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La fertilità degli uccelli dipende dalla loro capacità di immagazzinare abbastanza sperma vitale per un lungo periodo di tempo nei tubuli di stoccaggio dello sperma (SST).L'esatto meccanismo con cui gli spermatozoi entrano, risiedono e lasciano la SST rimane controverso.Lo sperma delle galline sharkasi ha mostrato un'elevata tendenza all'agglutinazione, formando fasci filamentosi mobili contenenti molte cellule.A causa della difficoltà di osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi in una tuba di Falloppio opaca, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una sezione trasversale del microcanale simile a quella degli spermatozoi per studiare l'agglutinazione e la motilità degli spermatozoi.Questo studio discute come si formano i fasci di spermatozoi, come si muovono e il loro possibile ruolo nell'estendere la residenza degli spermatozoi nella SST.Abbiamo studiato la velocità degli spermatozoi e il comportamento reologico quando il flusso del fluido è stato generato all'interno di un canale microfluidico dalla pressione idrostatica (portata = 33 µm/s).Gli spermatozoi tendono a nuotare controcorrente (reologia positiva) e la velocità del fascio di spermatozoi è significativamente ridotta rispetto ai singoli spermatozoi.È stato osservato che i fasci di spermatozoi si muovono a spirale e aumentano di lunghezza e spessore man mano che vengono reclutati più singoli spermatozoi. Sono stati osservati fasci di spermatozoi avvicinarsi e aderire alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere spazzati con una velocità del flusso del fluido > 33 µm/s. Sono stati osservati fasci di spermatozoi avvicinarsi e aderire alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere spazzati con una velocità del flusso del fluido > 33 µm/s. È abbastanza semplice che i pulsanti di spermatozoi si applichino e si applichino a un piccolo canale microfonico, così обы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / s. È stato osservato che fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere spazzati via a velocità di flusso del fluido > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过.33 µm/s 扫过. Ovviamente, questo tipo di spermatozoi è possibile e si rivolge a un piccolo micro canale, così обы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/s. È stato osservato che fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali del canale microfluidico per evitare di essere spazzati via dal flusso del fluido a > 33 µm/s.La microscopia elettronica a scansione e trasmissione ha rivelato che i fasci di spermatozoi erano supportati da abbondante materiale denso.I dati ottenuti dimostrano la mobilità unica degli spermatozoi di pollo Sharkazi, nonché la capacità degli spermatozoi di agglutinare e formare fasci mobili, che contribuisce a una migliore comprensione della conservazione a lungo termine degli spermatozoi in SMT.
Per ottenere la fecondazione negli esseri umani e nella maggior parte degli animali, lo sperma e gli ovuli devono arrivare al sito di fecondazione al momento giusto.Pertanto, l'accoppiamento deve avvenire prima o al momento dell'ovulazione.D'altra parte, alcuni mammiferi, come i cani, così come specie non mammifere, come insetti, pesci, rettili e uccelli, immagazzinano lo sperma nei loro organi riproduttivi per un lungo periodo di tempo finché le loro uova non sono pronte per la fecondazione (fecondazione asincrona 1 ).Gli uccelli sono in grado di mantenere la vitalità degli spermatozoi in grado di fecondare le uova per 2-10 settimane2.
Questa è una caratteristica unica che distingue gli uccelli dagli altri animali, poiché fornisce un'alta probabilità di fecondazione dopo una singola inseminazione per diverse settimane senza accoppiamento e ovulazione simultanei.Il principale organo di immagazzinamento dello sperma, chiamato tubulo di immagazzinamento dello sperma (SST), si trova nelle pieghe della mucosa interna alla giunzione uterovaginale.Ad oggi, i meccanismi attraverso i quali lo sperma entra, risiede ed esce dalla banca del seme non sono del tutto chiari.Sulla base di studi precedenti, sono state avanzate molte ipotesi, ma nessuna di esse è stata confermata.
Forman4 ha ipotizzato che gli spermatozoi mantengano la loro residenza nella cavità SST attraverso un movimento oscillatorio continuo contro la direzione del flusso del fluido attraverso i canali proteici situati sulle cellule epiteliali SST (reologia).L'ATP è esaurito a causa della costante attività flagellare necessaria per mantenere lo sperma nel lume SST e la motilità alla fine diminuisce fino a quando gli spermatozoi non vengono portati fuori dalla banca del seme dal flusso del fluido e iniziano un nuovo viaggio lungo la tuba di Falloppio ascendente per fecondare lo sperma.Uovo (Forman4).Questo modello di conservazione dello sperma è supportato dalla rilevazione mediante immunocitochimica delle acquaporine 2, 3 e 9 presenti nelle cellule epiteliali SST.Ad oggi, mancano studi sulla reologia del seme di pollo e sul suo ruolo nella conservazione della SST, nella selezione dello sperma vaginale e nella competizione spermatica.Nei polli, lo sperma entra nella vagina dopo l'accoppiamento naturale, ma oltre l'80% degli spermatozoi viene espulso dalla vagina poco dopo l'accoppiamento.Ciò suggerisce che la vagina è il sito principale per la selezione dello sperma negli uccelli.Inoltre, è stato riportato che meno dell'1% degli spermatozoi fecondati nella vagina finisce negli SST2.Nell'inseminazione artificiale dei pulcini nella vagina, il numero di spermatozoi che raggiungono SST tende ad aumentare 24 ore dopo l'inseminazione.Finora, il meccanismo di selezione degli spermatozoi durante questo processo non è chiaro e la motilità degli spermatozoi può svolgere un ruolo importante nell'assorbimento degli spermatozoi SST.A causa delle pareti spesse e opache delle tube di Falloppio, è difficile monitorare direttamente la motilità degli spermatozoi nelle tube di Falloppio degli uccelli.Pertanto, ci mancano le conoscenze di base su come gli spermatozoi passano alla SST dopo la fecondazione.
La reologia è stata recentemente riconosciuta come un importante fattore di controllo del trasporto dello sperma nei genitali dei mammiferi.Sulla base della capacità degli spermatozoi mobili di migrare in controcorrente, Zaferani et al.8 hanno utilizzato un sistema microfluidico Corra per isolare passivamente gli spermatozoi mobili da campioni di seme contenuto.Questo tipo di selezione dello sperma è essenziale per il trattamento medico dell'infertilità e la ricerca clinica ed è preferito rispetto ai metodi tradizionali che richiedono tempo e lavoro e possono compromettere la morfologia dello sperma e l'integrità strutturale.Tuttavia, ad oggi, non sono stati condotti studi sull'effetto delle secrezioni degli organi genitali dei polli sulla motilità degli spermatozoi.
Indipendentemente dal meccanismo che mantiene lo sperma immagazzinato nell'SST, molti ricercatori hanno osservato che gli spermatozoi residenti si agglutinano testa a testa nell'SST di polli 9, 10, quaglie 2 e tacchini 11 per formare fasci di sperma agglutinati.Gli autori suggeriscono che esiste un legame tra questa agglutinazione e la conservazione a lungo termine degli spermatozoi nell'SST.
Tingari e Lake12 hanno riportato una forte associazione tra gli spermatozoi nella ghiandola che riceve lo sperma del pollo e si sono chiesti se gli spermatozoi aviari agglutinassero allo stesso modo degli spermatozoi dei mammiferi.Credono che le profonde connessioni tra gli spermatozoi nei vasi deferenti possano essere dovute allo stress causato dalla presenza di un gran numero di spermatozoi in un piccolo spazio.
Quando si valuta il comportamento degli spermatozoi su vetrini freschi appesi, si possono osservare segni transitori di agglutinazione, specialmente ai bordi delle goccioline seminali.Tuttavia, l'agglutinazione era spesso disturbata dall'azione rotazionale associata al movimento continuo, il che spiega la natura transitoria di questo fenomeno.I ricercatori hanno anche notato che quando il diluente veniva aggiunto allo sperma, apparivano aggregati cellulari allungati "simili a fili".
I primi tentativi di imitare uno spermatozoo sono stati fatti rimuovendo un filo sottile da una goccia sospesa, che ha provocato una vescicola allungata simile allo sperma che sporgeva dalla goccia di seme.Gli spermatozoi si allinearono immediatamente in modo parallelo all'interno della vescicola, ma l'intera unità scomparve rapidamente a causa della limitazione 3D.Pertanto, per studiare l'agglutinazione degli spermatozoi, è necessario osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi direttamente nei tubuli di stoccaggio dello sperma isolati, che è difficile da ottenere.Pertanto, è necessario sviluppare uno strumento che imiti gli spermatozoi per supportare gli studi sulla motilità degli spermatozoi e sul comportamento di agglutinazione.Brillard et al.13 hanno riferito che la lunghezza media dei tubuli di immagazzinamento dello sperma nei pulcini adulti è di 400-600 µm, ma alcuni SST possono raggiungere i 2000 µm.Mero e Ogasawara14 hanno diviso le ghiandole seminifere in tubuli di stoccaggio dello sperma ingranditi e non ingranditi, entrambi uguali in lunghezza (~ 500 µm) e larghezza del collo (~ 38 µm), ma il diametro medio del lume dei tubuli era di 56,6 e 56,6 µm.., rispettivamente 11,2 μm, rispettivamente.Nel presente studio, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una dimensione del canale di 200 µm × 20 µm (W × H), la cui sezione trasversale è in qualche modo vicina a quella dell'SST amplificato.Inoltre, abbiamo esaminato la motilità degli spermatozoi e il comportamento di agglutinazione nel fluido che scorre, il che è coerente con l'ipotesi di Foreman secondo cui il fluido prodotto dalle cellule epiteliali SST mantiene lo sperma nel lume in una direzione (reologica) controcorrente.
Lo scopo di questo studio era di superare i problemi di osservazione della motilità degli spermatozoi nella tuba di Falloppio e di evitare le difficoltà di studiare la reologia e il comportamento degli spermatozoi in un ambiente dinamico.È stato utilizzato un dispositivo microfluidico che crea una pressione idrostatica per simulare la motilità degli spermatozoi nei genitali di un pollo.
Quando una goccia di un campione di sperma diluito (1:40) è stata caricata nel dispositivo a microcanali, è stato possibile identificare due tipi di motilità degli spermatozoi (sperma isolato e sperma legato).Inoltre, gli spermatozoi tendevano a nuotare controcorrente (reologia positiva; video 1, 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore a quella dello sperma solitario (p <0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che mostravano una reotassi positiva (p <0,001; Tabella 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore a quella dello sperma solitario (p <0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che mostravano una reotassi positiva (p <0,001; Tabella 2). I piccoli spermatozoi non hanno una quantità sufficiente di spermatozoi (p < 0,001), solo uno spermatozoo e un importante spermatozoiidov, demonstriruющих poloжительный reotassis (p < 0,001; tabella 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella dei singoli spermatozoi (p <0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che mostravano una reotassi positiva (p <0,001; Tabella 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。。））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных SPERMATOзоидов (p < 0,001), они увеличивали процен т сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; tabella 2). Sebbene la velocità dei fasci di spermatozoi fosse inferiore a quella dei singoli spermatozoi (p <0,001), aumentava la percentuale di spermatozoi con reologia positiva (p <0,001; Tabella 2).La reologia positiva per singoli spermatozoi e ciuffi è stimata rispettivamente in circa il 53% e l'85%.
È stato osservato che gli spermatozoi dei polli sharkasi subito dopo l'eiaculazione formano fasci lineari, costituiti da dozzine di individui.Questi ciuffi aumentano di lunghezza e spessore nel tempo e possono rimanere in vitro per diverse ore prima di dissiparsi (video 3).Questi fasci filamentosi hanno la forma di echidna spermatozoi che si formano all'estremità dell'epididimo.È stato riscontrato che lo sperma di gallina Sharkashi ha un'elevata tendenza ad agglutinare e formare un fascio reticolato in meno di un minuto dopo la raccolta.Queste travi sono dinamiche e in grado di aderire a qualsiasi parete vicina o oggetto statico.Sebbene i fasci di spermatozoi riducano la velocità degli spermatozoi, è chiaro che macroscopicamente ne aumentano la linearità.La lunghezza dei fasci varia a seconda del numero di spermatozoi raccolti in fasci.Sono state isolate due parti del fascio: la parte iniziale, comprendente la testa libera dello spermatozoo agglutinato, e la parte terminale, comprendente la coda e l'intera estremità distale dello spermatozoo.Utilizzando una telecamera ad alta velocità (950 fps), sono state osservate teste libere di spermatozoi agglutinati nella parte iniziale del fascio, responsabili del movimento del fascio per il loro moto oscillatorio, trascinando i restanti nel fascio con un moto elicoidale (Video 4).Tuttavia, nei lunghi cespi, è stato osservato che alcune teste di spermatozoi liberi aderiscono al corpo e la parte terminale del ciuffo agisce come alette per aiutare a spingere il ciuffo.
Mentre in un lento flusso di fluido, i fasci di spermatozoi si muovono paralleli tra loro, tuttavia, iniziano a sovrapporsi e ad aderire a tutto ciò che è fermo, in modo da non essere spazzati via dal flusso di corrente all'aumentare della velocità del flusso.I fasci si formano quando una manciata di spermatozoi si avvicinano l'uno all'altro, iniziano a muoversi in sincronia e si avvolgono l'uno intorno all'altro, per poi attaccarsi a una sostanza appiccicosa.Le figure 1 e 2 mostrano come gli spermatozoi si avvicinano l'uno all'altro, formando una giunzione mentre le code si avvolgono l'una intorno all'altra.
I ricercatori hanno applicato la pressione idrostatica per creare un flusso di fluido in un microcanale per studiare la reologia dello sperma.È stato utilizzato un microcanale con una dimensione di 200 µm × 20 µm (W × H) e una lunghezza di 3,6 µm.Utilizzare microcanali tra contenitori con siringhe montate alle estremità.Il colorante alimentare è stato utilizzato per rendere i canali più visibili.
Fissare i cavi di interconnessione e gli accessori alla parete.Il video è stato ripreso con un microscopio a contrasto di fase.Con ogni immagine vengono presentate la microscopia a contrasto di fase e le immagini di mappatura.(A) La connessione tra due flussi resiste al flusso a causa del movimento elicoidale (freccia rossa).(B) Il collegamento tra il fascio tubiero e la parete del canale (frecce rosse), allo stesso tempo sono collegati ad altri due fasci (frecce gialle).(C) I fasci di spermatozoi nel canale microfluidico iniziano a connettersi tra loro (frecce rosse), formando una rete di fasci di spermatozoi.(D) Formazione di una rete di fasci di spermatozoi.
Quando una goccia di sperma diluito è stata caricata nel dispositivo microfluidico ed è stato creato un flusso, è stato osservato che il raggio di spermatozoi si muoveva contro la direzione del flusso.I fasci si adattano perfettamente alle pareti dei microcanali e le teste libere nella parte iniziale dei fasci si adattano perfettamente a loro (video 5).Si attaccano anche a qualsiasi particella stazionaria sul loro percorso, come i detriti, per resistere all'essere spazzati via dalla corrente.Nel tempo, questi ciuffi diventano lunghi filamenti che intrappolano altri singoli spermatozoi e ciuffi più corti (Video 6).Quando il flusso inizia a rallentare, lunghe file di spermatozoi iniziano a formare una rete di linee di spermatozoi (Video 7; Figura 2).
Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei fili sono aumentati nel tentativo di catturare molti spermatozoi individuali che formano fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei fili sono aumentati nel tentativo di catturare molti spermatozoi individuali che formano fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Con un flusso di luce variabile (V > 33 μm/s) il flusso di luce a spirale non è sufficiente, con un aumento del numero di minuti жество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. A velocità di flusso elevate (V > 33 µm/s), i movimenti elicoidali dei filamenti aumentano mentre cercano di catturare molti spermatozoi individuali formando fasci che sono maggiormente in grado di resistere alla forza di deriva del flusso.在高流速(V > 33 µm/s)抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子, 从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 A causa della velocità del flusso sanguigno (V > 33 mm/s) la doppia velocità della spirale aumenta quando si preme il pulsante di uscita дельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ad alte velocità di flusso (V > 33 µm/s), il movimento elicoidale dei filamenti aumenta nel tentativo di catturare molti singoli spermatozoi formando fasci per resistere meglio alle forze di deriva del flusso.Hanno anche provato ad attaccare microcanali ai fianchi.
I fasci di spermatozoi sono stati identificati come gruppi di teste di spermatozoi e code arricciate mediante microscopia ottica (LM).Fasci di spermatozoi con vari aggregati sono stati identificati anche come teste attorcigliate e aggregati flagellari, code di spermatozoi multipli fusi, teste di spermatozoi attaccate a una coda e teste di spermatozoi con nuclei piegati come nuclei multipli fusi.microscopia elettronica a trasmissione (TEM).La microscopia elettronica a scansione (SEM) ha mostrato che i fasci di spermatozoi erano aggregati rivestiti di teste di spermatozoi e gli aggregati di spermatozoi mostravano una rete attaccata di code avvolte.
La morfologia e l'ultrastruttura degli spermatozoi, la formazione dei fasci di spermatozoi sono stati studiati mediante microscopia ottica (mezza sezione), microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), strisci di spermatozoi sono stati colorati con arancio di acridina ed esaminati mediante microscopia a epifluorescenza.
La colorazione dello striscio di spermatozoi con arancio di acridina (Fig. 3B) ha mostrato che le teste degli spermatozoi erano attaccate insieme e ricoperte di materiale secretorio, che ha portato alla formazione di grandi ciuffi (Fig. 3D).I fasci di spermatozoi consistevano in aggregati di spermatozoi con una rete di code attaccate (Fig. 4A-C).I fasci di spermatozoi sono composti dalle code di molti spermatozoi attaccati insieme (Fig. 4D).I segreti (Fig. 4E, F) coprivano le teste dei fasci di spermatozoi.
Formazione del fascio di spermatozoi Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina, è stato dimostrato che le teste degli spermatozoi aderiscono l'una all'altra.(A) La prima formazione del ciuffo di spermatozoi inizia con uno spermatozoo (cerchio bianco) e tre spermatozoi (cerchio giallo), con la spirale che inizia dalla coda e termina alla testa.(B) Microfotografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra teste di spermatozoi aderenti (frecce).Lo scarico copre le teste.Ingrandimento × 1000. (C) Sviluppo di un grande raggio trasportato dal flusso in un canale microfluidico (utilizzando una telecamera ad alta velocità a 950 fps).(D) Micrografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra grandi ciuffi (frecce).Ingrandimento: ×200.
Micrografia elettronica a scansione di un fascio di spermatozoi e di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina.(A, B, D, E) sono micrografie digitali a scansione elettronica a colori degli spermatozoi, e C ed F sono micrografie di strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina che mostrano l'attaccamento di più spermatozoi che avvolgono la rete caudale.(AC) Gli aggregati spermatici sono mostrati come una rete di code attaccate (frecce).(D) Adesione di diversi spermatozoi (con sostanza adesiva, contorno rosa, freccia) che avvolgono la coda.(E e F) Aggregati di testa di spermatozoi (puntatori) ricoperti di materiale adesivo (puntatori).Gli spermatozoi formavano fasci con diverse strutture simili a vortici (F).(C) ×400 e (F) ×200 ingrandimenti.
Usando la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo scoperto che i fasci di spermatozoi avevano code attaccate (Fig. 6A, C), teste attaccate alle code (Fig. 6B) o teste attaccate alle code (Fig. 6D).Le teste degli spermatozoi nel fascio sono curve, presentando in sezione due regioni nucleari (Fig. 6D).Nel fascio di incisione, gli spermatozoi avevano una testa attorcigliata con due regioni nucleari e più regioni flagellari (Fig. 5A).
Micrografia elettronica digitale a colori che mostra le code di collegamento nel fascio di spermatozoi e il materiale agglutinante che collega le teste degli spermatozoi.(A) Coda attaccata di un gran numero di spermatozoi.Nota come appare la coda sia nelle proiezioni verticale (freccia) che orizzontale (freccia).(B) La testa (freccia) dello sperma è collegata alla coda (freccia).(C) Sono attaccate diverse code di spermatozoi (frecce).(D) Il materiale di agglutinazione (AS, blu) collega quattro teste di spermatozoi (viola).
La microscopia elettronica a scansione è stata utilizzata per rilevare le teste degli spermatozoi in fasci di sperma coperti da secrezioni o membrane (Figura 6B), indicando che i fasci di sperma erano ancorati da materiale extracellulare.Il materiale agglutinato era concentrato nella testa dello spermatozoo (gruppo simile a una testa di medusa; Fig. 5B) ed espanso distalmente, dando un aspetto giallo brillante al microscopio a fluorescenza quando colorato con arancio di acridina (Fig. 6C).Questa sostanza è chiaramente visibile al microscopio a scansione ed è considerata un legante.Sezioni semi-sottili (Fig. 5C) e strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina mostravano fasci di sperma contenenti teste densamente impacchettate e code arricciate (Fig. 5D).
Varie microfotografie che mostrano l'aggregazione di teste di spermatozoi e code piegate utilizzando vari metodi.(A) Micrografia elettronica a trasmissione di colore digitale in sezione trasversale di un fascio di spermatozoi che mostra una testa di sperma arrotolata con un nucleo in due parti (blu) e diverse parti flagellari (verde).(B) Micrografia elettronica a scansione a colori digitale che mostra un gruppo di teste di spermatozoi simili a meduse (frecce) che sembrano essere coperte.(C) Sezione semi-sottile che mostra le teste degli spermatozoi aggregati (frecce) e le code arricciate (frecce).(D) Micrografia di uno striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra aggregati di teste di spermatozoi (frecce) e code aderenti arricciate (frecce).Si noti che una sostanza appiccicosa (S) copre la testa dello spermatozoo.(D) × 1000 ingrandimento.
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (Fig. 7A), è stato anche notato che le teste degli spermatozoi erano attorcigliate e i nuclei avevano una forma a spirale, come confermato da strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 7B).
(A) Micrografia elettronica a trasmissione di colore digitale e (B) Striscio di sperma colorato con arancio di acridina che mostra le teste arrotolate e l'attaccamento delle teste e delle code degli spermatozoi (frecce).(B) × 1000 ingrandimento.
Una scoperta interessante è che lo sperma di Sharkazi si aggrega per formare fasci filamentosi mobili.Le proprietà di questi fasci ci permettono di comprendere il loro possibile ruolo nell'assorbimento e nella conservazione degli spermatozoi nella SST.
Dopo l'accoppiamento, lo sperma entra nella vagina e subisce un intenso processo di selezione, con il risultato che solo un numero limitato di spermatozoi entra nell'SST15,16.Ad oggi, i meccanismi attraverso i quali gli spermatozoi entrano ed escono dalla SST non sono chiari.Nel pollame, gli spermatozoi vengono conservati nell'SST per un periodo prolungato da 2 a 10 settimane, a seconda della specie6.Rimane polemica sulla condizione del seme durante la conservazione nel SST.Sono in movimento oa riposo?In altre parole, come fanno gli spermatozoi a mantenere la loro posizione nella SST così a lungo?
Forman4 ha suggerito che la permanenza e l'espulsione di SST potrebbero essere spiegate in termini di motilità degli spermatozoi.Gli autori ipotizzano che gli spermatozoi mantengano la loro posizione nuotando contro il flusso di fluido creato dall'epitelio SST e che gli spermatozoi vengano espulsi dall'SST quando la loro velocità scende al di sotto del punto in cui iniziano a muoversi all'indietro per mancanza di energia.Zaniboni5 ha confermato la presenza di acquaporine 2, 3 e 9 nella porzione apicale delle cellule epiteliali SST, che possono indirettamente supportare il modello di conservazione dello sperma di Foreman.Nel presente studio, abbiamo scoperto che quasi la metà degli spermatozoi di Sharkashi mostra una reologia positiva nel fluido che scorre e che i fasci di spermatozoi agglutinati aumentano il numero di spermatozoi che mostrano una reologia positiva, sebbene l'agglutinazione li rallenti.Il modo in cui gli spermatozoi viaggiano lungo la tuba di Falloppio dell'uccello fino al sito di fecondazione non è del tutto chiaro.Nei mammiferi, la chemioterapia del fluido follicolare attira gli spermatozoi.Tuttavia, si ritiene che gli agenti chemiotattici dirigano gli spermatozoi ad avvicinarsi a lunghe distanze7.Pertanto, altri meccanismi sono responsabili del trasporto degli spermatozoi.È stato riportato che la capacità dello sperma di orientarsi e fluire contro il liquido delle tube di Falloppio rilasciato dopo l'accoppiamento è un fattore importante nel prendere di mira lo sperma nei topi.Parker 17 ha suggerito che gli spermatozoi attraversino gli ovidotti nuotando contro la corrente ciliare negli uccelli e nei rettili.Sebbene non sia stato dimostrato sperimentalmente negli uccelli, Adolphi18 è stato il primo a scoprire che lo sperma aviario dà risultati positivi quando viene creato un sottile strato di liquido tra un coprioggetto e un vetrino con una striscia di carta da filtro.Reologia.Hino e Yanagimachi [19] hanno posizionato un complesso ovaio-tubarico-uterino di topo in un anello di perfusione e hanno iniettato 1 µl di inchiostro nell'istmo per visualizzare il flusso del fluido nelle tube di Falloppio.Hanno notato un movimento molto attivo di contrazione e rilassamento nella tuba di Falloppio, in cui tutte le palline di inchiostro si muovevano costantemente verso l'ampolla della tuba di Falloppio.Gli autori sottolineano l'importanza del flusso del fluido tubarico dalle tube di Falloppio inferiore a quelle superiori per il sollevamento e la fecondazione dello sperma.Brillard20 ha riferito che nei polli e nei tacchini gli spermatozoi migrano con movimento attivo dall'ingresso vaginale, dove sono immagazzinati, alla giunzione utero-vaginale, dove sono immagazzinati.Tuttavia, questo movimento non è necessario tra la giunzione uterovaginale e l'infundibolo perché gli spermatozoi vengono trasportati per spostamento passivo.Conoscendo queste raccomandazioni precedenti ei risultati ottenuti nel presente studio, si può presumere che la capacità degli spermatozoi di muoversi a monte (reologia) sia una delle proprietà su cui si basa il processo di selezione.Ciò determina il passaggio degli spermatozoi attraverso la vagina e il loro ingresso nel CCT per la conservazione.Come suggerito da Forman4, questo può anche facilitare il processo di ingresso degli spermatozoi nell'SST e nel suo habitat per un periodo di tempo e quindi l'uscita quando la loro velocità inizia a rallentare.
D'altra parte, Matsuzaki e Sasanami 21 hanno suggerito che gli spermatozoi aviari subiscono cambiamenti di motilità dalla dormienza alla motilità nei tratti riproduttivi maschili e femminili.L'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti nella SST è stata proposta per spiegare il lungo tempo di conservazione degli spermatozoi e quindi il ringiovanimento dopo aver lasciato la SST.In condizioni ipossiche, Matsuzaki et al.1 ha riferito un'elevata produzione e rilascio di lattato nel SST, che può portare all'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti.In questo caso, l'importanza della reologia degli spermatozoi si riflette nella selezione e nell'assorbimento degli spermatozoi, e non nella loro conservazione.
Il modello di agglutinazione degli spermatozoi è considerato una spiegazione plausibile per il lungo periodo di conservazione dello sperma nell'SST, poiché questo è un modello comune di ritenzione dello sperma nel pollame2,22,23.Bakst et al.2 hanno osservato che la maggior parte degli spermatozoi aderiva l'uno all'altro, formando aggregati fascicolari, e singoli spermatozoi sono stati trovati raramente nel CCM di quaglia.D'altra parte, Wen et al.24 hanno osservato più spermatozoi sparsi e meno ciuffi di spermatozoi nel lume SST nei polli.Sulla base di queste osservazioni, si può presumere che la propensione all'agglutinazione degli spermatozoi differisca tra uccelli e tra spermatozoi nello stesso eiaculato.Inoltre, Van Krey et al.9 ha suggerito che la dissociazione casuale degli spermatozoi agglutinati è responsabile della graduale penetrazione degli spermatozoi nel lume della tuba di Falloppio.Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con minore capacità di agglutinazione dovrebbero essere espulsi per primi dal SST.In questo contesto, la capacità degli spermatozoi di agglutinare può essere un fattore che influenza l'esito della competizione spermatica negli uccelli sporchi.Inoltre, più a lungo lo sperma agglutinato si dissocia, più a lungo viene mantenuta la fertilità.
Sebbene l'aggregazione degli spermatozoi e l'aggregazione in fasci siano stati osservati in diversi studi2,22,24, non sono stati descritti in dettaglio a causa della complessità della loro osservazione cinematica all'interno della SST.Sono stati fatti diversi tentativi per studiare l'agglutinazione spermatica in vitro.È stata osservata un'aggregazione estesa ma transitoria quando il filo sottile è stato rimosso dalla goccia di seme penzolante.Ciò porta al fatto che una bolla allungata sporge dalla goccia, imitando la ghiandola seminale.A causa delle limitazioni 3D e dei brevi tempi di asciugatura a goccia, l'intero blocco è caduto rapidamente in rovina9.Nel presente studio, utilizzando polli Sharkashi e chip microfluidici, siamo stati in grado di descrivere come si formano questi ciuffi e come si muovono.Fasci di spermatozoi si sono formati immediatamente dopo la raccolta del seme e si è scoperto che si muovono a spirale, mostrando una reologia positiva quando presenti nel flusso.Inoltre, se visti macroscopicamente, è stato osservato che i fasci di spermatozoi aumentano la linearità della motilità rispetto agli spermatozoi isolati.Ciò suggerisce che l'agglutinazione degli spermatozoi può verificarsi prima della penetrazione della SST e che la produzione di spermatozoi non è limitata a una piccola area a causa dello stress come precedentemente suggerito (Tingari e Lake12).Durante la formazione del ciuffo, gli spermatozoi nuotano in sincronia fino a formare una giunzione, poi le loro code si avvolgono l'una intorno all'altra e la testa dello spermatozoo rimane libera, ma la coda e la parte distale dello spermatozoo si uniscono con una sostanza appiccicosa.Pertanto, la testa libera del legamento è responsabile del movimento, trascinando il resto del legamento.La microscopia elettronica a scansione dei fasci di spermatozoi ha mostrato teste di spermatozoi attaccate ricoperte da molto materiale appiccicoso, suggerendo che le teste di spermatozoi fossero attaccate in fasci a riposo, cosa che potrebbe essersi verificata dopo aver raggiunto il sito di stoccaggio (SST).
Quando uno striscio di spermatozoi viene colorato con arancio di acridina, al microscopio a fluorescenza si può vedere il materiale adesivo extracellulare attorno agli spermatozoi.Questa sostanza consente ai fasci di sperma di aderire e aggrapparsi a qualsiasi superficie o particella circostante in modo che non si muovano con il flusso circostante.Pertanto, le nostre osservazioni mostrano il ruolo dell'adesione degli spermatozoi sotto forma di fasci mobili.La loro capacità di nuotare controcorrente e aderire alle superfici vicine consente agli spermatozoi di rimanere più a lungo nella SST.
Rothschild25 ha utilizzato una fotocamera per emocitometria per studiare la distribuzione fluttuante del seme bovino in una goccia di sospensione, scattando fotomicrografie attraverso una fotocamera con asse ottico sia verticale che orizzontale del microscopio.I risultati hanno mostrato che gli spermatozoi erano attratti dalla superficie della camera.Gli autori suggeriscono che potrebbero esserci interazioni idrodinamiche tra lo sperma e la superficie.Tenendo conto di ciò, insieme alla capacità dello sperma dei pulcini Sharkashi di formare ciuffi appiccicosi, può aumentare la probabilità che lo sperma aderisca alla parete dell'SST e venga conservato per lunghi periodi di tempo.
Bccetti e Afzeliu26 hanno riferito che il glicocalice spermatico è necessario per il riconoscimento e l'agglutinazione dei gameti.Forman10 ha osservato che l'idrolisi dei legami α-glicosidici nei rivestimenti glicoproteici-glicolipidi trattando lo sperma aviario con neuraminidasi ha portato a una ridotta fertilità senza influire sulla motilità degli spermatozoi.Gli autori suggeriscono che l'effetto della neuraminidasi sul glicocalice altera il sequestro dello sperma alla giunzione utero-vaginale, riducendo così la fertilità.Le loro osservazioni non possono ignorare la possibilità che il trattamento con neuraminidasi possa ridurre il riconoscimento degli spermatozoi e degli ovociti.Forman ed Engel10 hanno scoperto che la fertilità era ridotta quando le galline venivano inseminate per via intravaginale con seme trattato con neuraminidasi.Tuttavia, la fecondazione in vitro con spermatozoi trattati con neuraminidasi non ha influenzato la fertilità rispetto ai polli di controllo.Gli autori hanno concluso che i cambiamenti nel rivestimento glicoproteico-glicolipide attorno alla membrana spermatica hanno ridotto la capacità dello sperma di fecondare compromettendo il sequestro dello sperma alla giunzione utero-vaginale, che a sua volta ha aumentato la perdita di sperma a causa della velocità della giunzione utero-vaginale, ma non influisce sul riconoscimento dello sperma e dell'uovo.
Nei tacchini Bakst e Bauchan 11 hanno trovato piccole vescicole e frammenti di membrana nel lume della SST e hanno osservato che alcuni di questi granuli si erano fusi con la membrana dello sperma.Gli autori suggeriscono che queste relazioni possono contribuire alla conservazione a lungo termine degli spermatozoi in SST.Tuttavia, i ricercatori non hanno specificato la fonte di queste particelle, se sono secrete dalle cellule epiteliali CCT, prodotte e secrete dal sistema riproduttivo maschile o prodotte dallo sperma stesso.Inoltre, queste particelle sono responsabili dell'agglutinazione.Grützner et al.27 hanno riferito che le cellule epiteliali dell'epididimo producono e secernono una proteina specifica necessaria per la formazione di tratti seminali a poro singolo.Gli autori riferiscono anche che la dispersione di questi fasci dipende dall'interazione delle proteine ​​dell'epididimo.Nixon et al.28 hanno scoperto che gli annessi secernono una proteina, l'osteonectina acida ricca di cisteina;SPARC è coinvolto nella formazione di ciuffi di spermatozoi in echidna e ornitorinchi a becco corto.La dispersione di questi fasci è associata alla perdita di questa proteina.
Nel presente studio, l'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica ha mostrato che gli spermatozoi aderiscono a una grande quantità di materiale denso.Si ritiene che queste sostanze siano responsabili dell'agglutinazione che si condensa tra e intorno alle teste aderenti, ma a concentrazioni inferiori nella regione della coda.Partiamo dal presupposto che questa sostanza agglutinante viene escreta dal sistema riproduttivo maschile (epididimo o dotto deferente) insieme allo sperma, poiché spesso osserviamo la separazione dello sperma dalla linfa e dal plasma seminale durante l'eiaculazione.È stato riportato che quando gli spermatozoi aviari passano attraverso l'epididimo e il dotto deferente, subiscono cambiamenti correlati alla maturazione che supportano la loro capacità di legare le proteine ​​​​e acquisire glicoproteine ​​​​associate al lemma plasmatico.La persistenza di queste proteine ​​sulle membrane spermatiche residenti nel SST suggerisce che queste proteine ​​possano influenzare l'acquisizione della stabilità della membrana spermatica 30 e determinarne la fertilità 31 .Ahammad et al.32 hanno riferito che gli spermatozoi ottenuti da varie parti del sistema riproduttivo maschile (dai testicoli al dotto deferente distale) hanno mostrato un progressivo aumento della vitalità in condizioni di conservazione liquida, indipendentemente dalla temperatura di conservazione, e la vitalità nei polli aumenta anche nelle tube di Falloppio dopo l'inseminazione artificiale.
I ciuffi di sperma di pollo Sharkashi hanno caratteristiche e funzioni diverse rispetto ad altre specie come echidna, ornitorinchi, topi di legno, ratti cervi e porcellini d'India.Nei polli sharkasi, la formazione di fasci di spermatozoi ha ridotto la loro velocità di nuoto rispetto ai singoli spermatozoi.Tuttavia, questi fasci aumentavano la percentuale di spermatozoi reologicamente positivi e aumentavano la capacità degli spermatozoi di stabilizzarsi in un ambiente dinamico.Pertanto, i nostri risultati confermano il precedente suggerimento secondo cui l'agglutinazione dello sperma nella SST è associata alla conservazione dello sperma a lungo termine.Ipotizziamo anche che la propensione degli spermatozoi a formare ciuffi possa controllare il tasso di perdita di spermatozoi nella SST, che può alterare l'esito della competizione spermatica.Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con bassa capacità di agglutinazione rilasciano prima SST, mentre gli spermatozoi con alta capacità di agglutinazione producono la maggior parte della prole.La formazione di fasci di spermatozoi a poro singolo è benefica e influisce sul rapporto genitore-figlio, ma utilizza un meccanismo diverso.Negli echidna e negli ornitorinchi, gli spermatozoi sono disposti parallelamente l'uno all'altro per aumentare la velocità di avanzamento del raggio.Fasci di echidna si muovono circa tre volte più velocemente dei singoli spermatozoi.Si ritiene che la formazione di tali ciuffi di spermatozoi negli echidna sia un adattamento evolutivo per mantenere il dominio, poiché le femmine sono promiscue e di solito si accoppiano con diversi maschi.Pertanto, gli spermatozoi di diversi eiaculati competono ferocemente per la fecondazione dell'uovo.
Gli spermatozoi agglutinati dei polli sharkasi sono facili da visualizzare utilizzando la microscopia a contrasto di fase, che è considerata vantaggiosa perché consente un facile studio del comportamento degli spermatozoi in vitro.Il meccanismo mediante il quale la formazione del ciuffo di spermatozoi promuove la riproduzione nei polli sharkasi è anche diverso da quello osservato in alcuni mammiferi placentari che rappresentano un comportamento cooperativo dello sperma come i topi di legno, dove alcuni spermatozoi raggiungono le uova, aiutando altri individui imparentati a raggiungere e danneggiare le loro uova.per metterti alla prova.comportamento altruistico.Autofecondazione 34. Un altro esempio di comportamento cooperativo negli spermatozoi è stato trovato nei topi cervi, dove gli spermatozoi erano in grado di identificarsi e combinarsi con gli spermatozoi più geneticamente imparentati e formare gruppi cooperativi per aumentare la loro velocità rispetto agli spermatozoi non imparentati35.
I risultati ottenuti in questo studio non contraddicono la teoria di Foman sulla conservazione a lungo termine degli spermatozoi in SWS.I ricercatori riferiscono che gli spermatozoi continuano a muoversi nel flusso delle cellule epiteliali che rivestono l'SST per un lungo periodo di tempo e, dopo un certo periodo di tempo, le riserve di energia degli spermatozoi si esauriscono, con conseguente diminuzione della velocità, che consente l'espulsione di sostanze a basso peso molecolare.energia degli spermatozoi con il flusso di fluido dal lume della SST La cavità della tuba di Falloppio.Nel presente studio, abbiamo osservato che metà del singolo spermatozoo ha mostrato la capacità di nuotare contro fluidi fluenti e la loro adesione nel fascio ha aumentato la loro capacità di mostrare una reologia positiva.Inoltre, i nostri dati sono coerenti con quelli di Matsuzaki et al.1 che ha riferito che una maggiore secrezione di lattato nella SST può inibire la motilità degli spermatozoi residenti.Tuttavia, i nostri risultati descrivono la formazione di legamenti mobili degli spermatozoi e il loro comportamento reologico in presenza di un ambiente dinamico all'interno di un microcanale nel tentativo di chiarire il loro comportamento in SST.La ricerca futura potrebbe concentrarsi sulla determinazione della composizione chimica e dell'origine dell'agente agglutinante, che senza dubbio aiuterà i ricercatori a sviluppare nuovi modi per conservare lo sperma liquido e aumentare la durata della fertilità.
Quindici sharkasi maschio a collo nudo di 30 settimane (omozigote dominante; Na Na) sono stati selezionati come donatori di sperma nello studio.Gli uccelli sono stati allevati presso la Research Poultry Farm della Facoltà di Agraria, Ashit University, Ashit Governorate, Egitto.Gli uccelli sono stati alloggiati in gabbie individuali (30 x 40 x 40 cm), sottoposti a un programma luce (16 ore di luce e 8 ore di buio) e alimentati con una dieta contenente 160 g di proteine ​​grezze, 2800 kcal di energia metabolizzabile, 35 g di calcio ciascuno.5 grammi di fosforo disponibile per chilogrammo di dieta.
Secondo i dati 36, ​​37, lo sperma è stato raccolto dai maschi mediante massaggio addominale.Sono stati raccolti un totale di 45 campioni di seme da 15 uomini in 3 giorni.Lo sperma (n = 15/giorno) è stato immediatamente diluito 1:1 (v:v) con Belsville Poultry Semen Diluent, che contiene difosfato di potassio (1,27 g), glutammato monosodico monoidrato (0,867 g), fruttosio (0,5 d) sodio anidro.acetato (0,43 g), tris(idrossimetil)amminometano (0,195 g), citrato di potassio monoidrato (0,064 g), monofosfato di potassio (0,065 g), cloruro di magnesio (0,034 g) e H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarità 333 mOsm/kg38.I campioni di seme diluito sono stati prima esaminati al microscopio ottico per garantire una buona qualità del seme (umidità) e poi conservati in un bagno d'acqua a 37°C fino all'uso entro mezz'ora dopo la raccolta.
La cinematica e la reologia degli spermatozoi sono descritte utilizzando un sistema di dispositivi microfluidici.I campioni di sperma sono stati ulteriormente diluiti a 1:40 in Beltsville Avian Semen Diluent, caricati in un dispositivo microfluidico (vedi sotto) e i parametri cinetici sono stati determinati utilizzando un sistema Computerized Semen Analysis (CASA) precedentemente sviluppato per la caratterizzazione microfluidica.sulla mobilità degli spermatozoi nei mezzi liquidi (Dipartimento di Ingegneria Meccanica, Facoltà di Ingegneria, Assiut University, Egitto).Il plugin può essere scaricato all'indirizzo: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Sono state misurate la velocità della curva (VCL, μm/s), la velocità lineare (VSL, μm/s) e la velocità media della traiettoria (VAP, μm/s).I video degli spermatozoi sono stati ripresi utilizzando un microscopio a contrasto di fase Optika XDS-3 invertito (con obiettivo 40x) collegato a una fotocamera Tucson ISH1000 a 30 fps per 3 s.Utilizzare il software CASA per studiare almeno tre aree e 500 traiettorie di spermatozoi per campione.Il video registrato è stato elaborato utilizzando un CASA fatto in casa.La definizione di motilità nel plug-in CASA si basa sulla velocità di nuoto degli spermatozoi rispetto alla portata e non include altri parametri come il movimento da lato a lato, poiché questo è risultato essere più affidabile nel flusso del fluido.Il movimento reologico è descritto come il movimento degli spermatozoi contro la direzione del flusso del fluido.Gli spermatozoi con proprietà reologiche sono stati divisi per il numero di spermatozoi mobili;gli spermatozoi a riposo e gli spermatozoi in movimento convettivo sono stati esclusi dal conteggio.
Tutti i prodotti chimici utilizzati sono stati ottenuti da Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egitto) se non diversamente specificato.Il dispositivo è stato fabbricato come descritto da El-sherry et al.40 con alcune modifiche.I materiali utilizzati per fabbricare i microcanali includevano lastre di vetro (Howard Glass, Worcester, MA), resist negativo SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcol diacetonico (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) e poliacetone.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).I microcanali sono fabbricati utilizzando la litografia morbida.Innanzitutto, una maschera facciale protettiva trasparente con il design a microcanali desiderato è stata stampata su una stampante ad alta risoluzione (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON).I maestri sono stati realizzati utilizzando lastre di vetro come substrati.Le piastre sono state pulite in acetone, isopropanolo e acqua deionizzata e quindi rivestite con uno strato di 20 µm di SU8-25 mediante spin coating (3000 rpm, 1 min).Gli strati di SU-8 sono stati quindi essiccati delicatamente (65°C, 2 min e 95°C, 10 min) ed esposti alla radiazione UV per 50 s.Cuocere dopo l'esposizione a 65°C e 95°C per 1 min e 4 min per reticolare gli strati SU-8 esposti, seguito dallo sviluppo in alcol diacetonico per 6,5 min.Duro cuocere i waffle (200 ° C per 15 min) per solidificare ulteriormente lo strato SU-8.
Il PDMS è stato preparato miscelando il monomero e l'indurente in un rapporto in peso di 10:1, quindi degasato in un essiccatore sotto vuoto e versato sul telaio principale SU-8.Il PDMS è stato polimerizzato in un forno (120 ° C, 30 min), quindi i canali sono stati tagliati, separati dal master e perforati per consentire il collegamento dei tubi all'ingresso e all'uscita del microcanale.Infine, i microcanali PDMS sono stati fissati in modo permanente ai vetrini del microscopio utilizzando un processore corona portatile (Electro-Technic Products, Chicago, IL) come descritto altrove.Il microcanale utilizzato in questo studio misura 200 µm × 20 µm (L × A) ed è lungo 3,6 cm.
Il flusso di fluido indotto dalla pressione idrostatica all'interno del microcanale si ottiene mantenendo il livello del fluido nel serbatoio di ingresso al di sopra del dislivello Δh39 nel serbatoio di uscita (Fig. 1).
dove f è il coefficiente di attrito, definito come f = C/Re per il flusso laminare in un canale rettangolare, dove C è una costante dipendente dall'aspect ratio del canale, L è la lunghezza del microcanale, Vav è la velocità media all'interno del microcanale, Dh è il diametro idraulico del canale, g – accelerazione di gravità.Utilizzando questa equazione, la velocità media del canale può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: