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La barriera emato-encefalica e la barriera emato-encefalica impediscono agli agenti bioterapeutici di raggiungere i loro bersagli nel sistema nervoso centrale, ostacolando così l'efficacia del trattamento delle malattie neurologiche. Per scoprire nuovi trasportatori cerebrali in vivo, abbiamo introdotto una libreria di peptidi fagici T7 e raccolto in serie sangue e liquido cerebrospinale (CSF) utilizzando un modello di ratti coscienti cannulati. Specifici cloni fagici sono risultati altamente arricchiti nel CSF dopo quattro cicli di selezione. I test sui singoli peptidi candidati hanno rivelato un arricchimento nel CSF di oltre 1000 volte. La bioattività del rilascio mediato dal peptide al cervello è stata confermata da una riduzione del 40% del livello di beta-amiloide nel liquido cerebrospinale utilizzando un inibitore del peptide BACE1 legato al nuovo peptide di transito identificato. Questi risultati suggeriscono che i peptidi identificati mediante metodi di selezione fagica in vivo possano essere utili veicoli per il rilascio sistemico di macromolecole al cervello con effetto terapeutico.
La ricerca sulle terapie mirate al sistema nervoso centrale (SNC) si è concentrata principalmente sull'identificazione di farmaci e agenti ottimizzati che mostrino proprietà mirate al SNC, con minore impegno nella scoperta dei meccanismi che guidano il rilascio attivo dei farmaci al cervello. Questa situazione sta iniziando a cambiare ora, poiché il rilascio dei farmaci, in particolare di molecole di grandi dimensioni, è parte integrante dello sviluppo di farmaci in neuroscienze moderne. L'ambiente del sistema nervoso centrale è ben protetto dal sistema di barriera cerebrovascolare, costituito dalla barriera emato-encefalica (BEE) e dalla barriera emato-encefalica (BCBB)1, rendendo difficile il rilascio dei farmaci al cervello1,2. Si stima che quasi tutti i farmaci a grandi molecole e oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole vengano eliminati dal cervello3. Ecco perché è molto importante identificare nuovi sistemi di trasporto cerebrale che forniscano un rilascio efficiente e specifico dei farmaci terapeutici al SNC4,5. Tuttavia, la BEE e la BCSFB rappresentano anche un'eccellente opportunità per il rilascio dei farmaci, poiché penetrano ed entrano in tutte le strutture cerebrali attraverso la sua estesa vascolarizzazione. Pertanto, gli attuali sforzi per utilizzare metodi non invasivi di somministrazione al cervello si basano in gran parte sul meccanismo del trasporto mediato da recettori (PMT) che utilizza il recettore endogeno BBB6. Nonostante i recenti progressi chiave nell'utilizzo della via del recettore della transferrina7,8, è necessario un ulteriore sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione con proprietà migliorate. A tal fine, il nostro obiettivo era identificare peptidi in grado di mediare il trasporto del liquido cerebrospinale (CSF), poiché potrebbero in linea di principio essere utilizzati per veicolare macromolecole al SNC o per aprire nuove vie recettoriali. In particolare, specifici recettori e trasportatori del sistema cerebrovascolare (BBB e BSCFB) possono fungere da potenziali bersagli per la somministrazione attiva e specifica di farmaci bioterapici. Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prodotto di secrezione del plesso coroideo (SC) ed è a diretto contatto con il liquido interstiziale del cervello attraverso lo spazio subaracnoideo e lo spazio ventricolare4. Recentemente è stato dimostrato che il liquido cerebrospinale subaracnoideo diffonde eccessivamente nell'interstizio cerebrale9. Speriamo di accedere allo spazio parenchimale utilizzando questo tratto di afflusso subaracnoideo o direttamente attraverso la barriera ematoencefalica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo implementato una solida strategia di selezione fagica in vivo che idealmente identifica i peptidi trasportati da una di queste due vie distinte.
Descriviamo ora un metodo di screening sequenziale in vivo mediante phage display con campionamento del liquido cerebrospinale (CSF) associato a sequenziamento ad alto rendimento (HTS) per monitorare i cicli di selezione iniziali con la massima diversità di librerie. Lo screening è stato eseguito su ratti coscienti con una cannula per cisterna (CM) di grandi dimensioni impiantata in modo permanente per evitare la contaminazione ematica. È importante sottolineare che questo approccio seleziona sia peptidi con targeting cerebrale sia peptidi con attività di trasporto attraverso la barriera cerebrovascolare. Abbiamo utilizzato i fagi T7 per le loro piccole dimensioni (~60 nm)10 e abbiamo suggerito che siano adatti al trasporto di vescicole che consentono l'attraversamento transcellulare della barriera endoteliale e/o epiteliale-midollare. Dopo quattro cicli di panning, le popolazioni fagiche sono state isolate mostrando un forte arricchimento del liquido cerebrospinale in vivo e un'associazione con i microvasi cerebrali. È importante sottolineare che siamo stati in grado di confermare i nostri risultati dimostrando che i peptidi candidati preferiti e quelli meglio sintetizzati chimicamente sono in grado di trasportare il carico proteico nel liquido cerebrospinale. In primo luogo, gli effetti farmacodinamici sul sistema nervoso centrale sono stati stabiliti combinando un peptide di transito primario con un inibitore del peptide BACE1. Oltre a dimostrare che le strategie di screening funzionale in vivo possono identificare nuovi peptidi di trasporto cerebrale come efficaci trasportatori di proteine, ci aspettiamo che approcci di selezione funzionale simili diventino importanti anche nell'identificazione di nuove vie di trasporto cerebrale.
Sulla base delle unità formanti placca (PFU), dopo la fase di confezionamento del fago, è stata progettata e creata una libreria di peptidi fagici lineari T7 casuali a 12 meri con una diversità di circa 109 (vedere Materiali e Metodi). È importante notare che abbiamo analizzato attentamente questa libreria prima del panning in vivo. L'amplificazione PCR dei campioni della libreria fagica utilizzando primer modificati ha generato ampliconi direttamente applicabili a HTS (Figura 1a supplementare). A causa di a) errori di sequenziamento di HTS11, b) impatto sulla qualità dei primer (NNK)1-12 e c) presenza di fagi wild-type (wt) (inserti scheletrici) nella libreria standby, è stata implementata una procedura di filtraggio delle sequenze per estrarre solo le informazioni di sequenza verificate (Figura 1b supplementare). Queste fasi di filtraggio si applicano a tutte le librerie di sequenziamento HTS. Per la libreria standard, sono state ottenute un totale di 233.868 letture, di cui il 39% ha superato i criteri di filtro ed è stato utilizzato per l'analisi della libreria e la selezione per i round successivi (Figure supplementari 1c–e). Le letture erano prevalentemente di lunghezza multipla di 3 coppie di basi con un picco a 36 nucleotidi (Figura supplementare 1c), confermando il design della libreria (NNK) 1-12. In particolare, circa l'11% dei membri della libreria conteneva un inserto PAGISRELVDKL wild-type (wt) a 12 dimensioni e quasi la metà delle sequenze (49%) conteneva inserzioni o delezioni. L'HTS della libreria ha confermato l'elevata diversità dei peptidi nella libreria: oltre l'81% delle sequenze peptidiche è stato trovato una sola volta e solo l'1,5% si è verificato in ≥4 copie (Figura supplementare 2a). Le frequenze degli amminoacidi (aa) in tutte le 12 posizioni del repertorio erano ben correlate con le frequenze attese per il numero di codoni generati dal repertorio NKK degenerato (Fig. 2b supplementare). La frequenza osservata dei residui aa codificati da questi inserti era ben correlata con la frequenza calcolata (r = 0,893) (Fig. 2c supplementare). La preparazione delle librerie fagiche per l'iniezione include le fasi di amplificazione e rimozione dell'endotossina. È stato precedentemente dimostrato che questo riduce potenzialmente la diversità delle librerie fagiche12,13. Pertanto, abbiamo sequenziato una libreria fagica amplificata su piastra che era stata sottoposta a rimozione dell'endotossina e l'abbiamo confrontata con la libreria originale per stimare la frequenza di AA. È stata osservata una forte correlazione (r = 0,995) tra il pool originale e il pool amplificato e purificato (Fig. 2d supplementare), indicando che la competizione tra cloni amplificati su piastra utilizzando il fago T7 non ha causato bias significativi. Questo confronto si basa sulla frequenza dei motivi tripeptidici in ciascuna libreria, poiché la diversità delle librerie (~109) non può essere completamente catturata nemmeno con HTS. L'analisi della frequenza degli aa in ciascuna posizione ha rivelato un piccolo bias dipendente dalla posizione nelle ultime tre posizioni del repertorio inserito (Fig. 2e supplementare). In conclusione, abbiamo concluso che la qualità e la diversità della libreria erano accettabili e sono state osservate solo lievi variazioni nella diversità dovute all'amplificazione e alla preparazione delle librerie fagiche tra diversi cicli di selezione.
Il campionamento seriale del liquido cerebrospinale può essere eseguito impiantando chirurgicamente una cannula nel canale cerebrospinale (CM) di ratti coscienti per facilitare l'identificazione del fago T7 iniettato per via endovenosa (iv) tramite la barriera ematoencefalica (BEE) e/o il BCSFB (Fig. 1a-b). Abbiamo utilizzato due bracci di selezione indipendenti (bracci A e B) nei primi tre cicli di selezione in vivo (Fig. 1c). Abbiamo gradualmente aumentato la severità della selezione diminuendo la quantità totale di fago introdotto nei primi tre cicli di selezione. Per il quarto ciclo di panning, abbiamo combinato campioni provenienti dai rami A e B ed eseguito tre ulteriori selezioni indipendenti. Per studiare le proprietà in vivo delle particelle di fago T7 in questo modello, il fago wild-type (inserto master PAGISRELVDKL) è stato iniettato nei ratti attraverso la vena caudale. Il recupero dei fagi dal liquido cerebrospinale e dal sangue a diversi tempi ha mostrato che i fagi icosaedrici T7, relativamente piccoli, presentavano una rapida fase di clearance iniziale dal compartimento ematico (Figura 3 supplementare). Sulla base dei titoli somministrati e del volume ematico dei ratti, abbiamo calcolato che solo circa l'1% in peso del fago della dose somministrata è stato rilevato nel sangue 10 minuti dopo l'iniezione endovenosa. Dopo questo rapido declino iniziale, è stata misurata una clearance primaria più lenta, con un'emivita di 27,7 minuti. È importante sottolineare che solo pochissimi fagi sono stati recuperati dal compartimento del liquido cerebrospinale, il che indica un basso background per la migrazione dei fagi wild-type nel compartimento del liquido cerebrospinale (Figura 3 supplementare). In media, solo circa 1 x 10-3% di titoli di fagi T7 nel sangue e 4 x 10-8% dei fagi inizialmente infusi sono stati rilevati nel liquido cerebrospinale durante l'intero periodo di campionamento (0-250 min). In particolare, l'emivita (25,7 min) del fago selvatico nel liquido cerebrospinale era simile a quella osservata nel sangue. Questi dati dimostrano che la barriera che separa il compartimento del liquido cerebrospinale dal sangue è intatta nei ratti incannulati con cellule staminali mesenchimali (CM), consentendo la selezione in vivo di librerie fagiche per identificare cloni che vengono facilmente trasportati dal sangue al compartimento del liquido cerebrospinale.
(a) Impostazione di un metodo per il ricampionamento del liquido cerebrospinale (CSF) da un pool di grandi dimensioni. (b) Diagramma che mostra la posizione cellulare della barriera del sistema nervoso centrale (SNC) e la strategia di selezione utilizzata per identificare i peptidi che attraversano la barriera emato-encefalica (BBB) ​​e la barriera emato-encefalica. (c) Diagramma di flusso dello screening del phage display in vivo. In ogni ciclo di selezione, i fagi (identificatori animali all'interno delle frecce) sono stati iniettati per via endovenosa. Due rami alternativi indipendenti (A, B) sono stati mantenuti separati fino al quarto ciclo di selezione. Per i cicli di selezione 3 e 4, ciascun clone fagico estratto dal CSF è stato sequenziato manualmente. (d) Cinetica del fago isolato dal sangue (cerchi rossi) e dal liquido cerebrospinale (triangoli verdi) durante il primo ciclo di selezione in due ratti cannulati dopo iniezione endovenosa della libreria peptidica T7 (2 x 1012 fagi/animale). I quadrati blu indicano la concentrazione iniziale media del fago nel sangue, calcolata dalla quantità di fago iniettato, tenendo conto del volume ematico totale. I quadrati neri indicano il punto di intersezione della linea y estrapolata dalle concentrazioni di fago nel sangue. (e,f) Presentare la frequenza relativa e la distribuzione di tutti i possibili motivi tripeptidici sovrapposti presenti nel peptide. È mostrato il numero di motivi riscontrati in 1000 letture. I motivi significativamente arricchiti (p < 0,001) sono contrassegnati con punti rossi. (e) Diagramma di dispersione di correlazione che confronta la frequenza relativa del motivo tripeptidico della libreria iniettata con il fago derivato dal sangue degli animali #1.1 e #1.2. (f) Diagramma di dispersione di correlazione che confronta le frequenze relative dei motivi tripeptidici #1.1 e #1.2 del fago animale isolati nel sangue e nel liquido cerebrospinale. (g, h) Rappresentazione dell'ID di sequenza del fago arricchito nel sangue (g) rispetto alle librerie iniettate e del fago arricchito nel liquido cerebrospinale (h) rispetto al sangue dopo un ciclo di selezione in vivo in entrambi gli animali. La dimensione del codice di una lettera indica la frequenza con cui l'amminoacido si trova in quella posizione. Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici. Le Figure 1a e b sono state progettate e prodotte da Eduard Urich.
Abbiamo iniettato una libreria di peptidi fagici in due ratti CM instrument (cladi A e B) e isolato il fago dal liquido cerebrospinale e dal sangue (Figura 1d). La rapida clearance iniziale della libreria è stata meno pronunciata rispetto al fago wild-type. L'emivita media della libreria iniettata in entrambi gli animali è stata di 24,8 minuti nel sangue, simile al fago wild-type, e di 38,5 minuti nel liquido cerebrospinale. Campioni di fagi di sangue e liquido cerebrospinale di ciascun animale sono stati sottoposti a HTS e tutti i peptidi identificati sono stati analizzati per la presenza di un breve motivo tripeptidico. I motivi tripeptidici sono stati scelti perché forniscono una base minima per la formazione della struttura e le interazioni peptide-proteina14,15. Abbiamo trovato una buona correlazione nella distribuzione dei motivi tra la libreria di fagi iniettata e i cloni estratti dal sangue di entrambi gli animali (Fig. 1e). I dati indicano che la composizione della libreria è solo marginalmente arricchita nel compartimento ematico. Le frequenze degli amminoacidi e le sequenze consenso sono state ulteriormente analizzate in ciascuna posizione utilizzando un adattamento del software Weblogo16. È interessante notare che abbiamo riscontrato un forte arricchimento nei residui di glicina nel sangue (Fig. 1g). Confrontando il sangue con i cloni selezionati dal liquido cerebrospinale (CSF), è stata osservata una forte selezione e una certa deselezione dei motivi (Fig. 1f), e alcuni amminoacidi erano preferenzialmente presenti in posizioni predeterminate nella sequenza a 12 elementi (Fig. 1h). In particolare, i singoli animali presentavano differenze significative nel liquido cerebrospinale, mentre l'arricchimento di glicina nel sangue è stato osservato in entrambi gli animali (Figure 4a–j supplementari). Dopo un filtraggio rigoroso dei dati di sequenza nel liquido cerebrospinale degli animali #1.1 e #1.2, sono stati ottenuti un totale di 964 e 420 peptidi 12-mer unici (Figure 1d–e supplementari). I cloni fagici isolati sono stati amplificati e sottoposti a un secondo ciclo di selezione in vivo. Il fago estratto dal secondo ciclo di selezione è stato sottoposto a HTS in ciascun animale e tutti i peptidi identificati sono stati utilizzati come input per un programma di riconoscimento dei motivi per analizzare la presenza di motivi tripeptidici (Fig. 2a, b, ef). Rispetto al primo ciclo del fago recuperato dal CSF, abbiamo osservato un'ulteriore selezione e deselezione di molti motivi nel CSF nei rami A e B (Fig. 2). È stato applicato un algoritmo di identificazione di rete per determinare se rappresentassero diversi modelli di sequenza coerente. È stata osservata una chiara similarità tra le sequenze a 12 dimensioni recuperate dal CSF nel clade alternativo A (Fig. 2c, d) e nel clade B (Fig. 2g, h). L'analisi aggregata in ciascun ramo ha rivelato diversi profili di selezione per i peptidi 12-mer (Fig. 5c, d supplementari) e un aumento del rapporto del titolo CSF/sangue nel tempo per i cloni aggregati dopo il secondo ciclo di selezione rispetto al primo ciclo di selezione (Fig. 5e supplementare).
Arricchimento di motivi e peptidi nel liquido cerebrospinale mediante due cicli successivi di selezione mediante fago display funzionale in vivo.
Tutti i fagi del liquido cerebrospinale recuperati dal primo ciclo di ciascun animale (animali #1.1 e #1.2) sono stati raggruppati, amplificati, sequenziati con HT e reiniettati insieme (2 x 1010 fagi/animale) 2 ratti cannulati SM (#1.1 → #). 2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4). (a, b, e, f) Diagrammi di dispersione di correlazione che confrontano la frequenza relativa dei motivi tripeptidici di tutti i fagi derivati ​​dal liquido cerebrospinale nel primo e nel secondo ciclo di selezione. Frequenza relativa e distribuzione dei motivi che rappresentano tutti i possibili tripeptidi sovrapposti trovati nei peptidi in entrambi gli orientamenti. È mostrato il numero di motivi trovati in 1000 letture. I motivi che sono stati significativamente (p < 0,001) selezionati o esclusi in una delle librerie confrontate sono evidenziati con punti rossi. (c, d, g, h) Rappresentazione grafica del logo di sequenza di tutte le sequenze lunghe di 12 amminoacidi ricche di LCS, basate sui cicli 2 e 1 di selezione in vivo. La dimensione del codice di una lettera indica la frequenza con cui l'amminoacido si trova in quella posizione. Per rappresentare il logo, viene confrontata la frequenza delle sequenze LCS estratte dai singoli animali tra due cicli di selezione e vengono mostrate le sequenze arricchite nel secondo ciclo: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4. Gli amminoacidi più arricchiti in una data posizione negli animali (c, d) n. 2.1 e n. 2.2 o (g, h) negli animali n. 2.3 e n. 2.4 sono mostrati a colori. Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici.
Dopo il terzo ciclo di selezione, abbiamo identificato 124 sequenze peptidiche uniche (#3.1 e #3.2) da 332 cloni fagici ricostituiti nel liquido cerebrospinale (CSF) isolati da due animali (Figura 6a supplementare). La sequenza LGSVS (18,7%) ha avuto la proporzione relativa più alta, seguita dagli inserti wild-type PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%). Nel quarto ciclo finale, abbiamo unito due rami selezionati indipendentemente da tre animali distinti (Figura 1c). Dei 925 cloni fagici sequenziati recuperati dal CSF, nel quarto ciclo abbiamo trovato 64 sequenze peptidiche uniche (Figura 6b supplementare), tra le quali la proporzione relativa di fagi wild-type è scesa allo 0,8%. I cloni di CSF più comuni nel quarto round sono stati LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3,2%). L'intervallo di lunghezza dei peptidi selezionati è dovuto a inserzioni/delezioni di nucleotidi o codoni di stop prematuri nei primer della libreria quando si utilizzano codoni degenerati per la progettazione della libreria NNK. I codoni di stop prematuri generano peptidi più corti e vengono selezionati perché contengono il motivo aa favorevole. Peptidi più lunghi possono derivare da inserzioni/delezioni nei primer delle librerie sintetiche. Questo posiziona il codone di stop progettato al di fuori del frame e lo legge finché un nuovo codone di stop non appare a valle. In generale, abbiamo calcolato i fattori di arricchimento per tutti e quattro i round di selezione confrontando i dati di input con i dati di output del campione. Per il primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato i titoli fagici wild-type come riferimento di background non specifico. È interessante notare che la selezione fagica negativa è stata molto forte nel primo ciclo di liquido cerebrospinale (CSF), ma non nel sangue (Fig. 3a), il che potrebbe essere dovuto alla bassa probabilità di diffusione passiva della maggior parte dei membri della libreria peptidica nel compartimento del CSF o alla tendenza dei fagi relativi a essere trattenuti o rimossi dal flusso sanguigno in modo più efficiente rispetto ai batteriofagi. Tuttavia, nel secondo ciclo di panning, è stata osservata una forte selezione di fagi nel CSF in entrambi i cladi, suggerendo che il ciclo precedente fosse arricchito di fagi che mostravano peptidi che promuovono l'assorbimento del CSF (Fig. 3a). Anche in questo caso, senza un significativo arricchimento nel sangue. Anche nel terzo e quarto ciclo, i cloni fagici erano significativamente arricchiti nel CSF. Confrontando la frequenza relativa di ciascuna sequenza peptidica unica tra gli ultimi due cicli di selezione, abbiamo scoperto che le sequenze erano ancora più arricchite nel quarto ciclo di selezione (Fig. 3b). Un totale di 931 motivi tripeptidici sono stati estratti da tutte le 64 sequenze peptidiche uniche utilizzando entrambi gli orientamenti peptidici. I motivi più arricchiti nel quarto round sono stati esaminati più attentamente per i loro profili di arricchimento in tutti i round rispetto alla libreria iniettata (cut-off: arricchimento del 10%) (Figura 6c supplementare). I modelli generali di selezione hanno mostrato che la maggior parte dei motivi studiati era arricchita in tutti i round precedenti di entrambi i rami di selezione. Tuttavia, alcuni motivi (ad esempio SGL, VSG, LGS GSV) provenivano prevalentemente dal clade alternativo A, mentre altri (ad esempio FGW, RTN, WGF, NTR) erano arricchiti nel clade alternativo B.
Validazione del trasporto nel liquido cerebrospinale di peptidi fagici arricchiti nel liquido cerebrospinale e di peptidi leader biotinilati coniugati a carichi utili di streptavidina.
(a) Rapporti di arricchimento calcolati in tutti e quattro i round (R1-R4) sulla base dei titoli fagici (PFU) iniettati (input = I) e dei titoli fagici determinati nel CSF (output = O). I fattori di arricchimento per gli ultimi tre round (R2-R4) sono stati calcolati confrontandoli con il round precedente e il primo round (R1) con i dati relativi al peso. Le barre vuote rappresentano il liquido cerebrospinale, le barre ombreggiate il plasma. (***p<0,001, basato sul t-test di Student). (b) Elenco dei peptidi fagici più abbondanti, classificati in base alla loro proporzione relativa rispetto a tutti i fagi raccolti nel CSF dopo il round 4 di selezione. I sei cloni fagici più comuni sono evidenziati a colori, numerati e con i relativi fattori di arricchimento tra i round 3 e 4 di selezione (riquadri). (c,d) I sei cloni fagici più arricchiti, i fagi vuoti e le librerie peptidiche fagiche parentali del round 4 sono stati analizzati individualmente in un modello di campionamento del liquido cerebrospinale (CSF). Campioni di liquido cerebrospinale e di sangue sono stati raccolti ai tempi indicati. (c) Quantità uguali di 6 cloni fagici candidati (2 x 1010 fagi/animale), fagi vuoti (#1779) (2 x 1010 fagi/animale) e librerie peptidiche fagiche stock (2 x 1012 fagi/animale) vengono iniettate. Almeno 3 CM vengono somministrati all'animale cannulato separatamente attraverso la vena caudale. Viene mostrata la farmacocinetica del liquido cerebrospinale di ciascun clone fagico iniettato e di ciascuna libreria peptidica fagica nel tempo. (d) mostra il rapporto CSF/sangue medio per tutti i fagi/mL recuperati durante il tempo di campionamento. (e) Quattro peptidi leader sintetici e un controllo scrambled sono stati legati con biotina alla streptavidina attraverso il loro N-terminale (tetramero) seguito da iniezione (venosa caudale ev, 10 mg di streptavidina/kg). Almeno tre ratti intubati (N = 3). Campioni di liquido cerebrospinale sono stati raccolti ai tempi indicati e le concentrazioni di streptavidina sono state misurate mediante ELISA anti-streptavidina su liquido cerebrospinale (nd = non rilevato). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basato sul test ANOVA). (f) Confronto della sequenza amminoacidica del clone peptidico fagico più arricchito #2002 (viola) con altri cloni peptidici fagici selezionati dal 4° ciclo di selezione. I frammenti amminoacidici identici e simili sono codificati a colori.
Tra tutti i fagi arricchiti nel quarto ciclo (Fig. 3b), sei cloni candidati sono stati selezionati per ulteriori analisi individuali nel modello di campionamento del liquido cerebrospinale (CSF). Quantità uguali di sei librerie peptidiche di fagi candidati, fagi vuoti (senza inserto) e profagi sono state iniettate in tre animali con carcinoma mammario cannulato (CM) e la farmacocinetica è stata determinata in saggi su liquido cerebrospinale (Fig. 3c) e sangue (Fig. 7 supplementare). Tutti i cloni fagici testati hanno mirato al compartimento del liquido cerebrospinale a un livello da 10 a 1000 volte superiore a quello del fago di controllo vuoto (#1779). Ad esempio, i cloni #2020 e #2077 presentavano titoli nel liquido cerebrospinale circa 1000 volte superiori rispetto al fago di controllo. Il profilo farmacocinetico di ciascun peptide selezionato è diverso, ma tutti presentano un'elevata capacità di homing nel liquido cerebrospinale. Abbiamo osservato una diminuzione costante nel tempo per i cloni #1903 e #2011, mentre per i cloni #2077, #2002 e #2009 un aumento durante i primi 10 minuti potrebbe indicare un trasporto attivo, ma deve essere verificato. I cloni #2020, #2002 e #2077 si sono stabilizzati a livelli elevati, mentre la concentrazione del CSF del clone #2009 è diminuita lentamente dopo l'aumento iniziale. Abbiamo quindi confrontato la frequenza relativa di ciascun candidato nel CSF con la sua concentrazione ematica (Fig. 3d). La correlazione del titolo medio di ciascun candidato nel CSF con il suo titolo ematico a tutti i tempi di campionamento ha mostrato che tre dei sei candidati erano significativamente arricchiti di CSF ematico. È interessante notare che il clone #2077 ha mostrato una maggiore stabilità ematica (Figura supplementare 7). Per confermare che i peptidi stessi siano in grado di trasportare attivamente carichi diversi dalle particelle fagiche nel compartimento del liquido cerebrospinale (CSF), abbiamo sintetizzato quattro peptidi leader derivatizzati con biotina all'estremità N-terminale, dove i peptidi si legano alla particella fagica. I peptidi biotinilati (n. 2002, 2009, 2020 e 2077) sono stati coniugati con streptavidina (SA) per ottenere forme multimeriche che imitano in qualche modo la geometria fagica. Questo formato ci ha anche permesso di misurare l'esposizione di SA nel sangue e nel liquido cerebrospinale come peptidi proteici trasportatori di carichi. È importante sottolineare che i dati fagici potevano spesso essere riprodotti quando i peptidi sintetici venivano somministrati in questo formato coniugato con SA (Fig. 3e). I peptidi mescolati presentavano una minore esposizione iniziale e una clearance del CSF più rapida, con livelli non rilevabili entro 48 ore. Per approfondire le vie di trasporto di questi cloni fagici peptidici nello spazio del liquido cerebrospinale (CSF), abbiamo analizzato la localizzazione dei singoli peptidi fagici utilizzando l'immunoistochimica (IHC) per rilevare direttamente le particelle fagiche 1 ora dopo l'iniezione endovenosa in vivo. In particolare, i cloni #2002, #2077 e #2009 sono stati rilevati mediante colorazione intensa nei capillari cerebrali, mentre il fago di controllo (#1779) e il clone #2020 non sono stati rilevati (Figura 8 supplementare). Ciò suggerisce che questi peptidi contribuiscano all'effetto sul cervello proprio attraversando la barriera ematoencefalica (BEE). Sono necessarie ulteriori analisi dettagliate per verificare questa ipotesi, poiché potrebbe essere coinvolta anche la via BSCFB. Confrontando la sequenza amminoacidica del clone più arricchito (#2002) con altri peptidi selezionati, si è notato che alcuni di essi presentano estensioni amminoacidiche simili, il che potrebbe indicare un meccanismo di trasporto analogo (Fig. 3f).
Grazie al suo profilo plasmatico unico e al significativo aumento del liquido cerebrospinale (CSF) nel tempo, il clone fagico #2077 è stato ulteriormente esplorato per un periodo più lungo di 48 ore ed è stato in grado di riprodurre il rapido aumento del liquido cerebrospinale (CSF) osservato in associazione a livelli sostenuti di SA (Fig. 4a). Per quanto riguarda altri cloni fagici identificati, il #2077 ha mostrato una forte colorazione per i capillari cerebrali e ha mostrato una significativa colocalizzazione con la lectina, marcatore capillare, quando visualizzato a risoluzione più elevata e possibilmente una certa colorazione nello spazio parenchimale (Figura 4b). Per indagare se gli effetti farmacologici mediati dai peptidi potessero essere ottenuti nel SNC, abbiamo condotto un esperimento in cui versioni biotinilate di i) il peptide di transito #2077 e ii) il peptide inibitore di BACE1 sono state miscelate con SA in due rapporti diversi. Per una combinazione abbiamo utilizzato solo l'inibitore del peptide BACE1 e per l'altra abbiamo utilizzato un rapporto 1:3 tra l'inibitore del peptide BACE1 e il peptide #2077. Entrambi i campioni sono stati somministrati per via endovenosa e i livelli ematici e cerebrospinali del peptide beta-amiloide 40 (Abeta40) sono stati misurati nel tempo. L'Abeta40 è stato misurato nel liquido cerebrospinale (CSF) in quanto riflette l'inibizione di BACE1 nel parenchima cerebrale. Come previsto, entrambi i complessi hanno ridotto significativamente i livelli ematici di Abeta40 (Fig. 4c, d). Tuttavia, solo i campioni contenenti una miscela del peptide n. 2077 e un inibitore del peptide BACE1 coniugato a SA hanno causato una diminuzione significativa di Abeta40 nel liquido cerebrospinale (Fig. 4c). I dati mostrano che il peptide n. 2077 è in grado di trasportare la proteina SA di 60 kDa nel SNC e induce anche effetti farmacologici con inibitori del peptide BACE1 coniugati a SA.
(a) Iniezione clonale (2 × 10 fagi/animale) del fago T7 che mostra i profili farmacocinetici a lungo termine del peptide #2077 del liquido cerebrospinale (RLSSVDSDLSGC) e del fago di controllo non iniettato (#1779) in almeno tre ratti intubati con cellule staminali mesenchimali (CM). (b) Immagine microscopica confocale di microvasi corticali rappresentativi in ​​ratti iniettati con fagi (2 × 10 10 fagi/animale) che mostra la controcolorazione del peptide #2077 e dei vasi (lectina). Questi cloni fagici sono stati somministrati a 3 ratti e lasciati in circolo per 1 ora prima della perfusione. I cervelli sono stati sezionati e colorati con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il capside del fago T7. Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, è stata somministrata per via endovenosa lectina marcata con DyLight594. Immagini fluorescenti che mostrano la colorazione con lectina (rosso) del lato luminale dei microvasi e dei fagi (verde) nel lume dei capillari e del tessuto cerebrale perivascolare. La barra della scala corrisponde a 10 µm. (c, d) Il peptide inibitore di BACE1 biotinilato, da solo o in combinazione con il peptide di transito biotinilato n. 2077, è stato accoppiato a streptavidina, seguita da iniezione endovenosa in almeno tre ratti CM cannulati (10 mg di streptavidina/kg). La riduzione di Aβ40 mediata dall'inibitore del peptide BACE1 è stata misurata mediante Aβ1-40 ELISA nel sangue (rosso) e nel liquido cerebrospinale (arancione) ai punti temporali indicati. Per maggiore chiarezza, sul grafico è tracciata una linea tratteggiata con una scala del 100%. (c) Riduzione percentuale di Aβ40 nel sangue (triangoli rossi) e nel liquido cerebrospinale (triangoli arancioni) nei ratti trattati con streptavidina coniugata al peptide di transito #2077 e al peptide inibitore di BACE1 in rapporto 3:1. (d) Riduzione percentuale di Aβ40 nel sangue (cerchi rossi) e nel liquido cerebrospinale (cerchi arancioni) nei ratti trattati con streptavidina accoppiata solo a un peptide inibitore di BACE1. La concentrazione di Aβ nel controllo era di 420 pg/ml (deviazione standard = 101 pg/ml).
Il "phage display" è stato applicato con successo in diverse aree della ricerca biomedica17. Questo metodo è stato utilizzato per studi sulla diversità vascolare in vivo18,19 e per studi mirati ai vasi cerebrali20,21,22,23,24,25,26. In questo studio, abbiamo esteso l'applicazione di questo metodo di selezione non solo all'identificazione diretta di peptidi diretti ai vasi cerebrali, ma anche all'individuazione di candidati con proprietà di trasporto attivo in grado di attraversare la barriera emato-encefalica. Descriviamo ora lo sviluppo di una procedura di selezione in vivo in ratti intubati con cellule staminali mesenchimali (CM) e ne dimostriamo il potenziale per identificare peptidi con proprietà di homing nel liquido cerebrospinale (CSF). Utilizzando il fago T7 che mostra una libreria di peptidi casuali a 12 mer, siamo stati in grado di dimostrare che il fago T7 è sufficientemente piccolo (circa 60 nm di diametro)10 da adattarsi alla barriera emato-encefalica, attraversandola direttamente o attraversando il plesso coroideo. Abbiamo osservato che il prelievo di liquido cerebrospinale (CSF) da ratti CM cannulati era un metodo di screening funzionale in vivo ben controllato e che il fago estratto non solo si legava al sistema vascolare, ma fungeva anche da trasportatore attraverso la barriera ematoencefalica. Inoltre, prelevando simultaneamente il sangue e applicando l'HTS al CSF e ai fagi derivati ​​dal sangue, abbiamo confermato che la scelta del CSF non era influenzata dall'arricchimento del sangue o dall'idoneità all'espansione tra i cicli di selezione. Tuttavia, il compartimento ematico fa parte della procedura di selezione, poiché i fagi in grado di raggiungere il compartimento del CSF devono sopravvivere e circolare nel flusso sanguigno abbastanza a lungo da arricchirsi nel cervello. Per estrarre informazioni di sequenza affidabili dai dati HTS grezzi, abbiamo implementato filtri adattati agli errori di sequenziamento specifici della piattaforma nel flusso di lavoro di analisi. Incorporando parametri cinetici nel metodo di screening, abbiamo confermato la rapida farmacocinetica dei fagi T7 wild-type (t½ ~ 28 min) nel sangue24, 27, 28 e ne abbiamo anche determinato l'emivita nel liquido cerebrospinale (t½ ~ 26 min) al minuto. Nonostante profili farmacocinetici simili nel sangue e nel liquido cerebrospinale, solo lo 0,001% della concentrazione ematica del fago è stato rilevato nel liquido cerebrospinale, indicando una bassa mobilità di fondo del fago T7 wild-type attraverso la barriera ematoencefalica. Questo lavoro evidenzia l'importanza del primo ciclo di selezione quando si utilizzano strategie di panning in vivo, soprattutto per i sistemi fagici che vengono rapidamente eliminati dalla circolazione, poiché pochi cloni sono in grado di raggiungere il compartimento del SNC. Pertanto, nel primo ciclo, la riduzione della diversità della libreria è stata molto ampia, poiché solo un numero limitato di cloni è stato infine raccolto in questo modello di liquido cerebrospinale molto rigoroso. Questa strategia di panning in vivo includeva diverse fasi di selezione, come l'accumulo attivo nel compartimento del liquido cerebrospinale (CSF), la sopravvivenza del clone nel compartimento ematico e la rapida rimozione dei cloni fagici T7 dal sangue entro i primi 10 minuti (Fig. 1d e Fig. 4M supplementare). Pertanto, dopo il primo ciclo, sono stati identificati diversi cloni fagici nel CSF, sebbene lo stesso pool iniziale fosse stato utilizzato per i singoli animali. Ciò suggerisce che molteplici fasi di selezione rigorosa per librerie di origine con un gran numero di membri della libreria comportano una significativa riduzione della diversità. Pertanto, gli eventi casuali diventeranno parte integrante del processo di selezione iniziale, influenzando notevolmente il risultato. È probabile che molti dei cloni nella libreria originale avessero una propensione all'arricchimento del CSF molto simile. Tuttavia, anche nelle stesse condizioni sperimentali, i risultati della selezione potrebbero differire a causa del numero ridotto di ciascun clone specifico nel pool iniziale.
I motivi arricchiti nel liquido cerebrospinale (CSF) differiscono da quelli presenti nel sangue. È interessante notare che abbiamo osservato il primo spostamento verso peptidi ricchi di glicina nel sangue di singoli animali (Fig. 1g, Figure supplementari 4e, 4f). I fagi contenenti peptidi di glicina potrebbero essere più stabili e meno inclini a essere rimossi dal circolo sanguigno. Tuttavia, questi peptidi ricchi di glicina non sono stati rilevati nei campioni di liquido cerebrospinale, suggerendo che le librerie selezionate siano state sottoposte a due diverse fasi di selezione: una nel sangue e una in cui sono stati lasciati accumulare nel liquido cerebrospinale. I cloni arricchiti in CSF risultanti dal quarto ciclo di selezione sono stati ampiamente testati. Quasi tutti i cloni testati individualmente sono stati confermati come arricchiti nel CSF rispetto al fago di controllo bianco. Un singolo peptide (#2077) è stato esaminato più in dettaglio. Ha mostrato un'emivita plasmatica più lunga rispetto ad altri hit (Figura 3d e Figura 7 supplementare) e, cosa interessante, questo peptide conteneva un residuo di cisteina al C-terminale. È stato recentemente dimostrato che l'aggiunta di cisteina ai peptidi può migliorarne le proprietà farmacocinetiche legandosi all'albumina 29. Questo è attualmente sconosciuto per il peptide #2077 e richiede ulteriori studi. Alcuni peptidi hanno mostrato una dipendenza dalla valenza nell'arricchimento del liquido cerebrospinale (dati non mostrati), che potrebbe essere correlata alla geometria superficiale esposta del capside T7. Il sistema T7 da noi utilizzato ha mostrato 5-15 copie di ciascun peptide per particella fagica. L'IHC è stata eseguita su cloni fagici principali candidati iniettati per via endovenosa nella corteccia cerebrale di ratti (Figura 8 supplementare). I dati hanno mostrato che almeno tre cloni (n. 2002, n. 2009 e n. 2077) interagivano con la BEE. Resta da stabilire se questa interazione con la barriera emato-encefalica determini l'accumulo di liquido cerebrospinale (CSF) o il trasferimento di questi cloni direttamente al BCSFB. È importante sottolineare che dimostriamo che i peptidi selezionati mantengono la loro capacità di trasporto nel CSF una volta sintetizzati e legati al carico proteico. Il legame dei peptidi biotinilati N-terminali all'SA ripete essenzialmente i risultati ottenuti con i rispettivi cloni fagici nel sangue e nel liquido cerebrospinale (Fig. 3e). Infine, dimostriamo che il peptide principale #2077 è in grado di promuovere l'azione cerebrale di un inibitore peptidico biotinilato di BACE1 coniugato all'SA, causando pronunciati effetti farmacodinamici nel SNC riducendo significativamente i livelli di Abeta40 nel CSF (Fig. 4). Non siamo stati in grado di identificare alcun omologo nel database eseguendo una ricerca di omologia di sequenza peptidica di tutti i risultati. È importante notare che la dimensione della libreria T7 è di circa 109, mentre la dimensione teorica della libreria per i 12-meri è di 4 x 1015. Pertanto, abbiamo selezionato solo una piccola frazione dello spazio di diversità della libreria peptidica a 12-meri, il che potrebbe significare che è possibile identificare peptidi più ottimizzati valutando lo spazio di sequenza adiacente di questi hit identificati. Ipoteticamente, uno dei motivi per cui non abbiamo trovato omologhi naturali di questi peptidi potrebbe essere la deselezione durante l'evoluzione per impedire l'ingresso incontrollato di determinati motivi peptidici nel cervello.
Nel complesso, i nostri risultati forniscono una base per futuri lavori volti a identificare e caratterizzare più dettagliatamente i sistemi di trasporto della barriera cerebrovascolare in vivo. L'impostazione di base di questo metodo si basa su una strategia di selezione funzionale che non solo identifica i cloni con proprietà di legame vascolare cerebrale, ma include anche un passaggio critico in cui i cloni di successo presentano un'attività intrinseca per attraversare le barriere biologiche in vivo e raggiungere il compartimento del SNC. L'obiettivo principale è chiarire il meccanismo di trasporto di questi peptidi e la loro preferenza per il legame con la microvascolatura specifica della regione cerebrale. Ciò potrebbe portare alla scoperta di nuove vie per il trasporto della barriera ematoencefalica e dei recettori. Ci aspettiamo che i peptidi identificati possano legarsi direttamente ai recettori cerebrovascolari o a ligandi circolanti trasportati attraverso la barriera ematoencefalica o la BCSFB. I vettori peptidici con attività di trasporto nel liquido cerebrospinale scoperti in questo lavoro saranno ulteriormente studiati. Attualmente stiamo studiando la specificità cerebrale di questi peptidi per la loro capacità di attraversare la barriera ematoencefalica e/o la BCSFB. Questi nuovi peptidi saranno strumenti estremamente preziosi per la potenziale scoperta di nuovi recettori o percorsi e per lo sviluppo di nuove piattaforme altamente efficienti per la somministrazione di macromolecole, come i farmaci biologici, al cervello.
Incannulare la grande cisterna (CM) utilizzando una modifica del metodo precedentemente descritto. Ratti Wistar anestetizzati (200-350 g) sono stati montati su un apparecchio stereotassico ed è stata praticata un'incisione mediana sul cuoio capelluto rasato e preparato in modo asettico per esporre il cranio. Sono stati praticati due fori nell'area della fascia superiore e fissati le viti di fissaggio nei fori. È stato praticato un foro aggiuntivo nella cresta occipitale laterale per la guida stereotassica di una cannula in acciaio inossidabile nella CM. È stato applicato del cemento dentale attorno alla cannula e fissato con viti. Dopo la fotopolimerizzazione e l'indurimento del cemento, la ferita cutanea è stata chiusa con sutura supramid 4/0. Il corretto posizionamento della cannula è confermato dalla fuoriuscita spontanea di liquido cerebrospinale (CSF). Rimuovere il ratto dall'apparecchio stereotassico, sottoporlo a cure postoperatorie e analgesiche adeguate e lasciarlo convalescente per almeno una settimana fino alla comparsa di segni di sangue nel liquido cerebrospinale. I ratti Wistar (Crl:WI/Han) sono stati ottenuti da Charles River (Francia). Tutti i ratti sono stati tenuti in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Ufficio Veterinario della Città di Basilea, Svizzera, e sono stati condotti in conformità con la Licenza per Animali n. 2474 (Valutazione del Trasporto Cerebrale Attivo mediante Misurazione dei Livelli di Candidati Terapeutici nel Liquido Cerebrospinale e nel Cervello del Ratto).
Mantenere delicatamente il ratto cosciente con la cannula CM in mano. Rimuovere la Datura dalla cannula e raccogliere 10 µl di liquido cerebrospinale a flusso spontaneo. Poiché la pervietà della cannula è stata compromessa, sono stati inclusi in questo studio solo campioni di liquido cerebrospinale limpido, senza tracce di contaminazione ematica o alterazioni del colore. Parallelamente, circa 10-20 µl di sangue sono stati prelevati da una piccola incisione sulla punta della coda e inseriti in provette con eparina (Sigma-Aldrich). Il liquido cerebrospinale e il sangue sono stati raccolti a diversi intervalli di tempo dopo l'iniezione endovenosa del fago T7. Circa 5-10 µl di liquido sono stati scartati prima del prelievo di ciascun campione di liquido cerebrospinale, il che corrisponde al volume morto del catetere.
Le librerie sono state generate utilizzando il vettore T7Select 10-3b come descritto nel manuale del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). In breve, un inserto di DNA casuale di 12 mer è stato sintetizzato nel seguente formato:
Il codone NNK è stato utilizzato per evitare doppi codoni di stop e sovraespressione di amminoacidi nell'inserto. N è un rapporto equimolare miscelato manualmente di ciascun nucleotide, e K è un rapporto equimolare miscelato manualmente di nucleotidi di adenina e citosina. Le regioni a singolo filamento sono state convertite in DNA a doppio filamento mediante ulteriore incubazione con dNTP (Novagen) ed enzima Klenow (New England Biolabs) in tampone Klenow (New England Biolabs) per 3 ore a 37 °C. Dopo la reazione, il DNA a doppio filamento è stato recuperato mediante precipitazione con EtOH. Il DNA risultante è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindIII (entrambi di Roche). L'inserto scisso e purificato (QIAquick, Qiagen) (T4 ligasi, New England Biolabs) è stato quindi ligato in frame in un vettore T7 pre-scisso dopo l'amminoacido 348 del gene del capside 10B. Le reazioni di ligazione sono state incubate a 16 °C per 18 ore prima del confezionamento in vitro. Il confezionamento in vitro del fago è stato eseguito secondo le istruzioni fornite con il kit di clonazione T7Select 10-3b (Novagen) e la soluzione di confezionamento è stata amplificata una volta fino alla lisi utilizzando Escherichia coli (BLT5615, Novagen). I lisati sono stati centrifugati, titolati e congelati a -80 °C come soluzione madre di glicerolo.
Amplificazione PCR diretta delle regioni variabili del fago amplificate in brodo o in piastra utilizzando primer di fusione proprietari 454/Roche-amplicon. Il primer di fusione diretto contiene sequenze fiancheggianti la regione variabile (NNK) 12 (specifiche del modello), adattatore A in titanio GS FLX e una sequenza chiave di libreria a quattro basi (TCAG) (Figura supplementare 1a):
Il primer di fusione inversa contiene anche biotina attaccata alle sfere di cattura e l'adattatore B in titanio GS FLX necessario per l'amplificazione clonale durante la PCR in emulsione:
Gli ampliconi sono stati quindi sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche secondo il protocollo 454 GS-FLX Titanium. Per il sequenziamento manuale Sanger (analizzatore di DNA Hitachi 3730 xl di Applied Biosystems), il DNA del fago T7 è stato amplificato mediante PCR e sequenziato con le seguenti coppie di primer:
Gli inserti delle singole placche sono stati sottoposti ad amplificazione PCR utilizzando il kit Roche Fast Start DNA Polymerase (secondo le istruzioni del produttore). Eseguire un hot start (10 min a 95 °C) e 35 cicli di boost (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
Fagi provenienti da librerie, fagi wild-type, fagi recuperati da liquido cerebrospinale e sangue, o singoli cloni sono stati amplificati in Escherichia coli BL5615 in brodo TB (Sigma Aldrich) o in piastre da 500 cm² (Thermo Scientific) per 4 ore a 37 °C. I fagi sono stati estratti dalle piastre risciacquandole con tampone Tris-EDTA (Fluka Analytical) o raccogliendo le placche con puntali sterili. I fagi sono stati isolati dal surnatante di coltura o dal tampone di estrazione con un ciclo di precipitazione con polietilenglicole (PEG 8000) (Promega) e risospesi in tampone Tris-EDTA.
Il fago amplificato è stato sottoposto a 2-3 cicli di rimozione dell'endotossina utilizzando microsfere di rimozione dell'endotossina (Miltenyi Biotec) prima dell'iniezione endovenosa (EV) (500 μl/animale). Nel primo ciclo, sono stati introdotti 2×10¹⁴ fagi; nel secondo, 2×10¹⁴ fagi; nel terzo e quarto ciclo di selezione, 2×10¹⁴ fagi per animale. Il contenuto di fagi nei campioni di liquido cerebrospinale (CSF) e di sangue prelevati ai tempi indicati è stato determinato mediante conteggio delle placche secondo le istruzioni del produttore (manuale del sistema T7Select). La selezione dei fagi è stata effettuata mediante iniezione endovenosa di librerie purificate nella vena caudale o mediante reiniezione del fago estratto dal CSF dal ciclo di selezione precedente, e i successivi prelievi sono stati effettuati rispettivamente a 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min su campioni di liquido cerebrospinale e di sangue. Sono stati condotti quattro cicli di panning in vivo, in cui i due rami selezionati sono stati conservati e analizzati separatamente durante i primi tre cicli di selezione. Tutti gli inserti fagici estratti dal liquido cerebrospinale (CSF) dai primi due cicli di selezione sono stati sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche, mentre tutti i cloni estratti dal liquido cerebrospinale (CSF) dagli ultimi due cicli di selezione sono stati sequenziati manualmente. Anche tutti i fagi del sangue del primo ciclo di selezione sono stati sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche. Per l'iniezione dei cloni fagici, i fagi selezionati sono stati amplificati in E. coli (BL5615) su piastre da 500 cm² a 37 °C per 4 ore. I cloni selezionati individualmente e sequenziati manualmente sono stati propagati in terreno di coltura TB. Dopo l'estrazione dei fagi, la purificazione e la rimozione dell'endotossina (come descritto sopra), 2×10¹⁴ fagi/animale in 300 μl sono stati iniettati per via endovenosa in una vena caudale.
Pre-elaborazione e filtraggio qualitativo dei dati di sequenza. I dati grezzi 454/Roche sono stati convertiti da un formato binario standard stream map (sff) a un formato leggibile da Pearson (fasta) utilizzando il software del fornitore. L'ulteriore elaborazione della sequenza nucleotidica è stata eseguita utilizzando programmi e script C proprietari (pacchetto software non ancora rilasciato) come descritto di seguito. L'analisi dei dati primari include rigorose procedure di filtraggio multistadio. Per filtrare le letture che non contenevano una sequenza di DNA con inserto 12mer valida, le letture sono state allineate sequenzialmente all'etichetta di inizio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), all'etichetta di fine (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e all'inserto di fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizzando il test globale di Needleman-Wunsch. L'allineamento consente fino a 2 inconsistenze per allineamento31. Pertanto, le letture senza tag di inizio e fine e le letture contenenti inserti di fondo, ovvero gli allineamenti che superano il numero consentito di mismatch, sono state rimosse dalla libreria. Per quanto riguarda le letture rimanenti, la sequenza di DNA N-mer che si estende dal segno di inizio e termina prima del segno di stop è stata escissa dalla sequenza di lettura originale e ulteriormente elaborata (di seguito denominata "inserto"). Dopo la traduzione dell'inserto, la porzione dopo il primo codone di stop all'estremità 5' del primer viene rimossa dall'inserto. Inoltre, sono stati rimossi anche i nucleotidi che portano a codoni incompleti all'estremità 3' del primer. Per escludere gli inserti contenenti solo sequenze di background, sono stati rimossi anche gli inserti tradotti che iniziano con il pattern amminoacidico "PAG". I peptidi con una lunghezza post-traduzionale inferiore a 3 amminoacidi sono stati rimossi dalla libreria. Infine, è stata rimossa la ridondanza nel pool di inserti e determinata la frequenza di ciascun inserto univoco. I risultati di questa analisi includono un elenco di sequenze nucleotidiche (inserti) e le relative frequenze (di lettura) (Figure supplementari 1c e 2).
Raggruppare gli inserti di DNA N-mer in base alla similarità di sequenza: per eliminare errori di sequenziamento specifici di 454/Roche (come problemi con il sequenziamento di estensioni omopolimeriche) e rimuovere ridondanze meno importanti, gli inserti di sequenza di DNA N-mer precedentemente filtrati (inserti) vengono ordinati in base alla similarità. Gli inserti (sono consentite fino a 2 basi non corrispondenti) vengono ordinati utilizzando un algoritmo iterativo definito come segue: gli inserti vengono ordinati prima in base alla loro frequenza (dalla più alta alla più bassa) e, se sono uguali, in base al loro ordinamento secondario in base alla lunghezza (dalla più lunga alla più corta). Pertanto, gli inserti più frequenti e più lunghi definiscono il primo "gruppo". La frequenza di gruppo viene impostata sulla frequenza chiave. Quindi, si è tentato di aggiungere al gruppo ogni inserto rimanente nell'elenco ordinato mediante allineamento Needleman-Wunsch a coppie. Se il numero di discrepanze, inserzioni o delezioni in un allineamento non supera la soglia di 2, un'inserzione viene aggiunta al gruppo e la frequenza complessiva del gruppo viene aumentata in base alla frequenza con cui l'inserzione è stata aggiunta. Gli inserti aggiunti a un gruppo vengono contrassegnati come utilizzati ed esclusi dall'ulteriore elaborazione. Se la sequenza di inserimento non può essere aggiunta a un gruppo già esistente, la sequenza di inserimento viene utilizzata per creare un nuovo gruppo con la frequenza di inserimento appropriata e contrassegnata come utilizzata. L'iterazione termina quando ciascuna sequenza di inserimento è stata utilizzata per formare un nuovo gruppo o può essere inclusa in un gruppo già esistente. Dopotutto, gli inserti raggruppati costituiti da nucleotidi vengono infine tradotti in sequenze peptidiche (librerie peptidiche). Il risultato di questa analisi è un insieme di inserimenti e le relative frequenze che costituiscono il numero di letture consecutive (Figura 2 supplementare).
Generazione di motivi: sulla base di un elenco di peptidi univoci, è stata creata una libreria contenente tutti i possibili pattern amminoacidici (aa), come mostrato di seguito. Ogni possibile pattern di lunghezza 3 è stato estratto dal peptide e il suo pattern inverso è stato aggiunto insieme a una libreria di motivi comuni contenente tutti i pattern (tripeptidi). Le librerie di motivi altamente ripetitivi sono state sequenziate e la ridondanza è stata rimossa. Quindi, per ciascun tripeptide nella libreria di motivi, ne abbiamo verificato la presenza nella libreria utilizzando strumenti computazionali. In questo caso, la frequenza del peptide contenente il tripeptide del motivo trovato viene aggiunta e assegnata al motivo nella libreria di motivi ("numero di motivi"). Il risultato della generazione di motivi è un array bidimensionale contenente tutte le occorrenze di tripeptidi (motivi) e i rispettivi valori, che rappresentano il numero di letture di sequenziamento che risultano nel motivo corrispondente quando le letture vengono filtrate, raggruppate e tradotte. Le metriche sono descritte in dettaglio sopra.
Normalizzazione del numero di motivi e dei relativi diagrammi di dispersione: il numero di motivi per ciascun campione è stato normalizzato utilizzando
dove ni è il numero di letture contenenti il ​​tema i. Pertanto, vi rappresenta la frequenza percentuale di letture (o peptidi) contenenti il ​​motivo i nel campione. I valori p per il numero non normalizzato di motivi sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher. Per quanto riguarda i correlogrammi del numero di motivi, le correlazioni di Spearman sono state calcolate utilizzando il numero normalizzato di motivi con R.
Per visualizzare il contenuto di amminoacidi in ciascuna posizione nella libreria peptidica, sono stati creati i logogrammi web 32 e 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Innanzitutto, il contenuto di amminoacidi in ciascuna posizione del peptide 12-mer viene memorizzato in una matrice 20×12. Successivamente, un set di 1000 peptidi contenenti lo stesso contenuto amminoacidico relativo in ciascuna posizione viene generato in formato fasta-sequence e fornito come input al logo web 3, che genera una rappresentazione grafica del contenuto amminoacidico relativo in ciascuna posizione per una data libreria peptidica. Per visualizzare set di dati multidimensionali, sono state create mappe di calore utilizzando uno strumento sviluppato internamente in R (biosHeatmap, un pacchetto R non ancora rilasciato). I dendrogrammi presentati nelle mappe di calore sono stati calcolati utilizzando il metodo di clustering gerarchico di Ward con la metrica della distanza euclidea. Per l'analisi statistica dei dati di punteggio dei motivi, i valori P per il punteggio non normalizzato sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher. I valori P per altri set di dati sono stati calcolati in R utilizzando il test t di Student o l'ANOVA.
Cloni fagici selezionati e fagi senza inserti sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda (2×1010 fagi/animale in 300 μl di PBS). Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, agli stessi animali sono stati iniettati per via endovenosa 100 μl di lectina marcata con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuti dopo l'iniezione del fago, i ratti sono stati perfusi attraverso il cuore con 50 ml di PBS seguiti da 50 ml di PFA/PBS al 4%. Campioni di cervello sono stati inoltre fissati per una notte in PFA/PBS al 4% e immersi in saccarosio al 30% per una notte a 4 °C. I campioni vengono congelati rapidamente nella miscela OCT. L'analisi immunoistochimica dei campioni congelati è stata eseguita a temperatura ambiente su criosezioni di 30 µm bloccate con BSA all'1% e incubate con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Incubare per una notte. Infine, le sezioni sono state lavate 3 volte con PBS ed esaminate al microscopio laser confocale (Leica TCS SP5).
Tutti i peptidi con una purezza minima del 98% sono stati sintetizzati da GenScript USA, biotinilati e liofilizzati. La biotina è legata tramite un ulteriore spaziatore di glicina tripla all'estremità N-terminale. Controllare tutti i peptidi mediante spettrometria di massa.
La streptavidina (Sigma S0677) è stata miscelata con un eccesso equimolare di 5 volte di peptide biotinilato, peptide inibitore di BACE1 biotinilato o una combinazione (rapporto 3:1) di peptide inibitore di BACE1 biotinilato e peptide inibitore di BACE1 in DMSO al 5-10%/incubata in PBS. 1 ora a temperatura ambiente prima dell'iniezione. I peptidi coniugati con streptavidina sono stati iniettati per via endovenosa a una dose di 10 mg/kg in una delle vene della coda di ratti con cavità cerebrale.
La concentrazione dei complessi streptavidina-peptide è stata valutata mediante saggio ELISA. Le piastre per microtitolazione Nunc Maxisorp (Sigma) sono state rivestite per una notte a 4 °C con 1,5 μg/ml di anticorpo murino anti-streptavidina (Thermo, MA1-20011). Dopo il bloccaggio (tampone di bloccaggio: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) a temperatura ambiente per 2 ore, la piastra è stata lavata con 0,05% Tween-20/PBS (tampone di lavaggio) per 3 secondi. Campioni di CSF e plasma sono stati aggiunti ai pozzetti diluiti con tampone di bloccaggio (plasma 1:10.000, CSF 1:115). La piastra è stata quindi incubata per una notte a 4 °C con anticorpo di rilevazione (1 μg/ml, anti-streptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Dopo tre lavaggi, la streptavidina è stata rilevata mediante incubazione in soluzione di substrato TMB (Roche) per un massimo di 20 minuti. Dopo aver bloccato lo sviluppo del colore con H₂SO₂ 1 M, misurare l'assorbanza a 450 nm.
La funzione del complesso streptavidina-peptide-inibitore di BACE1 è stata valutata mediante test ELISA per Aβ(1-40) secondo il protocollo del produttore (Wako, 294-64701). In breve, campioni di liquido cerebrospinale (CSF) sono stati diluiti in diluente standard (1:23) e incubati per una notte a 4 °C in piastre a 96 pozzetti rivestite con anticorpo di cattura BNT77. Dopo cinque lavaggi, è stato aggiunto l'anticorpo BA27 coniugato con HRP e incubato per 2 ore a 4 °C, seguito da cinque lavaggi. Aβ(1–40) è stato rilevato mediante incubazione in soluzione di TMB per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver bloccato lo sviluppo del colore con la soluzione di stop, misurare l'assorbanza a 450 nm. I campioni di plasma sono stati sottoposti a estrazione in fase solida prima del test ELISA per Aβ(1–40). Il plasma è stato aggiunto allo 0,2% di DEA (Sigma) in piastre da 96 pozzetti e incubato a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver lavato le piastre SPE (Oasis, 186000679) con acqua e metanolo al 100%, i campioni di plasma sono stati aggiunti alle piastre SPE e tutto il liquido è stato rimosso. I campioni sono stati lavati (prima con metanolo al 5%, poi con metanolo al 30%) ed eluiti con NH4OH al 2%/metanolo al 90%. Dopo aver essiccato l'eluato a 55 °C per 99 minuti a corrente di N2 costante, i campioni sono stati ridotti in diluenti standard e l'Aβ(1–40) è stata misurata come descritto sopra.
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