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Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica priva di sostanze chimiche basata sulla nanotecnologia che utilizza nanostrutture di acqua artificiale (EWNS). Le EWNS presentano un'elevata carica superficiale e sono sature di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in grado di interagire con diversi microrganismi, inclusi patogeni di origine alimentare, e di inattivarli. In questo studio si dimostra che le loro proprietà durante la sintesi possono essere ottimizzate e perfezionate per migliorarne ulteriormente il potenziale antibatterico. La piattaforma di laboratorio EWNS è stata progettata per perfezionare le proprietà delle EWNS modificando i parametri di sintesi. È stata inoltre effettuata la caratterizzazione delle proprietà delle EWNS (carica, dimensioni e contenuto di ROS) utilizzando moderni metodi analitici. Inoltre, è stato valutato il loro potenziale di inattivazione microbica contro microrganismi di origine alimentare come Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae. I risultati presentati dimostrano che le proprietà dell'EWNS possono essere ottimizzate durante la sintesi, con un conseguente aumento esponenziale dell'efficienza di inattivazione. In particolare, la carica superficiale è aumentata di un fattore quattro e le specie reattive dell'ossigeno sono aumentate. La velocità di rimozione microbica è risultata dipendente dalla carica microbica e variava da 1,0 a 3,8 log dopo un'esposizione di 45 minuti a una dose di aerosol di 40.000 #/cc di EWNS.
La contaminazione microbica è la causa principale delle malattie trasmesse tramite gli alimenti causate dall'ingestione di agenti patogeni o delle loro tossine. Solo negli Stati Uniti, le malattie trasmesse tramite gli alimenti causano circa 76 milioni di casi di malattia, 325.000 ricoveri ospedalieri e 5.000 decessi ogni anno1. Inoltre, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) stima che l'aumento del consumo di prodotti freschi sia responsabile del 48% di tutte le malattie trasmesse tramite gli alimenti segnalate negli Stati Uniti2. Il costo delle malattie e dei decessi causati da agenti patogeni di origine alimentare negli Stati Uniti è molto elevato, stimato dai Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in oltre 15,6 miliardi di dollari all'anno3.
Attualmente, gli interventi antimicrobici chimici4, radiativi5 e termici6 per garantire la sicurezza alimentare vengono per lo più eseguiti in punti critici di controllo (CCP) limitati lungo la filiera produttiva (solitamente dopo la raccolta e/o durante il confezionamento) piuttosto che in modo continuativo. Pertanto, sono soggetti a contaminazione incrociata. 7. Un migliore controllo delle malattie trasmesse dagli alimenti e del deterioramento degli alimenti richiede interventi antimicrobici che possano essere potenzialmente applicati lungo tutto il continuum dal produttore al consumatore, riducendo al contempo l'impatto ambientale e i costi.
Recentemente, è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica basata sulla nanotecnologia, priva di sostanze chimiche, in grado di inattivare i batteri presenti in superficie e nell'aria utilizzando nanostrutture d'acqua artificiali (EWNS). Le EWNS sono state sintetizzate utilizzando due processi paralleli: elettrospray e ionizzazione dell'acqua (Fig. 1a). Studi precedenti hanno dimostrato che le EWNS possiedono un insieme unico di proprietà fisiche e biologiche8,9,10. Le EWNS presentano una media di 10 elettroni per struttura e una dimensione media su scala nanometrica di 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Inoltre, la risonanza di spin elettronico (ESR) ha mostrato che le EWNS contengono una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente radicali idrossilici (OH•) e superossido (O2-) (Fig. 1c)8. Le EVNS rimangono nell'aria per lungo tempo e possono entrare in collisione con microrganismi sospesi nell'aria e presenti sulla superficie, rilasciando il loro carico di ROS e causandone l'inattivazione (Fig. 1d). Questi primi studi hanno anche dimostrato che l'EWNS può interagire e inattivare vari batteri Gram-negativi e Gram-positivi, inclusi i micobatteri, sulle superfici e nell'aria. La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che l'inattivazione era causata dalla rottura della membrana cellulare. Inoltre, studi sull'inalazione acuta hanno dimostrato che dosi elevate di EWNS non causano danni polmonari o infiammazione 8 .
(a) L'elettrospray si verifica quando viene applicata un'alta tensione tra un tubo capillare contenente liquido e un controelettrodo. (b) L'applicazione di alta pressione provoca due fenomeni diversi: (i) l'elettrospray di acqua e (ii) la formazione di specie reattive dell'ossigeno (ioni) intrappolate nell'EWNS. (c) La struttura unica dell'EWNS. (d) A causa della loro natura nanometrica, gli EWNS sono altamente mobili e possono interagire con agenti patogeni presenti nell'aria.
Anche la capacità della piattaforma antimicrobica EWNS di inattivare i microrganismi di origine alimentare sulla superficie degli alimenti freschi è stata recentemente dimostrata. È stato inoltre dimostrato che la carica superficiale dell'EWNS, in combinazione con un campo elettrico, può essere utilizzata per ottenere un rilascio mirato. Inoltre, i risultati preliminari sui pomodori biologici dopo un'esposizione di 90 minuti a un EWNS di circa 50.000 #/cm³ sono stati incoraggianti, con l'osservazione di vari microrganismi di origine alimentare come E. coli e Listeria 11. Inoltre, i test organolettici preliminari non hanno mostrato effetti sensoriali rispetto ai pomodori di controllo. Sebbene questi risultati iniziali di inattivazione siano incoraggianti per le applicazioni di sicurezza alimentare anche a dosi molto basse di EWNS di 50.000 #/cc, è chiaro che un potenziale di inattivazione più elevato sarebbe più vantaggioso per ridurre ulteriormente il rischio di infezione e deterioramento.
In questo articolo, concentreremo la nostra ricerca sullo sviluppo di una piattaforma di generazione di EWNS per consentire la messa a punto dei parametri di sintesi e l'ottimizzazione delle proprietà fisico-chimiche degli EWNS al fine di migliorarne il potenziale antibatterico. In particolare, l'ottimizzazione si è concentrata sull'aumento della carica superficiale (per migliorare la distribuzione mirata) e del contenuto di ROS (per migliorare l'efficienza di inattivazione). Caratterizzeremo le proprietà fisico-chimiche ottimizzate (dimensioni, carica e contenuto di ROS) utilizzando moderni metodi analitici e utilizzando microrganismi alimentari comuni come E. .
L'EVNS è stato sintetizzato mediante elettrospruzzatura e ionizzazione simultanee di acqua ad alta purezza (18 MΩ cm–1). Il nebulizzatore elettrico 12 è tipicamente utilizzato per l'atomizzazione di liquidi e la sintesi di particelle polimeriche e ceramiche 13 e fibre 14 di dimensioni controllate.
Come descritto in dettaglio nelle precedenti pubblicazioni 8, 9, 10, 11, in un tipico esperimento, è stata applicata un'alta tensione tra un capillare metallico e un controelettrodo collegato a terra. Durante questo processo, si verificano due fenomeni diversi: i) l'elettrospray e ii) la ionizzazione dell'acqua. Un intenso campo elettrico tra i due elettrodi provoca l'accumulo di cariche negative sulla superficie dell'acqua condensata, con conseguente formazione di coni di Taylor. Di conseguenza, si formano goccioline d'acqua altamente cariche, che continuano a frammentarsi in particelle più piccole, come nella teoria di Rayleigh16. Allo stesso tempo, intensi campi elettrici causano la scissione e la cessione di elettroni (ionizzazione) di alcune molecole d'acqua, il che porta alla formazione di una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS)17. Le ROS18 generate simultaneamente sono state incapsulate in EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra il sistema di generazione di EWNS sviluppato e utilizzato nella sintesi di EWNS in questo studio. Acqua purificata conservata in una bottiglia chiusa è stata immessa attraverso un tubo in Teflon (diametro interno di 2 mm) in un ago in acciaio inossidabile da 30 G (capillare metallico). Il flusso d'acqua è controllato dalla pressione dell'aria all'interno della bottiglia, come mostrato in Figura 2b. L'ago è montato su una console in Teflon e può essere regolato manualmente a una certa distanza dal controelettrodo. Il controelettrodo è un disco di alluminio lucidato con un foro al centro per il campionamento. Sotto il controelettrodo si trova un imbuto di campionamento in alluminio, collegato al resto dell'apparato sperimentale tramite una porta di campionamento (Fig. 2b). Per evitare accumuli di carica che potrebbero compromettere il funzionamento del campionatore, tutti i componenti del campionatore sono elettricamente collegati a terra.
(a) Sistema di generazione di nanostrutture d'acqua ingegnerizzate (EWNS). (b) Sezione trasversale del campionatore e dell'elettrospray, che mostra i parametri più importanti. (c) Configurazione sperimentale per l'inattivazione dei batteri.
Il sistema di generazione di EWNS sopra descritto è in grado di modificare i parametri operativi chiave per facilitare la regolazione fine delle proprietà dell'EWNS. Regolare la tensione applicata (V), la distanza tra l'ago e il controelettrodo (L) e il flusso d'acqua (φ) attraverso il capillare per regolare finemente le caratteristiche dell'EWNS. Simbolo utilizzato per rappresentare diverse combinazioni: [V (kV), L (cm)]. Regolare il flusso d'acqua per ottenere un cono di Taylor stabile di un determinato insieme [V, L]. Ai fini di questo studio, il diametro di apertura del controelettrodo (D) è stato mantenuto a 0,5 pollici (1,29 cm).
A causa della geometria limitata e dell'asimmetria, l'intensità del campo elettrico non può essere calcolata partendo da principi primi. Invece, è stato utilizzato il software QuickField™ (Svendborg, Danimarca)19 per calcolare il campo elettrico. Il campo elettrico non è uniforme, quindi il valore del campo elettrico all'estremità del capillare è stato utilizzato come valore di riferimento per diverse configurazioni.
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le diverse combinazioni sono illustrate nella Tabella Supplementare S1.
L'uscita del sistema di generazione EWNS è stata collegata direttamente a un analizzatore dimensionale di particelle a scansione di mobilità (SMPS, modello 3936, TSI, Shoreview, MN) per la misurazione della concentrazione del numero di particelle, nonché a un elettrometro di Faraday per aerosol (TSI, modello 3068B, Shoreview, MN). ) per le correnti di aerosol è stata misurata come descritto nella nostra precedente pubblicazione. Sia l'SMPS che l'elettrometro per aerosol hanno campionato a una portata di 0,5 L/min (flusso totale del campione 1 L/min). La concentrazione del numero di particelle e il flusso di aerosol sono stati misurati per 120 secondi. La misurazione è stata ripetuta 30 volte. Sulla base delle misurazioni della corrente, viene calcolata la carica totale di aerosol e viene stimata la carica media di EWNS per un dato numero totale di particelle EWNS selezionate. Il costo medio di EWNS può essere calcolato utilizzando l'equazione (1):
dove IEl è la corrente misurata, NSMPS è la concentrazione digitale misurata con l'SMPS e φEl è la portata per elettrometro.
Poiché l'umidità relativa (RH) influisce sulla carica superficiale, la temperatura e l'UR sono state mantenute costanti durante l'esperimento, rispettivamente a 21°C e al 45%.
Per misurare le dimensioni e la durata di vita dell'EWNS sono stati utilizzati il ​​microscopio a forza atomica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e la sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Giappone). La frequenza di scansione dell'AFM era di 1 Hz, l'area di scansione era di 5 μm × 5 μm e 256 linee di scansione. Tutte le immagini sono state sottoposte ad allineamento di primo ordine utilizzando il software Asylum (intervallo di maschera 100 nm, soglia 100 µm).
L'imbuto di prova è stato rimosso e la superficie della mica è stata posizionata a una distanza di 2,0 cm dal controelettrodo per un tempo medio di 120 s per evitare l'agglomerazione delle particelle e la formazione di goccioline irregolari sulla superficie della mica. L'EWNS è stato spruzzato direttamente sulla superficie della mica appena tagliata (Ted Pella, Redding, CA). Immagine della superficie della mica immediatamente dopo lo sputtering AFM. L'angolo di contatto della superficie della mica non modificata appena tagliata è prossimo a 0°, quindi l'EVNS è distribuito sulla superficie della mica a forma di cupola. Il diametro (a) e l'altezza (h) delle goccioline diffondenti sono stati misurati direttamente dalla topografia AFM e utilizzati per calcolare il volume di diffusione a cupola dell'EWNS utilizzando il nostro metodo precedentemente convalidato. Supponendo che l'EWNS integrato abbia lo stesso volume, il diametro equivalente può essere calcolato utilizzando l'equazione (2):
Sulla base del nostro metodo precedentemente sviluppato, è stata utilizzata una trappola di spin a risonanza di spin elettronico (ESR) per rilevare la presenza di intermedi radicalici a breve vita nell'EWNS. Gli aerosol sono stati fatti gorgogliare attraverso uno sparger Midget da 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contenente una soluzione 235 mM di DEPMPO(5-(dietossifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-ossido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Tutte le misurazioni ESR sono state eseguite utilizzando uno spettrometro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) e una cella a pannello piatto. Il software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) è stato utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. La determinazione delle caratteristiche dei ROS è stata effettuata solo per un set di condizioni operative [-6,5 kV, 4,0 cm]. Le concentrazioni di EWNS sono state misurate utilizzando l'SMPS dopo aver tenuto conto delle perdite di EWNS nell'impatto.
I livelli di ozono sono stati monitorati utilizzando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Per tutte le proprietà EWNS, il valore medio viene utilizzato come valore di misurazione e la deviazione standard come errore di misurazione. Sono stati eseguiti test t per confrontare i valori degli attributi EWNS ottimizzati con i valori corrispondenti dell'EWNS di base.
La Figura 2c mostra un sistema di "trazione" a precipitazione elettrostatica (EPES) precedentemente sviluppato e caratterizzato che può essere utilizzato per il rilascio mirato di EWNS sulla superficie. EPES utilizza cariche EVNS che possono essere "guidate" direttamente sulla superficie del bersaglio sotto l'influenza di un forte campo elettrico. I dettagli del sistema EPES sono presentati in una recente pubblicazione di Pyrgiotakis et al. 11 . Pertanto, EPES è costituito da una camera in PVC stampata in 3D con estremità rastremate e contiene due piastre metalliche parallele in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile 304, rivestimento a specchio) al centro, distanti 15,24 cm l'una dall'altra. Le schede sono state collegate a una sorgente esterna ad alta tensione (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la piastra inferiore è sempre collegata a una tensione positiva e quella superiore è sempre collegata a terra (massa flottante). Le pareti della camera sono rivestite con un foglio di alluminio, che è elettricamente messo a terra per prevenire la perdita di particelle. La camera è dotata di una porta di caricamento frontale sigillata che consente di posizionare le superfici di prova su supporti di plastica che le sollevano rispetto alla piastra metallica inferiore, per evitare interferenze ad alta tensione.
L'efficienza di deposizione di EWNS in EPES è stata calcolata secondo un protocollo precedentemente sviluppato e dettagliato nella Figura supplementare S111.
Come camera di controllo, una seconda camera di flusso cilindrica è stata collegata in serie al sistema EPES, in cui è stato utilizzato un filtro HEPA intermedio per rimuovere l'EWNS. Come mostrato in Figura 2c, l'aerosol di EWNS è stato pompato attraverso due camere integrate. Il filtro tra la sala di controllo e l'EPES rimuove qualsiasi EWNS rimanente, mantenendo gli stessi livelli di temperatura (T), umidità relativa (RH) e ozono.
È stato scoperto che importanti microrganismi trasmessi dagli alimenti contaminano gli alimenti freschi, come l'Escherichia coli (ATCC #27325), indicatore fecale, la Salmonella enterica (ATCC #53647), agente patogeno trasmesso dagli alimenti, la Listeria innocua (ATCC #33090), surrogato della Listeria monocytogenes patogena, derivata da ATCC (Manassas, VA), il Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sostituto del lievito deteriorante e un batterio inattivato più resistente, il Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Acquistate confezioni casuali di pomodorini biologici al vostro supermercato locale e conservateli in frigorifero a 4 °C fino al momento dell'uso (fino a 3 giorni). I pomodori sperimentali erano tutti della stessa dimensione, circa 1,2 cm di diametro.
I protocolli di coltura, inoculazione, esposizione e conteggio delle colonie sono descritti in dettaglio nella nostra precedente pubblicazione e nei Dati Supplementari. L'efficacia dell'EWNS è stata valutata esponendo pomodori inoculati a 40.000 #/cm3 per 45 minuti. In breve, tre pomodori sono stati utilizzati per valutare i microrganismi sopravvissuti al tempo t = 0 min. Tre pomodori sono stati posti in EPES ed esposti a EWNS a 40.000 #/cc (pomodori esposti a EWNS) e i restanti tre sono stati posti nella camera di controllo (pomodori di controllo). Non è stata effettuata alcuna ulteriore lavorazione dei pomodori in entrambi i gruppi. I pomodori esposti a EWNS e i pomodori di controllo sono stati rimossi dopo 45 minuti per valutare l'effetto dell'EWNS.
Ogni esperimento è stato condotto in triplicato. L'analisi dei dati è stata eseguita secondo il protocollo descritto nei Dati Supplementari.
I meccanismi di inattivazione sono stati valutati mediante sedimentazione di campioni di EWNS esposti (45 min a 40.000 #/cm3 di concentrazione di aerosol di EWNS) e campioni non irradiati di batteri innocui E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus. Le particelle sono state fissate in glutaraldeide al 2,5%, paraformaldeide all'1,25% e acido picrico allo 0,03% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, post-fissare con tetrossido di osmio (OsO4) all'1%/ferrocianuro di potassio (KFeCN6) all'1,5% per 2 ore, lavare 3 volte in acqua e incubare in acetato di uranile all'1% per 1 ora, quindi lavare due volte in acqua, quindi disidratare per 10 minuti in alcol al 50%, 70%, 90%, 100%. I campioni sono stati quindi immersi in ossido di propilene per 1 ora e impregnati con una miscela 1:1 di ossido di propilene e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). I ​​campioni sono stati inclusi in TAAB Epon e polimerizzati a 60 °C per 48 ore. La resina granulare polimerizzata è stata sezionata e visualizzata al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione convenzionale JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Giappone) dotato di una telecamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. Per ogni punto temporale, i lavaggi batterici sono stati seminati in triplicato, ottenendo un totale di nove punti dati per punto, la cui media è stata utilizzata come concentrazione batterica per quel particolare microrganismo. La deviazione standard è stata utilizzata come errore di misura. Tutti i punti sono validi.
Il logaritmo della diminuzione della concentrazione dei batteri rispetto a t = 0 min è stato calcolato utilizzando la seguente formula:
dove C0 è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo 0 (vale a dire dopo che la superficie si è asciugata ma prima di essere inserito nella camera) e Cn è la concentrazione di batteri sulla superficie dopo n minuti di esposizione.
Per tenere conto della degradazione naturale dei batteri durante l'esposizione di 45 minuti, la riduzione logaritmica rispetto al controllo dopo 45 minuti è stata calcolata anche come segue:
dove Cn è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo n e Cn-Controllo è la concentrazione di batteri di controllo al tempo n. I dati sono presentati come riduzione logaritmica rispetto al controllo (nessuna esposizione a EWNS).
Durante lo studio, diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo sono state valutate in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Diverse combinazioni sono illustrate nella Tabella Supplementare S1. Due casi che mostrano proprietà stabili e riproducibili (cono di Taylor, generazione di EWNS e stabilità nel tempo) sono stati selezionati per uno studio completo. Nella Figura 3 sono mostrati i risultati relativi a carica, dimensione e contenuto di ROS in entrambi i casi. I risultati sono riassunti anche nella Tabella 1. A titolo di riferimento, sia la Figura 3 che la Tabella 1 includono le proprietà degli EWNS8, 9, 10, 11 non ottimizzati precedentemente sintetizzati (EWNS di base). I calcoli della significatività statistica utilizzando un t-test a due code sono ripubblicati nella Tabella Supplementare S2. Inoltre, dati aggiuntivi includono studi sull'effetto del diametro del foro di campionamento del controelettrodo (D) e della distanza tra l'elettrodo di terra e la punta (L) (Figure Supplementari S2 e S3).
(ac) Distribuzione dimensionale misurata mediante AFM. (df) Caratteristica della carica superficiale. (g) Caratterizzazione ROS dell'EPR.
È inoltre importante notare che, in tutte le condizioni sopra descritte, la corrente di ionizzazione misurata era compresa tra 2 e 6 μA e la tensione tra -3,8 e -6,5 kV, con un consumo energetico inferiore a 50 mW per questo singolo modulo di contatto di generazione EWNS. Sebbene l'EWNS fosse sintetizzato ad alta pressione, i livelli di ozono erano molto bassi, non superando mai i 60 ppb.
La Figura supplementare S4 mostra i campi elettrici simulati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], rispettivamente. Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], i calcoli del campo sono rispettivamente 2 × 10⁻¹ V/m e 4,7 × 10⁻¹ V/m. Questo è prevedibile, poiché nel secondo caso il rapporto tensione-distanza è molto più elevato.
Le figure 3a e 3b mostrano il diametro dell'EWNS misurato con l'AFM8. I diametri medi calcolati dell'EWNS erano rispettivamente di 27 nm e 19 nm per gli schemi [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], le deviazioni standard geometriche delle distribuzioni sono rispettivamente 1,41 e 1,45, indicando una distribuzione dimensionale ristretta. Sia la dimensione media che la deviazione standard geometrica sono molto vicine all'EWNS di base, rispettivamente a 25 nm e 1,41. La figura 3c mostra la distribuzione dimensionale dell'EWNS di base misurata con lo stesso metodo nelle stesse condizioni.
In Fig. 3d, e sono mostrati i risultati della caratterizzazione della carica. I dati sono misurazioni medie di 30 misurazioni simultanee di concentrazione (#/cm3) e corrente (I). L'analisi mostra che la carica media sull'EWNS è di 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- rispettivamente per [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Presentano cariche superficiali significativamente più elevate rispetto all'EWNS di base (10 ± 2 e-), due volte superiori allo scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e quattro volte superiori allo scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. La Figura 3f mostra i dati di carica per l'EWNS di base.
Dalle mappe di concentrazione del numero di EWNS (Figure Supplementari S5 e S6), si può osservare che lo scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta un numero di particelle significativamente maggiore rispetto allo scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. È inoltre importante notare che la concentrazione del numero di EWNS è stata monitorata fino a 4 ore (Figure Supplementari S5 e S6), durante le quali la stabilità della generazione di EWNS ha mostrato gli stessi livelli di concentrazione del numero di particelle in entrambi i casi.
La figura 3g mostra lo spettro EPR dopo la sottrazione del controllo EWNS ottimizzato (sfondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Gli spettri ROS sono stati inoltre confrontati con lo scenario Baseline-EWNS in un lavoro precedentemente pubblicato. Il numero di EWNS che reagiscono con le trappole di spin è stato calcolato essere 7,5 × 104 EWNS/s, un valore simile a quello dello scenario Baseline-EWNS8 precedentemente pubblicato. Gli spettri EPR hanno mostrato chiaramente la presenza di due tipi di ROS, con O2- come specie predominante e OH• meno abbondante. Inoltre, un confronto diretto delle intensità dei picchi ha mostrato che l'EWNS ottimizzato aveva un contenuto di ROS significativamente più elevato rispetto all'EWNS baseline.
La figura 4 mostra l'efficienza di deposizione degli EWNS in EPES. I dati sono riassunti anche nella Tabella I e confrontati con i dati originali degli EWNS. In entrambi i casi di EUNS, la deposizione è prossima al 100% anche a una bassa tensione di 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV sono sufficienti per una deposizione del 100%, indipendentemente dalla variazione di carica superficiale. Nelle stesse condizioni, l'efficienza di deposizione degli EWNS di base era solo del 56% a causa della loro carica inferiore (media di 10 elettroni per EWNS).
In figura 5 e nella tabella 2 è riassunto il valore di inattivazione dei microrganismi inoculati sulla superficie di pomodori dopo esposizione a circa 40.000 #/cm3 di EWNS per 45 minuti alla modalità ottimale [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e Lactobacillus innocuous inoculati hanno mostrato una riduzione significativa di 3,8 log durante l'esposizione di 45 minuti. Nelle stesse condizioni, S. enterica ha avuto una diminuzione di 2,2 log, mentre S. cerevisiae e M. parafortutum hanno avuto una diminuzione di 1,0 log.
Le micrografie elettroniche (Figura 6) mostrano i cambiamenti fisici indotti dall'EWNS su cellule innocue di Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus, che ne hanno portato all'inattivazione. I batteri di controllo presentavano membrane cellulari intatte, mentre i batteri esposti presentavano membrane esterne danneggiate.
L'imaging al microscopio elettronico dei batteri di controllo e di quelli esposti ha rivelato danni alla membrana.
I dati sulle proprietà fisico-chimiche degli EWNS ottimizzati mostrano collettivamente che le proprietà (carica superficiale e contenuto di ROS) degli EWNS sono state significativamente migliorate rispetto ai dati di base degli EWNS precedentemente pubblicati8,9,10,11. D'altra parte, le loro dimensioni sono rimaste nell'ordine dei nanometri, molto simili ai risultati precedentemente riportati, consentendo loro di rimanere in aria per lunghi periodi di tempo. La polidispersità osservata può essere spiegata dalle variazioni della carica superficiale che determinano le dimensioni degli EWNS, dalla casualità dell'effetto Rayleigh e dalla potenziale coalescenza. Tuttavia, come dettagliato da Nielsen et al. 22, un'elevata carica superficiale riduce l'evaporazione aumentando efficacemente l'energia/tensione superficiale della goccia d'acqua. Nella nostra precedente pubblicazione8 questa teoria è stata confermata sperimentalmente per le microgocce 22 e gli EWNS. Anche la perdita di carica nel tempo può influenzare le dimensioni e contribuire alla distribuzione dimensionale osservata.
Inoltre, la carica per struttura è di circa 22-44 e-, a seconda della situazione, un valore significativamente più alto rispetto all'EWNS di base, che ha una carica media di 10 ± 2 elettroni per struttura. Tuttavia, è opportuno notare che questa è la carica media dell'EWNS. Seto et al. hanno dimostrato che la carica è disomogenea e segue una distribuzione log-normale21. Rispetto al nostro lavoro precedente, raddoppiando la carica superficiale si raddoppia l'efficienza di deposizione nel sistema EPES, arrivando quasi al 100%11.