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La corrosione microbica (MIC) è un problema serio in molti settori, in quanto può portare a enormi perdite economiche.L'acciaio inossidabile super duplex 2707 (2707 HDSS) viene utilizzato in ambienti marini grazie alla sua eccellente resistenza chimica.Tuttavia, la sua resistenza alla MIC non è stata dimostrata sperimentalmente.Questo studio ha esaminato il comportamento del MIC 2707 HDSS causato dal batterio aerobico marino Pseudomonas aeruginosa.L'analisi elettrochimica ha mostrato che in presenza di biofilm di Pseudomonas aeruginosa nel mezzo 2216E, si verifica un cambiamento positivo nel potenziale di corrosione e un aumento della densità di corrente di corrosione.L'analisi della spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) ha mostrato una diminuzione del contenuto di Cr sulla superficie del campione sotto il biofilm.L'analisi visiva delle fosse ha mostrato che il biofilm di P. aeruginosa ha prodotto una profondità massima della fossa di 0,69 µm durante 14 giorni di incubazione.Sebbene questo sia piccolo, indica che 2707 HDSS non è completamente immune alla MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Gli acciai inossidabili duplex (DSS) sono ampiamente utilizzati in vari settori grazie alla perfetta combinazione di eccellenti proprietà meccaniche e resistenza alla corrosione1,2.Tuttavia, la vaiolatura localizzata si verifica ancora e compromette l'integrità di questo acciaio3,4.Il DSS non è resistente alla corrosione microbica (MIC)5,6.Nonostante l'ampia gamma di applicazioni per DSS, ci sono ancora ambienti in cui la resistenza alla corrosione di DSS non è sufficiente per l'uso a lungo termine.Ciò significa che sono necessari materiali più costosi con una maggiore resistenza alla corrosione.Jeon et al7 hanno scoperto che anche gli acciai inossidabili super duplex (SDSS) hanno alcune limitazioni in termini di resistenza alla corrosione.Pertanto, in alcuni casi, sono richiesti acciai inossidabili super duplex (HDSS) con maggiore resistenza alla corrosione.Ciò ha portato allo sviluppo di HDSS altamente legato.
La resistenza alla corrosione DSS dipende dal rapporto tra le fasi alfa e gamma e si esaurisce nelle regioni Cr, Mo e W 8, 9, 10 adiacenti alla seconda fase.L'HDSS contiene un alto contenuto di Cr, Mo e N11, quindi ha un'eccellente resistenza alla corrosione e un valore elevato (45-50) del numero di resistenza al pitting equivalente (PREN) determinato da % in peso di Cr + 3,3 (% in peso di Mo + 0,5% in peso.%W) + 16% in peso.N12.La sua eccellente resistenza alla corrosione dipende da una composizione bilanciata contenente circa il 50% di fasi ferritiche (α) e il 50% austenitiche (γ).L'HDSS ha migliori proprietà meccaniche e una maggiore resistenza alla corrosione da cloruro.La migliore resistenza alla corrosione estende l'uso dell'HDSS in ambienti con cloruri più aggressivi come gli ambienti marini.
I MIC sono un grave problema in molti settori come quello del petrolio, del gas e dell'acqua14.La MIC rappresenta il 20% di tutti i danni da corrosione15.La MIC è una corrosione bioelettrochimica che può essere osservata in molti ambienti.I biofilm che si formano sulle superfici metalliche modificano le condizioni elettrochimiche, influenzando così il processo di corrosione.È opinione diffusa che la corrosione MIC sia causata dai biofilm.I microrganismi elettrogenici divorano i metalli per ottenere l'energia di cui hanno bisogno per sopravvivere17.Recenti studi sulla MIC hanno dimostrato che l'EET (trasferimento di elettroni extracellulari) è il fattore limitante nella MIC indotta da microrganismi elettrogenici.Zhang et al.18 hanno dimostrato che gli intermediari di elettroni accelerano il trasferimento di elettroni tra le cellule di Desulfovibrio sessificans e l'acciaio inossidabile 304, con conseguente attacco MIC più grave.Anning et al.19 e Wenzlaff et al.20 hanno dimostrato che i biofilm di batteri corrosivi che riducono i solfati (SRB) possono assorbire direttamente gli elettroni dai substrati metallici, provocando gravi vaiolature.
È noto che il DSS è suscettibile alla MIC in terreni contenenti SRB, batteri che riducono il ferro (IRB), ecc. 21 .Questi batteri causano la vaiolatura localizzata sulla superficie del DSS sotto i biofilm22,23.A differenza del DSS, il MIC HDSS24 non è molto conosciuto.
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, mobile, a forma di bastoncino, ampiamente distribuito in natura25.Pseudomonas aeruginosa è anche un importante gruppo microbico nell'ambiente marino, causando elevate concentrazioni di MIC.Pseudomonas è attivamente coinvolto nel processo di corrosione ed è riconosciuto come colonizzatore pioniere durante la formazione del biofilm.Mahat et al.28 e Yuan et al.29 hanno dimostrato che Pseudomonas aeruginosa tende ad aumentare il tasso di corrosione dell'acciaio dolce e delle leghe in ambienti acquatici.
L'obiettivo principale di questo lavoro era studiare le proprietà del MIC 2707 HDSS causato dal batterio aerobico marino Pseudomonas aeruginosa utilizzando metodi elettrochimici, metodi di analisi della superficie e analisi dei prodotti di corrosione.Per studiare il comportamento del MIC 2707 HDSS sono stati eseguiti studi elettrochimici, tra cui il potenziale a circuito aperto (OCP), la resistenza alla polarizzazione lineare (LPR), la spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) e la potenziale polarizzazione dinamica.L'analisi spettrometrica a dispersione di energia (EDS) è stata eseguita per rilevare elementi chimici su una superficie corrosa.Inoltre, è stata utilizzata la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) per determinare la stabilità della passivazione del film di ossido sotto l'influenza di un ambiente marino contenente Pseudomonas aeruginosa.La profondità delle fosse è stata misurata con un microscopio confocale a scansione laser (CLSM).
La tabella 1 mostra la composizione chimica di 2707 HDSS.La tabella 2 mostra che 2707 HDSS ha eccellenti proprietà meccaniche con una resistenza allo snervamento di 650 MPa.Sulla fig.1 mostra la microstruttura ottica dell'HDSS 2707 trattato termicamente in soluzione.Nella microstruttura contenente circa il 50% di fasi di austenite e il 50% di ferrite, sono visibili bande allungate di fasi di austenite e ferrite senza fasi secondarie.
Sulla fig.2a mostra il potenziale a circuito aperto (Eocp) in funzione del tempo di esposizione per 2707 HDSS in terreno abiotico 2216E e brodo di P. aeruginosa per 14 giorni a 37°C.Mostra che il cambiamento più grande e significativo in Eocp si verifica entro le prime 24 ore.I valori di Eocp in entrambi i casi hanno raggiunto il picco di -145 mV (rispetto a SCE) intorno alle 16 h per poi scendere bruscamente, raggiungendo -477 mV (rispetto a SCE) e -236 mV (rispetto a SCE) per il campione abiotico.e P Pseudomonas aeruginosa rispettivamente).Dopo 24 ore, il valore Eocp 2707 HDSS per P. aeruginosa era relativamente stabile a -228 mV (rispetto a SCE), mentre il valore corrispondente per i campioni non biologici era di circa -442 mV (rispetto a SCE).Eocp in presenza di P. aeruginosa era piuttosto basso.
Studio elettrochimico di 2707 campioni HDSS in terreno abiotico e brodo di Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp in funzione del tempo di esposizione, (b) curve di polarizzazione al giorno 14, (c) Rp in funzione del tempo di esposizione e (d) icorr in funzione del tempo di esposizione.
La tabella 3 mostra i parametri di corrosione elettrochimica di 2707 campioni di HDSS esposti a terreni inoculati abiotici e Pseudomonas aeruginosa per un periodo di 14 giorni.Le tangenti delle curve anodo e catodo sono state estrapolate per ottenere intersezioni che danno densità di corrente di corrosione (icorr), potenziale di corrosione (Ecorr) e pendenza di Tafel (βα e βc) secondo metodi standard30,31.
Come mostrato in fig.2b, uno spostamento verso l'alto della curva di P. aeruginosa ha comportato un aumento di Ecorr rispetto alla curva abiotica.Il valore icorr, che è proporzionale alla velocità di corrosione, è aumentato a 0,328 µA cm-2 nel campione di Pseudomonas aeruginosa, che è quattro volte maggiore rispetto al campione non biologico (0,087 µA cm-2).
LPR è un classico metodo elettrochimico non distruttivo per l'analisi rapida della corrosione.È stato anche utilizzato per studiare MIC32.Sulla fig.2c mostra la resistenza di polarizzazione (Rp) in funzione del tempo di esposizione.Un valore Rp più alto significa meno corrosione.Entro le prime 24 ore, Rp 2707 HDSS ha raggiunto il picco di 1955 kΩ cm2 per i campioni abiotici e 1429 kΩ cm2 per i campioni di Pseudomonas aeruginosa.La Figura 2c mostra anche che il valore Rp è diminuito rapidamente dopo un giorno e poi è rimasto relativamente invariato nei successivi 13 giorni.Il valore Rp di un campione di Pseudomonas aeruginosa è di circa 40 kΩ cm2, che è molto inferiore al valore di 450 kΩ cm2 di un campione non biologico.
Il valore di icorr è proporzionale alla velocità di corrosione uniforme.Il suo valore può essere calcolato dalla seguente equazione di Stern-Giri:
Secondo Zoe et al.33, il valore tipico della pendenza B del Tafel in questo lavoro è stato assunto pari a 26 mV/dec.La figura 2d mostra che l'icorr del campione non biologico 2707 è rimasto relativamente stabile, mentre il campione di P. aeruginosa ha oscillato notevolmente dopo le prime 24 ore.I valori icorr dei campioni di P. aeruginosa erano di un ordine di grandezza superiori a quelli dei controlli non biologici.Questa tendenza è coerente con i risultati della resistenza alla polarizzazione.
EIS è un altro metodo non distruttivo utilizzato per caratterizzare le reazioni elettrochimiche su superfici corrose.Spettri di impedenza e valori di capacità calcolati di campioni esposti ad ambiente abiotico e soluzione di Pseudomonas aeruginosa, resistenza passiva del film/biofilm Rb formata sulla superficie del campione, resistenza al trasferimento di carica Rct, capacità elettrica a doppio strato Cdl (EDL) e parametri costanti dell'elemento di fase QCPE (CPE).Questi parametri sono stati ulteriormente analizzati adattando i dati utilizzando un modello di circuito equivalente (EEC).
Sulla fig.3 mostra tipici grafici di Nyquist (a e b) e grafici di Bode (a' e b') per 2707 campioni di HDSS in terreni abiotici e brodo di P. aeruginosa per diversi tempi di incubazione.Il diametro dell'anello di Nyquist diminuisce in presenza di Pseudomonas aeruginosa.Il diagramma di Bode (Fig. 3b') mostra l'aumento dell'impedenza totale.Informazioni sulla costante di tempo di rilassamento possono essere ottenute dai massimi di fase.Sulla fig.4 mostra le strutture fisiche basate su un monostrato (a) e un doppio strato (b) e le corrispondenti EEC.Il CPE viene introdotto nel modello CEE.La sua ammettenza e impedenza sono espresse come segue:
Due modelli fisici e corrispondenti circuiti equivalenti per adattare lo spettro di impedenza del campione 2707 HDSS:
dove Y0 è il valore del KPI, j è il numero immaginario o (-1)1/2, ω è la frequenza angolare, n è l'indice di potenza del KPI minore di uno35.L'inversione della resistenza al trasferimento di carica (cioè 1/Rct) corrisponde alla velocità di corrosione.Minore è Rct, maggiore è il tasso di corrosione27.Dopo 14 giorni di incubazione, l'Rct dei campioni di Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto i 32 kΩ cm2, che è molto inferiore ai 489 kΩ cm2 dei campioni non biologici (Tabella 4).
Le immagini CLSM e le immagini SEM nella Figura 5 mostrano chiaramente che il rivestimento del biofilm sulla superficie del campione HDSS 2707 dopo 7 giorni è denso.Tuttavia, dopo 14 giorni, la copertura del biofilm era scarsa e sono comparse alcune cellule morte.La tabella 5 mostra lo spessore del biofilm su 2707 campioni HDSS dopo l'esposizione a P. aeruginosa per 7 e 14 giorni.Lo spessore massimo del biofilm è passato da 23,4 µm dopo 7 giorni a 18,9 µm dopo 14 giorni.Anche lo spessore medio del biofilm ha confermato questa tendenza.È diminuito da 22,2 ± 0,7 μm dopo 7 giorni a 17,8 ± 1,0 μm dopo 14 giorni.
(a) immagine CLSM 3-D a 7 giorni, (b) immagine CLSM 3-D a 14 giorni, (c) immagine SEM a 7 giorni e (d) immagine SEM a 14 giorni.
I campi elettromagnetici hanno rivelato elementi chimici in biofilm e prodotti di corrosione su campioni esposti a P. aeruginosa per 14 giorni.Sulla fig.La Figura 6 mostra che il contenuto di C, N, O e P nei biofilm e nei prodotti di corrosione è significativamente più elevato rispetto ai metalli puri, poiché questi elementi sono associati ai biofilm e ai loro metaboliti.I microbi hanno bisogno solo di tracce di cromo e ferro.Livelli elevati di Cr e Fe nel biofilm e prodotti di corrosione sulla superficie dei campioni indicano che la matrice metallica ha perso elementi a causa della corrosione.
Dopo 14 giorni, nel terreno 2216E sono state osservate fossette con e senza P. aeruginosa.Prima dell'incubazione, la superficie dei campioni era liscia e priva di difetti (Fig. 7a).Dopo l'incubazione e la rimozione del biofilm e dei prodotti di corrosione, le fosse più profonde sulla superficie dei campioni sono state esaminate utilizzando CLSM, come mostrato in Fig. 7b e c.Nessuna vaiolatura evidente è stata trovata sulla superficie dei controlli non biologici (profondità massima di vaiolatura 0,02 µm).La profondità massima della fossa causata da P. aeruginosa era di 0,52 µm a 7 giorni e di 0,69 µm a 14 giorni, sulla base della profondità massima media della fossa di 3 campioni (sono state selezionate 10 profondità massime della fossa per ciascun campione).Raggiungimento rispettivamente di 0,42 ± 0,12 µm e 0,52 ± 0,15 µm (Tabella 5).Questi valori di profondità del foro sono piccoli ma importanti.
(a) prima dell'esposizione, (b) 14 giorni in un ambiente abiotico e (c) 14 giorni in brodo di Pseudomonas aeruginosa.
Sulla fig.La Tabella 8 mostra gli spettri XPS di varie superfici campione e la composizione chimica analizzata per ciascuna superficie è riassunta nella Tabella 6. Nella Tabella 6, le percentuali atomiche di Fe e Cr in presenza di P. aeruginosa (campioni A e B) erano molto inferiori a quelle dei controlli non biologici.(campioni C e D).Per un campione di P. aeruginosa, la curva spettrale a livello del nucleo Cr 2p è stata adattata a quattro componenti di picco con energie di legame (BE) di 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, che possono essere attribuite a Cr, Cr2O3, CrO3.e Cr(OH)3, rispettivamente (Fig. 9a e b).Per i campioni non biologici, lo spettro del livello principale di Cr 2p contiene due picchi principali per Cr (573,80 eV per BE) e Cr2O3 (575,90 eV per BE) nelle Figg.9c e d, rispettivamente.La differenza più evidente tra campioni abiotici e campioni di P. aeruginosa era la presenza di Cr6+ e una proporzione relativa più elevata di Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) sotto il biofilm.
Gli ampi spettri XPS della superficie del campione 2707 HDSS in due supporti sono rispettivamente di 7 e 14 giorni.
(a) 7 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (b) 14 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (c) 7 giorni in un ambiente abiotico e (d) 14 giorni in un ambiente abiotico.
HDSS mostra un alto livello di resistenza alla corrosione nella maggior parte degli ambienti.Kim et al.2 hanno riferito che l'HDSS UNS S32707 è stato identificato come un DSS altamente legato con un PREN maggiore di 45. Il valore PREN del campione 2707 HDSS in questo lavoro era 49. Ciò è dovuto all'alto contenuto di cromo e all'alto contenuto di molibdeno e nichel, che sono utili in ambienti acidi.e ambienti con alto contenuto di cloruri.Inoltre, una composizione ben bilanciata e una microstruttura priva di difetti sono utili per la stabilità strutturale e la resistenza alla corrosione.Tuttavia, nonostante la sua eccellente resistenza chimica, i dati sperimentali in questo lavoro suggeriscono che 2707 HDSS non è completamente immune alle MIC del biofilm di P. aeruginosa.
I risultati elettrochimici hanno mostrato che il tasso di corrosione di 2707 HDSS nel brodo di P. aeruginosa è aumentato significativamente dopo 14 giorni rispetto all'ambiente non biologico.Nella Figura 2a, è stata osservata una diminuzione di Eocp sia nel mezzo abiotico che nel brodo di P. aeruginosa durante le prime 24 ore.Successivamente, il biofilm copre completamente la superficie del campione e Eocp diventa relativamente stabile36.Tuttavia, il livello Eocp biologico era molto più alto del livello Eocp non biologico.Ci sono ragioni per credere che questa differenza sia associata alla formazione di biofilm di P. aeruginosa.Sulla fig.2d in presenza di P. aeruginosa, il valore HDSS di icorr 2707 ha raggiunto 0,627 μA cm-2, che è un ordine di grandezza superiore a quello del controllo abiotico (0,063 μA cm-2), coerente con il valore Rct misurato da EIS.Durante i primi giorni, i valori di impedenza nel brodo di P. aeruginosa sono aumentati a causa dell'adesione delle cellule di P. aeruginosa e della formazione di biofilm.Tuttavia, quando il biofilm copre completamente la superficie del campione, l'impedenza diminuisce.Lo strato protettivo viene attaccato principalmente a causa della formazione di biofilm e metaboliti del biofilm.Di conseguenza, la resistenza alla corrosione è diminuita nel tempo e l'attaccamento di P. aeruginosa ha causato corrosione localizzata.Le tendenze negli ambienti abiotici erano diverse.La resistenza alla corrosione del controllo non biologico era molto superiore al valore corrispondente dei campioni esposti al brodo di P. aeruginosa.Inoltre, per le accessioni abiotiche, il valore Rct 2707 HDSS ha raggiunto 489 kΩ cm2 il giorno 14, che è 15 volte superiore al valore Rct (32 kΩ cm2) in presenza di P. aeruginosa.Pertanto, 2707 HDSS ha un'eccellente resistenza alla corrosione in un ambiente sterile, ma non è resistente alle MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Questi risultati possono anche essere osservati dalle curve di polarizzazione nelle Figg.2b.La ramificazione anodica è stata associata alla formazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa e alle reazioni di ossidazione dei metalli.In questo caso, la reazione catodica è la riduzione dell'ossigeno.La presenza di P. aeruginosa ha aumentato significativamente la densità di corrente di corrosione, circa un ordine di grandezza superiore rispetto al controllo abiotico.Ciò indica che il biofilm di P. aeruginosa migliora la corrosione localizzata di 2707 HDSS.Yuan et al.29 hanno scoperto che la densità di corrente di corrosione della lega Cu-Ni 70/30 aumenta sotto l'azione del biofilm di P. aeruginosa.Ciò può essere dovuto alla biocatalisi della riduzione dell'ossigeno da parte dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa.Questa osservazione può anche spiegare il MIC 2707 HDSS in questo lavoro.Potrebbe anche esserci meno ossigeno sotto i biofilm aerobici.Pertanto, il rifiuto di ri-passivare la superficie metallica con l'ossigeno può essere un fattore che contribuisce alla MIC in questo lavoro.
Dikinson et al.38 ha suggerito che la velocità delle reazioni chimiche ed elettrochimiche può essere direttamente influenzata dall'attività metabolica dei batteri sessili sulla superficie del campione e dalla natura dei prodotti di corrosione.Come mostrato nella Figura 5 e nella Tabella 5, il numero di cellule e lo spessore del biofilm sono diminuiti dopo 14 giorni.Ciò può essere ragionevolmente spiegato dal fatto che dopo 14 giorni, la maggior parte delle cellule sessili sulla superficie di 2707 HDSS è morta a causa dell'esaurimento dei nutrienti nel mezzo 2216E o del rilascio di ioni metallici tossici dalla matrice 2707 HDSS.Questa è una limitazione degli esperimenti batch.
In questo lavoro, un biofilm di P. aeruginosa ha contribuito all'esaurimento locale di Cr e Fe sotto il biofilm sulla superficie di 2707 HDSS (Fig. 6).La tabella 6 mostra la riduzione di Fe e Cr nel campione D rispetto al campione C, indicando che il Fe e il Cr disciolti causati dal biofilm di P. aeruginosa persistevano per i primi 7 giorni.L'ambiente 2216E viene utilizzato per simulare l'ambiente marino.Contiene 17700 ppm Cl-, che è paragonabile al suo contenuto nell'acqua di mare naturale.La presenza di 17700 ppm Cl- è stata la ragione principale della diminuzione di Cr nei campioni abiotici di 7 e 14 giorni analizzati mediante XPS.Rispetto ai campioni di P. aeruginosa, la dissoluzione del Cr nei campioni abiotici era molto inferiore a causa della forte resistenza del 2707 HDSS al cloro in condizioni abiotiche.Sulla fig.9 mostra la presenza di Cr6+ nel film passivante.Potrebbe essere coinvolto nella rimozione del cromo dalle superfici in acciaio da parte dei biofilm di P. aeruginosa, come suggerito da Chen e Clayton.
A causa della crescita batterica, i valori di pH del terreno prima e dopo la coltivazione erano rispettivamente di 7,4 e 8,2.Pertanto, al di sotto del biofilm di P. aeruginosa, è improbabile che la corrosione dell'acido organico contribuisca a questo lavoro a causa del pH relativamente alto nel mezzo di massa.Il pH del terreno di controllo non biologico non è cambiato in modo significativo (dall'iniziale 7,4 al finale 7,5) durante il periodo di test di 14 giorni.L'aumento del pH nel mezzo di semina dopo l'incubazione era dovuto all'attività metabolica di P. aeruginosa e si è riscontrato che aveva lo stesso effetto sul pH in assenza di strisce reattive.
Come mostrato nella Figura 7, la profondità massima della fossa causata dal biofilm di P. aeruginosa era di 0,69 µm, che è molto maggiore di quella del mezzo abiotico (0,02 µm).Ciò è coerente con i dati elettrochimici sopra descritti.La profondità della fossa di 0,69 µm è più di dieci volte inferiore al valore di 9,5 µm riportato per 2205 DSS nelle stesse condizioni.Questi dati mostrano che 2707 HDSS mostra una migliore resistenza ai MIC rispetto a 2205 DSS.Ciò non dovrebbe sorprendere poiché 2707 HDSS ha livelli di Cr più elevati che forniscono una passivazione più lunga, più difficile da depassivare P. aeruginosa e, a causa della sua struttura di fase bilanciata senza dannose precipitazioni secondarie, provoca pitting.
In conclusione, i pozzi MIC sono stati trovati sulla superficie di 2707 HDSS nel brodo di P. aeruginosa rispetto ai pozzi insignificanti nell'ambiente abiotico.Questo lavoro mostra che 2707 HDSS ha una migliore resistenza alla MIC rispetto a 2205 DSS, ma non è completamente immune alla MIC a causa del biofilm di P. aeruginosa.Questi risultati aiutano nella selezione degli acciai inossidabili adatti e dell'aspettativa di vita per l'ambiente marino.
Buono per 2707 HDSS fornito dalla Northeastern University (NEU) School of Metallurgy di Shenyang, in Cina.La composizione elementare di 2707 HDSS è mostrata nella Tabella 1, che è stata analizzata dal dipartimento di analisi e prove dei materiali del NEU.Tutti i campioni sono stati trattati per la soluzione solida a 1180°C per 1 ora.Prima del test di corrosione, un HDSS 2707 a forma di moneta con una superficie aperta superiore di 1 cm2 è stato lucidato a grana 2000 con carta vetrata al carburo di silicio e quindi lucidato con un impasto di polvere Al2O3 da 0,05 µm.I fianchi e il fondo sono protetti con vernice inerte.Dopo l'essiccazione, i campioni sono stati lavati con acqua deionizzata sterile e sterilizzati con etanolo al 75% (v/v) per 0,5 ore.Sono stati quindi asciugati all'aria sotto la luce ultravioletta (UV) per 0,5 ore prima dell'uso.
Il ceppo marino di Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 è stato acquistato dallo Xiamen Marine Culture Collection Center (MCCC), Cina.Pseudomonas aeruginosa è stata coltivata in condizioni aerobiche a 37° C. in flaconi da 250 ml e celle elettrochimiche di vetro da 500 ml utilizzando il mezzo liquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina).Il terreno contiene (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0016 6NH26NH3, 3.0016 NH3 5.0 peptone, 1.0 estratto di lievito e 0.1 citrato di ferro.Sterilizzare in autoclave a 121°C per 20 minuti prima dell'inoculazione.Contare le cellule sessili e planctoniche con un emocitometro al microscopio ottico a 400 ingrandimenti.La concentrazione iniziale di Pseudomonas aeruginosa planctonica immediatamente dopo l'inoculazione era di circa 106 cellule/ml.
I test elettrochimici sono stati eseguiti in una classica cella di vetro a tre elettrodi con un volume medio di 500 ml.Il foglio di platino e l'elettrodo a calomelano saturo (SAE) sono stati collegati al reattore tramite capillari Luggin riempiti con ponti salini, che fungevano rispettivamente da controelettrodo e elettrodo di riferimento.Per la fabbricazione degli elettrodi di lavoro, il filo di rame gommato è stato attaccato a ciascun campione e ricoperto di resina epossidica, lasciando circa 1 cm2 di area non protetta per l'elettrodo di lavoro su un lato.Durante le misurazioni elettrochimiche, i campioni sono stati posti nel terreno 2216E e mantenuti a una temperatura di incubazione costante (37°C) in un bagno d'acqua.OCP, LPR, EIS e potenziali dati di polarizzazione dinamica sono stati misurati utilizzando un potenziostato Autolab (riferimento 600TM, Gamry Instruments, Inc., USA).I test LPR sono stati registrati a una velocità di scansione di 0,125 mV s-1 nell'intervallo da -5 a 5 mV con Eocp e una frequenza di campionamento di 1 Hz.L'EIS è stato eseguito con un'onda sinusoidale su un intervallo di frequenza compreso tra 0,01 e 10.000 Hz utilizzando una tensione applicata di 5 mV allo stato stazionario Eocp.Prima della scansione del potenziale, gli elettrodi erano in modalità inattiva fino al raggiungimento di un valore stabile del potenziale di corrosione libera.Le curve di polarizzazione sono state quindi misurate da -0,2 a 1,5 V in funzione di Eocp a una velocità di scansione di 0,166 mV/s.Ciascun test è stato ripetuto 3 volte con e senza P. aeruginosa.
I campioni per l'analisi metallografica sono stati lucidati meccanicamente con carta SiC a grana 2000 bagnata e poi ulteriormente lucidati con una sospensione di polvere di Al2O3 da 0,05 µm per l'osservazione ottica.L'analisi metallografica è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico.I campioni sono stati mordenzati con una soluzione al 10% in peso di idrossido di potassio 43.
Dopo l'incubazione, i campioni sono stati lavati 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e quindi fissati con glutaraldeide al 2,5% (v/v) per 10 ore per fissare i biofilm.È stato quindi disidratato con etanolo dosato (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% in volume) prima dell'essiccazione all'aria.Infine, un film d'oro viene depositato sulla superficie del campione per fornire conduttività per l'osservazione SEM.Le immagini SEM sono state focalizzate sui punti con le cellule di P. aeruginosa più sessili sulla superficie di ciascun campione.Eseguire un'analisi EDS per trovare elementi chimici.Per misurare la profondità della fossa è stato utilizzato un microscopio a scansione laser confocale Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Germania).Per osservare i pozzi di corrosione sotto il biofilm, il campione di prova è stato prima pulito secondo lo standard nazionale cinese (CNS) GB/T4334.4-2000 per rimuovere i prodotti di corrosione e il biofilm dalla superficie del campione di prova.
L'analisi della spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS, ESCALAB250 surface analysis system, Thermo VG, USA) è stata eseguita utilizzando una sorgente di raggi X monocromatica (linea di alluminio Kα con un'energia di 1500 eV e una potenza di 150 W) in un'ampia gamma di energie di legame 0 in condizioni standard di -1350 eV.Spettri ad alta risoluzione sono stati registrati utilizzando un'energia di trasmissione di 50 eV e un passo di 0,2 eV.
I campioni incubati sono stati rimossi e lavati delicatamente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) per 15 s45.Per osservare la vitalità batterica dei biofilm sui campioni, i biofilm sono stati colorati utilizzando il kit di vitalità batterica BacLight LIVE/DEAD (Invitrogen, Eugene, OR, USA).Il kit contiene due coloranti fluorescenti: colorante fluorescente verde SYTO-9 e colorante fluorescente rosso ioduro di propidio (PI).In CLSM, i punti fluorescenti verdi e rossi rappresentano rispettivamente cellule vive e morte.Per la colorazione, 1 ml di una miscela contenente 3 µl di SYTO-9 e 3 µl di soluzione PI è stato incubato per 20 minuti a temperatura ambiente (23°C) al buio.Successivamente, i campioni colorati sono stati esaminati a due lunghezze d'onda (488 nm per le cellule vive e 559 nm per le cellule morte) utilizzando un apparecchio Nikon CLSM (C2 Plus, Nikon, Giappone).Lo spessore del biofilm è stato misurato in modalità di scansione 3D.
Come citare questo articolo: Li, H. et al.Corrosione microbica dell'acciaio inossidabile super duplex 2707 da biofilm marino di Pseudomonas aeruginosa.la scienza.6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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