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La corrosione microbica (MIC) rappresenta un problema serio in molti settori industriali, in quanto può comportare ingenti perdite economiche. L'acciaio inossidabile super duplex 2707 (2707 HDSS) viene utilizzato in ambienti marini grazie alla sua eccellente resistenza chimica. Tuttavia, la sua resistenza alla MIC non è stata dimostrata sperimentalmente. Questo studio ha esaminato il comportamento della MIC 2707 HDSS causata dal batterio aerobio marino Pseudomonas aeruginosa. L'analisi elettrochimica ha mostrato che, in presenza di biofilm di Pseudomonas aeruginosa nel mezzo 2216E, si verifica una variazione positiva del potenziale di corrosione e un aumento della densità di corrente di corrosione. L'analisi della spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) ha mostrato una diminuzione del contenuto di Cr sulla superficie del campione sotto il biofilm. L'analisi visiva delle fossette ha mostrato che il biofilm di P. aeruginosa ha prodotto una profondità massima di fossette di 0,69 µm durante 14 giorni di incubazione. Sebbene questo valore sia basso, indica che 2707 HDSS non è completamente immune alla MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Gli acciai inossidabili duplex (DSS) sono ampiamente utilizzati in diversi settori grazie alla perfetta combinazione di eccellenti proprietà meccaniche e resistenza alla corrosione1,2. Tuttavia, si verificano ancora fenomeni di vaiolatura localizzata che compromettono l'integrità di questo acciaio3,4. Il DSS non è resistente alla corrosione microbica (MIC)5,6. Nonostante l'ampia gamma di applicazioni del DSS, esistono ancora ambienti in cui la resistenza alla corrosione del DSS non è sufficiente per un utilizzo a lungo termine. Ciò significa che sono necessari materiali più costosi con una maggiore resistenza alla corrosione. Jeon et al7 hanno scoperto che anche gli acciai inossidabili super duplex (SDSS) presentano alcune limitazioni in termini di resistenza alla corrosione. Pertanto, in alcuni casi, sono necessari acciai inossidabili super duplex (HDSS) con una maggiore resistenza alla corrosione. Ciò ha portato allo sviluppo di HDSS altamente legati.
La resistenza alla corrosione del DSS dipende dal rapporto tra fasi alfa e gamma e si impoverisce nelle regioni 8, 9, 10 di Cr, Mo e W adiacenti alla seconda fase. L'HDSS contiene un alto contenuto di Cr, Mo e N11, pertanto presenta un'eccellente resistenza alla corrosione e un elevato valore (45-50) dell'indice di resistenza alla corrosione equivalente (PREN) determinato da % in peso di Cr + 3,3 (% in peso di Mo + 0,5% in peso di W) + 16% in peso di N12. La sua eccellente resistenza alla corrosione dipende da una composizione bilanciata contenente circa il 50% di fasi ferritiche (α) e il 50% di fasi austenitiche (γ). L'HDSS presenta migliori proprietà meccaniche e una maggiore resistenza alla corrosione da cloruri. La migliore resistenza alla corrosione estende l'uso dell'HDSS in ambienti con cloruri più aggressivi, come gli ambienti marini.
Le MIC rappresentano un problema importante in molti settori, come quello petrolifero, del gas e idrico14. Le MIC rappresentano il 20% di tutti i danni da corrosione15. Le MIC sono una corrosione bioelettrochimica osservabile in molti ambienti. I biofilm che si formano sulle superfici metalliche modificano le condizioni elettrochimiche, influenzando così il processo di corrosione. È opinione diffusa che la corrosione da MIC sia causata dai biofilm. I microrganismi elettrogenici erodono i metalli per ottenere l'energia necessaria alla loro sopravvivenza17. Recenti studi sulle MIC hanno dimostrato che l'EET (trasferimento elettronico extracellulare) è il fattore limitante la velocità delle MIC indotte da microrganismi elettrogenici. Zhang et al. 18 hanno dimostrato che gli intermediari elettronici accelerano il trasferimento di elettroni tra le cellule di Desulfovibrio sessificans e l'acciaio inossidabile 304, con conseguente attacco da MIC più grave. Anning et al. 19 e Wenzlaff et al. 20 hanno dimostrato che i biofilm dei batteri solfato-riduttori corrosivi (SRB) possono assorbire direttamente gli elettroni dai substrati metallici, causando una grave corrosione.
È noto che il DSS è sensibile alla MIC in terreni contenenti SRB, batteri ferro-riduttori (IRB), ecc. 21 . Questi batteri causano vaiolature localizzate sulla superficie del DSS sotto i biofilm 22,23. A differenza del DSS, la MIC dell'HDSS24 non è ben nota.
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, mobile, a forma di bastoncello, ampiamente distribuito in natura25. Pseudomonas aeruginosa è anche un importante gruppo microbico nell'ambiente marino, causando elevate concentrazioni di MIC. Pseudomonas è attivamente coinvolto nel processo di corrosione ed è riconosciuto come un colonizzatore pioniere durante la formazione del biofilm. Mahat et al. 28 e Yuan et al. 29 hanno dimostrato che Pseudomonas aeruginosa tende ad aumentare la velocità di corrosione dell'acciaio dolce e delle leghe in ambienti acquatici.
L'obiettivo principale di questo lavoro era indagare le proprietà del MIC 2707 HDSS, causato dal batterio aerobio marino Pseudomonas aeruginosa, utilizzando metodi elettrochimici, metodi di analisi superficiale e analisi dei prodotti di corrosione. Sono stati condotti studi elettrochimici, tra cui potenziale a circuito aperto (OCP), resistenza di polarizzazione lineare (LPR), spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) e polarizzazione dinamica del potenziale, per studiare il comportamento del MIC 2707 HDSS. È stata condotta un'analisi spettrometrica a dispersione di energia (EDS) per rilevare elementi chimici su una superficie corrosa. Inoltre, è stata utilizzata la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) per determinare la stabilità della passivazione del film di ossido sotto l'influenza di un ambiente marino contenente Pseudomonas aeruginosa. La profondità delle cavità è stata misurata con un microscopio confocale a scansione laser (CLSM).
La Tabella 1 mostra la composizione chimica dell'HDSS 2707. La Tabella 2 mostra che l'HDSS 2707 possiede eccellenti proprietà meccaniche, con un limite di snervamento di 650 MPa. La Figura 1 mostra la microstruttura ottica dell'HDSS 2707 trattato termicamente in soluzione. Nella microstruttura, contenente circa il 50% di fasi austenite e il 50% di ferrite, sono visibili bande allungate di fasi austenite e ferrite senza fasi secondarie.
La figura 2a mostra il potenziale a circuito aperto (Eocp) in funzione del tempo di esposizione per 2707 HDSS in terreno abiotico 2216E e brodo di P. aeruginosa per 14 giorni a 37 °C. Si evidenzia che la variazione più significativa e significativa dell'Eocp si verifica entro le prime 24 ore. I valori di Eocp in entrambi i casi hanno raggiunto un picco a -145 mV (rispetto a SCE) intorno alle 16 ore, per poi scendere bruscamente, raggiungendo -477 mV (rispetto a SCE) e -236 mV (rispetto a SCE) per il campione abiotico e per i campioni di P. aeruginosa. Dopo 24 ore, il valore di Eocp 2707 HDSS per P. aeruginosa era relativamente stabile a -228 mV (rispetto a SCE), mentre il valore corrispondente per i campioni non biologici era di circa -442 mV (rispetto a SCE). L'Eocp in presenza di P. aeruginosa era piuttosto basso.
Studio elettrochimico di 2707 campioni di HDSS in mezzo abiotico e brodo di Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp in funzione del tempo di esposizione, (b) curve di polarizzazione al giorno 14, (c) Rp in funzione del tempo di esposizione e (d) icorr in funzione del tempo di esposizione.
La Tabella 3 mostra i parametri di corrosione elettrochimica di 2707 campioni di HDSS esposti a mezzi abiotici e inoculati con Pseudomonas aeruginosa per un periodo di 14 giorni. Le tangenti delle curve di anodo e catodo sono state estrapolate per ottenere intersezioni che forniscono la densità di corrente di corrosione (icorr), il potenziale di corrosione (Ecorr) e la pendenza di Tafel (βα e βc) secondo metodi standard30,31.
Come mostrato in figura 2b, uno spostamento verso l'alto della curva di P. aeruginosa ha determinato un aumento di Ecorr rispetto alla curva abiotica. Il valore di Ecorr, proporzionale alla velocità di corrosione, è aumentato a 0,328 µA cm-2 nel campione di Pseudomonas aeruginosa, un valore quattro volte superiore a quello del campione non biologico (0,087 µA cm-2).
LPR è un classico metodo elettrochimico non distruttivo per l'analisi rapida della corrosione. È stato utilizzato anche per studiare la MIC32. La figura 2c mostra la resistenza di polarizzazione (Rp) in funzione del tempo di esposizione. Un valore di Rp più elevato significa minore corrosione. Entro le prime 24 ore, Rp 2707 HDSS ha raggiunto un picco di 1955 kΩ cm2 per i campioni abiotici e 1429 kΩ cm2 per i campioni di Pseudomonas aeruginosa. La figura 2c mostra anche che il valore di Rp è diminuito rapidamente dopo un giorno, per poi rimanere relativamente invariato nei successivi 13 giorni. Il valore di Rp di un campione di Pseudomonas aeruginosa è di circa 40 kΩ cm2, un valore molto inferiore a quello di 450 kΩ cm2 di un campione non biologico.
Il valore di icorr è proporzionale alla velocità di corrosione uniforme. Il suo valore può essere calcolato dalla seguente equazione di Stern-Giri:
Secondo Zoe et al. 33, il valore tipico della pendenza B di Tafel in questo lavoro è stato assunto pari a 26 mV/dec. La Figura 2d mostra che l'icorr del campione non biologico 2707 è rimasto relativamente stabile, mentre il campione di P. aeruginosa ha subito notevoli fluttuazioni dopo le prime 24 ore. I valori di icorr dei campioni di P. aeruginosa erano di un ordine di grandezza superiori a quelli dei controlli non biologici. Questa tendenza è coerente con i risultati della resistenza alla polarizzazione.
L'EIS è un altro metodo non distruttivo utilizzato per caratterizzare le reazioni elettrochimiche sulle superfici corrose. Sono stati analizzati gli spettri di impedenza e i valori di capacità calcolati di campioni esposti ad ambiente abiotico e a una soluzione di Pseudomonas aeruginosa, la resistenza del film passivo/biofilm Rb formato sulla superficie del campione, la resistenza al trasferimento di carica Rct, la capacità elettrica del doppio strato Cdl (EDL) e i parametri costanti dell'elemento di fase QCPE (CPE). Questi parametri sono stati ulteriormente analizzati adattando i dati utilizzando un modello di circuito equivalente (EEC).
La figura 3 mostra tipici diagrammi di Nyquist (a e b) e diagrammi di Bode (a' e b') per 2707 campioni di HDSS in terreni abiotici e brodo di P. aeruginosa per diversi tempi di incubazione. Il diametro dell'anello di Nyquist diminuisce in presenza di Pseudomonas aeruginosa. Il diagramma di Bode (Fig. 3b') mostra l'aumento dell'impedenza totale. Informazioni sulla costante di tempo di rilassamento possono essere ottenute dai massimi di fase. La figura 4 mostra le strutture fisiche basate su un monostrato (a) e un doppio strato (b) e i corrispondenti EEC. Il CPE viene introdotto nel modello EEC. La sua ammettenza e impedenza sono espresse come segue:
Due modelli fisici e corrispondenti circuiti equivalenti per adattare lo spettro di impedenza del campione 2707 HDSS:
dove Y0 è il valore KPI, j è il numero immaginario o (-1)1/2, ω è la frequenza angolare, n è l'indice di potenza KPI inferiore a uno35. L'inversione della resistenza al trasferimento di carica (ovvero 1/Rct) corrisponde alla velocità di corrosione. Minore è l'Rct, maggiore è la velocità di corrosione27. Dopo 14 giorni di incubazione, l'Rct dei campioni di Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto 32 kΩ cm2, un valore molto inferiore ai 489 kΩ cm2 dei campioni non biologici (Tabella 4).
Le immagini CLSM e SEM in Figura 5 mostrano chiaramente che il rivestimento del biofilm sulla superficie del campione HDSS 2707 dopo 7 giorni è denso. Tuttavia, dopo 14 giorni, la copertura del biofilm era scarsa e sono comparse alcune cellule morte. La Tabella 5 mostra lo spessore del biofilm sui campioni HDSS 2707 dopo esposizione a P. aeruginosa per 7 e 14 giorni. Lo spessore massimo del biofilm è cambiato da 23,4 µm dopo 7 giorni a 18,9 µm dopo 14 giorni. Anche lo spessore medio del biofilm ha confermato questa tendenza. È diminuito da 22,2 ± 0,7 µm dopo 7 giorni a 17,8 ± 1,0 µm dopo 14 giorni.
(a) Immagine CLSM 3D a 7 giorni, (b) Immagine CLSM 3D a 14 giorni, (c) Immagine SEM a 7 giorni e (d) Immagine SEM a 14 giorni.
I campi elettromagnetici (EMF) hanno rivelato elementi chimici nei biofilm e nei prodotti di corrosione su campioni esposti a P. aeruginosa per 14 giorni. Nella Figura 6 si mostra che il contenuto di C, N, O e P nei biofilm e nei prodotti di corrosione è significativamente più elevato rispetto ai metalli puri, poiché questi elementi sono associati ai biofilm e ai loro metaboliti. I microbi necessitano solo di tracce di cromo e ferro. Elevati livelli di Cr e Fe nel biofilm e nei prodotti di corrosione sulla superficie dei campioni indicano che la matrice metallica ha perso elementi a causa della corrosione.
Dopo 14 giorni, sono state osservate fossette con e senza P. aeruginosa nel terreno di coltura 2216E. Prima dell'incubazione, la superficie dei campioni era liscia e priva di difetti (Fig. 7a). Dopo l'incubazione e la rimozione del biofilm e dei prodotti di corrosione, le fossette più profonde sulla superficie dei campioni sono state esaminate utilizzando CLSM, come mostrato nelle Fig. 7b e c. Non è stata riscontrata alcuna vaiolatura evidente sulla superficie dei controlli non biologici (profondità massima della vaiolatura 0,02 µm). La profondità massima della vaiolatura causata da P. aeruginosa è stata di 0,52 µm a 7 giorni e di 0,69 µm a 14 giorni, sulla base della profondità massima media delle fossette di 3 campioni (sono state selezionate 10 profondità massime delle fossette per ciascun campione). Sono state raggiunte rispettivamente 0,42 ± 0,12 µm e 0,52 ± 0,15 µm (Tabella 5). Questi valori di profondità del foro sono piccoli ma importanti.
(a) prima dell'esposizione, (b) 14 giorni in un ambiente abiotico e (c) 14 giorni nel brodo di Pseudomonas aeruginosa.
Nella figura 8 sono riportati gli spettri XPS di diverse superfici di campioni, mentre la composizione chimica analizzata per ciascuna superficie è riassunta nella Tabella 6. Nella Tabella 6, le percentuali atomiche di Fe e Cr in presenza di P. aeruginosa (campioni A e B) erano molto inferiori a quelle dei controlli non biologici (campioni C e D). Per un campione di P. aeruginosa, la curva spettrale a livello del nucleo Cr2p è stata adattata a quattro componenti di picco con energie di legame (BE) di 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, attribuibili rispettivamente a Cr, Cr2O3, CrO3 e Cr(OH)3 (Fig. 9a e b). Per i campioni non biologici, lo spettro del livello principale di Cr2p presenta due picchi principali per Cr (573,80 eV per BE) e Cr2O3 (575,90 eV per BE) rispettivamente nelle Figure 9c e d. La differenza più evidente tra i campioni abiotici e quelli di P. aeruginosa è stata la presenza di Cr6+ e una maggiore proporzione relativa di Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) sotto il biofilm.
Gli ampi spettri XPS della superficie del campione 2707 HDSS in due supporti sono rispettivamente di 7 e 14 giorni.
(a) 7 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (b) 14 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (c) 7 giorni in un ambiente abiotico e (d) 14 giorni in un ambiente abiotico.
L'HDSS mostra un'elevata resistenza alla corrosione nella maggior parte degli ambienti. Kim et al.2 hanno riportato che l'HDSS UNS S32707 è stato identificato come un DSS altamente legato con un PREN superiore a 45. Il valore PREN del campione 2707 HDSS in questo lavoro era 49. Ciò è dovuto all'elevato contenuto di cromo e all'elevato contenuto di molibdeno e nichel, utili in ambienti acidi e con elevato contenuto di cloruri. Inoltre, una composizione ben bilanciata e una microstruttura priva di difetti sono vantaggiose per la stabilità strutturale e la resistenza alla corrosione. Tuttavia, nonostante la sua eccellente resistenza chimica, i dati sperimentali di questo lavoro suggeriscono che l'HDSS 2707 non è completamente immune alle MIC del biofilm di P. aeruginosa.
I risultati elettrochimici hanno mostrato che la velocità di corrosione dell'HDSS 2707 nel brodo di P. aeruginosa è aumentata significativamente dopo 14 giorni rispetto all'ambiente non biologico. In Figura 2a, è stata osservata una diminuzione dell'Eocp sia nel mezzo abiotico che nel brodo di P. aeruginosa durante le prime 24 ore. Successivamente, il biofilm ricopre completamente la superficie del campione e l'Eocp diventa relativamente stabile36. Tuttavia, il livello di Eocp biologico era molto più alto del livello di Eocp non biologico. Vi sono ragioni per ritenere che questa differenza sia associata alla formazione di biofilm di P. aeruginosa. In Figura 2d, in presenza di P. aeruginosa, il valore di icorr 2707 HDSS ha raggiunto 0,627 μA cm-2, un ordine di grandezza superiore a quello del controllo abiotico (0,063 μA cm-2), il che era coerente con il valore Rct misurato mediante EIS. Durante i primi giorni, i valori di impedenza nel brodo di P. aeruginosa sono aumentati a causa dell'adesione delle cellule di P. aeruginosa e della formazione di biofilm. Tuttavia, quando il biofilm ricopre completamente la superficie del campione, l'impedenza diminuisce. Lo strato protettivo viene attaccato principalmente a causa della formazione di biofilm e dei relativi metaboliti. Di conseguenza, la resistenza alla corrosione è diminuita nel tempo e l'adesione di P. aeruginosa ha causato corrosione localizzata. Gli andamenti in ambienti abiotici sono stati diversi. La resistenza alla corrosione del controllo non biologico è stata molto superiore al valore corrispondente dei campioni esposti al brodo di P. aeruginosa. Inoltre, per le accessioni abiotiche, il valore HDSS di Rct 2707 ha raggiunto 489 kΩ cm2 il giorno 14, che è 15 volte superiore al valore di Rct (32 kΩ cm2) in presenza di P. aeruginosa. Pertanto, l'HDSS 2707 ha un'eccellente resistenza alla corrosione in un ambiente sterile, ma non è resistente alle MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Questi risultati possono essere osservati anche dalle curve di polarizzazione nelle Fig. 2b. La ramificazione anodica è stata associata alla formazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa e alle reazioni di ossidazione dei metalli. In questo caso, la reazione catodica è la riduzione dell'ossigeno. La presenza di P. aeruginosa ha aumentato significativamente la densità di corrente di corrosione, circa un ordine di grandezza superiore rispetto al controllo abiotico. Ciò indica che il biofilm di P. aeruginosa potenzia la corrosione localizzata dell'HDSS 2707. Yuan et al.29 hanno riscontrato che la densità di corrente di corrosione della lega Cu-Ni 70/30 è aumentata sotto l'azione del biofilm di P. aeruginosa. Ciò potrebbe essere dovuto alla biocatalisi della riduzione dell'ossigeno da parte dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa. Questa osservazione potrebbe anche spiegare la MIC dell'HDSS 2707 in questo lavoro. Potrebbe anche esserci meno ossigeno sotto i biofilm aerobici. Pertanto, il rifiuto di ripassivare la superficie metallica con ossigeno potrebbe essere un fattore che contribuisce alla MIC in questo lavoro.
Dickinson et al. 38 hanno suggerito che la velocità delle reazioni chimiche ed elettrochimiche può essere direttamente influenzata dall'attività metabolica dei batteri sessili sulla superficie del campione e dalla natura dei prodotti di corrosione. Come mostrato in Figura 5 e Tabella 5, il numero di cellule e lo spessore del biofilm sono diminuiti dopo 14 giorni. Ciò può essere ragionevolmente spiegato dal fatto che, dopo 14 giorni, la maggior parte delle cellule sessili sulla superficie dell'HDSS 2707 è morta a causa della deplezione dei nutrienti nel mezzo 2216E o del rilascio di ioni metallici tossici dalla matrice dell'HDSS 2707. Questa è una limitazione degli esperimenti in batch.
In questo lavoro, un biofilm di P. aeruginosa ha contribuito alla deplezione locale di Cr e Fe sotto il biofilm sulla superficie di 2707 HDSS (Fig. 6). La Tabella 6 mostra la riduzione di Fe e Cr nel campione D rispetto al campione C, indicando che il Fe e il Cr disciolti causati dal biofilm di P. aeruginosa sono persistiti per i primi 7 giorni. L'ambiente 2216E viene utilizzato per simulare l'ambiente marino. Contiene 17700 ppm di Cl-, che è paragonabile al suo contenuto nell'acqua di mare naturale. La presenza di 17700 ppm di Cl- è stata la ragione principale della diminuzione di Cr nei campioni abiotici di 7 e 14 giorni analizzati mediante XPS. Rispetto ai campioni di P. aeruginosa, la dissoluzione di Cr nei campioni abiotici è stata molto inferiore a causa della forte resistenza di 2707 HDSS al cloro in condizioni abiotiche. In fig. La Figura 9 mostra la presenza di Cr6+ nel film passivante. Potrebbe essere coinvolto nella rimozione del cromo dalle superfici in acciaio da parte dei biofilm di P. aeruginosa, come suggerito da Chen e Clayton.
A causa della crescita batterica, i valori di pH del terreno di coltura prima e dopo la coltivazione erano rispettivamente di 7,4 e 8,2. Pertanto, al di sotto del biofilm di P. aeruginosa, è improbabile che la corrosione da acidi organici contribuisca a questo risultato a causa del pH relativamente elevato del terreno di coltura. Il pH del terreno di coltura di controllo non biologico non è variato in modo significativo (da 7,4 iniziale a 7,5 finale) durante il periodo di prova di 14 giorni. L'aumento del pH nel terreno di coltura dei semi dopo l'incubazione era dovuto all'attività metabolica di P. aeruginosa e si è riscontrato che aveva lo stesso effetto sul pH in assenza di strisce reattive.
Come mostrato in Figura 7, la profondità massima delle fossette causata dal biofilm di P. aeruginosa è stata di 0,69 µm, molto maggiore di quella del mezzo abiotico (0,02 µm). Ciò è coerente con i dati elettrochimici descritti sopra. La profondità delle fossette di 0,69 µm è oltre dieci volte inferiore al valore di 9,5 µm riportato per il DSS 2205 nelle stesse condizioni. Questi dati mostrano che il DSS 2707 HDSS presenta una migliore resistenza alle MIC rispetto al DSS 2205. Ciò non dovrebbe sorprendere, poiché il DSS 2707 HDSS presenta livelli di Cr più elevati, che garantiscono una passivazione più lunga, una maggiore difficoltà di depassivazione di P. aeruginosa e, a causa della sua struttura di fase bilanciata senza precipitazioni secondarie dannose, causa vaiolatura.
In conclusione, sulla superficie dell'HDSS 2707 sono state riscontrate fossette di MIC nel brodo di P. aeruginosa, rispetto a fossette insignificanti nell'ambiente abiotico. Questo lavoro dimostra che l'HDSS 2707 ha una migliore resistenza alla MIC rispetto al DSS 2205, ma non è completamente immune alla MIC a causa del biofilm di P. aeruginosa. Questi risultati contribuiscono alla selezione di acciai inossidabili adatti e alla loro aspettativa di vita per l'ambiente marino.
Buono per 2707 HDSS fornito dalla Northeastern University (NEU) School of Metallurgy di Shenyang, Cina. La composizione elementare di 2707 HDSS è mostrata nella Tabella 1, analizzata dal Dipartimento di Analisi e Collaudo dei Materiali della NEU. Tutti i campioni sono stati trattati per soluzione solida a 1180 °C per 1 ora. Prima del test di corrosione, un campione di 2707 HDSS a forma di moneta con una superficie superiore aperta di 1 cm² è stato lucidato a grana 2000 con carta abrasiva al carburo di silicio e successivamente lucidato con una sospensione di polvere di Al₂O₂ da 0,05 µm. I lati e il fondo sono protetti con vernice inerte. Dopo l'asciugatura, i campioni sono stati lavati con acqua deionizzata sterile e sterilizzati con etanolo al 75% (v/v) per 0,5 ore. Sono stati quindi asciugati all'aria sotto luce ultravioletta (UV) per 0,5 ore prima dell'uso.
Il ceppo di Pseudomonas aeruginosa marina MCCC 1A00099 è stato acquistato dallo Xiamen Marine Culture Collection Center (MCCC), Cina. Pseudomonas aeruginosa è stata coltivata in condizioni aerobiche a 37 °C in fiasche da 250 ml e celle elettrochimiche in vetro da 500 ml utilizzando il terreno liquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina). Il terreno contiene (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 6NH26NH3, 3,0016 NH3, 5,0 peptone, 1,0 estratto di lievito e 0,1 citrato di ferro. Autoclavare a 121 °C per 20 minuti prima dell'inoculazione. Contare le cellule sessili e planctoniche con un emocitometro al microscopio ottico a 400 ingrandimenti. La concentrazione iniziale di Pseudomonas aeruginosa planctonica subito dopo l'inoculazione era di circa 106 cellule/ml.
I test elettrochimici sono stati condotti in una classica cella di vetro a tre elettrodi con un volume medio di 500 ml. La lamina di platino e l'elettrodo a calomelano saturo (SAE) sono stati collegati al reattore tramite capillari di Luggin riempiti con ponti salini, che fungevano rispettivamente da controelettrodo e da elettrodo di riferimento. Per la fabbricazione degli elettrodi di lavoro, a ciascun campione è stato applicato un filo di rame gommato e ricoperto con resina epossidica, lasciando circa 1 cm² di area non protetta per l'elettrodo di lavoro su un lato. Durante le misurazioni elettrochimiche, i campioni sono stati immersi nel mezzo 2216E e mantenuti a una temperatura di incubazione costante (37 °C) in un bagno d'acqua. I dati di OCP, LPR, EIS e polarizzazione dinamica del potenziale sono stati misurati utilizzando un potenziostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., USA). I ​​test LPR sono stati registrati a una velocità di scansione di 0,125 mV s-1 nell'intervallo da -5 a 5 mV con Eocp e una frequenza di campionamento di 1 Hz. L'EIS è stato eseguito con un'onda sinusoidale su un intervallo di frequenza da 0,01 a 10.000 Hz utilizzando una tensione applicata di 5 mV a Eocp in stato stazionario. Prima della scansione del potenziale, gli elettrodi sono rimasti in modalità di riposo fino al raggiungimento di un valore stabile del potenziale di corrosione libera. Le curve di polarizzazione sono state quindi misurate da -0,2 a 1,5 V in funzione di Eocp a una velocità di scansione di 0,166 mV/s. Ogni test è stato ripetuto 3 volte con e senza P. aeruginosa.
I campioni per l'analisi metallografica sono stati lucidati meccanicamente con carta vetrata al SiC a grana 2000 bagnata e successivamente lucidati ulteriormente con una sospensione di polvere di Al₂O₂ a 0,05 µm per l'osservazione ottica. L'analisi metallografica è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico. I campioni sono stati incisi con una soluzione al 10% in peso di idrossido di potassio 43.
Dopo l'incubazione, i campioni sono stati lavati 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e quindi fissati con glutaraldeide al 2,5% (v/v) per 10 ore per fissare i biofilm. Il campione è stato quindi disidratato con etanolo a dosaggi (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% in volume) prima dell'essiccazione all'aria. Infine, un film d'oro viene depositato sulla superficie del campione per fornire conduttività per l'osservazione al microscopio elettronico a scansione (SEM). Le immagini SEM sono state focalizzate sui punti con le cellule di P. aeruginosa più sessili sulla superficie di ciascun campione. Eseguire un'analisi EDS per individuare gli elementi chimici. Un microscopio confocale a scansione laser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Germania) è stato utilizzato per misurare la profondità delle fossette. Per osservare le cavità di corrosione sotto il biofilm, il campione di prova è stato prima pulito secondo lo standard nazionale cinese (CNS) GB/T4334.4-2000 per rimuovere i prodotti della corrosione e il biofilm dalla superficie del campione di prova.
L'analisi spettroscopica fotoelettronica a raggi X (XPS, sistema di analisi di superficie ESCALAB250, Thermo VG, USA) è stata eseguita utilizzando una sorgente di raggi X monocromatica (linea Kα in alluminio con energia di 1500 eV e potenza di 150 W) in un ampio intervallo di energie di legame pari a 0 in condizioni standard di -1350 eV. Gli spettri ad alta risoluzione sono stati registrati utilizzando un'energia di trasmissione di 50 eV e un passo di 0,2 eV.
I campioni incubati sono stati rimossi e lavati delicatamente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) per 15 secondi e 45 secondi. Per osservare la vitalità batterica dei biofilm sui campioni, questi sono stati colorati utilizzando il kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Il kit contiene due coloranti fluorescenti: il colorante verde SYTO-9 e il colorante rosso ioduro di propidio (PI). Nel CLSM, i punti fluorescenti verdi e rossi rappresentano rispettivamente cellule vive e morte. Per la colorazione, 1 ml di una miscela contenente 3 µl di SYTO-9 e 3 µl di soluzione di PI è stato incubato per 20 minuti a temperatura ambiente (23 °C) al buio. Successivamente, i campioni colorati sono stati esaminati a due lunghezze d'onda (488 nm per le cellule vive e 559 nm per le cellule morte) utilizzando un apparecchio Nikon CLSM (C2 Plus, Nikon, Giappone). Lo spessore del biofilm è stato misurato mediante scansione 3D.
Come citare questo articolo: Li, H. et al. Corrosione microbica dell'acciaio inossidabile super duplex 2707 da parte del biofilm marino di Pseudomonas aeruginosa. the science. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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