svolge un importante ruolo nutrizionale per i vettori della malaria che sono chiusi come gli adulti malnutriti [8], poiché fornisce alle zanzare femmine la capacità di acquisire importanti composti azotati composti impegnandosi in un'alimentazione a basso rischio. Questa scoperta ha conseguenze epidemiologiche significative, poiché le femmine aumentano la loro aspettativa di vita, l'attività e la capacità riproduttiva, tutti fattori che influenzano la capacità del vettore. Inoltre, questo comportamento potrebbe essere l'obiettivo di futuri programmi di gestione dei vettori.