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Il sanguinamento incontrollato è una delle principali cause di morte.Il raggiungimento di una rapida emostasi garantisce la sopravvivenza del soggetto come primo soccorso durante il combattimento, gli incidenti stradali e le operazioni di riduzione della morte.L'impalcatura composita rinforzata con fibre nanoporose (NFRCS) derivata da una semplice composizione filmogena emostatica (HFFC) come fase continua può innescare e migliorare l'emostasi.Lo sviluppo dell'NFRCS si basa sul design dell'ala della libellula.La struttura dell'ala della libellula è costituita da ali trasversali e longitudinali e le membrane delle ali sono collegate tra loro per mantenere l'integrità della microstruttura.L'HFFC riveste uniformemente la superficie della fibra con un film di spessore nanometrico e collega lo spessore di cotone distribuito in modo casuale (Ct) (fase dispersa) per formare una struttura nanoporosa.La combinazione di fasi continue e disperse riduce di dieci volte il costo del prodotto rispetto ai prodotti disponibili in commercio.Gli NFRCS modificati (tamponi o braccialetti) possono essere utilizzati in una varietà di applicazioni biomediche.Studi in vivo hanno concluso che il Cp NFRCS sviluppato innesca e migliora il processo di coagulazione nel sito di applicazione.NFRCS può modulare il microambiente e agire a livello cellulare grazie alla sua struttura nanoporosa che si traduce in una migliore guarigione della ferita nel modello della ferita da escissione.
Il sanguinamento incontrollato durante il combattimento, le situazioni intraoperatorie e di emergenza possono rappresentare una seria minaccia per la vita dei feriti1.Queste condizioni portano inoltre ad un aumento complessivo delle resistenze vascolari periferiche, portando allo shock emorragico.Le misure appropriate per controllare il sanguinamento durante e dopo l'intervento chirurgico sono considerate potenzialmente pericolose per la vita2,3.Il danno ai grandi vasi porta a una massiccia perdita di sangue, con conseguente tasso di mortalità ≤ 50% in combattimento e 31% durante l'intervento chirurgico1.La massiccia perdita di sangue porta a una diminuzione del volume corporeo, che riduce la gittata cardiaca.Un aumento delle resistenze vascolari periferiche totali e una progressiva compromissione della microcircolazione portano all'ipossia negli organi di supporto vitale.Lo shock emorragico può verificarsi se la condizione continua senza un intervento efficace1,4,5.Altre complicazioni includono la progressione dell'ipotermia e dell'acidosi metabolica, nonché un disturbo della coagulazione che impedisce il processo di coagulazione.Lo shock emorragico grave è associato a un rischio più elevato di morte6,7,8.Nello shock di grado III (progressivo), la trasfusione di sangue è essenziale per la sopravvivenza del paziente durante la morbilità e la mortalità intraoperatoria e postoperatoria.Per superare tutte le suddette situazioni pericolose per la vita, abbiamo sviluppato un'impalcatura composita rinforzata con fibre nanoporose (NFRCS) che utilizza una concentrazione minima di polimero (0,5%) utilizzando una combinazione di polimeri emostatici solubili in acqua.
Con l'uso del rinforzo in fibra, è possibile sviluppare prodotti convenienti.Le fibre disposte in modo casuale ricordano la struttura dell'ala di una libellula, bilanciata dalle strisce orizzontali e verticali sulle ali.Le vene trasversali e longitudinali dell'ala comunicano con la membrana dell'ala (Fig. 1).NFRCS è costituito da Ct rinforzato come sistema di scaffold con una migliore resistenza fisica e meccanica (Figura 1).A causa della convenienza e dell'artigianato, i chirurghi preferiscono utilizzare calibri di filo di cotone (Ct) durante le operazioni e le medicazioni. Pertanto, considerando i suoi molteplici vantaggi, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (contribuisce al potenziamento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. Pertanto, considerando i suoi molteplici vantaggi, tra cui > 90% di cellulosa cristallina (contribuisce al potenziamento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico di NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаллической целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной SISTEMI NFRCS9,10. Pertanto, dati i suoi numerosi vantaggi, tra cui >90% di cellulosa cristallina (coinvolta nell'aumento dell'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come sistema scheletrico NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血活性），Ct 被用作NFRCS9,10的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Pertanto, dati i suoi numerosi vantaggi, tra cui oltre il 90% di cellulosa cristallina (aiuta a migliorare l'attività emostatica), Ct è stato utilizzato come impalcatura per NFRCS9,10.Ct è stato rivestito superficialmente (è stata osservata la formazione di un film nano-spesso) e interconnesso con una composizione filmogena emostatica (HFFC).HFFC agisce come un matrigel, tenendo insieme Ct posizionati casualmente.Il design sviluppato trasmette lo stress all'interno della fase dispersa (fibre di rinforzo).È difficile ottenere strutture nanoporose con una buona resistenza meccanica utilizzando concentrazioni minime di polimero.Inoltre, non è facile personalizzare diversi stampi per diverse applicazioni biomediche.
La figura mostra un diagramma del progetto NFRCS basato sulla struttura dell'ala della libellula (A).Questa immagine mostra un'analogia comparativa della struttura alare di una libellula (le vene intersecanti e longitudinali dell'ala sono interconnesse) e una fotomicrografia in sezione trasversale di Cp NFRCS (B).Rappresentazione schematica di NFRCS.
Gli NFRC sono stati sviluppati utilizzando HFFC come fase continua per affrontare le limitazioni di cui sopra.L'HFFC è composto da vari polimeri emostatici filmogeni tra cui il chitosano (come principale polimero emostatico) con metilcellulosa (MC), idrossipropilmetilcellulosa (HPMC 50 cp) e alcol polivinilico (PVA)) (125 kDa) come polimero di supporto che promuove la formazione di trombi.formazione.L'aggiunta di polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) ha migliorato la capacità di assorbimento dell'umidità dell'NFRCS.Il polietilenglicole 400 (PEG 400) è stato aggiunto per migliorare la reticolazione polimerica nelle miscele polimeriche legate.Tre diverse composizioni emostatiche HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), ovvero chitosano con MC (Cm), chitosano con HPMC (Ch) e chitosano con PVA (Cp), sono state applicate a Ct.Vari studi di caratterizzazione in vitro e in vivo hanno confermato l'attività emostatica e cicatrizzante di NFRCS.I materiali compositi offerti da NFRCS possono essere utilizzati per personalizzare varie forme di ponteggi per soddisfare esigenze specifiche.
Inoltre, NFRCS può essere modificato come benda o rotolo per coprire l'intera area della lesione degli arti inferiori e altre parti del corpo.In particolare per le lesioni agli arti da combattimento, il design NFRCS progettato può essere modificato in mezzo braccio o gamba intera (Figura supplementare S11).L'NFRCS può essere trasformato in un braccialetto con colla tissutale, che può essere utilizzato per fermare l'emorragia da gravi lesioni al polso di suicidio.Il nostro obiettivo principale è sviluppare un NFRCS con il minor polimero possibile che possa essere consegnato a una vasta popolazione (al di sotto della soglia di povertà) e che possa essere inserito in un kit di pronto soccorso.Semplice, efficiente ed economico nel design, NFRCS avvantaggia le comunità locali e può avere un impatto globale.
Chitosano (peso molecolare 80 kDa) e amaranto sono stati acquistati da Merck, India.Idrossipropilmetilcellulosa 50 Cp, polietilenglicole 400 e metilcellulosa sono stati acquistati da Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.L'alcool polivinilico (peso molecolare 125 kDa) (87-90% idrolizzato) è stato acquistato da National Chemicals, Gujarat.La polivinilpirrolidina K30 è stata acquistata da Molychem, Mumbai, i tamponi sterili sono stati acquistati da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, con acqua Milli Q (sistema di purificazione dell'acqua Direct-Q3, Merck, India) come vettore.
NFRCS è stato sviluppato utilizzando un metodo di liofilizzazione11,12.Tutte le composizioni HFFC (Tabella 1) sono state preparate utilizzando un agitatore meccanico.Preparare una soluzione allo 0,5% di chitosano utilizzando acido acetico all'1% in acqua agitando continuamente a 800 giri/min su un agitatore meccanico.Alla soluzione di chitosano è stato aggiunto il peso esatto del polimero caricato indicato in Tabella 1 e agitato fino ad ottenere una soluzione polimerica limpida.Alla miscela risultante sono stati aggiunti PVP K30 e PEG 400 nelle quantità indicate in Tabella 1, e l'agitazione è stata continuata fino ad ottenere una soluzione polimerica viscosa limpida.Il risultante bagno di soluzione polimerica è stato sonicato per 60 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate dalla miscela polimerica.Come mostrato nella Figura supplementare S1 (b), Ct è stato distribuito uniformemente in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (stampo) integrata con 5 ml di HFFC.
La piastra a sei pozzetti è stata sonicata per 60 minuti per ottenere una bagnatura e una distribuzione uniformi di HFFC nella rete Ct.Quindi congelare la piastra a sei pozzetti a -20°C per 8-12 ore.Le piastre di congelamento sono state liofilizzate per 48 ore per ottenere varie formulazioni di NFRCS.Lo stesso procedimento viene utilizzato per produrre forme e strutture diverse, come tamponi o tamponi cilindrici, o qualsiasi altra forma per applicazioni diverse.
Il chitosano accuratamente pesato (80 kDa) (3%) viene sciolto in acido acetico all'1% usando un agitatore magnetico.Alla risultante soluzione di chitosano è stato aggiunto PEG 400 all'1% e agitata per 30 minuti.Versare la soluzione ottenuta in un contenitore quadrato o rettangolare e congelare a -80°C per 12 ore.I campioni congelati sono stati liofilizzati per 48 ore per ottenere Cs13 poroso.
L'NFRCS sviluppato è stato sottoposto a esperimenti utilizzando la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Giappone) per confermare la compatibilità chimica del chitosano con altri polimeri14,15.Gli spettri FTIR (ampiezza dell'intervallo spettrale da 400 a 4000 cm-1) di tutti i campioni testati sono stati ottenuti eseguendo 32 scansioni.
Il tasso di assorbimento del sangue (BAR) per tutte le formulazioni è stato valutato utilizzando il metodo descritto da Chen et al.16 con lievi modifiche.Gli NFRK sviluppati di tutte le composizioni sono stati essiccati in un forno sotto vuoto a 105°C durante la notte per rimuovere il solvente residuo.30 mg di NFRCS (peso iniziale del campione - W0) e 30 mg di Ct (controllo positivo) sono stati collocati in piastre separate contenenti una premiscela di citrato di sodio al 3,8%.Ad intervalli di tempo predeterminati, cioè 5, 10, 20, 30, 40 e 60 secondi, gli NFRCS sono stati rimossi e le loro superfici pulite dal sangue non assorbito ponendo i campioni su Ct per 30 secondi.Il peso finale del sangue assorbito da NFRCS 16 è stato considerato (W1) in ogni momento.Calcolare la percentuale BAR utilizzando la seguente formula:
Il tempo di coagulazione del sangue (BCT) è stato determinato come riportato da Wang et al.17 .Il tempo necessario per la coagulazione del sangue intero (sangue di ratto premiscelato con citrato di sodio al 3,8%) in presenza di NFRCS è stato calcolato come BCT del campione di prova.I vari componenti NFRCS (30 mg) sono stati posti in fiale con tappo a vite da 10 ml e incubate a 37°C.Alla fiala è stato aggiunto sangue (0,5 ml) e sono stati aggiunti 0,3 ml di CaCl2 0,2 ​​M per attivare la coagulazione del sangue.Infine, capovolgere la fiala ogni 15 secondi (fino a 180°) fino a quando non si forma un coagulo solido.Il BCT del campione è stimato dal numero di lanci vail17,18.Sulla base di BCT, sono state selezionate due composizioni ottimali da NFRCS Cm, Ch e Cp per ulteriori studi di caratterizzazione.
Il BCT delle composizioni Ch NFRCS e Cp NFRCS è stato determinato implementando il metodo descritto da Li et al.19 .Posizionare 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs (controllo positivo) in piastre Petri separate (37 °C).Il sangue contenente il 3,8% di citrato di sodio è stato miscelato con 0,2 M CaCl2 in un rapporto di volume 10:1 per avviare il processo di coagulazione del sangue.20 µl di miscela di sangue di ratto 0,2 M CaCl2 sono stati applicati alla superficie del campione e collocati in una capsula di Petri vuota.Il controllo era sangue versato in capsule di Petri vuote senza Ct.A intervalli fissi di 0, 3 e 5 minuti, arrestare la coagulazione aggiungendo 10 ml di acqua deionizzata (DI) al campione contenente il piatto senza disturbare il coagulo.Gli eritrociti non coagulati (eritrociti) subiscono l'emolisi in presenza di acqua deionizzata e rilasciano emoglobina.L'emoglobina in diversi punti temporali (HA(t)) è stata misurata a 540 nm (λmax emoglobina) utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.L'assorbimento assoluto di emoglobina (AH(0)) in 0 min di 20 µl di sangue in 10 ml di acqua deionizzata è stato preso come standard di riferimento.L'assorbimento relativo dell'emoglobina (RHA) del sangue coagulato è stato calcolato dal rapporto HA(t)/HA(0) utilizzando lo stesso lotto di sangue.
Utilizzando un analizzatore di texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), sono state determinate le proprietà adesive di NFRK al tessuto danneggiato.Premere un piatto cilindrico a fondo aperto contro l'interno della pelle di maiale (senza lo strato di grasso).I campioni (Ch NFRCS e Cp NFRCS) sono stati applicati tramite cannula in stampi cilindrici per creare adesione alla pelle del maiale.Dopo un'incubazione di 3 minuti a temperatura ambiente (RT) (25°C), la forza adesiva NFRCS è stata registrata a una velocità costante di 0,5 mm/sec.
La caratteristica principale dei sigillanti chirurgici è quella di aumentare la coagulazione del sangue riducendo la perdita di sangue.La coagulazione senza perdita in NFRCS è stata valutata utilizzando un metodo precedentemente pubblicato con lievi modifiche 19 .Fare una provetta da microcentrifuga (2 ml) (diametro interno 10 mm) con un foro 8 × 5 mm2 su un lato della provetta da centrifuga (che rappresenta una ferita aperta).NFRCS viene utilizzato per chiudere l'apertura e il nastro viene utilizzato per sigillare i bordi esterni.Aggiungere 20 ml di 0,2 M CaCl2 alla provetta per microcentrifuga contenente la premiscela di citrato di sodio al 3,8%.Dopo 10 minuti, le provette per microcentrifuga sono state rimosse dalle piastre ed è stato determinato l'aumento della massa delle piastre dovuto al deflusso di sangue dall'NFRK (n = 3).Perdita di sangue Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati confrontati con Cs.
L'integrità a umido di NFRCS è stata determinata sulla base del metodo descritto da Mishra e Chaudhary21 con modifiche minori.Posizionare il NFRCS in una beuta da 100 ml con 50 ml di acqua e agitare per 60 s senza formare un top.Ispezione visiva e definizione delle priorità dei campioni per l'integrità fisica in base alla raccolta.
La forza di legame di HFFC a Ct è stata studiata utilizzando metodi pubblicati in precedenza con modifiche minori.L'integrità del rivestimento superficiale è stata valutata esponendo NFRK a onde acustiche (stimolo esterno) in presenza di acqua milliQ (Ct).Gli NFRCS Ch NFRCS e Cp NFRCS sviluppati sono stati collocati in un bicchiere pieno d'acqua e sonicati rispettivamente per 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 30 minuti.Dopo l'essiccazione, la differenza percentuale tra il peso iniziale e finale dell'NFRCS è stata utilizzata per calcolare la perdita percentuale di materiale (HFFC).La BCT in vitro ha ulteriormente supportato la forza legante o la perdita di materiali superficiali.L'efficienza del legame dell'HFFC al Ct fornisce la coagulazione del sangue e un rivestimento elastico sulla superficie del Ct22.
L'omogeneità dell'NFRCS sviluppato è stata determinata dal BCT dei campioni (30 mg) prelevati da posizioni generali selezionate casualmente dell'NFRCS.Seguire la procedura BCT menzionata in precedenza per determinare la conformità NFRCS.La vicinanza tra tutti e cinque i campioni garantisce una copertura superficiale uniforme e la deposizione di HFFC nella mesh Ct.
L'area nominale di contatto con il sangue (NBCA) è stata determinata come riportato in precedenza con alcune modifiche.Coagulare il sangue bloccando 20 ml di sangue tra le due superfici di Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.Dopo 1 ora, le due parti dello stent sono state separate e misurata manualmente l'area del coagulo.Il valore medio di tre ripetizioni è stato considerato NBCA NFRCS19.
L'analisi Dynamic Vapor Sorption (DVS) è stata utilizzata per valutare l'efficacia di NFRCS nell'assorbire acqua dall'ambiente esterno o dal sito della lesione responsabile dell'inizio della coagulazione.Il DVS valuta o registra gravimetricamente l'assorbimento e la perdita di vapore in un campione utilizzando una bilancia ultrasensibile con una risoluzione di massa di ±0,1 µg.Una pressione di vapore parziale (umidità relativa) viene generata da un controllore elettronico del flusso di massa attorno al campione miscelando gas di trasporto saturi e secchi. Secondo le linee guida della Farmacopea europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, i campioni sono stati classificati in 4 categorie (0–0,012% p/p − non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15% moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23. Secondo le linee guida della Farmacopea Europea, in base alla percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, i campioni sono stati classificati in 4 categorie (0–0,012% p/p − non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15 % moderatamente igroscopici e > 15% molto igroscopici)23.In accordo con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, a seconda della percentuale di assorbimento di umidità da parte dei campioni, i campioni sono stati suddivisi in 4 categorie (0–0,012% p/p – non igroscopici, 0,2–2% p/p leggermente igroscopici, 2–15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderatamente igroscopico e > 15% molto igroscopico)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/w- 非吸湿性、0.2-2% w/w轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南, 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 类 （（0-0.012% W/w- 吸湿性 、 、 、 、 0.2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 % 非常吸湿）23.In accordo con le raccomandazioni della Farmacopea Europea, i campioni sono suddivisi in 4 classi a seconda della percentuale di umidità assorbita dal campione (0-0,012% in peso – non igroscopico, 0,2-2% in peso leggermente igroscopico, 2-15% in peso).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderatamente igroscopico, > 15% molto igroscopico) 23.L'efficienza igroscopica di NFCS X NFCS e TsN NFCS è stata determinata su un analizzatore DVS TA TGA Q5000 SA.Durante questo processo, sono stati ottenuti il ​​tempo di esecuzione, l'umidità relativa (RH) e il peso del campione in tempo reale a 25°C24.Il contenuto di umidità viene calcolato mediante un'accurata analisi di massa NFRCS utilizzando la seguente equazione:
MC è l'umidità NFRCS.m1 – peso secco dei FANS.m2 è la massa NFRCS in tempo reale a un dato RH.
La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 ° C per 10 ore (<7 × 10–3 Torr). La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo aver svuotato i campioni a 25 ° C per 10 ore (<7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота жидким азотом после опоро жнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Torr). La superficie totale è stata stimata utilizzando un esperimento di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni sono stati svuotati a 25°C per 10 ore (<7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面积.在 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азотом посл е опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 torr). La superficie totale è stata stimata utilizzando esperimenti di adsorbimento di azoto con azoto liquido dopo che i campioni sono stati svuotati per 10 ore a 25°C (< 7 x 10-3 torr).L'area superficiale totale, il volume dei pori e la dimensione dei pori NFRCS sono stati determinati con un Quantachrome di NOVA 1000e, Austria, utilizzando il software RS 232.
Preparare il 5% di globuli rossi (soluzione salina come diluente) dal sangue intero.Quindi trasferire un'aliquota di HFFC (0,25 ml) in una piastra a 96 pozzetti e 5% di massa RBC (0,1 ml).Incubare la miscela a 37°C per 40 minuti.Una miscela di globuli rossi e siero è stata considerata come controllo positivo e una miscela di soluzione salina e globuli rossi come controllo negativo.L'emoagglutinazione è stata determinata secondo la scala Stajitzky.Le scale proposte sono le seguenti: + + + + aggregati granulari densi;+ + + cuscinetti inferiori lisci con bordi curvi;+ + cuscinetti inferiori lisci con bordi strappati;+ stretti anelli rossi attorno ai bordi dei cuscinetti lisci;– (negativo) pulsante rosso discreto 12 al centro del pozzetto inferiore.
L'emocompatibilità di NFRCS è stata studiata secondo il metodo dell'Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Il metodo gravimetrico descritto da Singh et al.Sono state apportate modifiche minori per valutare la formazione di trombi in presenza o sulla superficie di NFRCS.500 mg di Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati incubati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 24 ore a 37°C.Dopo 24 ore, il PBS è stato rimosso e NFRCS è stato trattato con 2 ml di sangue contenente il 3,8% di citrato di sodio.Sulla superficie del NFRCS, aggiungere 0,04 ml di 0,1 M CaCl2 ai campioni incubati.Dopo 45 minuti sono stati aggiunti 5 ml di acqua distillata per arrestare la coagulazione.Il sangue coagulato sulla superficie di NFRK è stato trattato con una soluzione di formaldeide al 36-38%.I coaguli fissati con formaldeide sono stati essiccati e pesati.La percentuale di trombosi è stata stimata calcolando il peso del bicchiere senza sangue e campione (controllo negativo) e del bicchiere con sangue (controllo positivo).
Come conferma iniziale, i campioni sono stati visualizzati al microscopio ottico per comprendere la capacità del rivestimento superficiale HFFC, del Ct interconnesso e della rete Ct di formare pori.Sezioni sottili di Ch e Cp da NFRCS sono state tagliate con una lama di bisturi.La sezione risultante è stata posta su un vetrino, coperto con un coprioggetto, e i bordi sono stati fissati con la colla.I vetrini preparati sono stati osservati al microscopio ottico e le fotografie sono state scattate a diversi ingrandimenti.
La deposizione del polimero nelle reti Ct è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza basata sul metodo descritto da Rice et al.29. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo menzionato in precedenza. La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e NFRCS (Ch e Cp) sono stati preparati secondo il metodo menzionato in precedenza.La composizione HFFC utilizzata per la formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) ed è stato ottenuto NFRCS (Ch e Cp) secondo il metodo precedentemente menzionato.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方法制备NFRCS（Ch & Cp）。La composizione HFFC utilizzata nella formulazione è stata miscelata con un colorante fluorescente (amaranto) e ha ricevuto NFRCS (Ch e Cp), come menzionato in precedenza.Sezioni sottili di NFRK sono state tagliate dai campioni ottenuti, poste su vetrini e coperte con vetrini coprioggetto.Osservare i vetrini preparati al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro verde (310-380 nm).Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 4x per comprendere le relazioni Ct e la deposizione di polimero in eccesso nella rete Ct.
La topografia superficiale di NFRCS Ch e Cp è stata determinata utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) con un cantilever TESP ultra nitido in modalità maschiatura: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.La rugosità della superficie è stata determinata mediante metodo RMS (root mean square) utilizzando il software (Scanning Probe Image Processor).Varie posizioni NFRCS sono state renderizzate su immagini 3D per verificare l'uniformità della superficie.La deviazione standard del punteggio per una data area è definita come la rugosità della superficie.L'equazione RMS è stata utilizzata per quantificare la rugosità superficiale di NFRCS31.
Sono stati eseguiti studi basati su FESEM utilizzando FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, per comprendere la morfologia superficiale di Ch NFRCS e Cp NFRCS, che hanno mostrato un BCT migliore rispetto a Cm NFRCS.Lo studio FESEM è stato condotto secondo il metodo descritto da Zhao et al.32 con piccole modifiche.NFRCS da 20 a 30 mg Ch NFRCS e Cp NFRCS sono stati premiscelati con 20 µl di citrato di sodio al 3,8% premiscelato con sangue di ratto.20 μl di CaCl2 0,2 ​​M sono stati aggiunti ai campioni trattati con sangue per avviare la coagulazione e i campioni sono stati incubati a temperatura ambiente per 10 minuti.Inoltre, gli eritrociti in eccesso sono stati rimossi dalla superficie NFRCS mediante risciacquo con soluzione salina.
I campioni successivi sono stati trattati con glutaraldeide allo 0,1% e quindi essiccati in un forno ad aria calda a 37°C per rimuovere l'umidità.I campioni essiccati sono stati rivestiti e analizzati 32 .Altre immagini ottenute durante l'analisi erano la formazione di coaguli sulla superficie delle singole fibre di cotone, la deposizione di polimeri tra Ct, la morfologia degli eritrociti (forma), l'integrità del coagulo e la morfologia degli eritrociti in presenza di NFRCS.Le aree NFRCS non trattate e le aree NFRCS trattate con Ch e Cp incubate con sangue sono state sottoposte a scansione per gli ioni elementari (sodio, potassio, azoto, calcio, magnesio, zinco, rame e selenio)33.Confronta le percentuali di ioni elementari tra campioni trattati e non trattati per comprendere l'accumulo di ioni elementari durante la formazione del coagulo e l'omogeneità del coagulo.
Lo spessore del rivestimento superficiale Cp HFFC sulla superficie Ct è stato determinato utilizzando FESEM.Le sezioni trasversali di Cp NFRCS sono state tagliate dalla struttura e rivestite con sputtering.I risultanti campioni di rivestimento sputter sono stati osservati mediante FESEM e lo spessore del rivestimento superficiale è stato misurato 34, 35, 36.
La micro-TC a raggi X fornisce immagini 3D non distruttive ad alta risoluzione e consente di studiare la disposizione strutturale interna di NFRK.Micro-CT utilizza un raggio di raggi X che passa attraverso il campione per registrare il coefficiente di attenuazione lineare locale dei raggi X nel campione, che aiuta a ottenere informazioni morfologiche.La posizione interna di Ct in Cp NFRCS e Cp NFRCS trattata con sangue è stata esaminata mediante micro-CT per comprendere l'efficienza di assorbimento e la coagulazione del sangue in presenza di NFRCS37,38,39.Le strutture 3D dei campioni Cp NFRCS trattati con sangue e non trattati sono state ricostruite utilizzando micro-CT (V | tome | x S240, Phoenix, Germania).Utilizzando il software VG STUDIO-MAX versione 2.2, sono state acquisite diverse immagini a raggi X da diverse angolazioni (copertura idealmente a 360°) per sviluppare immagini 3D per NFRCS.I dati di proiezione raccolti sono stati ricostruiti in immagini volumetriche 3D utilizzando il corrispondente semplice software 3D ScanIP Academic.
Inoltre, per comprendere la distribuzione del coagulo, sono stati aggiunti all'NFRCS 20 µl di sangue citrato premiscelato e 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M per avviare la coagulazione del sangue.I campioni preparati vengono lasciati indurire.La superficie NFRK è stata trattata con glutaraldeide allo 0,5% ed essiccata in un forno ad aria calda a 30–40°C per 30 min.Il coagulo di sangue formato sull'NFRCS è stato scansionato, ricostruito ed è stata visualizzata un'immagine 3D del coagulo di sangue.
I test antibatterici sono stati eseguiti su Cp NFRCS (meglio rispetto a Ch NFRCS) utilizzando il metodo precedentemente descritto con modifiche minori.L'attività antibatterica di Cp NFRCS e Cp HFFC è stata determinata utilizzando tre diversi microrganismi di prova [S.aureus (batteri gram-positivi), E.coli (batteri gram-negativi) e Candida bianca (C.albicans)] che crescono su agar in piastre di Petri in un incubatore.Inoculare uniformemente 50 ml della sospensione di coltura batterica diluita ad una concentrazione di 105-106 CFU ml-1 sul terreno agarizzato.Versare il terreno in una capsula di Petri e lasciarlo solidificare.Sulla superficie della piastra di agar sono stati realizzati pozzetti da riempire con HFFC (3 pozzetti per HFFC e 1 per controllo negativo).Aggiungere 200 microlitri HFFC a 3 pozzetti e 200 microlitri pH 7,4 PBS al 4 ° pozzetto.Sull'altro lato della capsula di Petri, posizionare un disco NFRCS Cp da 12 mm sull'agar solidificato e inumidire con PBS (pH 7,4).Ciprofloxacina, ampicillina e fluconazolo compresse sono considerati standard di riferimento per Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans.Misurare manualmente la zona di inibizione e acquisire un'immagine digitale della zona di inibizione.
Dopo l'approvazione etica istituzionale, lo studio è stato condotto presso il Kasturba Medical College of Education and Research a Manipal, Karnataka, nel sud dell'India.Il protocollo sperimentale TEG in vitro è stato esaminato e approvato dal Comitato etico istituzionale del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).I soggetti sono stati reclutati da donatori di sangue volontari (di età compresa tra 18 e 55 anni) dalla banca del sangue dell'ospedale.Inoltre, è stato ottenuto dai volontari un modulo di consenso informato per la raccolta dei campioni di sangue.Native TEG (N-TEG) ​​​​è stato utilizzato per studiare l'effetto della formulazione Cp HFFC su sangue intero premiscelato con citrato di sodio.N-TEG è ampiamente riconosciuto per il suo ruolo nella rianimazione presso il punto di cura, che crea problemi ai medici a causa del potenziale ritardo clinicamente significativo nei risultati (test di coagulazione di routine).L'analisi N-TEG è stata eseguita utilizzando sangue intero.Il consenso informato e la storia medica dettagliata sono stati ottenuti da tutti i partecipanti.Lo studio non ha incluso partecipanti con complicanze emostatiche o trombotiche come gravidanza/postpartum o malattie del fegato.Sono stati esclusi dallo studio anche i soggetti che assumevano farmaci che influenzano la cascata della coagulazione.Test di laboratorio di base (emoglobina, tempo di protrombina, tromboplastina attivata e conta piastrinica) sono stati eseguiti su tutti i partecipanti secondo le procedure standard.N-TEG determina la viscoelasticità del coagulo sanguigno, la struttura iniziale del coagulo, l'interazione delle particelle, il rafforzamento del coagulo e la lisi del coagulo.L'analisi N-TEG fornisce dati grafici e numerici sugli effetti collettivi di diversi elementi cellulari e del plasma.L'analisi N-TEG è stata eseguita su due diversi volumi di Cp HFFC (10 µl e 50 µl).Di conseguenza, 1 ml di sangue intero con acido citrico è stato aggiunto a 10 μl di Cp HFFC.Aggiungere 1 ml (Cp HFFC + sangue citrato), 340 microlitri di sangue misto a 20 microlitri 0,2 M CaCl2 contenente piatto TEG.Successivamente, le piastre TEG sono state caricate in TEG® 5000, US per misurare R, K, angolo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% dei campioni di sangue in presenza di Cp HFFC41.
Il protocollo di studio in vivo è stato rivisto e approvato dal Comitato istituzionale per l'etica degli animali (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni del Comitato per il controllo e la supervisione della sperimentazione animale (CPCSEA).Tutti gli studi NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) sono stati eseguiti su ratti Wistar femmine (di peso compreso tra 200 e 250 g).Tutti gli animali sono stati acclimatati ad una temperatura di 24-26°C, gli animali hanno avuto libero accesso a cibo standard e acqua ad libitum.Tutti gli animali sono stati divisi casualmente in diversi gruppi, ogni gruppo era composto da tre animali.Tutti gli studi sono stati eseguiti in conformità con Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Prima dello studio, gli animali sono stati anestetizzati mediante somministrazione intraperitoneale (ip) di una miscela di 20-50 mg di ketamina (per 1 kg di peso corporeo) e 2-10 mg di xilazina (per 1 kg di peso corporeo).Dopo lo studio è stato calcolato il volume di sanguinamento valutando la differenza tra il peso iniziale e quello finale dei campioni, il valore medio ottenuto dalle tre prove è stato preso come volume di sanguinamento del campione.
Il modello di amputazione della coda di topo è stato implementato per comprendere il potenziale di NFRCS per modulare il sanguinamento in caso di trauma, combattimento o incidente stradale (modello di infortunio).Tagliare il 50% della coda con una lama di bisturi e mettere in aria per 15 s per garantire il normale sanguinamento.Inoltre, i campioni di prova sono stati posizionati sulla coda di un ratto applicando una pressione (Ct, Cs, Ch NFRCS e Cp NFRCS).Sanguinamento e PCT sono stati riportati per i campioni di prova (n = 3)17,45.
L'efficacia del controllo della pressione NFRCS in combattimento è stata studiata su un modello dell'arteria femorale superficiale.L'arteria femorale viene esposta, perforata con un trocar 24G e sanguinata entro 15 secondi.Dopo che si osserva sanguinamento incontrollato, il campione di prova viene posizionato nel sito di puntura con pressione applicata.Immediatamente dopo l'applicazione del campione di prova, è stato registrato il tempo di coagulazione ed è stata osservata l'efficienza emostatica per i successivi 5 minuti.La stessa procedura è stata ripetuta con Cs e Ct46.
Dowling et al.47 hanno proposto un modello di danno epatico per valutare il potenziale emostatico dei materiali emostatici nel contesto del sanguinamento intraoperatorio.BCT è stato registrato per campioni Ct (controllo negativo), quadro Cs (controllo positivo), campioni Ch NFRCS e campioni Cp NFRCS.La vena cava sovraepatica del ratto è stata esposta eseguendo una laparotomia mediana.Successivamente, la parte distale del lobo sinistro è stata tagliata con le forbici.Fai un'incisione nel fegato con la lama di un bisturi e lascialo sanguinare per alcuni secondi.I campioni di test Ch NFRCS e Cp NFRCS accuratamente pesati sono stati posizionati sulla superficie danneggiata senza alcuna pressione positiva ed è stato registrato il BCT.Il gruppo di controllo (Ct) ha quindi applicato una pressione seguita da Cs 30 s47 senza rompere la lesione.
I test di guarigione della ferita in vivo sono stati eseguiti utilizzando un modello di ferita escissionale per valutare le proprietà di guarigione della ferita degli NFRCS basati su polimeri sviluppati.I modelli di ferite escissionali sono stati selezionati ed eseguiti secondo metodi precedentemente pubblicati con modifiche minori19,32,48.Tutti gli animali sono stati anestetizzati come precedentemente descritto.Utilizzare un punzone per biopsia (12 mm) per praticare un'incisione circolare profonda nella pelle della schiena.I siti della ferita preparati sono stati rivestiti con Cs (controllo positivo), Ct (riconoscendo che i tamponi di cotone interferiscono con la guarigione), Ch NFRCS e Cp NFRCS (gruppo sperimentale) e un controllo negativo senza alcun trattamento.In ogni giorno dello studio, l'area della ferita è stata misurata in tutti i ratti.Usa una fotocamera digitale per scattare una foto dell'area della ferita e indossare una nuova medicazione.La percentuale di chiusura della ferita è stata misurata con la seguente formula:
Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle di ratto del gruppo migliore è stata asportata ((Cp NFRCS) e il gruppo di controllo) e studiata mediante colorazione H&E e colorazione tricromica di Masson. Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle di ratto del gruppo migliore è stata asportata ((Cp NFRCS) e il gruppo di controllo) e studiata mediante colorazione H&E e colorazione tricromica di Masson.Sulla base della percentuale di chiusura della ferita al 12° giorno dello studio, la pelle dei ratti del gruppo migliore ((Cp NFRCS) e del gruppo di controllo) è stata asportata ed esaminata mediante colorazione con ematossilina-eosina e tricromica di Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行进行色和眳组）I ratti nel gruppo migliore ((Cp NFRCS) e gruppi di controllo) sono stati asportati per la colorazione con ematossilina-eosina e la colorazione tricromica di Masson in base alla percentuale di chiusura della ferita il giorno 12 dello studio.La procedura di colorazione implementata è stata eseguita secondo metodi precedentemente descritti49,50.In breve, dopo la fissazione in formalina al 10%, i campioni sono stati disidratati utilizzando una serie di alcoli graduati.Utilizzare un microtomo per ottenere sezioni sottili (5 m di spessore) del tessuto asportato.Sezioni seriali sottili di controlli e Cp NFRCS sono state trattate con ematossilina ed eosina per studiare i cambiamenti istopatologici.La colorazione tricromica di Masson è stata utilizzata per rilevare la formazione di fibrille di collagene.I risultati ottenuti sono stati studiati alla cieca dai patologi.
La stabilità dei campioni Cp NFRCS è stata studiata a temperatura ambiente (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) per 12 mesi51.Cp NFRCS (scolorimento della superficie e crescita microbica) è stato ispezionato visivamente e testato per la resistenza all'usura da piegatura e BCT secondo i metodi sopra descritti nella sezione Materiali e metodi.
La scalabilità e la riproducibilità di Cp NFRCS è stata esaminata preparando Cp NFRCS con una dimensione di 15 × 15 cm2.Inoltre, campioni da 30 mg (n = 5) sono stati asportati da varie frazioni Cp NFRCS e il BCT dei campioni studiati è stato valutato come descritto in precedenza nella sezione Metodi.
Abbiamo tentato di sviluppare varie forme e strutture utilizzando composizioni Cp NFRCS per varie applicazioni biomediche.Tali forme o configurazioni includono tamponi conici per epistassi, procedure dentistiche e tamponi cilindrici per sanguinamento vaginale.
Tutti i set di dati sono espressi come media ± deviazione standard e sono stati analizzati da ANOVA utilizzando Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) seguito dal test di confronti multipli di Bonferroni (* p <0,05).
Tutte le procedure eseguite negli studi sull'uomo erano conformi agli standard dell'Istituto e del Consiglio nazionale delle ricerche, nonché alla Dichiarazione di Helsinki del 1964 e ai suoi successivi emendamenti, o standard etici simili.Tutti i partecipanti sono stati informati sulle caratteristiche dello studio e sulla sua natura volontaria.I dati dei partecipanti rimangono riservati una volta raccolti.Il protocollo sperimentale TEG in vitro è stato esaminato e approvato dal Comitato etico istituzionale del Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).I volontari hanno firmato il consenso informato per raccogliere campioni di sangue.
Tutte le procedure eseguite negli studi sugli animali sono state eseguite in conformità con la Kastuba Faculty of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tutti gli esperimenti sugli animali progettati sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per il controllo e la supervisione della sperimentazione animale (CPCSEA).Tutti gli autori seguono le linee guida ARRIVE.
Gli spettri FTIR di tutti i NFRCS sono stati analizzati e confrontati con lo spettro del chitosano mostrato nella Figura 2A.Picchi spettrali caratteristici del chitosano (registrati) a 3437 cm-1 (allungamento OH e NH, sovrapposizione), 2945 e 2897 cm-1 (allungamento CH), 1660 cm-1 (ceppo NH2), 1589 cm-1 (flessione N-H), 1157 cm-1 (allungamento del ponte O-), 1067 cm-1 (allungamento C-O, idrossile secondario), 993 cm-1 ( tratto CO, Bo-OH) 52.53.54.La tabella supplementare S1 mostra i valori dello spettro di assorbimento FTIR NFRCS per chitosano (reporter), chitosano puro, Cm, Ch e Cp.Gli spettri FTIR di tutti i NFRCS (Cm, Ch e Cp) hanno mostrato le stesse bande di assorbimento caratteristiche del chitosano puro senza cambiamenti significativi (Fig. 2A).I risultati FTIR hanno confermato l'assenza di interazioni chimiche o fisiche tra i polimeri utilizzati per sviluppare l'NFRCS, indicando che i polimeri utilizzati sono inerti.
Caratterizzazione in vitro di Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.(A) rappresenta gli spettri FTIR combinati delle composizioni di chitosano e Cm NFRCS, Ch NFRCS e Cp NFRCS sotto compressione.(B) a) Tasso di assorbimento del sangue intero di NFRCS Cm, Ch, Cp e Cg (n = 3);I campioni Ct hanno mostrato una BAR più alta perché il batuffolo di cotone ha una maggiore efficienza di assorbimento;b) Sangue dopo l'assorbimento del sangue Illustrazione del campione assorbito.Rappresentazione grafica del BCT del campione di prova C (Cp NFRCS aveva il miglior BCT (15 s, n = 3)). I dati in C, D, E e G sono stati mostrati come media ± SD e le barre di errore rappresentano SD, *** p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono stati mostrati come media ± SD e le barre di errore rappresentano SD, *** p <0,0001. I suoni in Do, Re, Mi e Sol sono caratterizzati da un'inclinazione ± standard, e da una plancia con un'inclinazione standard ие, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono presentati come media ± deviazione standard e le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 I suoni in Do, Re, Mi e Sol si alternano tra loro in base a ± chiusura standard, plance di supporto standard da clonazione, ***p <0,0001. I dati in C, D, E e G sono mostrati come media ± deviazione standard, le barre di errore rappresentano la deviazione standard, ***p<0,0001.