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La barriera emato-encefalica e la barriera emato-encefalica impediscono agli agenti bioterapeutici di raggiungere i loro bersagli nel sistema nervoso centrale, ostacolando così un trattamento efficace delle malattie neurologiche.Per scoprire nuovi trasportatori cerebrali in vivo, abbiamo introdotto una libreria di peptidi fagici T7 e raccolto in serie sangue e liquido cerebrospinale (CSF) utilizzando un modello di grande pool cosciente cannulato di ratti.I cloni fagici specifici sono stati altamente arricchiti nel CSF dopo quattro cicli di selezione.I test sui singoli peptidi candidati hanno rivelato un arricchimento di oltre 1000 volte nel liquido cerebrospinale.La bioattività del rilascio mediato dal peptide al cervello è stata confermata da una riduzione del 40% del livello di amiloide-β nel liquido cerebrospinale utilizzando un inibitore del peptide BACE1 collegato al nuovo peptide di transito identificato.Questi risultati suggeriscono che i peptidi identificati dai metodi di selezione dei fagi in vivo possono essere veicoli utili per la consegna sistemica di macromolecole al cervello con un effetto terapeutico.
La ricerca sulla terapia mirata al sistema nervoso centrale (SNC) si è in gran parte concentrata sull'identificazione di farmaci e agenti ottimizzati che presentano proprietà di targeting del SNC, con meno sforzi per scoprire i meccanismi che guidano la somministrazione attiva di farmaci al cervello.Questo sta iniziando a cambiare ora poiché la somministrazione di farmaci, in particolare molecole di grandi dimensioni, è parte integrante del moderno sviluppo di farmaci neuroscientifici.L'ambiente del sistema nervoso centrale è ben protetto dal sistema di barriera cerebrovascolare, costituito dalla barriera emato-encefalica (BBB) ​​e dalla barriera emato-encefalica (BCBB)1, rendendo difficile la somministrazione di farmaci al cervello1,2.Si stima che quasi tutti i farmaci a molecola grande e oltre il 98% dei farmaci a molecola piccola vengano eliminati dal cervello3.Ecco perché è molto importante identificare nuovi sistemi di trasporto cerebrale che forniscano una consegna efficiente e specifica di farmaci terapeutici al SNC4,5.Tuttavia, BBB e BCSFB presentano anche un'eccellente opportunità per la somministrazione di farmaci poiché penetrano ed entrano in tutte le strutture del cervello attraverso la sua vasta vascolarizzazione.Pertanto, gli attuali sforzi per utilizzare metodi non invasivi di consegna al cervello si basano in gran parte sul meccanismo di trasporto mediato dal recettore (PMT) che utilizza il recettore BBB6 endogeno.Nonostante i recenti progressi chiave nell'utilizzo della via del recettore della transferrina7,8, è necessario un ulteriore sviluppo di nuovi sistemi di rilascio con proprietà migliorate.A tal fine, il nostro obiettivo era identificare peptidi in grado di mediare il trasporto del CSF, in quanto potrebbero in linea di principio essere utilizzati per fornire macromolecole al sistema nervoso centrale o per aprire nuove vie recettoriali.In particolare, specifici recettori e trasportatori del sistema cerebrovascolare (BBB e BSCFB) possono fungere da potenziali bersagli per la somministrazione attiva e specifica di farmaci bioterapeutici.Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prodotto secretorio del plesso coroideo (CS) ed è in contatto diretto con il liquido interstiziale del cervello attraverso lo spazio subaracnoideo e lo spazio ventricolare4.Recentemente è stato dimostrato che il liquido cerebrospinale subaracnoideo diffonde eccessivamente nell'interstizio cerebrale9.Speriamo di accedere allo spazio parenchimale utilizzando questo tratto di afflusso subaracnoideo o direttamente attraverso la BBB.Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo implementato una solida strategia di selezione dei fagi in vivo che identifica idealmente i peptidi trasportati da uno di questi due percorsi distinti.
Descriviamo ora un metodo sequenziale di screening dei fagi in vivo con campionamento CSF ​​accoppiato con sequenziamento ad alto rendimento (HTS) per monitorare i turni di selezione iniziale con la più alta diversità di librerie.Lo screening è stato eseguito su ratti coscienti con una cannula di grande cisterna (CM) impiantata in modo permanente per evitare la contaminazione del sangue.È importante sottolineare che questo approccio seleziona sia il targeting cerebrale che i peptidi con attività di trasporto attraverso la barriera cerebrovascolare.Abbiamo utilizzato i fagi T7 a causa delle loro piccole dimensioni (~ 60 nm) e abbiamo suggerito che sono adatti per il trasporto di vescicole che consentono l'attraversamento transcellulare della barriera endoteliale e/o epiteliale-midollare.Dopo quattro cicli di panning, le popolazioni di fagi sono state isolate mostrando un forte arricchimento del CSF in vivo e un'associazione di microvasi cerebrali.È importante sottolineare che siamo stati in grado di confermare le nostre scoperte dimostrando che i migliori peptidi candidati preferiti e sintetizzati chimicamente sono in grado di trasportare il carico proteico nel liquido cerebrospinale.In primo luogo, gli effetti farmacodinamici del sistema nervoso centrale sono stati stabiliti combinando un peptide di transito principale con un inibitore del peptide BACE1.Oltre a dimostrare che le strategie di screening funzionale in vivo possono identificare nuovi peptidi di trasporto cerebrale come efficaci trasportatori di proteine, ci aspettiamo che simili approcci di selezione funzionale diventino importanti anche nell'identificazione di nuovi percorsi di trasporto cerebrale.
Sulla base delle unità formanti placca (PFU), dopo la fase di confezionamento dei fagi, è stata progettata e creata una libreria di peptidi fagici T7 lineari casuali a 12 meri con una diversità di circa 109 (vedere Materiali e metodi).È importante notare che abbiamo analizzato attentamente questa libreria prima della panoramica in vivo.L'amplificazione PCR di campioni di librerie fagiche utilizzando primer modificati ha generato ampliconi che erano direttamente applicabili a HTS (Figura 1a supplementare).A causa di a) errori di sequenziamento HTS11, b) impatto sulla qualità dei primer (NNK) 1-12 e c) presenza di fagi wild-type (wt) (inserti scheletrici) nella libreria di standby, è stata implementata una procedura di filtraggio della sequenza per estrarre solo informazioni sulla sequenza verificate (Figura 1b supplementare).Questi passaggi di filtro si applicano a tutte le librerie di sequenziamento HTS.Per la libreria standard, sono state ottenute un totale di 233.868 letture, di cui il 39% ha superato i criteri di filtro e sono state utilizzate per l'analisi della libreria e la selezione per i round successivi (Figura supplementare 1c-e).Le letture erano prevalentemente multiple di 3 paia di basi di lunghezza con un picco a 36 nucleotidi (Figura 1c supplementare), confermando il progetto della libreria (NNK) 1-12.In particolare, circa l'11% dei membri della libreria conteneva un inserto PAGISRELVDKL backbone wild-type (wt) a 12 dimensioni e quasi la metà delle sequenze (49%) conteneva inserimenti o eliminazioni.L'HTS della libreria della libreria ha confermato l'elevata diversità dei peptidi nella libreria: oltre l'81% delle sequenze peptidiche è stato trovato solo una volta e solo l'1, 5% si è verificato in ≥4 copie (Figura 2a supplementare).Le frequenze degli amminoacidi (aa) in tutte le 12 posizioni del repertorio erano ben correlate con le frequenze previste per il numero di codoni generati dal repertorio NKK degenerato (Figura 2b supplementare).La frequenza osservata dei residui aa codificati da questi inserti era ben correlata con la frequenza calcolata ( r = 0, 893) (Figura 2c supplementare).La preparazione delle librerie fagiche per l'iniezione include le fasi di amplificazione e rimozione dell'endotossina.Ciò ha precedentemente dimostrato di ridurre potenzialmente la diversità delle librerie fagiche12,13.Pertanto, abbiamo sequenziato una libreria fagica amplificata su piastra che aveva subito la rimozione dell'endotossina e l'abbiamo confrontata con la libreria originale per stimare la frequenza di AA.È stata osservata una forte correlazione (r = 0,995) tra il pool originale e il pool amplificato e purificato (Figura 2d supplementare), indicando che la competizione tra cloni amplificati su piastre utilizzando il fago T7 non ha causato gravi pregiudizi.Questo confronto si basa sulla frequenza dei motivi tripeptidici in ciascuna libreria, poiché la diversità delle librerie (~ 109) non può essere completamente catturata anche con HTS.L'analisi della frequenza di aa in ciascuna posizione ha rivelato un piccolo pregiudizio dipendente dalla posizione nelle ultime tre posizioni del repertorio inserito (Figura 2e supplementare).In conclusione, abbiamo concluso che la qualità e la diversità della libreria erano accettabili e sono stati osservati solo piccoli cambiamenti nella diversità a causa dell'amplificazione e della preparazione delle librerie fagiche tra diversi cicli di selezione.
Il campionamento seriale del liquido cerebrospinale può essere eseguito impiantando chirurgicamente una cannula nel CM di ratti coscienti per facilitare l'identificazione del fago T7 iniettato per via endovenosa (iv) tramite BBB e / o BCSFB (Fig. 1a-b).Abbiamo utilizzato due bracci di selezione indipendenti (bracci A e B) nei primi tre round di selezione in vivo (figura 1c).Abbiamo gradualmente aumentato il rigore della selezione diminuendo la quantità totale di fago introdotto nei primi tre turni di selezione.Per il quarto round di panning, abbiamo combinato i campioni dei rami A e B ed eseguito tre ulteriori selezioni indipendenti.Per studiare le proprietà in vivo delle particelle fagiche T7 in questo modello, il fago wild-type (inserto principale PAGISRELVDKL) è stato iniettato nei ratti attraverso la vena della coda.Il recupero dei fagi dal liquido cerebrospinale e dal sangue in diversi momenti ha mostrato che i fagi icosaedrici T7 relativamente piccoli avevano una rapida fase iniziale di eliminazione dal compartimento sanguigno (Figura 3 supplementare).Sulla base dei titoli somministrati e del volume sanguigno dei ratti, abbiamo calcolato che solo circa l'1% in peso.fago dalla dose somministrata è stato rilevato nel sangue 10 minuti dopo l'iniezione endovenosa.Dopo questo rapido declino iniziale, è stata misurata una clearance primaria più lenta con un'emivita di 27,7 minuti.È importante sottolineare che solo pochissimi fagi sono stati recuperati dal compartimento CSF, indicando uno sfondo basso per la migrazione dei fagi di tipo selvaggio nel compartimento CSF ​​(Figura 3 supplementare).In media, solo circa 1 x 10-3% di titoli di fago T7 nel sangue e 4 x 10-8% di fagi inizialmente infusi sono stati rilevati nel liquido cerebrospinale durante l'intero periodo di campionamento (0-250 min).In particolare, l'emivita (25,7 min) del fago wild-type nel liquido cerebrospinale era simile a quella osservata nel sangue.Questi dati dimostrano che la barriera che separa il compartimento CSF ​​dal sangue è intatta nei ratti cannulati CM, consentendo la selezione in vivo di librerie di fagi per identificare i cloni che vengono prontamente trasportati dal sangue nel compartimento CSF.
(a) Messa a punto di un metodo per ricampionare il liquido cerebrospinale (CSF) da una grande piscina.(b) Diagramma che mostra la posizione cellulare della barriera del sistema nervoso centrale (SNC) e la strategia di selezione utilizzata per identificare i peptidi che attraversano la barriera emato-encefalica (BBB) ​​e la barriera emato-encefalica.(c) Diagramma di flusso di screening del display dei fagi in vivo.In ogni round di selezione, i fagi (identificatori animali all'interno delle frecce) sono stati iniettati per via endovenosa.Due rami alternativi indipendenti (A, B) sono tenuti separati fino al 4° turno di selezione.Per i turni di selezione 3 e 4, ogni clone fagico estratto dal CSF è stato sequenziato manualmente.(d) Cinetica del fago isolato dal sangue (cerchi rossi) e dal liquido cerebrospinale (triangoli verdi) durante il primo ciclo di selezione in due ratti cannulati dopo l'iniezione endovenosa della libreria di peptidi T7 (2 x 1012 fagi/animale).I quadrati blu indicano la concentrazione iniziale media di fago nel sangue, calcolata dalla quantità di fago iniettato, tenendo conto del volume totale del sangue.I quadrati neri indicano il punto di intersezione della linea y estrapolata dalle concentrazioni dei fagi nel sangue.(e, f) Presentare la frequenza relativa e la distribuzione di tutti i possibili motivi tripeptidici sovrapposti trovati nel peptide.Viene mostrato il numero di motivi trovati in 1000 letture.I motivi significativamente arricchiti (p <0,001) sono contrassegnati da punti rossi.(e) Grafico a dispersione di correlazione che confronta la frequenza relativa del motivo tripeptide della libreria iniettata con il fago derivato dal sangue dagli animali n. 1.1 e n. 1.2.( f ) Grafico a dispersione di correlazione che confronta le frequenze relative dei motivi tripeptidici di fagi animali n. 1.1 e n. 1.2 isolati nel sangue e nel liquido cerebrospinale.( g, h ) Rappresentazione dell'ID di sequenza del fago arricchito nel sangue ( g ) rispetto alle librerie iniettate e al fago arricchito nel CSF ( h ) rispetto al sangue dopo un ciclo di selezione in vivo in entrambi gli animali.La dimensione del codice di una lettera indica la frequenza con cui quell'amminoacido si trova in quella posizione.Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici.La figura 1a, b è stata progettata e prodotta da Eduard Urich.
Abbiamo iniettato una libreria di peptidi fagici in due ratti strumento CM (cladi A e B) e fago isolato dal liquido cerebrospinale e dal sangue (Figura 1d).La rapida liquidazione iniziale della libreria era meno pronunciata rispetto al fago di tipo selvaggio.L'emivita media della libreria iniettata in entrambi gli animali era di 24,8 minuti nel sangue, simile al fago di tipo selvaggio, e di 38,5 minuti nel liquido cerebrospinale.I campioni di sangue e di fago del liquido cerebrospinale di ciascun animale sono stati sottoposti a HTS e tutti i peptidi identificati sono stati analizzati per la presenza di un breve motivo tripeptide.I motivi tripeptidici sono stati scelti perché forniscono una base minima per la formazione della struttura e le interazioni peptide-proteina14,15.Abbiamo trovato una buona correlazione nella distribuzione dei motivi tra la libreria fagica iniettata e i cloni estratti dal sangue di entrambi gli animali (Fig. 1e).I dati indicano che la composizione della libreria è solo marginalmente arricchita nel compartimento del sangue.Le frequenze degli amminoacidi e le sequenze di consenso sono state ulteriormente analizzate in ciascuna posizione utilizzando un adattamento del software Weblogo16.È interessante notare che abbiamo trovato un forte arricchimento nei residui di glicina nel sangue (figura 1g).Quando il sangue è stato confrontato con i cloni selezionati dal CSF, sono state osservate una forte selezione e una certa deselezione dei motivi (Fig. 1f), e alcuni amminoacidi erano preferenzialmente presenti in posizioni predeterminate nei 12 membri (Fig. 1h).In particolare, i singoli animali differivano significativamente nel liquido cerebrospinale, mentre l'arricchimento di glicina nel sangue è stato osservato in entrambi gli animali (Figura 4a-j supplementare).Dopo un rigoroso filtraggio dei dati di sequenza nel liquido cerebrospinale degli animali n. 1.1 e n. 1.2, sono stati ottenuti un totale di 964 e 420 peptidi 12-mer unici (Figura 1d-e supplementare).I cloni fagici isolati sono stati amplificati e sottoposti a un secondo ciclo di selezione in vivo.I fagi estratti dal secondo round di selezione sono stati sottoposti a HTS in ciascun animale e tutti i peptidi identificati sono stati utilizzati come input per un programma di riconoscimento del motivo per analizzare la presenza di motivi tripeptidici (Fig. 2a, b, ef).Rispetto al primo ciclo del fago recuperato dal CSF, abbiamo osservato un'ulteriore selezione e deselezione di molti motivi nel CSF nei rami A e B (Fig. 2).È stato applicato un algoritmo di identificazione della rete per determinare se rappresentavano diversi modelli di sequenza coerente.È stata osservata una chiara somiglianza tra le sequenze a 12 dimensioni recuperate dal CSF nel clade alternativo A (Fig. 2c, d) e nel clade B (Fig. 2g, h).L'analisi aggregata in ciascun ramo ha rivelato diversi profili di selezione per i peptidi 12-mer (Figura 5c, d supplementare) e un aumento del rapporto titolo CSF/sangue nel tempo per i cloni raggruppati dopo il secondo ciclo di selezione rispetto al primo ciclo di selezione (Figura 5e supplementare).).
Arricchimento di motivi e peptidi nel liquido cerebrospinale mediante due cicli successivi di selezione del display dei fagi funzionali in vivo.
Tutti i fagi del liquido cerebrospinale recuperati dal primo round di ciascun animale (animali n. 1.1 e n. 1.2) sono stati raggruppati, amplificati, sequenziati HT e reiniettati insieme (2 x 1010 fagi/animale) 2 ratti cannulati SM (n. 1.1 → #).2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4).( a, b, e, f ) Grafici a dispersione di correlazione che confrontano la frequenza relativa dei motivi tripeptidici di tutti i fagi derivati ​​​​dal CSF nel primo e nel secondo round di selezione.Frequenza relativa e distribuzione dei motivi che rappresentano tutti i possibili tripeptidi sovrapposti trovati nei peptidi in entrambi gli orientamenti.Viene mostrato il numero di motivi trovati in 1000 letture.I motivi che sono stati significativamente (p <0,001) selezionati o esclusi in una delle librerie confrontate sono evidenziati con punti rossi.(c, d, g, h) Rappresentazione del logo di sequenza di tutte le sequenze lunghe di 12 amminoacidi ricche di CSF basate sui round 2 e 1 della selezione in vivo.La dimensione del codice di una lettera indica la frequenza con cui quell'amminoacido si trova in quella posizione.Per rappresentare il logo, viene confrontata la frequenza delle sequenze di CSF estratte da singoli animali tra due turni di selezione e vengono mostrate le sequenze arricchite nel secondo turno: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4.Gli amminoacidi più arricchiti in una data posizione negli animali (c, d) n.2.1 e n.2.2 o (g, h) negli animali n.2.3 e n.2.4 sono mostrati a colori.Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici.
Dopo il terzo round di selezione, abbiamo identificato 124 sequenze peptidiche uniche (n. 3.1 e n. 3.2) da 332 cloni fagici ricostituiti con CSF isolati da due animali (Figura 6a supplementare).La sequenza LGSVS (18,7%) aveva la percentuale relativa più alta, seguita dagli inserti wild-type PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%).Nell'ultimo quarto round, abbiamo raggruppato due rami selezionati indipendentemente da tre animali separati (Fig. 1c).Dei 925 cloni fagici sequenziati recuperati dal CSF, nel quarto round abbiamo trovato 64 sequenze peptidiche uniche (Figura 6b supplementare), tra le quali la percentuale relativa di fago di tipo selvaggio è scesa allo 0, 8%.I cloni CSF più comuni nel quarto round sono stati LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).L'intervallo di lunghezza dei peptidi selezionati è dovuto a inserzioni/delezioni di nucleotidi o codoni di arresto prematuri nei primer della libreria quando si utilizzano codoni degenerati per la progettazione della libreria NNK.I codoni di stop prematuro generano peptidi più corti e sono selezionati perché contengono il motivo aa favorevole.I peptidi più lunghi possono derivare da inserzioni/delezioni nei primer delle librerie sintetiche.Questo posiziona il codone di stop progettato all'esterno del frame e lo legge finché non appare un nuovo codone di stop a valle.In generale, abbiamo calcolato i fattori di arricchimento per tutti e quattro i turni di selezione confrontando i dati di input con i dati di output del campione.Per il primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato titoli fagici di tipo selvaggio come riferimento di sfondo non specifico.È interessante notare che la selezione fagica negativa era molto forte nel primo ciclo CSF, ma non nel sangue (Fig. 3a), il che potrebbe essere dovuto alla bassa probabilità di diffusione passiva della maggior parte dei membri della libreria peptidica nel compartimento CSF ​​o i fagi relativi tendono ad essere trattenuti o rimossi in modo più efficiente dal flusso sanguigno rispetto ai batteriofagi.Tuttavia, nel secondo round di panning, è stata osservata una forte selezione di fagi nel CSF in entrambi i cladi, suggerendo che il round precedente era arricchito in fagi che mostravano peptidi che promuovono l'assorbimento del CSF (Fig. 3a).Ancora una volta, senza un significativo arricchimento del sangue.Anche nel terzo e quarto round, i cloni fagici sono stati significativamente arricchiti nel CSF.Confrontando la frequenza relativa di ciascuna sequenza peptidica univoca tra gli ultimi due round di selezione, abbiamo scoperto che le sequenze erano ancora più arricchite nel quarto round di selezione (Fig. 3b).Un totale di 931 motivi tripeptidici sono stati estratti da tutte le 64 sequenze peptidiche uniche utilizzando entrambi gli orientamenti peptidici.I motivi più arricchiti nel quarto round sono stati esaminati più da vicino per i loro profili di arricchimento in tutti i round rispetto alla libreria iniettata (cut-off: arricchimento del 10%) (Figura 6c supplementare).I modelli generali di selezione hanno mostrato che la maggior parte dei motivi studiati sono stati arricchiti in tutti i cicli precedenti di entrambi i rami di selezione.Tuttavia, alcuni motivi (ad es. SGL, VSG, LGS GSV) provenivano prevalentemente dal clade A alternativo, mentre altri (ad es. FGW, RTN, WGF, NTR) erano arricchiti dal clade alternativo B.
Convalida del trasporto CSF ​​di peptidi visualizzati da fagi arricchiti con CSF e peptidi leader biotinilati coniugati a carichi utili di streptavidina.
( a ) Rapporti di arricchimento calcolati in tutti e quattro i round (R1-R4) basati sui titoli dei fagi iniettati (input = I) (PFU) e sui titoli dei fagi CSF determinati (output = O).I fattori di arricchimento per gli ultimi tre round (R2-R4) sono stati calcolati confrontandoli con il round precedente e il primo round (R1) con i dati di peso.Le barre aperte sono liquido cerebrospinale, le barre ombreggiate sono plasma.(***p<0,001, basato sul test t di Student).( b ) Elenco dei peptidi fagici più abbondanti, classificati in base alla loro proporzione relativa a tutti i fagi raccolti nel CSF dopo il round 4 di selezione.I sei cloni fagici più comuni sono evidenziati a colori, numerati e i loro fattori di arricchimento tra i round 3 e 4 di selezione (riquadri).( c, d ) I sei cloni fagici più arricchiti, i fagi vuoti e le librerie di peptidi fagici parentali del round 4 sono stati analizzati individualmente in un modello di campionamento CSF.I campioni di CSF e di sangue sono stati raccolti nei punti temporali indicati.(c) Quantità uguali di 6 cloni fagici candidati (2 x 1010 fagi/animali), fagi vuoti (#1779) (2 x 1010 fagi/animali) e librerie di peptidi fagici stock (2 x 1012 fagi/animali) Iniettare almeno 3 CM viene somministrato all'animale cannulato separatamente attraverso la vena della coda.Viene mostrata la farmacocinetica CSF di ciascun clone fagico iniettato e libreria di peptidi fagici nel tempo.(d) mostra il rapporto medio CSF/sangue per tutti i fagi recuperati/mL durante il tempo di campionamento.(e) Quattro peptidi leader sintetici e un controllo criptato sono stati collegati con la biotina alla streptavidina attraverso il loro N-terminale (display tetramero) seguito dall'iniezione (vena della coda iv, 10 mg di streptavidina/kg).Almeno tre ratti intubati (N = 3).).I campioni di CSF sono stati raccolti nei punti temporali indicati e le concentrazioni di streptavidina sono state misurate mediante ELISA anti-streptavidina CSF (nd = non rilevato).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basato sul test ANOVA).(f) Confronto della sequenza amminoacidica del clone peptidico fagico più arricchito n. 2002 (viola) con altri cloni peptidici fagici selezionati dal 4° ciclo di selezione.I frammenti di amminoacidi identici e simili sono codificati a colori.
Di tutti i fagi arricchiti nel quarto round (Fig. 3b), sei cloni candidati sono stati selezionati per un'ulteriore analisi individuale nel modello di campionamento CSF.Quantità uguali di sei fagi candidati, fagi vuoti (nessun inserto) e librerie di peptidi profagi sono state iniettate in tre animali CM cannulati e la farmacocinetica è stata determinata nei test CSF (Fig. 3c) e sangue (Figura 7 supplementare).Tutti i cloni fagici testati miravano al compartimento CSF ​​a un livello 10-1000 volte superiore a quello del fago di controllo vuoto (#1779).Ad esempio, i cloni #2020 e #2077 avevano titoli CSF circa 1000 volte superiori rispetto al fago di controllo.Il profilo farmacocinetico di ciascun peptide selezionato è diverso, ma tutti hanno un'elevata capacità di homing del CSF.Abbiamo osservato una diminuzione costante nel tempo per i cloni #1903 e #2011, mentre per i cloni #2077, #2002 e #2009 un aumento durante i primi 10 minuti potrebbe indicare un trasporto attivo ma deve essere verificato.I cloni n. 2020, n. 2002 e n. 2077 si sono stabilizzati a livelli elevati, mentre la concentrazione CSF del clone n. 2009 è lentamente diminuita dopo l'aumento iniziale.Abbiamo quindi confrontato la frequenza relativa di ciascun candidato CSF ​​con la sua concentrazione ematica (Fig. 3d).La correlazione del titolo medio di ciascun candidato CSF ​​con il suo titolo ematico a tutti i tempi di campionamento ha mostrato che tre dei sei candidati erano significativamente arricchiti nel sangue CSF.È interessante notare che il clone n. 2077 ha mostrato una maggiore stabilità del sangue (Figura 7 supplementare).Per confermare che i peptidi stessi sono in grado di trasportare attivamente carichi diversi dalle particelle fagiche nel compartimento CSF, abbiamo sintetizzato quattro peptidi leader derivatizzati con biotina all'N-terminale dove i peptidi si attaccano alla particella fagica.I peptidi biotinilati (n. 2002, 2009, 2020 e 2077) sono stati coniugati con streptavidina (SA) per ottenere forme multimeriche che imitano in qualche modo la geometria dei fagi.Questo formato ci ha anche permesso di misurare l'esposizione SA nel sangue e nel liquido cerebrospinale come peptidi proteici di trasporto merci.È importante sottolineare che i dati sui fagi potrebbero spesso essere riprodotti quando i peptidi sintetici venivano somministrati in questo formato coniugato con SA (Fig. 3e).I peptidi rimescolati avevano un'esposizione iniziale minore e una clearance del CSF più rapida con livelli non rilevabili entro 48 ore.Per ottenere informazioni sui percorsi di consegna di questi cloni di fagi peptidici nello spazio CSF, abbiamo analizzato la localizzazione dei singoli colpi di peptidi fagici utilizzando l'immunoistochimica (IHC) per rilevare direttamente le particelle di fagi 1 ora dopo l'iniezione endovenosa in vivo.In particolare, i cloni n. 2002, n. 2077 e n. 2009 potrebbero essere rilevati da una forte colorazione nei capillari cerebrali, mentre il fago di controllo (n. 1779) e il clone n. 2020 non sono stati rilevati (Figura 8 supplementare).Ciò suggerisce che questi peptidi contribuiscono all'effetto sul cervello proprio attraversando la BBB.È necessaria un'ulteriore analisi dettagliata per verificare questa ipotesi, poiché potrebbe essere coinvolta anche la rotta BSCFB.Confrontando la sequenza amminoacidica del clone più arricchito (#2002) con altri peptidi selezionati, è stato notato che alcuni di essi hanno estensioni amminoacidiche simili, che possono indicare un meccanismo di trasporto simile (Fig. 3f).
A causa del suo profilo plasmatico unico e del significativo aumento del CSF nel tempo, il clone n. 2077 del display fagico è stato ulteriormente esplorato per un periodo più lungo di 48 ore ed è stato in grado di riprodurre il rapido aumento del CSF osservato in associazione con livelli SA sostenuti (Fig. 4a).Per quanto riguarda altri cloni fagici identificati, # 2077 si è macchiato fortemente per i capillari cerebrali e ha mostrato una significativa colocalizzazione con lectina del marcatore capillare se visualizzato a una risoluzione più elevata e possibilmente qualche colorazione nello spazio parenchimale (Figura 4b).Per studiare se gli effetti farmacologici mediati dal peptide potessero essere ottenuti nel sistema nervoso centrale, abbiamo eseguito un esperimento in cui le versioni biotinilate di i) il peptide di transito n.Per una combinazione abbiamo utilizzato solo l'inibitore del peptide BACE1 e per l'altra abbiamo utilizzato un rapporto 1:3 tra l'inibitore del peptide BACE1 e il peptide #2077.Entrambi i campioni sono stati somministrati per via endovenosa e i livelli di sangue e liquido cerebrospinale del peptide beta-amiloide 40 (Abeta40) sono stati misurati nel tempo.Abeta40 è stato misurato nel liquido cerebrospinale in quanto riflette l'inibizione di BACE1 nel parenchima cerebrale.Come previsto, entrambi i complessi hanno ridotto significativamente i livelli ematici di Abeta40 (Fig. 4c, d).Tuttavia, solo i campioni contenenti una miscela di peptide n.2077 e un inibitore del peptide BACE1 coniugato con SA hanno causato una significativa diminuzione dell'Abeta40 nel liquido cerebrospinale (Fig. 4c).I dati mostrano che il peptide n.2077 è in grado di trasportare la proteina SA da 60 kDa nel sistema nervoso centrale e induce anche effetti farmacologici con inibitori SA-coniugati del peptide BACE1.
( a ) Iniezione clonale (2 × 10 fagi / animale) del fago T7 che mostra i profili farmacocinetici a lungo termine del peptide CSF n. 2077 (RLSSVDSDLSGC) e del fago di controllo non iniettato (n. 1779) in almeno tre ratti CM-intubati.( b ) Immagine microscopica confocale di microvasi corticali rappresentativi in ​​ratti iniettati con fagi (2 × 10 10 fagi / animale) che mostra la colorazione di contrasto del peptide n. 2077 e dei vasi (lectina).Questi cloni fagici sono stati somministrati a 3 ratti e lasciati circolare per 1 ora prima della perfusione.I cervelli sono stati sezionati e colorati con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il capside del fago T7.Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, la lectina marcata con DyLight594 è stata somministrata per via endovenosa.Immagini fluorescenti che mostrano la colorazione della lectina (rossa) del lato luminale dei microvasi e dei fagi (verde) nel lume dei capillari e del tessuto cerebrale perivascolare.La barra della scala corrisponde a 10 µm.( c, d ) Il peptide inibitorio BACE1 biotinilato da solo o in combinazione con il peptide di transito biotinilato n. 2077 è stato accoppiato alla streptavidina seguita dall'iniezione endovenosa di almeno tre ratti CM cannulati (10 mg di streptavidina / kg).La riduzione di Aβ40 mediata dall'inibitore del peptide BACE1 è stata misurata mediante ELISA Aβ1-40 nel sangue (rosso) e nel liquido cerebrospinale (arancione) nei punti temporali indicati.Per maggiore chiarezza, sul grafico viene tracciata una linea tratteggiata con una scala del 100%.(c) Riduzione percentuale di Aβ40 nel sangue (triangoli rossi) e nel liquido cerebrospinale (triangoli arancioni) nei ratti trattati con streptavidina coniugata al peptide di transito n. 2077 e al peptide inibitorio BACE1 in un rapporto 3:1.( d ) Riduzione percentuale del sangue Aβ40 (cerchi rossi) e del liquido cerebrospinale (cerchi arancioni) di ratti trattati con streptavidina accoppiata solo a un peptide inibitorio BACE1.La concentrazione di Aβ nel controllo era di 420 pg/ml (deviazione standard = 101 pg/ml).
Il phage display è stato applicato con successo in diverse aree della ricerca biomedica17.Questo metodo è stato utilizzato per studi sulla diversità vascolare in vivo18,19 nonché per studi mirati ai vasi cerebrali20,21,22,23,24,25,26.In questo studio, abbiamo esteso l'applicazione di questo metodo di selezione non solo all'identificazione diretta di peptidi mirati ai vasi cerebrali, ma anche alla scoperta di candidati con proprietà di trasporto attivo per attraversare la barriera emato-encefalica.Descriviamo ora lo sviluppo di una procedura di selezione in vivo nei ratti CM intubati e dimostriamo il suo potenziale per identificare i peptidi con proprietà di homing CSF.Utilizzando il fago T7 che mostra una libreria di peptidi casuali di 12 mer, siamo stati in grado di dimostrare che il fago T7 è abbastanza piccolo (circa 60 nm di diametro)10 da adattarsi alla barriera emato-encefalica, attraversando così direttamente la barriera emato-encefalica o il plesso coroideo.Abbiamo osservato che la raccolta di CSF da ratti CM cannulati era un metodo di screening funzionale in vivo ben controllato e che il fago estratto non solo si legava al sistema vascolare ma fungeva anche da trasportatore attraverso la barriera emato-encefalica.Inoltre, raccogliendo simultaneamente sangue e applicando HTS a CSF ​​e fagi derivati ​​​​dal sangue, abbiamo confermato che la nostra scelta di CSF non è stata influenzata dall'arricchimento del sangue o dall'idoneità all'espansione tra i cicli di selezione.Tuttavia, il compartimento del sangue fa parte della procedura di selezione, poiché i fagi in grado di raggiungere il compartimento del CSF devono sopravvivere e circolare nel flusso sanguigno abbastanza a lungo da arricchirsi nel cervello.Per estrarre informazioni di sequenza affidabili dai dati HTS grezzi, abbiamo implementato filtri adattati agli errori di sequenziamento specifici della piattaforma nel flusso di lavoro dell'analisi.Incorporando i parametri cinetici nel metodo di screening, abbiamo confermato la rapida farmacocinetica dei fagi T7 wild-type (t½ ~ 28 min) nel sangue24, 27, 28 e determinato anche la loro emivita nel liquido cerebrospinale (t½ ~ 26 min) al minuto).Nonostante profili farmacocinetici simili nel sangue e nel liquido cerebrospinale, solo lo 0,001% della concentrazione ematica del fago potrebbe essere rilevato nel liquido cerebrospinale, indicando una bassa mobilità di fondo del fago T7 wild-type attraverso la barriera emato-encefalica.Questo lavoro evidenzia l'importanza del primo ciclo di selezione quando si utilizzano strategie di panning in vivo, in particolare per i sistemi fagici che vengono rapidamente eliminati dalla circolazione, poiché pochi cloni sono in grado di raggiungere il compartimento del SNC.Pertanto, nel primo round, la riduzione della diversità della libreria è stata molto ampia, poiché alla fine è stato raccolto solo un numero limitato di cloni in questo modello CSF ​​molto rigoroso.Questa strategia di panning in vivo includeva diverse fasi di selezione come l'accumulo attivo nel compartimento del CSF, la sopravvivenza del clone nel compartimento del sangue e la rapida rimozione dei cloni del fago T7 dal sangue entro i primi 10 minuti (Fig. 1d e Fig. 4M supplementare).).Pertanto, dopo il primo round, sono stati identificati diversi cloni fagici nel CSF, sebbene lo stesso pool iniziale sia stato utilizzato per i singoli animali.Ciò suggerisce che più passaggi di selezione rigorosa per le biblioteche di origine con un gran numero di membri della biblioteca si traducono in una significativa riduzione della diversità.Pertanto, gli eventi casuali diventeranno parte integrante del processo di selezione iniziale, influenzando notevolmente il risultato.È probabile che molti dei cloni nella libreria originale avessero una propensione all'arricchimento del CSF molto simile.Tuttavia, anche nelle stesse condizioni sperimentali, i risultati della selezione possono differire a causa del piccolo numero di ogni particolare clone nel pool iniziale.
I motivi arricchiti nel CSF differiscono da quelli nel sangue.È interessante notare che abbiamo notato il primo spostamento verso peptidi ricchi di glicina nel sangue dei singoli animali.(Fig. 1g, Figg. 4e, 4f supplementari).I fagi contenenti peptidi di glicina possono essere più stabili e hanno meno probabilità di essere eliminati dalla circolazione.Tuttavia, questi peptidi ricchi di glicina non sono stati rilevati nei campioni di liquido cerebrospinale, suggerendo che le librerie curate hanno attraversato due diverse fasi di selezione: una nel sangue e un'altra lasciata accumulare nel liquido cerebrospinale.I cloni arricchiti con CSF risultanti dal quarto ciclo di selezione sono stati ampiamente testati.È stato confermato che quasi tutti i cloni testati individualmente erano arricchiti in CSF rispetto al fago di controllo in bianco.Un colpo di peptide (n. 2077) è stato esaminato in modo più dettagliato.Ha mostrato un'emivita plasmatica più lunga rispetto ad altri colpi (Figura 3d e Figura supplementare 7) e, cosa interessante, questo peptide conteneva un residuo di cisteina al C-terminale.È stato recentemente dimostrato che l'aggiunta di cisteina ai peptidi può migliorare le loro proprietà farmacocinetiche legandosi all'albumina 29 .Questo è attualmente sconosciuto per il peptide #2077 e richiede ulteriori studi.Alcuni peptidi hanno mostrato una dipendenza dalla valenza nell'arricchimento del CSF (dati non mostrati), che potrebbe essere correlata alla geometria della superficie visualizzata del capside T7.Il sistema T7 che abbiamo utilizzato ha mostrato 5-15 copie di ciascun peptide per particella fagica.L'IHC è stato eseguito su cloni fagici di piombo candidati iniettati per via endovenosa nella corteccia cerebrale dei ratti (Figura 8 supplementare).I dati hanno mostrato che almeno tre cloni (n. 2002, n. 2009 e n. 2077) hanno interagito con il BBB.Resta da determinare se questa interazione BBB provochi l'accumulo di CSF o il movimento di questi cloni direttamente al BCSFB.È importante sottolineare che mostriamo che i peptidi selezionati mantengono la loro capacità di trasporto CSF ​​quando sintetizzati e legati al carico proteico.Il legame dei peptidi biotinilati N-terminali a SA ripete essenzialmente i risultati ottenuti con i rispettivi cloni fagici nel sangue e nel liquido cerebrospinale (Fig. 3e).Infine, mostriamo che il peptide di piombo n. 2077 è in grado di promuovere l'azione cerebrale di un inibitore del peptide biotinilato di BACE1 coniugato con SA, causando effetti farmacodinamici pronunciati nel SNC riducendo significativamente i livelli di Abeta40 nel CSF (Fig. 4).Non siamo stati in grado di identificare alcun omologo nel database eseguendo una ricerca di omologia della sequenza peptidica di tutti i risultati.È importante notare che la dimensione della libreria T7 è di circa 109, mentre la dimensione teorica della libreria per 12-mers è 4 x 1015. Pertanto, abbiamo selezionato solo una piccola frazione dello spazio di diversità della libreria di peptidi 12-mer, il che può significare che è possibile identificare più peptidi ottimizzati valutando lo spazio di sequenza adiacente di questi risultati identificati.Ipoteticamente, uno dei motivi per cui non abbiamo trovato alcun omologo naturale di questi peptidi potrebbe essere la deselezione durante l'evoluzione per impedire l'ingresso incontrollato di alcuni motivi peptidici nel cervello.
Presi insieme, i nostri risultati forniscono una base per il lavoro futuro per identificare e caratterizzare i sistemi di trasporto della barriera cerebrovascolare in vivo in modo più dettagliato.L'impostazione di base di questo metodo si basa su una strategia di selezione funzionale che non solo identifica i cloni con proprietà di legame vascolare cerebrale, ma include anche un passaggio critico in cui i cloni di successo hanno attività intrinseca per attraversare le barriere biologiche in vivo nel compartimento CNS.è quello di chiarire il meccanismo di trasporto di questi peptidi e la loro preferenza per il legame alla microvascolarizzazione specifica della regione del cervello.Ciò potrebbe portare alla scoperta di nuovi percorsi per il trasporto del BBB e dei recettori.Ci aspettiamo che i peptidi identificati possano legarsi direttamente ai recettori cerebrovascolari oa ligandi circolanti trasportati attraverso la BBB o la BCSFB.I vettori peptidici con attività di trasporto CSF ​​scoperti in questo lavoro saranno ulteriormente studiati.Attualmente stiamo studiando la specificità cerebrale di questi peptidi per la loro capacità di attraversare la BBB e/o la BCSFB.Questi nuovi peptidi saranno strumenti estremamente preziosi per la potenziale scoperta di nuovi recettori o percorsi e per lo sviluppo di nuove piattaforme altamente efficienti per la consegna di macromolecole, come i biologici, al cervello.
Incannulare la grande cisterna (CM) utilizzando una modifica del metodo precedentemente descritto.Ratti Wistar anestetizzati (200-350 g) sono stati montati su un apparato stereotassico ed è stata praticata un'incisione mediana sul cuoio capelluto rasato e preparato asetticamente per esporre il cranio.Praticare due fori nella zona dell'anta superiore e fissare le viti di fissaggio nei fori.Un ulteriore foro è stato praticato nella cresta occipitale laterale per la guida stereotassica di una cannula in acciaio inossidabile nel CM.Applicare il cemento dentale intorno alla cannula e fissare con le viti.Dopo la fotopolimerizzazione e l'indurimento del cemento, la ferita cutanea è stata chiusa con sutura supramid 4/0.Il corretto posizionamento della cannula è confermato dalla perdita spontanea di liquido cerebrospinale (CSF).Rimuovere il ratto dall'apparato stereotassico, ricevere cure postoperatorie adeguate e gestione del dolore e consentirgli di riprendersi per almeno una settimana fino a quando non si osservano segni di sangue nel liquido cerebrospinale.Ratti Wistar (Crl:WI/Han) sono stati ottenuti da Charles River (Francia).Tutti i ratti sono stati tenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Ufficio veterinario della città di Basilea, in Svizzera, e sono stati eseguiti in conformità con la licenza animale n. 2474 (valutazione del trasporto cerebrale attivo misurando i livelli di candidati terapeutici nel liquido cerebrospinale e nel cervello di ratto).
Tenere delicatamente il topo cosciente con la cannula CM in mano.Rimuovere Datura dalla cannula e raccogliere 10 ml di liquido cerebrospinale che scorre spontaneamente.Poiché la pervietà della cannula è stata infine compromessa, in questo studio sono stati inclusi solo campioni chiari di liquido cerebrospinale senza evidenza di contaminazione del sangue o scolorimento.In parallelo, circa 10-20 μl di sangue sono stati prelevati da una piccola incisione sulla punta della coda in provette con eparina (Sigma-Aldrich).CSF e sangue sono stati raccolti in vari momenti dopo l'iniezione endovenosa del fago T7.Prima della raccolta di ciascun campione di CSF sono stati scartati circa 5-10 μl di liquido, che corrisponde al volume morto del catetere.
Le librerie sono state generate utilizzando il vettore T7Select 10-3b come descritto nel manuale del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).In breve, un inserto casuale di DNA di 12 mer è stato sintetizzato nel seguente formato:
Il codone NNK è stato utilizzato per evitare i doppi codoni di stop e la sovraespressione dell'amminoacido nell'inserto.N è un rapporto equimolare miscelato manualmente di ciascun nucleotide e K è un rapporto equimolare miscelato manualmente di nucleotidi di adenina e citosina.Le regioni a filamento singolo sono state convertite in DNA a doppio filamento mediante ulteriore incubazione con dNTP (Novagen) ed enzima Klenow (New England Biolabs) in tampone Klenow (New England Biolabs) per 3 ore a 37°C.Dopo la reazione, il DNA a doppio filamento è stato recuperato mediante precipitazione con EtOH.Il DNA risultante è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindIII (entrambi di Roche).L'inserto clivato e purificato (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) è stato quindi ligato in-frame in un vettore T7 pre-clivato dopo l'amminoacido 348 del gene del capside 10B.Le reazioni di ligazione sono state incubate a 16°C per 18 ore prima del confezionamento in vitro.Il confezionamento dei fagi in vitro è stato eseguito secondo le istruzioni fornite con il kit di clonazione T7Select 10-3b (Novagen) e la soluzione di confezionamento è stata amplificata una volta alla lisi utilizzando Escherichia coli (BLT5615, Novagen).I lisati sono stati centrifugati, titolati e congelati a -80°C come soluzione madre di glicerolo.
Amplificazione PCR diretta di regioni variabili fagiche amplificate in brodo o piastra utilizzando primer di fusione proprietari 454/Roche-amplicon.Il primer di fusione diretta contiene sequenze che fiancheggiano la regione variabile (NNK) 12 (specifica del modello), GS FLX Titanium Adapter A e una sequenza di chiavi della libreria a quattro basi (TCAG) (Figura 1a supplementare):
Il primer per fusione inversa contiene anche biotina attaccata alle microsfere di cattura e l'adattatore B in titanio GS FLX necessario per l'amplificazione clonale durante la PCR in emulsione:
Gli ampliconi sono stati quindi sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche secondo il protocollo 454 GS-FLX Titanium.Per il sequenziamento manuale Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), il DNA fagico T7 è stato amplificato mediante PCR e sequenziato con le seguenti coppie di primer:
Gli inserti delle singole placche sono stati sottoposti ad amplificazione PCR utilizzando il kit Roche Fast Start DNA Polymerase (secondo le istruzioni del produttore).Eseguire un avvio a caldo (10 min a 95 gradi centigradi) e 35 cicli di boost (50 s a 95 gradi centigradi, 1 min a 50 gradi centigradi e 1 min a 72 gradi centigradi).
Il fago delle librerie, il fago wild-type, il fago recuperato dal CSF e dal sangue o i singoli cloni sono stati amplificati in Escherichia coli BL5615 in brodo TB (Sigma Aldrich) o in piastre da 500 cm2 (Thermo Scientific) per 4 ore a 37°C.I fagi sono stati estratti dalle piastre sciacquando le piastre con tampone Tris-EDTA (Fluka Analytical) o raccogliendo le placche con punte di pipette sterili.I fagi sono stati isolati dal surnatante di coltura o dal tampone di estrazione con un ciclo di precipitazione di polietilenglicole (PEG 8000) (Promega) e risospesi in tampone Tris-EDTA.
Il fago amplificato è stato sottoposto a 2-3 cicli di rimozione dell'endotossina utilizzando sfere di rimozione dell'endotossina (Miltenyi Biotec) prima dell'iniezione endovenosa (IV) (500 μl/animale).Nel primo round sono stati introdotti fagi 2 × 1012;nel secondo, 2×1010 fagi;nel terzo e quarto turno di selezione, 2×109 fagi per animale.Il contenuto di fagi nel liquido cerebrospinale e nei campioni di sangue raccolti nei punti temporali indicati è stato determinato mediante conteggio della placca secondo le istruzioni del produttore (manuale del sistema T7Select).La selezione dei fagi è stata eseguita mediante iniezione endovenosa di librerie purificate nella vena della coda o mediante reiniezione di fagi estratti dal CSF dal precedente round di selezione, e le successive raccolte sono state eseguite a 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min rispettivamente CSF e campioni di sangue.Sono stati condotti un totale di quattro cicli di panning in vivo in cui i due rami selezionati sono stati immagazzinati e analizzati separatamente durante i primi tre cicli di selezione.Tutti gli inserti fagici estratti da CSF dai primi due cicli di selezione sono stati sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche, mentre tutti i cloni estratti da CSF dagli ultimi due cicli di selezione sono stati sequenziati manualmente.Anche tutti i fagi del sangue del primo ciclo di selezione sono stati sottoposti a pyrosequencing 454/Roche.Per l'iniezione di cloni fagici, fagi selezionati sono stati amplificati in E. coli (BL5615) su piastre da 500 cm2 a 37°C per 4 ore.I cloni selezionati individualmente e sequenziati manualmente sono stati propagati nel mezzo TB.Dopo l'estrazione dei fagi, la purificazione e la rimozione dell'endotossina (come descritto sopra), 2 × 1010 fagi / animale in 300 μl sono stati iniettati per via endovenosa in una vena della coda.
Preelaborazione e filtraggio qualitativo dei dati di sequenza.I dati grezzi 454/Roche sono stati convertiti da un formato di mappa di flusso standard binario (sff) a un formato leggibile dall'uomo Pearson (fasta) utilizzando il software del fornitore.L'ulteriore elaborazione della sequenza nucleotidica è stata eseguita utilizzando programmi e script C proprietari (pacchetto software non rilasciato) come descritto di seguito.L'analisi dei dati primari include rigorose procedure di filtraggio in più fasi.Per filtrare le letture che non contenevano una sequenza di DNA dell'inserto 12mer valida, le letture sono state allineate in sequenza per avviare l'etichetta (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'etichetta di arresto (TAAGCTTGCGGCCGCGCACTCGAGTA) e l'inserto di sfondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizzando il test globale di Needleman-Wunsch.allineamento che consente fino a 2 incoerenze per allineamento31.Pertanto, le letture senza tag di inizio e fine e le letture contenenti inserti in background, ovvero allineamenti che superano il numero consentito di mancate corrispondenze, sono state rimosse dalla libreria.Per quanto riguarda le restanti letture, la sequenza di DNA N-mer che si estende dal segno di inizio e termina prima del segno di arresto è stata asportata dalla sequenza di lettura originale e ulteriormente elaborata (di seguito denominata "inserto").Dopo la traslazione dell'inserto, la porzione dopo il primo codone di stop all'estremità 5' del primer viene rimossa dall'inserto.Inoltre, sono stati rimossi anche i nucleotidi che portavano a codoni incompleti all'estremità 3' del primer.Per escludere gli inserti contenenti solo sequenze di sfondo, sono stati rimossi anche gli inserti tradotti che iniziano con il modello di amminoacidi "PAG".I peptidi con una lunghezza post-traduzionale inferiore a 3 amminoacidi sono stati rimossi dalla libreria.Infine, rimuovere la ridondanza nel pool di inserti e determinare la frequenza di ciascun inserto univoco.I risultati di questa analisi includevano un elenco di sequenze nucleotidiche (inserti) e le loro frequenze (di lettura) (Figure supplementari 1c e 2).
Raggruppa gli inserti di DNA N-mer per somiglianza di sequenza: per eliminare gli errori di sequenziamento specifici di 454/Roche (come i problemi con le estensioni di omopolimero di sequenziamento) e rimuovere le ridondanze meno importanti, gli inserti di sequenza di DNA N-mer precedentemente filtrati (inserti) vengono ordinati per somiglianza.inserimenti (fino a 2 basi non corrispondenti consentite) utilizzando un algoritmo iterativo definito come segue: gli inserimenti vengono ordinati prima in base alla loro frequenza (dal più alto al più basso) e, se sono uguali, in base al loro ordinamento secondario per lunghezza (dal più lungo al più breve)).Così, gli inserimenti più frequenti e più lunghi definiscono il primo “gruppo”.La frequenza di gruppo è impostata sulla frequenza chiave.Quindi, ogni inserimento rimanente nell'elenco ordinato è stato provato ad essere aggiunto al gruppo mediante l'allineamento a coppie di Needleman-Wunsch.Se il numero di mancate corrispondenze, inserimenti o eliminazioni in un allineamento non supera la soglia di 2, viene aggiunto un inserimento al gruppo e la frequenza complessiva del gruppo viene aumentata in base alla frequenza con cui è stato aggiunto l'inserimento.Gli inserti aggiunti a un gruppo vengono contrassegnati come utilizzati ed esclusi da ulteriori elaborazioni.Se la sequenza di inserimento non può essere aggiunta a un gruppo già esistente, la sequenza di inserimento viene utilizzata per creare un nuovo gruppo con la frequenza di inserimento appropriata e contrassegnata come utilizzata.L'iterazione termina quando ogni sequenza di inserimento è stata utilizzata per formare un nuovo gruppo o può essere inclusa in un gruppo già esistente.Dopotutto, gli inserti raggruppati costituiti da nucleotidi vengono infine tradotti in sequenze peptidiche (librerie di peptidi).Il risultato di questa analisi è un insieme di inserzioni e le loro frequenze corrispondenti che costituiscono il numero di letture consecutive (Figura 2 supplementare).
Generazione del motivo: sulla base di un elenco di peptidi unici, è stata creata una libreria contenente tutti i possibili modelli di aminoacidi (aa) come mostrato di seguito.Ogni possibile modello di lunghezza 3 è stato estratto dal peptide e il suo modello inverso è stato aggiunto insieme a una libreria di motivi comune contenente tutti i modelli (tripeptidi).Le librerie di motivi altamente ripetitivi sono state messe in sequenza e la ridondanza è stata rimossa.Quindi, per ogni tripeptide nella libreria dei motivi, ne abbiamo verificato la presenza nella libreria utilizzando strumenti computazionali.In questo caso, la frequenza del peptide contenente il motivo tripeptide trovato viene aggiunta e assegnata al motivo nella libreria dei motivi ("numero di motivi").Il risultato della generazione del motivo è un array bidimensionale contenente tutte le occorrenze di tripeptidi (motivi) e i rispettivi valori, che sono il numero di letture di sequenziamento che risultano nel motivo corrispondente quando le letture vengono filtrate, raggruppate e tradotte.Metriche come descritto in dettaglio sopra.
Normalizzazione del numero di motivi e grafici a dispersione corrispondenti: il numero di motivi per ciascun campione è stato normalizzato utilizzando
dove ni è il numero di letture contenenti l'argomento i.Pertanto, vi rappresenta la frequenza percentuale di letture (o peptidi) contenenti il ​​motivo i nel campione.I valori P per il numero non normalizzato di motivi sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher.Per quanto riguarda i correlogrammi del numero di motivi, le correlazioni di Spearman sono state calcolate utilizzando il numero normalizzato di motivi con R.
Per visualizzare il contenuto di amminoacidi in ogni posizione nella libreria di peptidi, sono stati creati i logogrammi web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Innanzitutto, il contenuto di amminoacidi in ciascuna posizione del peptide 12-mer viene memorizzato in una matrice 20×12.Quindi, un insieme di 1000 peptidi contenenti lo stesso contenuto relativo di amminoacidi in ciascuna posizione viene generato in formato di sequenza fasta e fornito come input al logo web 3, che genera una rappresentazione grafica del contenuto relativo di amminoacidi in ciascuna posizione.per una data libreria di peptidi.Per visualizzare set di dati multidimensionali, sono state create mappe di calore utilizzando uno strumento sviluppato internamente in R (biosHeatmap, un pacchetto R ancora da rilasciare).I dendrogrammi presentati nelle mappe di calore sono stati calcolati utilizzando il metodo di raggruppamento gerarchico di Ward con la metrica della distanza euclidea.Per l'analisi statistica dei dati sul punteggio del motivo, i valori P per il punteggio non normalizzato sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher.I valori P per altri set di dati sono stati calcolati in R utilizzando il test t di Student o ANOVA.
Cloni fagici selezionati e fagi senza inserti sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda (2 × 1010 fagi / animale in 300 μl di PBS).Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, agli stessi animali sono stati iniettati per via endovenosa 100 μl di lectina marcata con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuti dopo l'iniezione fagica, i ratti sono stati perfusi attraverso il cuore con 50 ml di PBS seguiti da 50 ml di PFA/PBS al 4%.I campioni di cervello sono stati inoltre fissati durante la notte in PFA/PBS al 4% e immersi in saccarosio al 30% durante la notte a 4°C.I campioni vengono congelati istantaneamente nella miscela OCT.L'analisi immunoistochimica dei campioni congelati è stata eseguita a temperatura ambiente su criosezioni da 30 µm bloccate con 1% di BSA e incubate con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C.Incubare durante la notte.Infine, le sezioni sono state lavate 3 volte con PBS ed esaminate con un microscopio laser confocale (Leica TCS SP5).
Tutti i peptidi con una purezza minima del 98% sono stati sintetizzati da GenScript USA, biotinilati e liofilizzati.La biotina è legata tramite un ulteriore spaziatore a tripla glicina all'N-terminale.Controllare tutti i peptidi utilizzando la spettrometria di massa.
La streptavidina (Sigma S0677) è stata miscelata con un eccesso equimolare di 5 volte di peptide biotinilato, peptide inibitorio BACE1 biotinilato o una combinazione (rapporto 3:1) di peptide inibitorio BACE1 biotinilato e peptide inibitorio BACE1 in 5-10% DMSO/incubato in PBS.1 ora a temperatura ambiente prima dell'iniezione.I peptidi coniugati con streptavidina sono stati iniettati per via endovenosa alla dose di 10 mg/kg in una delle vene della coda di ratti con cavità cerebrale.
La concentrazione dei complessi streptavidina-peptide è stata valutata mediante ELISA.Le micropiastre Nunc Maxisorp (Sigma) sono state rivestite durante la notte a 4°C con 1,5 μg/ml di anticorpo murino anti-streptavidina (Thermo, MA1-20011).Dopo il blocco (tampone bloccante: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) a temperatura ambiente per 2 ore, lavare la piastra con 0,05% Tween-20/PBS (tampone di lavaggio) per 3 secondi, CSF e campioni di plasma sono stati aggiunti ai pozzetti diluiti con tampone bloccante (plasma 1:10.000, CSF 1:11 5).La piastra è stata quindi incubata per una notte a 4°C con anticorpo di rilevamento (1 μg/ml, anti-streptavidina-HRP, Novus NB120-7239).Dopo tre fasi di lavaggio, la streptavidina è stata rilevata mediante incubazione nella soluzione di substrato TMB (Roche) per un massimo di 20 minuti.Dopo aver fermato lo sviluppo del colore con H2SO4 1M, misurare l'assorbanza a 450 nm.
La funzione del complesso inibitore streptavidina-peptide-BACE1 è stata valutata mediante Aβ(1-40) ELISA secondo il protocollo del produttore (Wako, 294-64701).In breve, i campioni di CSF sono stati diluiti in diluente standard (1:23) e incubati durante la notte a 4°C in piastre da 96 pozzetti rivestite con anticorpo di cattura BNT77.Dopo cinque passaggi di lavaggio, l'anticorpo BA27 coniugato con HRP è stato aggiunto e incubato per 2 ore a 4°C, seguito da cinque passaggi di lavaggio.Aβ(1–40) è stato rilevato mediante incubazione in soluzione TMB per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo che lo sviluppo del colore è stato interrotto con la soluzione di arresto, misurare l'assorbanza a 450 nm.I campioni di plasma sono stati sottoposti a estrazione in fase solida prima dell'ELISA Aβ(1–40).Il plasma è stato aggiunto allo 0,2% di DEA (Sigma) in piastre da 96 pozzetti e incubato a temperatura ambiente per 30 minuti.Dopo aver lavato successivamente le piastre SPE (Oasis, 186000679) con acqua e metanolo al 100%, i campioni di plasma sono stati aggiunti alle piastre SPE e tutto il liquido è stato rimosso.I campioni sono stati lavati (prima con 5% metanolo poi 30% metanolo) ed eluiti con 2% NH4OH/90% metanolo.Dopo aver essiccato l'eluato a 55°C per 99 min a corrente N2 costante, i campioni sono stati ridotti in diluenti standard e Aβ(1–40) è stato misurato come descritto sopra.
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