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La biopsia liquida (LB) è un concetto che sta rapidamente guadagnando popolarità nel campo biomedico.Il concetto si basa principalmente sulla rilevazione di frammenti di DNA extracellulare circolante (ccfDNA), che vengono principalmente rilasciati come piccoli frammenti dopo la morte cellulare in vari tessuti.Una piccola percentuale di questi frammenti proviene da tessuti o organismi estranei (stranieri).Nel lavoro attuale, abbiamo applicato questo concetto alle cozze, una specie sentinella nota per la loro elevata capacità di filtrazione dell'acqua di mare.Usiamo la capacità delle cozze di agire come filtri naturali per catturare frammenti di DNA ambientale da una varietà di fonti per fornire informazioni sulla biodiversità degli ecosistemi marini costieri.I nostri risultati mostrano che l'emolinfa di cozza contiene frammenti di DNA di dimensioni molto variabili, da 1 a 5 kb.Il sequenziamento shotgun ha dimostrato che un gran numero di frammenti di DNA sono di origine microbica estranea.Tra questi, abbiamo trovato frammenti di DNA di batteri, archaea e virus, inclusi virus noti per infettare una varietà di ospiti che si trovano comunemente negli ecosistemi marini costieri.In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB applicato ai mitili rappresenta una ricca ma ancora inesplorata fonte di conoscenza sulla diversità microbica negli ecosistemi marini costieri.
L'impatto dei cambiamenti climatici (CC) sulla biodiversità degli ecosistemi marini è un'area di ricerca in rapida crescita.Il riscaldamento globale non solo provoca importanti stress fisiologici, ma spinge anche i limiti evolutivi della stabilità termica degli organismi marini, influenzando l'habitat di numerose specie, spingendole alla ricerca di condizioni più favorevoli [1, 2].Oltre a influenzare la biodiversità dei metazoi, il CC sconvolge il delicato equilibrio delle interazioni ospite-microbico.Questa dysbacteriosis microbica rappresenta una seria minaccia per gli ecosistemi marini in quanto rende gli organismi marini più suscettibili ai patogeni infettivi [3, 4].Si ritiene che le SS svolgano un ruolo importante nelle morti di massa, che rappresentano un serio problema per la gestione degli ecosistemi marini globali [5, 6].Si tratta di una questione importante visti gli impatti economici, ecologici e nutrizionali di molte specie marine.Ciò è particolarmente vero per i bivalvi che vivono nelle regioni polari, dove gli effetti della CK sono più immediati e gravi [6, 7].Infatti, bivalvi come Mytilus spp.sono ampiamente utilizzati per monitorare gli effetti del CC sugli ecosistemi marini.Non sorprende che sia stato sviluppato un numero relativamente elevato di biomarcatori per monitorare la loro salute, spesso utilizzando un approccio a due livelli che coinvolge biomarcatori funzionali basati sull'attività enzimatica o su funzioni cellulari come la vitalità cellulare e l'attività fagocitica [8].Questi metodi includono anche la misurazione della concentrazione di specifici indicatori di pressione che si accumulano nei tessuti molli dopo l'assorbimento di grandi quantità di acqua di mare.Tuttavia, l'elevata capacità di filtrazione e il sistema circolatorio semiaperto dei bivalvi offrono l'opportunità di sviluppare nuovi biomarcatori dell'emolinfa utilizzando il concetto di biopsia liquida (LB), un approccio semplice e minimamente invasivo alla gestione del paziente.campioni di sangue [9, 10].Sebbene nel LB umano si possano trovare diversi tipi di molecole circolanti, questo concetto si basa principalmente sull'analisi del sequenziamento del DNA dei frammenti di DNA extracellulare circolante (ccfDNA) nel plasma.Infatti, la presenza di DNA circolante nel plasma umano è nota dalla metà del XX secolo [11], ma è solo negli ultimi anni che l'avvento di metodi di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla diagnosi clinica basata sul ccfDNA.La presenza di questi frammenti di DNA circolante è dovuta in parte al rilascio passivo di DNA genomico (nucleare e mitocondriale) dopo la morte cellulare. Negli individui sani, la concentrazione di ccfDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL) ma può essere aumentata di 5-10 volte in pazienti affetti da varie patologie o sottoposti a stress, con conseguente danno tissutale. Negli individui sani, la concentrazione di ccfDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL) ma può essere aumentata di 5-10 volte in pazienti affetti da varie patologie o sottoposti a stress, con conseguente danno tissutale. Se il livello di controllo minimo è inferiore a 5–10 раз у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Nelle persone sane, la concentrazione di cccDNA è normalmente bassa (<10 ng/mL), ma può aumentare di 5-10 volte in pazienti con varie patologie o sotto stress che porta a danni ai tessuti.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5 -10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤CcfDNA di ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) su здоровых людей, non si può ottenere увеличены in 5-10 раз у пациентов con различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Le concentrazioni di ccfDNA sono generalmente basse (<10 ng/ml) negli individui sani, ma possono essere aumentate di 5-10 volte in pazienti con varie patologie o stress, con conseguente danno tissutale.La dimensione dei frammenti di ccfDNA varia ampiamente, ma di solito varia da 150 a 200 bp.[12].L'analisi del ccfDNA auto-derivato, cioè, ccfDNA da cellule ospiti normali o trasformate, può essere utilizzata per rilevare i cambiamenti genetici ed epigenetici presenti nel genoma nucleare e/o mitocondriale, aiutando così i medici a selezionare specifiche terapie mirate molecolari [13] .Tuttavia, il ccfDNA può essere ottenuto da fonti estranee come il ccfDNA da cellule fetali durante la gravidanza o da organi trapiantati [14,15,16,17].Il ccfDNA è anche un'importante fonte di informazioni per rilevare la presenza di acidi nucleici di un agente infettivo (estraneo), che consente il rilevamento non invasivo di infezioni diffuse non identificate dalle emocolture, evitando la biopsia invasiva del tessuto infetto [18].Studi recenti hanno infatti dimostrato che il sangue umano contiene una ricca fonte di informazioni che possono essere utilizzate per identificare agenti patogeni virali e batterici e che circa l'1% del ccfDNA trovato nel plasma umano è di origine straniera [19].Questi studi dimostrano che la biodiversità del microbioma circolante di un organismo può essere valutata utilizzando l'analisi del ccfDNA.Tuttavia, fino a poco tempo fa, questo concetto era utilizzato esclusivamente nell'uomo e, in misura minore, in altri vertebrati [20, 21].
Nel presente documento, utilizziamo il potenziale LB per analizzare il ccfDNA di Aulacomya atra, una specie meridionale che si trova comunemente nelle isole subantartiche Kerguelen, un gruppo di isole in cima a un grande altopiano formatosi 35 milioni di anni fa.eruzione vulcanica.Utilizzando un sistema sperimentale in vitro, abbiamo scoperto che i frammenti di DNA nell'acqua di mare vengono rapidamente assorbiti dai mitili ed entrano nel compartimento dell'emolinfa.Il sequenziamento del fucile da caccia ha dimostrato che il ccfDNA dell'emolinfa dei mitili contiene frammenti di DNA di origine propria e non propria, inclusi batteri simbiotici e frammenti di DNA provenienti da biomi tipici degli ecosistemi costieri marini vulcanici freddi.L'emolinfa ccfDNA contiene anche sequenze virali derivate da virus con diversi intervalli di ospiti.Abbiamo anche trovato frammenti di DNA di animali multicellulari come pesci ossei, anemoni di mare, alghe e insetti.In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB può essere applicato con successo agli invertebrati marini per generare un ricco repertorio genomico negli ecosistemi marini.
Adulti (55-70 mm di lunghezza) Mytilus platensis (M. platensis) e Aulacomya atra (A. atra) sono stati raccolti dalle coste rocciose intertidali di Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Isole Kerguelen nel dicembre 2018. Altre cozze blu adulte (Mytilus spp.) sono state ottenute da un fornitore commerciale (PEI Mussel King Inc., Isola del Principe Edoardo, Canada) e poste in un serbatoio aerato a temperatura controllata (4°C) contenente 10-20 L di salamoia artificiale al 32‰.(sale marino artificiale Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Per ogni esperimento sono stati misurati la lunghezza e il peso dei singoli gusci.
Un protocollo di accesso aperto gratuito per questo programma è disponibile online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).In breve, l'emolinfa LB è stata raccolta dai muscoli abduttori come descritto [22].L'emolinfa è stata chiarificata mediante centrifugazione a 1200 x g per 3 minuti, il supernatante è stato congelato (-20°C) fino all'uso.Per l'isolamento e la purificazione del cfDNA, i campioni (1,5-2,0 ml) sono stati scongelati e processati utilizzando il kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) secondo le istruzioni del produttore.Il ccfDNA è stato conservato a -80°C fino a ulteriori analisi.In alcuni esperimenti, ccfDNA è stato isolato e purificato utilizzando il QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Il DNA purificato è stato quantificato utilizzando un test PicoGreen standard.La distribuzione dei frammenti del ccfDNA isolato è stata analizzata mediante elettroforesi capillare utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizzando un kit DNA ad alta sensibilità.Il test è stato eseguito utilizzando 1 µl del campione di ccfDNA secondo le istruzioni del produttore.
Per il sequenziamento dei frammenti di emolinfa ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) ha preparato librerie shotgun utilizzando il kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75.È stato utilizzato un adattatore standard (BioO).I file di dati grezzi sono disponibili dall'archivio di lettura della sequenza NCBI (SRR8924808 e SRR8924809).La qualità della lettura di base è stata valutata utilizzando FastQC [23].Trimmomatic [24] è stato utilizzato per ritagliare adattatori e letture di scarsa qualità.Le letture shotgun con estremità accoppiate sono state unite in FLASH in letture singole più lunghe con una sovrapposizione minima di 20 bp per evitare disallineamenti [25]. Le letture unite sono state annotate con BLASTN utilizzando un database di tassonomia NCBI bivalve (valore e <1e-3 e omologia del 90%) e il mascheramento delle sequenze a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26]. Le letture unite sono state annotate con BLASTN utilizzando un database di tassonomia NCBI bivalve (valore e <1e-3 e omologia del 90%) e il mascheramento delle sequenze a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26]. L'elenco degli aggiornamenti disponibili con il programma BLASTN e l'elenco dei seguenti tassi di interesse sono stati rilasciati ллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с испол ьзованием POLVERE [26]. Le letture raggruppate sono state annotate con BLASTN utilizzando il database della tassonomia dei bivalvi NCBI (valore e < 1e-3 e omologia del 90%) e il mascheramento della sequenza a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 并 使用 polvere [26] 进行 复杂度 序列 的。 。 。 。蔽L'audio della canzone è stato scaricato da BLASTN con l'invio di suoni tattili da parte di BLASTN ых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием POLVERE [26]. Le letture raggruppate sono state annotate con BLASTN utilizzando il database tassonomico bivalve NCBI (valore e <1e-3 e omologia del 90%) e il mascheramento di sequenza a bassa complessità è stato eseguito utilizzando DUST [26].Le letture sono state divise in due gruppi: relative a sequenze bivalvi (qui chiamate auto-letture) e non correlate (non-auto-letture).Due gruppi sono stati assemblati separatamente utilizzando MEGAHIT per generare contigs [27].Nel frattempo, la distribuzione tassonomica delle letture del microbioma alieno è stata classificata utilizzando Kraken2 [28] e rappresentata graficamente da un grafico a torta Krona su Galaxy [29, 30].I kmer ottimali sono stati determinati in kmers-59 dai nostri esperimenti preliminari. I self contigs sono stati quindi identificati mediante allineamento con BLASTN (database NCBI bivalve, valore e <1e-10 e omologia del 60%) per un'annotazione finale. I self contigs sono stati quindi identificati mediante allineamento con BLASTN (database NCBI bivalve, valore e <1e-10 e omologia del 60%) per un'annotazione finale. I conti correnti non identificabili possono essere inviati a BLASTN (Blaza Dannых двустворчатых del NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) per le annotazioni valide. I self-contigs sono stati quindi identificati confrontando BLASTN (database bivalve NCBI, valore e <1e-10 e omologia del 60%) per l'annotazione finale.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% I nomi identificativi dei conti associati alle annotazioni locali possono essere inviati a BLASTN (basa dannati х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). I self-contigs sono stati quindi identificati per l'annotazione finale mediante corrispondenza con BLASTN (database bivalve NCBI, valore e <1e-10 e omologia del 60%). Parallelamente, i contig del gruppo non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e <1e-10 e omologia del 60%). Parallelamente, i contig del gruppo non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e <1e-10 e omologia del 60%). Parallelamente, i conti del gruppo sono stati selezionati con BLASTN (dall'anno nt NCBI, значение e <1e-10 e гомология 60%). Parallelamente, i contigs del gruppo straniero sono stati annotati con BLASTN (database NT NCBI, valore e <1e-10 e 60% di omologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Parallelamente i conti, non si sono rivolti al gruppo di esperti, sono stati nominati da BLASTN (dall'anno nt NCBI, зна чение e <1e-10 и гомология 60%). Parallelamente, i contigs del gruppo non self sono stati annotati con BLASTN (database NCBI nt, valore e <1e-10 e omologia del 60%). BLASTX è stato condotto anche su contig non self utilizzando i database NCBI delle proteine ​​​​nr e RefSeq (valore e <1e−10 e 60% di omologia). BLASTX è stato condotto anche su contig non self utilizzando i database NCBI delle proteine ​​​​nr e RefSeq (valore e <1e−10 e 60% di omologia). BLASTX ha anche rilasciato un nuovo numero di conti non distribuiti con il numero di riferimento del codice NCBI e RefSeq NCBI (grado e <1e-10) e гомология 60%). BLASTX è stato eseguito anche su contig non self utilizzando i database proteici nr e RefSeq NCBI (valore e <1e-10 e 60% di omologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX ha aggiunto un numero limitato di conti con l'elenco dei numeri di riferimento e RefSeq NCBI (classe e <1e-10 e гомология 60%). BLASTX è stato eseguito anche su contig non self utilizzando i database proteici nr e RefSeq NCBI (valore e <1e-10 e 60% di omologia).I pool BLASTN e BLASTX di contigs non self rappresentano i contigs finali (vedere file supplementare).
I primer utilizzati per la PCR sono elencati nella Tabella S1.La Taq DNA polimerasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) è stata utilizzata per amplificare i geni bersaglio ccfDNA.Sono state utilizzate le seguenti condizioni di reazione: denaturazione a 95°C per 3 minuti, 95°C per 1 minuto, temperatura di ricottura impostata per 1 minuto, allungamento a 72°C per 1 minuto, 35 cicli e infine 72°C entro 10 minuti..I prodotti della PCR sono stati separati mediante elettroforesi in gel di agarosio (1,5%) contenenti SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) a 95 V.
I mitili (Mytilus spp.) sono stati acclimatati in 500 ml di acqua di mare ossigenata (32 PSU) per 24 ore a 4°C.Il DNA plasmidico contenente un inserto che codifica la sequenza di cDNA della galectina-7 umana (numero di accesso NCBI L07769) è stato aggiunto alla fiala a una concentrazione finale di 190 μg/μl.Le cozze incubate nelle stesse condizioni senza aggiunta di DNA erano il controllo.La terza vasca di controllo conteneva DNA senza mitili.Per monitorare la qualità del DNA nell'acqua di mare, sono stati prelevati campioni di acqua di mare (20 μl; tre ripetizioni) da ciascun serbatoio all'ora indicata.Per la tracciabilità del DNA plasmidico, le cozze LB sono state raccolte nei tempi indicati e analizzate mediante qPCR e ddPCR.A causa dell'elevato contenuto di sale dell'acqua di mare, le aliquote sono state diluite in acqua di qualità PCR (1:10) prima di tutti i test PCR.
La PCR con goccioline digitali (ddPCR) è stata eseguita utilizzando il protocollo BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Utilizzare il profilo di temperatura per determinare la temperatura ottimale (tabella S1).Le gocce sono state generate utilizzando un generatore di gocce QX200 (BioRad).La ddPCR è stata eseguita come segue: 95°C per 5 min, 50 cicli di 95°C per 30 s e una determinata temperatura di annealing per 1 min e 72°C per 30 s, 4°C per 5 min e 90°C entro 5 minuti.Il numero di gocce e le reazioni positive (numero di copie/µl) sono stati misurati utilizzando un lettore di gocce QX200 (BioRad).I campioni con meno di 10.000 goccioline sono stati respinti.Il controllo del pattern non è stato eseguito ogni volta che è stato eseguito ddPCR.
qPCR è stata eseguita utilizzando Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) e primer specifici LGALS7.Tutte le PCR quantitative sono state eseguite in 20 µl utilizzando il kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).La qPCR è stata avviata con un'incubazione di 15 minuti a 95°C seguita da 40 cicli a 95°C per 10 secondi e a 60°C per 60 secondi con una raccolta di dati.Le curve di fusione sono state generate utilizzando misurazioni successive a 95°C per 5 s, 65°C per 60 s e 97°C alla fine della qPCR.Ogni qPCR è stata eseguita in triplicato, ad eccezione dei campioni di controllo.
Poiché le cozze sono note per il loro alto tasso di filtrazione, abbiamo prima studiato se potessero filtrare e trattenere i frammenti di DNA presenti nell'acqua di mare.Eravamo anche interessati a sapere se questi frammenti si accumulassero nel loro sistema linfatico semiaperto.Abbiamo risolto questo problema sperimentalmente tracciando il destino dei frammenti di DNA solubili aggiunti ai serbatoi di cozze blu.Per facilitare il tracciamento dei frammenti di DNA, abbiamo utilizzato DNA plasmidico estraneo (non autonomo) contenente il gene umano della galectina-7.ddPCR traccia frammenti di DNA plasmidico nell'acqua di mare e nei mitili.I nostri risultati mostrano che se la quantità di frammenti di DNA nell'acqua di mare è rimasta relativamente costante nel tempo (fino a 7 giorni) in assenza di cozze, in presenza di cozze questo livello è quasi completamente scomparso entro 8 ore (Fig. 1a, b).Frammenti di DNA esogeno sono stati facilmente rilevati entro 15 minuti nel fluido intravalvolare e nell'emolinfa (Fig. 1c).Questi frammenti potrebbero ancora essere rilevati fino a 4 ore dopo l'esposizione.Questa attività filtrante rispetto ai frammenti di DNA è paragonabile all'attività filtrante di batteri e alghe [31].Questi risultati suggeriscono che le cozze possono filtrare e accumulare DNA estraneo nei loro compartimenti fluidi.
Concentrazioni relative di DNA plasmidico nell'acqua di mare in presenza (A) o assenza (B) di cozze, misurate mediante ddPCR.In A, i risultati sono espressi in percentuale, con i bordi delle caselle che rappresentano il 75° e il 25° percentile.La curva logaritmica adattata è mostrata in rosso e l'area ombreggiata in grigio rappresenta l'intervallo di confidenza del 95%.In B, la linea rossa rappresenta la media e la linea blu rappresenta l'intervallo di confidenza al 95% per la concentrazione.C Accumulo di DNA plasmidico nell'emolinfa e nel fluido valvolare dei mitili in tempi diversi dopo l'aggiunta di DNA plasmidico.I risultati sono presentati come copie assolute rilevate/mL (±SE).
Successivamente, abbiamo studiato l'origine del ccfDNA nelle cozze raccolte dai mitili sulle isole Kerguelen, un remoto gruppo di isole con influenza antropica limitata.A tale scopo, il cccDNA da emolinfe di cozze è stato isolato e purificato con metodi comunemente usati per purificare il cccDNA umano [32, 33].Abbiamo scoperto che le concentrazioni medie di emolinfa ccfDNA nelle cozze sono nell'intervallo di microgrammi bassi per ml di emolinfa (vedi Tabella S2, Informazioni supplementari).Questa gamma di concentrazioni è molto più ampia che nelle persone sane (bassi nanogrammi per millilitro), ma in rari casi, nei malati di cancro, il livello di ccfDNA può raggiungere diversi microgrammi per millilitro [34, 35].Un'analisi della distribuzione delle dimensioni dell'emolinfa ccfDNA ha mostrato che questi frammenti variano notevolmente in termini di dimensioni, che vanno da 1000 bp a 1000 bp.fino a 5000 bp (Fig. 2).Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando il QIAamp Investigator Kit a base di silice, un metodo comunemente utilizzato nella scienza forense per isolare e purificare rapidamente il DNA genomico da campioni di DNA a bassa concentrazione, incluso il ccfDNA [36].
Elettroforgramma rappresentativo del ccfDNA dell'emolinfa di mitilo.Estratto con NucleoSnap Plasma Kit (in alto) e QIAamp DNA Investigator Kit.B Grafico a violino che mostra la distribuzione delle concentrazioni di emolinfa ccfDNA (± SE) nei mitili.Le linee nere e rosse rappresentano rispettivamente la mediana e il primo e il terzo quartile.
Circa l'1% del ccfDNA negli esseri umani e nei primati ha una fonte straniera [21, 37].Dato il sistema circolatorio semiaperto dei bivalvi, l'acqua di mare ricca di microbi e la distribuzione dimensionale del ccfDNA di cozze, abbiamo ipotizzato che il ccfDNA di emolinfa di cozze possa contenere un pool ricco e diversificato di DNA microbico.Per verificare questa ipotesi, abbiamo sequenziato il ccfDNA dell'emolinfa da campioni di Aulacomya atra raccolti dalle isole Kerguelen, ottenendo oltre 10 milioni di letture, il 97,6% delle quali ha superato il controllo di qualità.Le letture sono state quindi classificate in base a fonti auto e non auto utilizzando i database bivalvi BLASTN e NCBI (Fig. S1, Informazioni supplementari).
Negli esseri umani, sia il DNA nucleare che quello mitocondriale possono essere rilasciati nel flusso sanguigno [38].Tuttavia, nel presente studio, non è stato possibile descrivere in dettaglio il DNA genomico nucleare dei mitili, dato che il genoma di A. atra non è stato sequenziato o descritto.Tuttavia, siamo stati in grado di identificare un numero di frammenti di ccfDNA della nostra stessa origine utilizzando la libreria bivalve (Fig. S2, Informazioni supplementari).Abbiamo anche confermato la presenza di frammenti di DNA di nostra origine mediante amplificazione PCR diretta di quei geni A. atra che sono stati sequenziati (Fig. 3).Allo stesso modo, dato che il genoma mitocondriale di A. atra è disponibile nei database pubblici, si possono trovare prove della presenza di frammenti di ccfDNA mitocondriale nell'emolinfa di A. atra.La presenza di frammenti di DNA mitocondriale è stata confermata dall'amplificazione PCR (Fig. 3).
Vari geni mitocondriali erano presenti nell'emolinfa di A. atra (punti rossi - numero di magazzino: SRX5705969) e M. platensis (punti blu - numero di magazzino: SRX5705968) amplificati mediante PCR.Figura adattata da Breton et al., 2011 B Amplificazione del surnatante di emolinfa da A. atra Memorizzato su carta FTA.Utilizzare un punzone da 3 mm per aggiungere direttamente al tubo PCR contenente la miscela PCR.
Dato l'abbondante contenuto microbico nell'acqua di mare, inizialmente ci siamo concentrati sulla caratterizzazione delle sequenze di DNA microbico nell'emolinfa.Per fare ciò, utilizziamo due diverse strategie.La prima strategia ha utilizzato Kraken2, un programma di classificazione delle sequenze basato su algoritmi in grado di identificare sequenze microbiche con un'accuratezza paragonabile a BLAST e altri strumenti [28].Più di 6719 letture sono state determinate come di origine batterica, mentre 124 e 64 provenivano rispettivamente da archaea e virus (Fig. 4).I frammenti di DNA batterico più abbondanti erano Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) e Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Questa distribuzione è coerente con studi precedenti sul microbioma del mitilo blu marino [39, 40].I gammaproteobatteri erano la classe principale di proteobatteri (44%), inclusi molti vibrionales (figura 4b).Il metodo ddPCR ha confermato la presenza di frammenti di Vibrio DNA nel ccfDNA di A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Per ottenere maggiori informazioni sull'origine batterica del ccfDNA, è stato adottato un approccio aggiuntivo (Fig. S2, Informazioni supplementari). In questo caso, le letture sovrapposte sono state assemblate come letture paired-end e sono state classificate come di origine self (bivalvi) o non self utilizzando BLASTN e un valore e di 1e−3 e un cutoff con omologia> 90%. In questo caso, le letture sovrapposte sono state assemblate come letture paired-end e sono state classificate come di origine self (bivalvi) o non self utilizzando BLASTN e un valore e di 1e−3 e un cutoff con omologia> 90%. In questo periodo di osservazione perplessa, scrivi come prova con i tuoi conoscenti e le tue classi classiche come fai con te бственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. In questo caso, le letture sovrapposte sono state raccolte come letture accoppiate e sono state classificate come native (bivalvi) o non originali utilizzando BLASTN e valore e di 1e-3 e cutoff con omologia> 90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下, 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数, 使用 使用 使用 blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90%同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 In questo caso di ricerca di una classe, di una classe come di una classe e di una conoscenza comune ные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомол огии> 90%. In questo caso, le letture sovrapposte sono state raccolte come letture accoppiate e classificate come proprie (bivalvi) o non originali utilizzando i valori e BLASTN e 1e-3 e una soglia di omologia >90%.Poiché il genoma di A. atra non è stato ancora sequenziato, abbiamo utilizzato la strategia di assemblaggio de novo dell'assemblatore MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Un totale di 147.188 contig sono stati identificati come dipendenti (bivalvi) di origine.Questi contig sono stati quindi esplosi con valori e di 1e-10 utilizzando BLASTN e BLASTX.Questa strategia ci ha permesso di identificare 482 frammenti non bivalvi presenti in A. atra ccfDNA.Più della metà (57%) di questi frammenti di DNA sono stati ottenuti da batteri, principalmente da simbionti branchiali, inclusi simbionti sulfotrofici, e da simbionti branchiali Solemya velum (Fig. 5).
Abbondanza relativa a livello di tipo.B Diversità microbica di due phyla principali (Firmicutes e Proteobacteria).Amplificazione rappresentativa di ddPCR C Vibrio spp.A. Frammenti del gene 16S rRNA (blu) in tre atra emolinfe.
Sono stati analizzati un totale di 482 contig raccolti.Profilo generale della distribuzione tassonomica delle annotazioni contigue metagenomiche (procarioti ed eucarioti).B Distribuzione dettagliata dei frammenti di DNA batterico identificati da BLASTN e BLASTX.
L'analisi di Kraken2 ha anche mostrato che il ccfDNA di cozze conteneva frammenti di DNA arcaico, inclusi frammenti di DNA di Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) e Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).La presenza di frammenti di DNA derivati ​​da Euryarchaeota e Crenarchaeota, precedentemente trovati nella comunità microbica dei mitili californiani, non dovrebbe sorprendere [42].Sebbene Euryarchaeota sia spesso associato a condizioni estreme, è ora riconosciuto che sia Euryarchaeota che Crenarcheota sono tra i procarioti più comuni nell'ambiente criogenico marino [43, 44].La presenza di microrganismi metanogenici nei mitili non è sorprendente, dati i recenti rapporti di estese perdite di metano dalle perdite sul fondo dell'altopiano delle Kerguelen [45] e della possibile produzione microbica di metano osservata al largo delle isole Kerguelen [46].
La nostra attenzione si è poi spostata sulle letture dei virus del DNA.Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio fuori bersaglio del contenuto virale delle cozze.Come previsto, abbiamo trovato frammenti di DNA di batteriofagi (Caudovirales) (Fig. 6b).Tuttavia, il DNA virale più comune proviene da un phylum di nucleocitovirus, noto anche come virus del DNA citoplasmatico nucleare di grandi dimensioni (NCLDV), che ha il genoma più grande di qualsiasi altro virus.All'interno di questo phylum, la maggior parte delle sequenze di DNA appartiene alle famiglie Mimimidoviridae (58%) e Poxviridae (21%), i cui ospiti naturali includono vertebrati e artropodi, mentre una piccola parte di queste sequenze di DNA appartiene ad alghe virologiche note.Infetta le alghe eucariotiche marine.Le sequenze sono state ottenute anche dal virus Pandora, il virus gigante con la dimensione del genoma più grande di qualsiasi genere virale conosciuto.È interessante notare che la gamma di ospiti noti per essere infettati dal virus, come determinato dal sequenziamento dell'emolinfa ccfDNA, era relativamente ampia (Figura S3, Informazioni supplementari).Include virus che infettano insetti come Baculoviridae e Iridoviridae, nonché virus che infettano amebe, alghe e vertebrati.Abbiamo anche trovato sequenze corrispondenti al genoma del Pithovirus sibericum.I pitovirus (noti anche come "virus zombi") sono stati isolati per la prima volta dal permafrost di 30.000 anni in Siberia [47].Pertanto, i nostri risultati sono coerenti con precedenti rapporti che mostrano che non tutte le specie moderne di questi virus sono estinte [48] e che questi virus possono essere presenti in ecosistemi marini subartici remoti.
Infine, abbiamo testato per vedere se potevamo trovare frammenti di DNA di altri animali multicellulari.Un totale di 482 contig estranei sono stati identificati da BLASTN e BLASTX con librerie nt, nr e RefSeq (genomiche e proteiche).I nostri risultati mostrano che tra i frammenti estranei di ccfDNA di animali multicellulari predomina il DNA delle ossa ossee (Fig. 5).Sono stati trovati anche frammenti di DNA di insetti e altre specie.Una parte relativamente ampia dei frammenti di DNA non è stata identificata, probabilmente a causa della sottorappresentazione di un gran numero di specie marine nei database genomici rispetto alle specie terrestri [49].
Nel presente documento, applichiamo il concetto LB alle cozze, sostenendo che il sequenziamento dell'emolinfa ccfDNA può fornire informazioni sulla composizione degli ecosistemi marini costieri.In particolare, abbiamo scoperto che 1) l'emolinfa di cozza contiene concentrazioni relativamente elevate (livelli di microgrammi) di frammenti di DNA circolanti relativamente grandi (~ 1-5 kb);2) questi frammenti di DNA sono sia indipendenti che non indipendenti 3) Tra le fonti estranee di questi frammenti di DNA, abbiamo trovato DNA batterico, arcaico e virale, nonché DNA di altri animali multicellulari;4) L'accumulo di questi frammenti estranei di ccfDNA nell'emolinfa avviene rapidamente e contribuisce all'attività di filtraggio interno dei mitili.In conclusione, il nostro studio dimostra che il concetto di LB, finora applicato principalmente nel campo della biomedicina, codifica una ricca ma inesplorata fonte di conoscenza che può essere utilizzata per comprendere meglio l'interazione tra le specie sentinella e il loro ambiente.
Oltre ai primati, l'isolamento del ccfDNA è stato riportato nei mammiferi, inclusi topi, cani, gatti e cavalli [50, 51, 52].Tuttavia, a nostra conoscenza, il nostro studio è il primo a segnalare il rilevamento e il sequenziamento del ccfDNA nelle specie marine con un sistema di circolazione aperto.Questa caratteristica anatomica e la capacità di filtraggio dei mitili possono, almeno in parte, spiegare le diverse caratteristiche dimensionali dei frammenti di DNA circolanti rispetto ad altre specie.Negli esseri umani, la maggior parte dei frammenti di DNA che circolano nel sangue sono piccoli frammenti di dimensioni comprese tra 150 e 200 bp.con un picco massimo di 167 bp [34, 53].Una piccola ma significativa porzione di frammenti di DNA ha una dimensione compresa tra 300 e 500 bp e circa il 5% è più lunga di 900 bp.[54].La ragione di questa distribuzione dimensionale è che la principale fonte di ccfDNA nel plasma si verifica a causa della morte cellulare, a causa della morte cellulare o della necrosi delle cellule ematopoietiche circolanti in individui sani o dell'apoptosi delle cellule tumorali nei pazienti oncologici (noto come DNA tumorale circolante)., ctDNA).La distribuzione delle dimensioni del ccfDNA dell'emolinfa che abbiamo trovato nelle cozze variava da 1000 a 5000 bp, suggerendo che il ccfDNA della cozza ha un'origine diversa.Questa è un'ipotesi logica, poiché i mitili hanno un sistema vascolare semiaperto e vivono in ambienti acquatici marini contenenti alte concentrazioni di DNA genomico microbico.Infatti, i nostri esperimenti di laboratorio che utilizzano DNA esogeno hanno dimostrato che i mitili accumulano frammenti di DNA nell'acqua di mare, almeno dopo alcune ore vengono degradati dopo l'assorbimento cellulare e/o rilasciati e/o immagazzinati in varie organizzazioni.Data la rarità delle cellule (sia procariotiche che eucariotiche), l'uso di compartimenti intravalvolari ridurrà la quantità di ccfDNA da fonti proprie e da fonti estere.Considerando l'importanza dell'immunità innata bivalve e il gran numero di fagociti circolanti, abbiamo inoltre ipotizzato che anche il ccfDNA estraneo sia arricchito nei fagociti circolanti che accumulano DNA estraneo all'ingestione di microrganismi e/o detriti cellulari.Presi insieme, i nostri risultati mostrano che l'emolinfa bivalve ccfDNA è un deposito unico di informazioni molecolari e rafforza il loro status di specie sentinella.
I nostri dati indicano che il sequenziamento e l'analisi dei frammenti di emolinfa ccfDNA di origine batterica possono fornire informazioni chiave sulla flora batterica ospite e sui batteri presenti nell'ecosistema marino circostante.Le tecniche di shot sequencing hanno rivelato sequenze del batterio commensale A. atra gill che sarebbero state perse se fossero stati utilizzati metodi convenzionali di identificazione dell'rRNA 16S, in parte a causa di un bias della libreria di riferimento.In effetti, il nostro uso dei dati LB raccolti da M. platensis nello stesso strato di cozze alle Kerguelen ha mostrato che la composizione dei simbionti batterici associati alle branchie era la stessa per entrambe le specie di cozze (Fig. S4, Informazioni supplementari).Questa somiglianza di due mitili geneticamente diversi può riflettere la composizione delle comunità batteriche nei depositi freddi, sulfurei e vulcanici delle Kerguelen [55, 56, 57, 58].Livelli più elevati di microrganismi che riducono lo zolfo sono stati ben descritti durante la raccolta di mitili da aree costiere bioturbate [59], come la costa di Port-au-France.Un'altra possibilità è che la flora dei mitili commensali possa essere influenzata dalla trasmissione orizzontale [60, 61].Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare la correlazione tra l'ambiente marino, la superficie del fondo marino e la composizione dei batteri simbiotici nei mitili.Questi studi sono attualmente in corso.
La lunghezza e la concentrazione dell'emolinfa ccfDNA, la sua facilità di purificazione e l'alta qualità per consentire un rapido sequenziamento del fucile sono alcuni dei numerosi vantaggi dell'utilizzo del ccfDNA di cozze per valutare la biodiversità negli ecosistemi marini costieri.Questo approccio è particolarmente efficace per caratterizzare le comunità virali (viromi) in un dato ecosistema [62, 63].A differenza di batteri, archaea ed eucarioti, i genomi virali non contengono geni filogeneticamente conservati come le sequenze 16S.I nostri risultati indicano che le biopsie liquide di specie indicatrici come le cozze possono essere utilizzate per identificare un numero relativamente elevato di frammenti di virus ccfDNA noti per infettare gli ospiti che abitano tipicamente gli ecosistemi marini costieri.Ciò include virus noti per infettare protozoi, artropodi, insetti, piante e virus batterici (p. es., batteriofagi).Una distribuzione simile è stata trovata quando abbiamo esaminato il viroma ccfDNA dell'emolinfa delle cozze blu (M. platensis) raccolte nello stesso strato di cozze a Kerguelen (Tabella S2, Informazioni supplementari).Il sequenziamento shotgun del ccfDNA è davvero un nuovo approccio che sta guadagnando slancio nello studio del viroma degli esseri umani o di altre specie [21, 37, 64].Questo approccio è particolarmente utile per studiare i virus a DNA a doppio filamento, poiché nessun singolo gene è conservato tra tutti i virus a DNA a doppio filamento, che rappresentano la classe di virus più diversificata e ampia a Baltimora [65].Sebbene la maggior parte di questi virus rimanga non classificata e possa includere virus provenienti da una parte completamente sconosciuta del mondo virale [66], abbiamo scoperto che i viromi e gli intervalli di ospiti dei mitili A. atra e M. platensis rientrano tra le due specie.allo stesso modo (vedi figura S3, informazioni aggiuntive).Questa somiglianza non è sorprendente, in quanto potrebbe riflettere una mancanza di selettività nell'assorbimento del DNA presente nell'ambiente.Sono attualmente necessari studi futuri che utilizzino l'RNA purificato per caratterizzare il viroma dell'RNA.
Nel nostro studio, abbiamo utilizzato una pipeline molto rigorosa adattata dal lavoro di Kowarski e colleghi [37], che ha utilizzato una cancellazione in due passaggi di letture e contig raggruppati prima e dopo l'assemblaggio del ccfDNA nativo, risultando in un'alta percentuale di letture non mappate.Pertanto, non possiamo escludere che alcune di queste letture non mappate possano ancora avere una propria origine, principalmente perché non disponiamo di un genoma di riferimento per questa specie di cozze.Abbiamo utilizzato questa pipeline anche perché eravamo preoccupati per le chimere tra le letture self e non self e le lunghezze di lettura generate da Illumina MiSeq PE75.Un altro motivo per la maggior parte delle letture inesplorate è che gran parte dei microbi marini, specialmente in aree remote come le Kerguelen, non sono stati annotati.Abbiamo utilizzato Illumina MiSeq PE75, assumendo lunghezze dei frammenti di ccfDNA simili al ccfDNA umano.Per studi futuri, dati i nostri risultati che mostrano che l'emolinfa ccfDNA ha letture più lunghe rispetto agli esseri umani e/o ai mammiferi, si consiglia di utilizzare una piattaforma di sequenziamento più adatta per frammenti di ccfDNA più lunghi.Questa pratica renderà molto più facile identificare più indicazioni per un'analisi più approfondita.L'ottenimento della sequenza completa del genoma nucleare di A. atra attualmente non disponibile faciliterebbe notevolmente anche la discriminazione del ccfDNA da fonti autonome e non autonome.Dato che la nostra ricerca si è concentrata sulla possibilità di applicare il concetto di biopsia liquida alle cozze, ci auguriamo che, poiché questo concetto verrà utilizzato nella ricerca futura, verranno sviluppati nuovi strumenti e condotte per aumentare il potenziale di questo metodo per studiare la diversità microbica delle cozze.ecosistema marino.
In quanto biomarcatore clinico non invasivo, elevati livelli plasmatici umani di ccfDNA sono associati a varie malattie, danni ai tessuti e condizioni di stress [67,68,69].Questo aumento è associato al rilascio di frammenti di DNA della propria origine dopo il danno tissutale.Abbiamo affrontato questo problema utilizzando lo stress da calore acuto, in cui le cozze sono state brevemente esposte a una temperatura di 30 °C.Abbiamo eseguito questa analisi su tre diversi tipi di cozze in tre esperimenti indipendenti.Tuttavia, non abbiamo riscontrato alcun cambiamento nei livelli di ccfDNA dopo lo stress da calore acuto (vedere la Figura S5, informazioni aggiuntive).Questa scoperta potrebbe spiegare, almeno in parte, il fatto che i mitili hanno un sistema circolatorio semiaperto e accumulano grandi quantità di DNA estraneo a causa della loro elevata attività filtrante.D'altra parte, i mitili, come molti invertebrati, possono essere più resistenti al danno tissutale indotto dallo stress, limitando così il rilascio di ccfDNA nella loro emolinfa [70, 71].
Ad oggi, l'analisi del DNA della biodiversità negli ecosistemi acquatici si è concentrata principalmente sul metabarcoding del DNA ambientale (eDNA).Tuttavia, questo metodo è solitamente limitato nell'analisi della biodiversità quando vengono utilizzati i primer.L'uso del sequenziamento del fucile da caccia elude i limiti della PCR e la selezione distorta dei set di primer.Pertanto, in un certo senso, il nostro metodo è più vicino al metodo di sequenziamento del fucile eDNA ad alto rendimento recentemente utilizzato, che è in grado di sequenziare direttamente il DNA frammentato e analizzare quasi tutti gli organismi [72, 73].Tuttavia, ci sono una serie di questioni fondamentali che distinguono LB dai metodi eDNA standard.Naturalmente, la principale differenza tra eDNA e LB è l'uso di host di filtri naturali.È stato riportato l'uso di specie marine come spugne e bivalvi (Dresseina spp.) come filtro naturale per lo studio dell'eDNA [74, 75].Tuttavia, lo studio di Dreissena ha utilizzato biopsie tissutali da cui è stato estratto il DNA.L'analisi del ccfDNA da LB non richiede biopsia tissutale, attrezzature e logistica specializzate e talvolta costose associate all'eDNA o alla biopsia tissutale.In effetti, abbiamo recentemente riferito che il ccfDNA di LB può essere conservato e analizzato con il supporto FTA senza mantenere una catena del freddo, che rappresenta una grande sfida per la ricerca in aree remote [76].Anche l'estrazione di ccfDNA da biopsie liquide è semplice e fornisce DNA di alta qualità per il sequenziamento shotgun e l'analisi PCR.Questo è un grande vantaggio dati alcuni dei limiti tecnici associati all'analisi eDNA [77].La semplicità e il basso costo del metodo di campionamento è inoltre particolarmente adatto a programmi di monitoraggio a lungo termine.Oltre alla loro elevata capacità filtrante, un'altra caratteristica ben nota dei bivalvi è la composizione chimica mucopolisaccaridica del loro muco, che favorisce l'assorbimento dei virus [78, 79].Ciò rende i bivalvi un filtro naturale ideale per caratterizzare la biodiversità e l'impatto dei cambiamenti climatici in un dato ecosistema acquatico.Sebbene la presenza di frammenti di DNA derivati ​​​​dall'ospite possa essere vista come una limitazione del metodo rispetto all'eDNA, il costo associato all'avere un tale ccfDNA nativo rispetto all'eDNA è contemporaneamente comprensibile per la grande quantità di informazioni disponibili per gli studi sulla salute.ospite sfalsato.Ciò include la presenza di sequenze virali integrate nel genoma dell'ospite ospite.Ciò è particolarmente importante per i mitili, data la presenza di retrovirus leucemici trasmessi orizzontalmente nei bivalvi [80, 81].Un altro vantaggio di LB rispetto a eDNA è che sfrutta l'attività fagocitica delle cellule del sangue circolanti nell'emolinfa, che fagocita i microrganismi (e i loro genomi).La fagocitosi è la funzione principale delle cellule del sangue nei bivalvi [82].Infine, il metodo sfrutta l'elevata capacità filtrante dei mitili (in media 1,5 l/h di acqua di mare) e la circolazione di due giorni, che aumentano la miscelazione di diversi strati di acqua di mare, consentendo la cattura di eDNA eterologo.[83, 84].Pertanto, l'analisi del ccfDNA delle cozze è una strada interessante dati gli impatti nutrizionali, economici e ambientali delle cozze.Simile all'analisi del LB raccolto dall'uomo, questo metodo apre anche la possibilità di misurare i cambiamenti genetici ed epigenetici nel DNA dell'ospite in risposta a sostanze esogene.Ad esempio, è possibile prevedere tecnologie di sequenziamento di terza generazione per eseguire l'analisi della metilazione dell'intero genoma nel ccfDNA nativo utilizzando il sequenziamento dei nanopori.Questo processo dovrebbe essere facilitato dal fatto che la lunghezza dei frammenti di ccfDNA della cozza è idealmente compatibile con piattaforme di sequenziamento a lettura lunga che consentono l'analisi della metilazione del DNA dell'intero genoma da una singola corsa di sequenziamento senza la necessità di trasformazioni chimiche.85,86] Questa è una possibilità interessante, poiché è stato dimostrato che i modelli di metilazione del DNA riflettono una risposta allo stress ambientale e persistono per molte generazioni.Pertanto, può fornire preziose informazioni sui meccanismi sottostanti che governano la risposta dopo l'esposizione ai cambiamenti climatici o agli inquinanti [87].Tuttavia, l'uso di LB non è privo di limitazioni.Inutile dire che ciò richiede la presenza di specie indicatrici nell'ecosistema.Come accennato in precedenza, l'utilizzo di LB per valutare la biodiversità di un dato ecosistema richiede anche una rigorosa pipeline bioinformatica che tenga conto della presenza di frammenti di DNA dalla fonte.Un altro problema importante è la disponibilità di genomi di riferimento per le specie marine.Si spera che iniziative come il Marine Mammal Genomes Project e il recente progetto Fish10k [88] faciliteranno tale analisi in futuro.L'applicazione del concetto LB agli organismi marini filtratori è anche compatibile con gli ultimi progressi nella tecnologia di sequenziamento, rendendolo adatto allo sviluppo di biomarcatori multi-ohm per fornire informazioni importanti sulla salute degli habitat marini in risposta allo stress ambientale.
I dati sul sequenziamento del genoma sono stati depositati nell'archivio di lettura della sequenza NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 sotto Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impatto del cambiamento climatico sulla vita marina e sugli ecosistemi.Cole Biologia.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Considera gli impatti combinati del cambiamento climatico e di altri fattori di stress locali sull'ambiente marino.ambiente scientifico generale.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Scienza del primo marzo.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La ridotta tolleranza al calore in condizioni di stress da calore ripetitivo spiega l'elevata mortalità estiva delle cozze blu.Rapporto scientifico 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Recenti cambiamenti nella frequenza, nelle cause e nell'entità delle morti animali.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Molteplici agenti patogeni non specie-specifici possono aver causato la mortalità di massa di Pinna nobilis.Vita.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potenziale impatto del cambiamento climatico sulle malattie zoonotiche artiche.Int J Salute circumpolare.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Mitili blu (Mytilus edulis spp.) Come organismi segnale nel monitoraggio dell'inquinamento costiero: una rassegna.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrazione della biopsia liquida nel trattamento del cancro.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maturazione della biopsia liquida: consente la circolazione del DNA tumorale.Nat Rev Cancro.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Acidi nucleici nel plasma umano.Verbali assemblee società controllate Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nuovo ruolo per il DNA privo di cellule come marcatore molecolare per il trattamento del cancro.Quantificazione dell'analisi biomolare.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS La biopsia liquida entra in clinica: problemi di implementazione e sfide future.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW e altri.Il DNA fetale è presente nel plasma e nel siero materno.Lancetta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studio del decorso della gravidanza e delle sue complicanze utilizzando l'RNA extracellulare circolante nel sangue delle donne durante la gravidanza.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biopsia liquida: il DNA privo di cellule del donatore viene utilizzato per rilevare lesioni allogeniche in un innesto renale.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovazioni nella diagnostica prenatale: sequenziamento del genoma del plasma materno.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Rilevazione rapida di agenti patogeni con sequenziamento metagenomico di nuova generazione di fluidi corporei infetti.Medicina Nazionale.2021;27:115-24.