Alcuni argomenti sulla risoluzione dei problemi LC non sono mai obsoleti, in quanto vi sono problemi nella pratica LC, anche se la tecnologia dello strumento migliora nel tempo. Esistono molti modi in cui possono sorgere problemi in un sistema LC e portare a una scarsa forma dei picchi. Quando sorgono problemi relativi alla forma dei picchi, un breve elenco di possibili cause per questi risultati aiuta a semplificare la nostra esperienza di risoluzione dei problemi.
È stato divertente scrivere questa colonna "Risoluzione dei problemi LC" e pensare agli argomenti ogni mese, perché alcuni argomenti non passano mai di moda. Mentre nel campo della ricerca cromatografica alcuni argomenti o idee diventano obsoleti poiché vengono sostituiti da idee nuove e migliori, nel campo della risoluzione dei problemi, da quando il primo articolo sulla risoluzione dei problemi è apparso su questa rivista (all'epoca LC Journal) poiché alcuni argomenti sono ancora rilevanti) nel 1983(1). Negli ultimi anni, ho focalizzato diverse sezioni sulla risoluzione dei problemi LC sulle tendenze contemporanee che influenzano la cromatografia liquida (LC) (ad esempio, il confronto relativo della nostra comprensione dell'effetto della pressione sulla ritenzione [2] Nuovi progressi) La nostra interpretazione dei risultati LC e come risolvere i problemi con i moderni strumenti LC. La serie è molto rilevante per la famosa "Guida alla risoluzione dei problemi LC" di LCGC (4) appesa in molti laboratori. Per la terza parte di questa serie, ho scelto di concentrarmi sui problemi relativi alla forma o alle caratteristiche dei picchi. Incredibilmente, la carta murale elenca 44 diverse potenziali cause di scarsa forma del picco! Non possiamo considerare tutti questi problemi in dettaglio in un articolo, quindi in questa prima puntata sull'argomento, mi concentrerò su alcuni di quelli che vedo più spesso. s su questo importante argomento.
Mi ritrovo sempre più a rispondere alle domande sulla risoluzione dei problemi con "tutto è possibile". Questa risposta può sembrare facile quando si considerano osservazioni difficili da interpretare, ma la trovo spesso appropriata. Con molte possibili cause di scarsa forma dei picchi, è importante mantenere una mente aperta quando si considera quale potrebbe essere il problema ed essere in grado di dare la priorità alle potenziali cause per iniziare i nostri sforzi di risoluzione dei problemi, concentrandosi su quelle possibilità più comuni, questo punto è molto importante.possibile.
Un passaggio chiave in qualsiasi esercizio di risoluzione dei problemi, ma a mio avviso sottovalutato, è riconoscere che c'è un problema che deve essere risolto. Riconoscere che c'è un problema spesso significa riconoscere che ciò che accade allo strumento è diverso dalle nostre aspettative, che sono modellate dalla teoria, dalla conoscenza empirica e dall'esperienza (5). per la forma effettiva dei picchi sono semplici. La teoria (6) supporta bene l'aspettativa del libro di testo che, nella maggior parte dei casi, i picchi cromatografici dovrebbero essere simmetrici e conformi alla forma di una distribuzione gaussiana, come mostrato nella Figura 1a. Quello che ci aspettiamo dalle larghezze dei picchi è una questione più complessa, e discuteremo questo argomento in un prossimo articolo. Trascorreremo del tempo discutendo alcuni esempi specifici di situazioni che possono portare a questi tipi di forme.
A volte i picchi non vengono osservati affatto nel cromatogramma in cui si prevede che vengano eluiti. Il grafico a parete sopra indicato indica che l'assenza di un picco (supponendo che il campione contenga effettivamente l'analita target a una concentrazione che dovrebbe rendere la risposta del rivelatore sufficiente per vederlo al di sopra del rumore) è generalmente correlata a qualche problema dello strumento o a condizioni di fase mobile errate (se osservate).picchi, solitamente troppo “deboli”). Un breve elenco di potenziali problemi e soluzioni in questa categoria è riportato nella Tabella I.
Come accennato in precedenza, la questione di quanto ampliamento del picco dovrebbe essere tollerato prima di prestare attenzione e cercare di risolverlo è un argomento complesso che discuterò in un articolo futuro. La mia esperienza è che un significativo ampliamento del picco è spesso accompagnato da un cambiamento significativo nella forma del picco e l'accodamento del picco è più comune del pre-picco o della divisione. Tuttavia, anche i picchi nominalmente simmetrici vengono ampliati, il che può essere causato da diversi motivi:
Ciascuno di questi problemi è stato discusso in dettaglio nei numeri precedenti di Risoluzione dei problemi LC e i lettori interessati a questi argomenti possono fare riferimento a questi articoli precedenti per informazioni sulle cause principali e sulle potenziali soluzioni a questi problemi.Più dettagli.
L'accodamento dei picchi, l'anticipo dei picchi e la divisione possono essere tutti causati da fenomeni chimici o fisici e l'elenco delle potenziali soluzioni a questi problemi varia notevolmente, a seconda che si tratti di un problema chimico o fisico. Spesso, confrontando i diversi picchi in un cromatogramma, è possibile trovare indizi importanti su quale sia il colpevole. Se tutti i picchi in un cromatogramma presentano forme simili, molto probabilmente la causa non è fisica. probabilmente chimico.
Le cause chimiche dell'accodamento dei picchi sono troppo complesse per essere discusse brevemente in questa sede. Si rimanda il lettore interessato al recente numero di "LC Troubleshooting" per una discussione più approfondita (10). Tuttavia, una cosa facile da provare è ridurre la massa dell'analita iniettato e vedere se la forma del picco migliora. Se è così, allora questo è un buon indizio che il problema è "sovraccarico di massa". può essere ottenuto anche con masse iniettate maggiori.
Esistono anche molte potenziali ragioni fisiche per il peak tailing. I lettori interessati a una discussione dettagliata delle possibilità possono fare riferimento a un altro numero recente di "LC Troubleshooting" (11). Una delle cause fisiche più comuni del peak tailing è una scarsa connessione in un punto tra l'iniettore e il rivelatore (12). Un esempio estremo è mostrato nella Figura 1d, ottenuta nel mio laboratorio poche settimane fa. ed su un capillare in acciaio inossidabile. Dopo alcuni esperimenti iniziali per la risoluzione dei problemi, ci siamo resi conto che la profondità della porta nello statore della valvola di iniezione era molto più profonda di quanto eravamo abituati, risultando in un grande volume morto nella parte inferiore della porta. Questo problema è facilmente risolto sostituendo il circuito di iniezione con un altro tubo, possiamo regolare la ghiera nella posizione corretta per eliminare il volume morto nella parte inferiore della porta.
I fronti di picco come quelli mostrati nella Figura 1e possono anche essere causati da problemi fisici o chimici. Una causa fisica comune del bordo d'attacco è che il letto di particelle della colonna non è ben compattato o che le particelle si sono riorganizzate nel tempo. trattenuto dalla fase stazionaria (quindi, il fattore di ritenzione) è linearmente correlato alla concentrazione dell'analita nella colonna. Cromatograficamente, ciò significa che all'aumentare della massa dell'analita iniettato nella colonna, il picco diventa più alto, ma non più largo. Come per il sovraccarico di massa che causa l'accodamento del picco (10), anche l'anticipo del picco causato dalla ritenzione non lineare può essere diagnosticato riducendo la massa dell'analita iniettato.
A volte osserviamo quello che sembra essere un picco "diviso", come mostrato nella Figura 1f. Il primo passo per risolvere questo problema è determinare se la forma del picco è dovuta alla coeluizione parziale (ovvero, la presenza di due composti distinti ma che eluiscono strettamente). .Spesso, l'indizio più importante per questa decisione è se tutti i picchi nel cromatogramma presentano forme divise o solo uno o due. Se sono solo uno o due, è probabilmente un problema di coeluizione;se tutti i picchi sono divisi, è probabilmente un problema fisico, molto probabilmente correlato alla colonna stessa.
I picchi di divisione relativi alle proprietà fisiche della colonna stessa sono solitamente dovuti a fritte di ingresso o uscita parzialmente bloccate, o alla riorganizzazione delle particelle nella colonna, che consente alla fase mobile di fluire più velocemente della fase mobile in alcune aree della formazione del canale della colonna. in altre regioni (11). La fritta parzialmente ostruita può talvolta essere eliminata invertendo il flusso attraverso la colonna;tuttavia, nella mia esperienza, questa è solitamente una soluzione a breve termine piuttosto che a lungo termine. Questo è spesso fatale con le colonne moderne se le particelle si ricombinano all'interno della colonna. A questo punto, è meglio sostituire la colonna e continuare.
Il picco nella figura 1g, anche da un recente caso nel mio laboratorio, di solito indica che il segnale è così alto che ha raggiunto l'estremità superiore dell'intervallo di risposta. Per i rivelatori di assorbanza ottica (UV-vis in questo caso), quando la concentrazione dell'analita è molto alta, l'analita assorbe la maggior parte della luce che passa attraverso la cella di flusso del rivelatore, lasciando pochissima luce da rilevare. ”, rendendo il segnale molto “sfocato” in apparenza e indipendente dalla concentrazione dell'analita.Quando ciò accade, il problema può spesso essere facilmente risolto riducendo il volume di iniezione dell'analita, riducendo il volume di iniezione, diluendo il campione o entrambi.
Nella scuola di cromatografia, usiamo il segnale del rivelatore (cioè l'asse y nel cromatogramma) come indicatore della concentrazione dell'analita nel campione. Quindi sembra strano vedere un cromatogramma con un segnale inferiore allo zero, poiché la semplice interpretazione è che questo indica una concentrazione negativa dell'analita - che ovviamente non è fisicamente possibile.
In questo caso, un picco negativo significa semplicemente che le molecole che eluiscono dalla colonna assorbono meno luce della fase mobile stessa immediatamente prima e dopo il picco. Ciò può verificarsi, ad esempio, quando si utilizzano lunghezze d'onda di rilevamento relativamente basse (<230 nm) e additivi della fase mobile che assorbono la maggior parte della luce a queste lunghezze d'onda. Tali additivi possono essere componenti del solvente della fase mobile come metanolo o componenti tampone come acetato o formiato. motivo fondamentale per evitarli di per sé (questo metodo è talvolta indicato come "rilevamento UV indiretto") (13). Tuttavia, se vogliamo davvero evitare del tutto i picchi negativi, nel caso del rilevamento dell'assorbanza, la soluzione migliore è utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento diversa in modo che l'analita assorba più della fase mobile, o modificare la composizione della fase mobile in modo che assorbano meno luce degli analiti.
I picchi negativi possono comparire anche quando si utilizza il rilevamento dell'indice di rifrazione (RI) quando l'indice di rifrazione di componenti diversi dall'analita nel campione, come la matrice del solvente, è diverso dall'indice di rifrazione della fase mobile. Ciò accade anche con il rilevamento UV-vis, ma questo effetto tende ad essere attenuato rispetto al rilevamento RI. In entrambi i casi, i picchi negativi possono essere ridotti al minimo abbinando più strettamente la composizione della matrice del campione a quella della fase mobile.
Nella terza parte sull'argomento di base della risoluzione dei problemi LC, ho discusso le situazioni in cui la forma dei picchi osservata differisce dalla forma dei picchi prevista o normale. Un'efficace risoluzione dei problemi di tali problemi inizia con la conoscenza delle forme dei picchi previste (basate sulla teoria o sull'esperienza precedente con i metodi esistenti), quindi le deviazioni da queste aspettative sono evidenti. risoluzione dei problemi, ma non coglie tutte le possibilità. I lettori interessati a un elenco più approfondito di cause e soluzioni possono fare riferimento alla "Guida alla risoluzione dei problemi di LC" di LCGC.
(4) Carta da parati LCGC "Guida alla risoluzione dei problemi LC". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.
Tempo di pubblicazione: luglio-04-2022