Alcuni argomenti sulla risoluzione dei problemi LC non sono mai fuori moda, poiché sussistono problemi nella pratica LC, anche se la tecnologia degli strumenti migliora nel tempo. Esistono molti modi in cui possono verificarsi problemi in un sistema LC e finire con una scarsa forma del picco. Quando si verificano problemi relativi alla forma del picco, un breve elenco di possibili cause per questi risultati aiuta a semplificare la nostra esperienza di risoluzione dei problemi.
È stato divertente scrivere questa rubrica "Risoluzione dei problemi LC" e pensare agli argomenti ogni mese, perché alcuni argomenti non passano mai di moda. Mentre nel campo della ricerca in cromatografia alcuni argomenti o idee diventano obsoleti poiché vengono sostituiti da idee più nuove e migliori, nel campo della risoluzione dei problemi, da quando il primo articolo sulla risoluzione dei problemi è apparso su questa rivista (all'epoca la rivista LC), poiché alcuni argomenti sono ancora rilevanti nel 1983 (1). Negli ultimi anni, ho concentrato diverse sezioni di Risoluzione dei problemi LC sulle tendenze contemporanee che influenzano la cromatografia liquida (LC) (ad esempio, il confronto relativo della nostra comprensione dell'effetto della pressione sulla ritenzione [2] Nuovi progressi) La nostra interpretazione dei risultati LC e come risolvere i problemi con i moderni strumenti LC. Nella puntata di questo mese, continuo la mia serie (3), iniziata a dicembre 2021, che si è concentrata su alcuni degli argomenti "vita o morte" della risoluzione dei problemi LC: elementi che sono ottimi per qualsiasi risolutore di problemi sono essenziali, indipendentemente dall'età del sistema che stiamo utilizzando. L'argomento principale di questa serie è altamente rilevante per la famosa tabella murale "Guida alla risoluzione dei problemi LC" (4) dell'LCGC esposta in molti laboratori. Per la terza parte di questa serie, ho scelto di concentrarmi sui problemi relativi alla forma o alle caratteristiche del picco. Incredibilmente, la tabella murale elenca 44 diverse potenziali cause di una scarsa forma del picco! Non possiamo considerare tutti questi problemi in dettaglio in un articolo, quindi in questa prima puntata sull'argomento, mi concentrerò su alcuni di quelli che vedo più spesso. Spero che gli utenti LC giovani e meno giovani trovino alcuni suggerimenti e promemoria utili su questo importante argomento.
Mi ritrovo sempre più spesso a rispondere alle domande sulla risoluzione dei problemi con "tutto è possibile". Questa risposta può sembrare facile quando si considerano osservazioni difficili da interpretare, ma la trovo spesso appropriata. Con molte possibili cause di una scarsa forma del picco, è importante mantenere una mente aperta quando si considera quale potrebbe essere il problema ed essere in grado di dare priorità alle potenziali cause per iniziare i nostri sforzi di risoluzione dei problemi, concentrandoci sulle possibilità più comuni, questo punto è molto importante.
Un passaggio fondamentale in qualsiasi esercizio di risoluzione dei problemi, ma che ritengo sottovalutato, è riconoscere che esiste un problema da risolvere. Riconoscere che esiste un problema spesso significa riconoscere che ciò che accade allo strumento è diverso dalle nostre aspettative, che sono plasmate dalla teoria, dalla conoscenza empirica e dall'esperienza (5). La "forma del picco" a cui si fa riferimento qui in realtà non si riferisce solo alla forma del picco (simmetrico, asimmetrico, liscio, soffice, bordo d'attacco, coda, ecc.), ma anche alla larghezza. Le nostre aspettative per la forma effettiva del picco sono semplici. La teoria (6) supporta bene l'aspettativa del libro di testo secondo cui, nella maggior parte dei casi, i picchi cromatografici dovrebbero essere simmetrici e conformi alla forma di una distribuzione gaussiana, come mostrato nella Figura 1a. Ciò che ci aspettiamo dalle larghezze dei picchi è una questione più complessa e discuteremo questo argomento in un articolo futuro. Le altre forme dei picchi nella Figura 1 mostrano alcune delle altre possibilità che potrebbero essere osservate, in altre parole, alcuni dei modi in cui le cose potrebbero andare male. Nel resto di questa puntata dedicheremo del tempo a discutere alcuni esempi specifici di situazioni che possono dare origine a questi tipi di forma.
A volte i picchi non vengono osservati affatto nel cromatogramma dove dovrebbero essere eluiti. Il grafico a parete sopra riportato indica che l'assenza di un picco (supponendo che il campione contenga effettivamente l'analita target a una concentrazione che dovrebbe rendere la risposta del rivelatore sufficiente a vederlo al di sopra del rumore) è solitamente correlata a qualche problema dello strumento o a condizioni errate della fase mobile (se osservate). picchi, solitamente troppo "deboli"). Un breve elenco di potenziali problemi e soluzioni in questa categoria è disponibile nella Tabella I.
Come accennato in precedenza, la questione di quanto allargamento del picco debba essere tollerato prima di prestare attenzione e cercare di risolverlo è un argomento complesso che discuterò in un articolo futuro. La mia esperienza è che un allargamento significativo del picco è spesso accompagnato da un cambiamento significativo nella forma del picco e lo scodamento del picco è più comune del pre-picco o della scissione. Tuttavia, anche i picchi nominalmente simmetrici risultano allargati, il che può essere causato da diversi motivi:
Ciascuno di questi problemi è stato discusso in dettaglio nei numeri precedenti di Troubleshooting LC e i lettori interessati possono fare riferimento a questi articoli per informazioni sulle cause profonde e sulle possibili soluzioni. Maggiori dettagli.
Peak tailing, peak fronting e splitting possono essere tutti causati da fenomeni chimici o fisici e l'elenco delle possibili soluzioni a questi problemi varia notevolmente, a seconda che si tratti di un problema chimico o fisico. Spesso, confrontando i diversi picchi in un cromatogramma, è possibile trovare indizi importanti su quale sia il colpevole. Se tutti i picchi in un cromatogramma presentano forme simili, la causa molto probabilmente non è fisica. Se solo uno o pochi picchi sono interessati, ma i restanti sembrano a posto, la causa è molto probabilmente chimica.
Le cause chimiche dello scodamento dei picchi sono troppo complesse per essere discusse brevemente qui. Il lettore interessato può consultare il recente numero di "LC Troubleshooting" per una discussione più approfondita (10). Tuttavia, un tentativo semplice è quello di ridurre la massa dell'analita iniettato e osservare se la forma del picco migliora. In tal caso, questo è un buon indizio che il problema è il "sovraccarico di massa". In questo caso, il metodo deve essere limitato all'iniezione di piccole masse di analita oppure le condizioni cromatografiche devono essere modificate in modo da ottenere buone forme dei picchi anche con masse iniettate maggiori.
Esistono anche molte potenziali cause fisiche per il peak tailing. I lettori interessati a una discussione dettagliata delle possibilità possono consultare un altro numero recente di "LC Troubleshooting" (11). Una delle cause fisiche più comuni del peak tailing è una connessione scadente in un punto tra l'iniettore e il rilevatore (12). Un esempio estremo è mostrato nella Figura 1d, ottenuta nel mio laboratorio alcune settimane fa. In questo caso, abbiamo costruito un sistema con una nuova valvola di iniezione che non avevamo mai usato prima e installato un circuito di iniezione di piccolo volume con una ghiera stampata su un capillare in acciaio inossidabile. Dopo alcuni esperimenti iniziali di risoluzione dei problemi, ci siamo resi conto che la profondità della porta nello statore della valvola di iniezione era molto più profonda del solito, con conseguente ampio volume morto sul fondo della porta. Questo problema si risolve facilmente sostituendo il circuito di iniezione con un altro tubo; possiamo regolare la ghiera nella posizione corretta per eliminare il volume morto sul fondo della porta.
Fronti di picco come quelli mostrati nella Figura 1e possono anche essere causati da problemi fisici o chimici. Una causa fisica comune del bordo d'attacco è che il letto di particelle della colonna non è ben impaccato, o che le particelle si sono riorganizzate nel tempo. Come con lo scodamento del picco causato da questo fenomeno fisico, il modo migliore per risolvere questo problema è sostituire la colonna e continuare. Fondamentalmente, le forme dei picchi del bordo d'attacco di origine chimica spesso derivano da ciò che chiamiamo condizioni di ritenzione "non lineari". In condizioni ideali (lineari), la quantità di analita trattenuta dalla fase stazionaria (quindi, il fattore di ritenzione) è linearmente correlata alla concentrazione dell'analita nella colonna. Cromatograficamente, ciò significa che all'aumentare della massa di analita iniettata nella colonna, il picco diventa più alto, ma non più largo. Questa relazione si interrompe quando il comportamento di ritenzione non è lineare e i picchi non solo diventano più alti ma anche più larghi man mano che viene iniettata più massa. Inoltre, le forme non lineari determinano la forma dei picchi cromatografici, con conseguente anticipo o bordi di uscita. Come nel caso del sovraccarico di massa che causa il picco di coda (10), anche il picco in anticipo causato dalla ritenzione non lineare può essere diagnosticato riducendo la massa dell'analita iniettato. Se la forma del picco migliora, il metodo deve essere modificato per non superare la qualità di iniezione che causa il bordo di attacco, oppure le condizioni cromatografiche devono essere cambiate per ridurre al minimo questo comportamento.
A volte osserviamo quello che sembra essere un picco "diviso", come mostrato nella Figura 1f. Il primo passo per risolvere questo problema è determinare se la forma del picco è dovuta a una co-eluizione parziale (vale a dire la presenza di due composti distinti ma che eluiscono molto vicino). Se in realtà ci sono due analiti diversi che eluiscono molto vicino, allora si tratta di migliorare la loro risoluzione (ad esempio, aumentando la selettività, la ritenzione o il conteggio delle piastre) e i picchi "divisi" apparenti sono correlati a prestazioni fisiche. Le prestazioni non hanno nulla a che fare con la colonna stessa. Spesso, l'indizio più importante per questa decisione è se tutti i picchi nel cromatogramma presentano forme divise o solo uno o due. Se sono solo uno o due, probabilmente è un problema di co-eluizione; se tutti i picchi sono divisi, probabilmente è un problema fisico, molto probabilmente correlato alla colonna stessa.
I picchi di divisione correlati alle proprietà fisiche della colonna stessa sono solitamente dovuti a frit di ingresso o di uscita parzialmente bloccati, o alla riorganizzazione delle particelle nella colonna, che consente alla fase mobile di fluire più velocemente della fase mobile in determinate aree della formazione del canale della colonna e in altre regioni (11). A volte i frit parzialmente ostruiti possono essere rimossi invertendo il flusso attraverso la colonna; tuttavia, secondo la mia esperienza, questa è solitamente una soluzione a breve termine piuttosto che a lungo termine. Questo è spesso fatale con le colonne moderne se le particelle si ricombinano all'interno della colonna. A questo punto, è meglio sostituire la colonna e continuare.
Il picco in Figura 1g, anch'esso rilevato di recente nel mio laboratorio, indica solitamente che il segnale è così alto da aver raggiunto il limite superiore dell'intervallo di risposta. Per i rivelatori ottici ad assorbanza (UV-vis in questo caso), quando la concentrazione dell'analita è molto elevata, l'analita assorbe la maggior parte della luce che attraversa la cella a flusso del rivelatore, lasciando pochissima luce da rilevare. In queste condizioni, il segnale elettrico proveniente dal fotorivelatore è fortemente influenzato da diverse fonti di rumore, come la luce parassita e la "corrente oscura", rendendo il segnale molto "sfocato" e indipendente dalla concentrazione dell'analita. In questo caso, il problema può essere spesso risolto facilmente riducendo il volume di iniezione dell'analita, diluendo il campione o entrambe le cose.
Nella scuola di cromatografia, usiamo il segnale del rivelatore (vale a dire l'asse y nel cromatogramma) come indicatore della concentrazione dell'analita nel campione. Quindi sembra strano vedere un cromatogramma con un segnale inferiore a zero, poiché l'interpretazione più semplice è che ciò indica una concentrazione negativa dell'analita, il che ovviamente non è fisicamente possibile. Nella mia esperienza, i picchi negativi si osservano più spesso quando si usano rivelatori ottici di assorbanza (ad esempio UV-vis).
In questo caso, un picco negativo significa semplicemente che le molecole che eluiscono dalla colonna assorbono meno luce della fase mobile stessa immediatamente prima e dopo il picco. Ciò può verificarsi, ad esempio, quando si utilizzano lunghezze d'onda di rilevamento relativamente basse (<230 nm) e additivi della fase mobile che assorbono la maggior parte della luce a queste lunghezze d'onda. Tali additivi possono essere componenti del solvente della fase mobile come metanolo o componenti del tampone come acetato o formiato. In realtà è possibile utilizzare i picchi negativi per preparare una curva di calibrazione e ottenere informazioni quantitative accurate, quindi non esiste una ragione fondamentale per evitarli di per sé (questo metodo è talvolta definito "rilevamento UV indiretto") (13). Tuttavia, se si desidera davvero evitare del tutto i picchi negativi, nel caso del rilevamento dell'assorbanza, la soluzione migliore è utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento diversa in modo che l'analita assorba più della fase mobile o modificare la composizione della fase mobile in modo che assorbano meno luce degli analiti.
Picchi negativi possono comparire anche quando si utilizza la rilevazione dell'indice di rifrazione (RI), quando l'indice di rifrazione di componenti diversi dall'analita nel campione, come la matrice del solvente, è diverso dall'indice di rifrazione della fase mobile. Ciò accade anche con la rilevazione UV-vis, ma questo effetto tende ad attenuarsi rispetto alla rilevazione dell'RI. In entrambi i casi, i picchi negativi possono essere ridotti al minimo facendo corrispondere più precisamente la composizione della matrice del campione a quella della fase mobile.
Nella terza parte sull'argomento di base della risoluzione dei problemi LC, ho discusso le situazioni in cui la forma del picco osservata differisce da quella prevista o normale. Una risoluzione efficace dei problemi di tali problemi inizia con la conoscenza delle forme del picco previste (in base alla teoria o all'esperienza precedente con i metodi esistenti), quindi le deviazioni da queste aspettative sono evidenti. I problemi di forma del picco hanno molte cause potenziali diverse (troppo ampia, coda, bordo d'attacco, ecc.). In questa puntata, discuterò in dettaglio alcune delle ragioni che vedo più spesso. Conoscere questi dettagli fornisce un buon punto di partenza per la risoluzione dei problemi, ma non cattura tutte le possibilità. I ​​lettori interessati a un elenco più dettagliato di cause e soluzioni possono fare riferimento alla tabella murale "Guida alla risoluzione dei problemi LC" LCGC.
(4) Tabella murale "Guida alla risoluzione dei problemi LC" LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisi dei dati ed elaborazione del segnale in cromatografia (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF e Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.