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La fertilità degli uccelli dipende dalla loro capacità di immagazzinare spermatozoi vitali a sufficienza per un lungo periodo di tempo nei tubuli di riserva spermatica (SST). L'esatto meccanismo attraverso il quale gli spermatozoi entrano, risiedono e lasciano gli SST rimane controverso. Gli spermatozoi delle galline sharkasi hanno mostrato un'elevata tendenza all'agglutinazione, formando fasci filamentosi mobili contenenti numerose cellule. Data la difficoltà di osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi in una tuba di Falloppio opaca, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una sezione trasversale dei microcanali simile a quella degli spermatozoi per studiarne l'agglutinazione e la motilità. Questo studio discute come si formano i fasci di spermatozoi, come si muovono e il loro possibile ruolo nell'estensione della residenza degli spermatozoi negli SST. Abbiamo studiato la velocità e il comportamento reologico degli spermatozoi quando il flusso di fluido veniva generato all'interno di un canale microfluidico mediante pressione idrostatica (portata = 33 µm/s). Gli spermatozoi tendono a nuotare controcorrente (reologia positiva) e la velocità del gruppo di spermatozoi è significativamente ridotta rispetto a quella dei singoli spermatozoi. È stato osservato che i gruppi di spermatozoi si muovono a spirale e aumentano di lunghezza e spessore man mano che vengono reclutati più spermatozoi singoli. Sono stati osservati fasci di spermatozoi avvicinarsi e aderire alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati da una velocità del flusso del fluido > 33 µm/s. Sono stati osservati fasci di spermatozoi avvicinarsi e aderire alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati da una velocità del flusso del fluido > 33 µm/s. Ho capito bene cosa gli spermatozoi si attaccano e si attaccano al vapore acqueo microfluido canali, cosa scrivere nella sezione со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali dei canali microfluidici per evitare di essere trascinati via a velocità di flusso del fluido superiori a 33 µm/s.La velocità di trasferimento è di 33 µm/s.33 µm/s in meno. Ho capito bene cosa gli spermatozoi si attaccano e si attaccano al forno a microonde canale, cosa vedere сметания потоком жидкости со скоростью > 33 mm/s. È stato osservato che i fasci di spermatozoi si avvicinano e aderiscono alle pareti laterali del canale microfluidico per evitare di essere trascinati via dal flusso del fluido a >33 µm/s.La microscopia elettronica a scansione e trasmissione ha rivelato che i fasci di spermatozoi erano sostenuti da abbondante materiale denso. I dati ottenuti dimostrano la mobilità unica degli spermatozoi di pollo Sharkazi, nonché la loro capacità di agglutinare e formare fasci mobili, il che contribuisce a una migliore comprensione della conservazione a lungo termine degli spermatozoi in SMT.
Per ottenere la fecondazione negli esseri umani e nella maggior parte degli animali, spermatozoi e ovuli devono arrivare al sito di fecondazione al momento giusto. Pertanto, l'accoppiamento deve avvenire prima o al momento dell'ovulazione. D'altra parte, alcuni mammiferi, come i cani, così come specie non mammifere, come insetti, pesci, rettili e uccelli, immagazzinano lo sperma nei loro organi riproduttivi per un periodo di tempo prolungato fino a quando i loro ovuli non sono pronti per la fecondazione (fecondazione asincrona 1 ). Gli uccelli sono in grado di mantenere la vitalità degli spermatozoi in grado di fecondare gli ovuli per 2-10 settimane2.
Questa è una caratteristica unica che distingue gli uccelli dagli altri animali, poiché offre un'alta probabilità di fecondazione dopo una singola inseminazione per diverse settimane, senza accoppiamento e ovulazione simultanei. Il principale organo di riserva degli spermatozoi, chiamato tubulo di riserva spermatica (SST), è situato nelle pieghe mucose interne della giunzione utero-vaginale. Ad oggi, i meccanismi attraverso i quali gli spermatozoi entrano, risiedono ed escono dalla banca del seme non sono completamente compresi. Sulla base di studi precedenti, sono state avanzate molte ipotesi, ma nessuna di esse è stata confermata.
Forman4 ha ipotizzato che gli spermatozoi mantengano la loro residenza nella cavità della SST attraverso un continuo movimento oscillatorio contro la direzione del flusso del fluido attraverso canali proteici situati sulle cellule epiteliali della SST (reologia). L'ATP viene esaurito a causa della costante attività flagellare necessaria per mantenere gli spermatozoi nel lume della SST e la motilità alla fine diminuisce fino a quando gli spermatozoi non vengono trasportati fuori dalla banca del seme dal flusso del fluido e iniziano un nuovo viaggio lungo la tuba di Falloppio ascendente per fecondare lo spermatozoo. Ovulo (Forman4). Questo modello di conservazione degli spermatozoi è supportato dal rilevamento mediante immunocitochimica delle acquaporine 2, 3 e 9 presenti nelle cellule epiteliali della SST. Ad oggi, mancano studi sulla reologia dello sperma di pollo e sul suo ruolo nella conservazione della SST, nella selezione degli spermatozoi vaginali e nella competizione spermatica. Nei polli, gli spermatozoi entrano in vagina dopo l'accoppiamento naturale, ma oltre l'80% degli spermatozoi viene espulso dalla vagina poco dopo l'accoppiamento. Ciò suggerisce che la vagina sia il sito primario per la selezione degli spermatozoi negli uccelli. Inoltre, è stato riportato che meno dell'1% degli spermatozoi fecondati in vagina finisce negli SST2. Nell'inseminazione artificiale dei pulcini in vagina, il numero di spermatozoi che raggiungono lo SST tende ad aumentare 24 ore dopo l'inseminazione. Finora, il meccanismo di selezione degli spermatozoi durante questo processo non è chiaro e la motilità degli spermatozoi potrebbe svolgere un ruolo importante nell'assorbimento degli spermatozoi per lo SST. A causa delle pareti spesse e opache delle tube di Falloppio, è difficile monitorare direttamente la motilità degli spermatozoi nelle tube di Falloppio degli uccelli. Pertanto, non disponiamo di conoscenze di base su come gli spermatozoi transitino verso lo SST dopo la fecondazione.
La reologia è stata recentemente riconosciuta come un fattore importante nel controllo del trasporto degli spermatozoi nei genitali dei mammiferi. Basandosi sulla capacità degli spermatozoi mobili di migrare controcorrente, Zaferani et al. 8 hanno utilizzato un sistema microfluidico Corra per isolare passivamente gli spermatozoi mobili da campioni di seme conservati in un recinto. Questo tipo di selezione del seme è essenziale per il trattamento dell'infertilità medica e per la ricerca clinica, ed è preferibile ai metodi tradizionali che richiedono molto tempo e lavoro e possono compromettere la morfologia e l'integrità strutturale degli spermatozoi. Tuttavia, ad oggi, non sono stati condotti studi sull'effetto delle secrezioni degli organi genitali dei polli sulla motilità degli spermatozoi.
Indipendentemente dal meccanismo che mantiene lo sperma conservato nel SST, molti ricercatori hanno osservato che gli spermatozoi residenti si agglutinano testa a testa nel SST di polli 9, 10, quaglie 2 e tacchini 11, formando fasci di spermatozoi agglutinati. Gli autori suggeriscono che esista un legame tra questa agglutinazione e la conservazione a lungo termine degli spermatozoi nel SST.
Tingari e Lake12 hanno segnalato una forte associazione tra gli spermatozoi nella ghiandola ricevente degli spermatozoi del pollo e si sono chiesti se gli spermatozoi aviari agglutinassero allo stesso modo degli spermatozoi dei mammiferi. Ritengono che le profonde connessioni tra gli spermatozoi nei dotti deferenti possano essere dovute allo stress causato dalla presenza di un gran numero di spermatozoi in uno spazio ridotto.
Valutando il comportamento degli spermatozoi su vetrini freschi appesi, si possono osservare segni transitori di agglutinazione, soprattutto ai bordi delle goccioline di liquido seminale. Tuttavia, l'agglutinazione è stata spesso disturbata dall'azione rotazionale associata al movimento continuo, il che spiega la natura transitoria di questo fenomeno. I ricercatori hanno anche notato che, quando il diluente veniva aggiunto al liquido seminale, comparivano aggregati cellulari allungati, simili a fili.
I primi tentativi di imitare uno spermatozoo furono fatti rimuovendo un filo sottile da una goccia di liquido seminale pendente, il che diede origine a una vescicola allungata simile a uno spermatozoo che sporgeva dalla goccia stessa. Gli spermatozoi si allinearono immediatamente parallelamente all'interno della vescicola, ma l'intera unità scomparve rapidamente a causa della limitazione tridimensionale. Pertanto, per studiare l'agglutinazione degli spermatozoi, è necessario osservare la motilità e il comportamento degli spermatozoi direttamente nei tubuli di riserva spermatica isolati, un'operazione difficile da realizzare. Pertanto, è necessario sviluppare uno strumento che imiti gli spermatozoi per supportare gli studi sulla motilità e sul comportamento dell'agglutinazione degli spermatozoi. Brillard et al.13 hanno riportato che la lunghezza media dei tubuli di riserva spermatica nei pulcini adulti è di 400-600 µm, ma alcuni SST possono raggiungere i 2000 µm. Mero e Ogasawara14 hanno suddiviso le ghiandole seminifere in tubuli di riserva spermatica ingranditi e non ingranditi, entrambi identici in lunghezza (~500 µm) e larghezza del collo (~38 µm), ma il diametro medio del lume dei tubuli era rispettivamente di 56,6 e 56,6 µm. . , rispettivamente 11,2 µm. Nello studio attuale, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico con una dimensione del canale di 200 µm × 20 µm (L × A), la cui sezione trasversale è piuttosto vicina a quella del SST amplificato. Inoltre, abbiamo esaminato la motilità degli spermatozoi e il comportamento di agglutinazione nel fluido in movimento, il che è coerente con l'ipotesi di Foreman secondo cui il fluido prodotto dalle cellule epiteliali del SST mantiene gli spermatozoi nel lume in direzione controcorrente (reologica).
L'obiettivo di questo studio era superare i problemi legati all'osservazione della motilità degli spermatozoi nella tuba di Falloppio e di evitare le difficoltà legate allo studio della reologia e del comportamento degli spermatozoi in un ambiente dinamico. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico che crea pressione idrostatica per simulare la motilità degli spermatozoi nei genitali di un pollo.
Inserendo una goccia di campione di sperma diluito (1:40) nel dispositivo a microcanali, è stato possibile identificare due tipi di motilità spermatica (spermatozoi isolati e spermatozoi legati). Inoltre, gli spermatozoi tendevano a nuotare controcorrente (reologia positiva; video 1, 2). Sebbene i gruppi di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella degli spermatozoi solitari (p < 0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che presentavano una reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2). Sebbene i gruppi di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella degli spermatozoi solitari (p < 0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che presentavano una reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2). Molti spermatozoi hanno un punteggio più basso, che è uno spermatozoo diverso (p < 0,001), solo il professionista è stato inventato spermatozoi dimostrativi della reazione polacca (p < 0,001; tabella 2). Sebbene i fasci di spermatozoi avessero una velocità inferiore rispetto a quella dei singoli spermatozoi (p < 0,001), aumentavano la percentuale di spermatozoi che mostravano una reotassi positiva (p < 0,001; Tabella 2).尽管精子束的速度低于孤精子的速度（p < 0,001）, ma non è così: p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0.001 ； 2。。。。。）））））） Il punteggio degli spermatozoi non è stato elevato, rispetto agli spermatozoi differenziati (p < 0,001) professionista spermatozoi s положительной реологией (p < 0,001; tabella 2). Sebbene la velocità dei gruppi di spermatozoi fosse inferiore a quella dei singoli spermatozoi (p < 0,001), è aumentata la percentuale di spermatozoi con reologia positiva (p < 0,001; Tabella 2).Si stima che la reologia positiva per singoli spermatozoi e ciuffi sia rispettivamente pari a circa il 53% e l'85%.
È stato osservato che gli spermatozoi dei polli Sharkasi, subito dopo l'eiaculazione, formano fasci lineari, composti da decine di individui. Questi fasci aumentano di lunghezza e spessore nel tempo e possono rimanere in vitro per diverse ore prima di dissolversi (video 3). Questi fasci filamentosi hanno la forma degli spermatozoi di echidna che si formano all'estremità dell'epididimo. È stato riscontrato che lo sperma delle galline Sharkashi ha un'elevata tendenza ad agglutinarsi e a formare un fascio reticolato in meno di un minuto dalla raccolta. Questi fasci sono dinamici e in grado di aderire a qualsiasi parete o oggetto statico nelle vicinanze. Sebbene i fasci di spermatozoi riducano la velocità degli spermatozoi, è chiaro che macroscopicamente ne aumentano la linearità. La lunghezza dei fasci varia a seconda del numero di spermatozoi raccolti in fasci. Sono state isolate due parti del fascio: la parte iniziale, che include la testa libera dello spermatozoo agglutinato, e la parte terminale, che include la coda e l'intera estremità distale dello spermatozoo. Utilizzando una telecamera ad alta velocità (950 fps), sono state osservate teste libere di spermatozoi agglutinati nella parte iniziale del fascio, responsabili del movimento del fascio grazie al loro moto oscillatorio, trascinando i rimanenti all'interno del fascio con un movimento elicoidale (Video 4). Tuttavia, nei ciuffi lunghi, è stato osservato che alcune teste libere di spermatozoi aderiscono al corpo e la porzione terminale del ciuffo funge da paletta per favorire la spinta del fascio.
Mentre sono immersi in un flusso fluido lento, i gruppi di spermatozoi si muovono parallelamente l'uno all'altro, tuttavia, iniziano a sovrapporsi e ad aderire a tutto ciò che è immobile, per non essere trascinati via dalla corrente che aumenta con l'aumentare della velocità. I ​​gruppi si formano quando una manciata di spermatozoi si avvicinano, iniziano a muoversi in sincronia e ad avvolgersi l'uno intorno all'altro, per poi aderire a una sostanza appiccicosa. Le figure 1 e 2 mostrano come gli spermatozoi si avvicinano, formando una giunzione mentre le code si avvolgono l'una intorno all'altra.
I ricercatori hanno applicato la pressione idrostatica per creare un flusso di fluido in un microcanale per studiare la reologia degli spermatozoi. È stato utilizzato un microcanale con dimensioni di 200 µm × 20 µm (L × A) e una lunghezza di 3,6 µm. Utilizzare microcanali tra contenitori con siringhe inserite alle estremità. È stato utilizzato del colorante alimentare per rendere i canali più visibili.
Fissare i cavi di interconnessione e gli accessori alla parete. Il video è stato ripreso con un microscopio a contrasto di fase. Per ogni immagine vengono presentate immagini di microscopia a contrasto di fase e di mappatura. (A) La connessione tra due flussi oppone resistenza al flusso a causa del moto elicoidale (freccia rossa). (B) La connessione tra il fascio tubiero e la parete del canale (frecce rosse), allo stesso tempo connessa ad altri due fasci (frecce gialle). (C) I fasci di spermatozoi nel canale microfluidico iniziano a connettersi tra loro (frecce rosse), formando una rete di fasci di spermatozoi. (D) Formazione di una rete di fasci di spermatozoi.
Quando una goccia di sperma diluito veniva caricata nel dispositivo microfluidico e si creava un flusso, si osservava che il fascio di spermatozoi si muoveva in direzione opposta al flusso. I fasci si adattavano perfettamente alle pareti dei microcanali e le teste libere nella parte iniziale dei fasci si adattavano perfettamente a esse (video 5). Aderiscono anche a qualsiasi particella stazionaria sul loro percorso, come detriti, per resistere all'essere trascinati via dalla corrente. Col tempo, questi ciuffi diventano lunghi filamenti che intrappolano altri spermatozoi singoli e ciuffi più corti (video 6). Man mano che il flusso inizia a rallentare, lunghe file di spermatozoi iniziano a formare una rete di linee spermatiche (video 7; figura 2).
Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei fili aumentano nel tentativo di catturare più spermatozoi singoli formando fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Ad alta velocità di flusso (V > 33 µm/s), i movimenti a spirale dei fili aumentano nel tentativo di catturare più spermatozoi singoli formando fasci che resistono meglio alla forza di deriva del flusso. Quando la corrente è alta (V > 33 cm/s) la doppia spirale non viene utilizzata, perché si accende usalo molto spermatozoi, spermatozoi indesiderati, che sono un ottimo protettore di un'altra pentola. A velocità di flusso elevate (V > 33 µm/s), i movimenti elicoidali dei filamenti aumentano nel tentativo di catturare numerosi spermatozoi singoli, formando fasci che sono maggiormente in grado di resistere alla forza di deriva del flusso.在高流速(V > 33 µm/s)时, 螺纹的螺旋运动增加, 以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ， 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Con un'elevata potenza di scarico (V > 33 cm/s) la doppia spirale non si accende nella fase di scarico molti altri spermatozoi, spermatozoi, che amano trarre vantaggio dal silama di un'altra bevanda. A portate elevate (V > 33 µm/s), il movimento elicoidale dei filamenti aumenta nel tentativo di catturare numerosi spermatozoi individuali formando fasci per resistere meglio alle forze di deriva del flusso.Hanno anche provato ad applicare dei microcanali alle pareti laterali.
I fasci di spermatozoi sono stati identificati come gruppi di teste spermatiche e code arricciate utilizzando la microscopia ottica (LM). Fasci di spermatozoi con vari aggregati sono stati inoltre identificati come teste ritorte e aggregati flagellari, code spermatiche multiple fuse, teste spermatiche attaccate a una coda e teste spermatiche con nuclei piegati come nuclei multipli fusi. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha mostrato che i fasci di spermatozoi erano aggregati inguainati di teste spermatiche e gli aggregati di spermatozoi mostravano una rete di code avvolte.
La morfologia e l'ultrastruttura degli spermatozoi, la formazione dei fasci di spermatozoi sono state studiate utilizzando la microscopia ottica (sezione a metà), la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM); gli strisci di sperma sono stati colorati con arancio di acridina ed esaminati utilizzando la microscopia a epifluorescenza.
La colorazione dello striscio di spermatozoi con arancio di acridina (Fig. 3B) ha mostrato che le teste degli spermatozoi erano incollate tra loro e ricoperte di materiale secretorio, che ha portato alla formazione di grandi ciuffi (Fig. 3D). I fasci di spermatozoi erano costituiti da aggregati di spermatozoi con una rete di code attaccate (Fig. 4A-C). I fasci di spermatozoi sono composti dalle code di molti spermatozoi incollate tra loro (Fig. 4D). Le secrezioni (Fig. 4E, F) ricoprivano le teste dei fasci di spermatozoi.
Formazione del fascio di spermatozoi Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e gli strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina, è stato dimostrato che le teste degli spermatozoi sono unite. (A) La formazione precoce del fascio di spermatozoi inizia con uno spermatozoo (cerchio bianco) e tre spermatozoi (cerchio giallo), con la spirale che inizia dalla coda e termina alla testa. (B) Micrografia di uno striscio di spermatozoi colorato con arancio di acridina che mostra le teste degli spermatozoi aderenti (frecce). La secrezione ricopre la/le testa/e. Ingrandimento: × 1000. (C) Sviluppo di un ampio fascio trasportato dal flusso in un canale microfluidico (utilizzando una telecamera ad alta velocità a 950 fps). (D) Micrografia di uno striscio di spermatozoi colorato con arancio di acridina che mostra grandi fasci (frecce). Ingrandimento: × 200.
Micrografia elettronica a scansione di un fascio di spermatozoi e di uno striscio di spermatozoi colorato con arancio di acridina. (A, B, D, E) sono micrografie elettroniche a scansione digitale a colori di spermatozoi, mentre C e F sono micrografie di strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina che mostrano l'adesione di più spermatozoi che avvolgono la membrana caudale. (AC) Gli aggregati di spermatozoi sono mostrati come una rete di code attaccate (frecce). (D) Adesione di diversi spermatozoi (con sostanza adesiva, contorno rosa, freccia) che avvolgono la coda. (E e F) Aggregati della testa dello spermatozoo (indicatori) ricoperti di materiale adesivo (indicatori). Gli spermatozoi formavano fasci con diverse strutture vorticose (F). (C) Ingrandimenti ×400 e (F) ×200.
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, abbiamo scoperto che i fasci di spermatozoi presentavano code attaccate (Fig. 6A, C), teste attaccate alle code (Fig. 6B) o teste attaccate alle code (Fig. 6D). Le teste degli spermatozoi nel fascio sono curve, presentando in sezione due regioni nucleari (Fig. 6D). Nel fascio di incisione, gli spermatozoi presentavano una testa contorta con due regioni nucleari e molteplici regioni flagellari (Fig. 5A).
Micrografia elettronica digitale a colori che mostra le code di collegamento nel fascio di spermatozoi e il materiale agglutinante che collega le teste degli spermatozoi. (A) Coda attaccata di un gran numero di spermatozoi. Si noti l'aspetto della coda sia nelle proiezioni verticali (freccia) che orizzontali (freccia). (B) La testa (freccia) dello spermatozoo è attaccata alla coda (freccia). (C) Diverse code di spermatozoi (frecce) sono attaccate. (D) Il materiale agglutinante (AS, blu) collega quattro teste degli spermatozoi (viola).
La microscopia elettronica a scansione è stata utilizzata per rilevare le teste degli spermatozoi in fasci di spermatozoi ricoperti da secrezioni o membrane (Figura 6B), indicando che i fasci di spermatozoi erano ancorati da materiale extracellulare. Il materiale agglutinato era concentrato nella testa dello spermatozoo (assemblaggio simile a una testa di medusa; Fig. 5B) e si espandeva distalmente, conferendo un aspetto giallo brillante alla microscopia a fluorescenza quando colorato con arancio di acridina (Fig. 6C). Questa sostanza è chiaramente visibile al microscopio a scansione ed è considerata un legante. Sezioni semisottili (Fig. 5C) e strisci di spermatozoi colorati con arancio di acridina mostravano fasci di spermatozoi contenenti teste densamente compattate e code arricciate (Fig. 5D).
Diverse microfotografie che mostrano l'aggregazione delle teste degli spermatozoi e delle code ripiegate utilizzando vari metodi. (A) Micrografia elettronica a trasmissione digitale a colori in sezione trasversale di un fascio di spermatozoi che mostra una testa dello spermatozoo arrotolata con un nucleo in due parti (blu) e diverse parti flagellari (verde). (B) Micrografia elettronica a scansione digitale a colori che mostra un gruppo di teste dello spermatozoo simili a meduse (frecce) che sembrano essere coperte. (C) Sezione semi-sottile che mostra teste dello spermatozoo aggregate (frecce) e code arricciate (frecce). (D) Micrografia di uno striscio di spermatozoi colorato con arancio di acridina che mostra aggregati di teste dello spermatozoo (frecce) e code arricciate aderenti (frecce). Si noti che una sostanza appiccicosa (S) ricopre la testa dello spermatozoo. (D) Ingrandimento 1000 ×.
Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (Fig. 7A), è stato inoltre notato che le teste degli spermatozoi erano contorte e i nuclei avevano una forma a spirale, come confermato dagli strisci di sperma colorati con arancio di acridina ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza (Fig. 7B).
(A) Micrografia elettronica a trasmissione digitale a colori e (B) Striscio di spermatozoi colorato con arancio di acridina che mostra le teste arrotolate e l'attaccamento delle teste e delle code degli spermatozoi (frecce). (B) Ingrandimento × 1000.
Una scoperta interessante è che gli spermatozoi di Sharkazi si aggregano formando fasci filamentosi mobili. Le proprietà di questi fasci ci permettono di comprendere il loro possibile ruolo nell'assorbimento e nella conservazione degli spermatozoi nel SST.
Dopo l'accoppiamento, gli spermatozoi entrano nella vagina e subiscono un intenso processo di selezione, con il risultato che solo un numero limitato di spermatozoi entra nell'SST15,16. Ad oggi, i meccanismi con cui gli spermatozoi entrano ed escono dall'SST non sono chiari. Nel pollame, gli spermatozoi vengono conservati nell'SST per un periodo prolungato, da 2 a 10 settimane, a seconda della specie6. Rimangono controversie sulle condizioni del seme durante la conservazione nell'SST. Sono in movimento o a riposo? In altre parole, come fanno gli spermatozoi a mantenere la loro posizione nell'SST per così tanto tempo?
Forman4 ha suggerito che la residenza e l'espulsione degli SST potrebbero essere spiegate in termini di motilità degli spermatozoi. Gli autori ipotizzano che gli spermatozoi mantengano la loro posizione nuotando contro il flusso del fluido creato dall'epitelio degli SST e che vengano espulsi dagli SST quando la loro velocità scende al di sotto del punto in cui iniziano a muoversi all'indietro per mancanza di energia. Zaniboni5 ha confermato la presenza di acquaporine 2, 3 e 9 nella porzione apicale delle cellule epiteliali degli SST, il che potrebbe indirettamente supportare il modello di conservazione degli spermatozoi di Foreman. Nel presente studio, abbiamo scoperto che quasi la metà degli spermatozoi di Sharkashi mostra una reologia positiva nel fluido in movimento e che i fasci di spermatozoi agglutinati aumentano il numero di spermatozoi con reologia positiva, sebbene l'agglutinazione li rallenti. Il modo in cui gli spermatozoi risalgono la tuba di Falloppio dell'uccello fino al sito di fecondazione non è ancora del tutto chiaro. Nei mammiferi, il fluido follicolare chemioattrae gli spermatozoi. Tuttavia, si ritiene che i chemioattraenti indirizzino gli spermatozoi ad affrontare lunghe distanze7. Pertanto, altri meccanismi sono responsabili del trasporto degli spermatozoi. La capacità degli spermatozoi di orientarsi e fluire contro il fluido delle tube di Falloppio rilasciato dopo l'accoppiamento è stata segnalata come un fattore importante nel targeting degli spermatozoi nei topi. Parker 17 ha suggerito che gli spermatozoi attraversano gli ovidotti nuotando contro la corrente ciliare negli uccelli e nei rettili. Sebbene non sia stato dimostrato sperimentalmente negli uccelli, Adolphi18 è stato il primo a scoprire che gli spermatozoi aviari danno risultati positivi quando si crea un sottile strato di liquido tra un coprioggetto e un vetrino con una striscia di carta da filtro. Reologia. Hino e Yanagimachi [19] hanno posizionato un complesso ovaio-tuba-uterino di topo in un anello di perfusione e hanno iniettato 1 µl di inchiostro nell'istmo per visualizzare il flusso di fluido nelle tube di Falloppio. Hanno notato un movimento molto attivo di contrazione e rilassamento nella tuba di Falloppio, in cui tutte le palline di inchiostro si muovevano costantemente verso l'ampolla della tuba. Gli autori sottolineano l'importanza del flusso del fluido tubarico dalle tube di Falloppio inferiori a quelle superiori per il sollevamento e la fecondazione degli spermatozoi. Brillard20 ha riferito che nei polli e nei tacchini, gli spermatozoi migrano tramite movimento attivo dall'ingresso vaginale, dove sono immagazzinati, alla giunzione utero-vaginale, dove vengono conservati. Tuttavia, questo movimento non è necessario tra la giunzione utero-vaginale e l'infundibolo, poiché gli spermatozoi vengono trasportati per spostamento passivo. Conoscendo queste precedenti raccomandazioni e i risultati ottenuti nel presente studio, si può presumere che la capacità degli spermatozoi di muoversi controcorrente (reologia) sia una delle proprietà su cui si basa il processo di selezione. Ciò determina il passaggio degli spermatozoi attraverso la vagina e il loro ingresso nel CCT per la conservazione. Come ha suggerito Forman4, questo potrebbe anche facilitare il processo con cui gli spermatozoi entrano nell'SST e nel suo habitat per un certo periodo di tempo e poi escono quando la loro velocità inizia a rallentare.
D'altra parte, Matsuzaki e Sasanami 21 hanno suggerito che gli spermatozoi aviari subiscano cambiamenti di motilità dalla dormienza alla motilità nei tratti riproduttivi maschile e femminile. L'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti nel SST è stata proposta per spiegare il lungo tempo di conservazione degli spermatozoi e il successivo ringiovanimento dopo aver lasciato il SST. In condizioni di ipossia, Matsuzaki et al. 1 hanno riportato un'elevata produzione e rilascio di lattato nel SST, che può portare all'inibizione della motilità degli spermatozoi residenti. In questo caso, l'importanza della reologia spermatica si riflette nella selezione e nell'assorbimento degli spermatozoi, e non nella loro conservazione.
Il modello di agglutinazione degli spermatozoi è considerato una spiegazione plausibile per il lungo periodo di conservazione degli spermatozoi nell'SST, poiché si tratta di un modello comune di ritenzione degli spermatozoi nel pollame2,22,23. Bakst et al. 2 hanno osservato che la maggior parte degli spermatozoi aderiva l'uno all'altro, formando aggregati fascicolari, e che spermatozoi singoli erano raramente presenti nel CCM della quaglia. D'altra parte, Wen et al. 24 hanno osservato un numero maggiore di spermatozoi sparsi e un minor numero di ciuffi di spermatozoi nel lume dell'SST nei polli. Sulla base di queste osservazioni, si può presumere che la propensione all'agglutinazione degli spermatozoi differisca tra i volatili e tra gli spermatozoi nello stesso eiaculato. Inoltre, Van Krey et al. 9 hanno suggerito che la dissociazione casuale degli spermatozoi agglutinati sia responsabile della graduale penetrazione degli spermatozoi nel lume della tuba di Falloppio. Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con minore capacità di agglutinazione dovrebbero essere espulsi per primi dal SST. In questo contesto, la capacità degli spermatozoi di agglutinare potrebbe essere un fattore che influenza l'esito della competizione spermatica negli uccelli contaminati. Inoltre, più a lungo gli spermatozoi agglutinati si dissociano, più a lungo viene mantenuta la fertilità.
Sebbene l'aggregazione degli spermatozoi e la loro aggregazione in fasci siano state osservate in diversi studi2,22,24, non sono state descritte in dettaglio a causa della complessità della loro osservazione cinematica all'interno della SST. Sono stati fatti diversi tentativi di studiare l'agglutinazione degli spermatozoi in vitro. Un'aggregazione estesa ma transitoria è stata osservata quando il filo sottile è stato rimosso dalla goccia di semi penzolante. Ciò porta al fatto che una bolla allungata sporge dalla goccia, imitando la ghiandola seminale. A causa delle limitazioni 3D e dei brevi tempi di asciugatura a goccia, l'intero blocco è caduto rapidamente in rovina9. Nel presente studio, utilizzando polli Sharkashi e chip microfluidici, siamo stati in grado di descrivere come si formano questi fasci e come si muovono. I fasci di spermatozoi si sono formati immediatamente dopo la raccolta del seme e si è riscontrato che si muovevano a spirale, mostrando una reologia positiva quando presenti nel flusso. Inoltre, quando osservati macroscopicamente, è stato osservato che i fasci di spermatozoi aumentano la linearità della motilità rispetto agli spermatozoi isolati. Ciò suggerisce che l'agglutinazione degli spermatozoi possa verificarsi prima della penetrazione del SST e che la produzione di spermatozoi non sia limitata a una piccola area a causa dello stress, come precedentemente suggerito (Tingari e Lake12). Durante la formazione del ciuffo, gli spermatozoi nuotano in sincronia fino a formare una giunzione, quindi le loro code si avvolgono l'una attorno all'altra e la testa dello spermatozoo rimane libera, ma la coda e la parte distale dello spermatozoo rimangono attaccate insieme da una sostanza appiccicosa. Pertanto, la testa libera del legamento è responsabile del movimento, trascinando il resto del legamento. La microscopia elettronica a scansione dei fasci di spermatozoi ha mostrato teste di spermatozoi attaccate ricoperte da una grande quantità di materiale appiccicoso, suggerendo che le teste di spermatozoi fossero attaccate in fasci di riposo, il che potrebbe essersi verificato dopo aver raggiunto il sito di stoccaggio (SST).
Colorando uno striscio di spermatozoi con arancio di acridina, al microscopio a fluorescenza si può osservare un materiale adesivo extracellulare che circonda gli spermatozoi. Questa sostanza permette ai gruppi di spermatozoi di aderire e aggrapparsi a qualsiasi superficie o particella circostante, evitando così di essere trasportati dalla corrente. Pertanto, le nostre osservazioni mostrano il ruolo dell'adesione degli spermatozoi sotto forma di gruppi mobili. La loro capacità di nuotare controcorrente e di aderire alle superfici circostanti consente agli spermatozoi di rimanere più a lungo nel SST.
Rothschild25 ha utilizzato una camera emocitometrica per studiare la distribuzione flottante del seme bovino in una goccia di sospensione, eseguendo microfotografie attraverso una camera con asse ottico sia verticale che orizzontale. I risultati hanno mostrato che gli spermatozoi erano attratti dalla superficie della camera. Gli autori suggeriscono che potrebbero esserci interazioni idrodinamiche tra lo sperma e la superficie. Tenendo conto di ciò, insieme alla capacità del seme di pulcino Sharkashi di formare ciuffi appiccicosi, si potrebbe aumentare la probabilità che il seme aderisca alla parete del SST e venga conservato per lunghi periodi di tempo.
Bccetti e Afzeliu26 hanno riportato che il glicocalice spermatico è necessario per il riconoscimento e l'agglutinazione dei gameti. Forman10 ha osservato che l'idrolisi dei legami α-glicosidici nei rivestimenti glicoproteina-glicolipidi, trattando il seme aviario con neuraminidasi, ha portato a una riduzione della fertilità senza influire sulla motilità degli spermatozoi. Gli autori suggeriscono che l'effetto della neuraminidasi sul glicocalice comprometta il sequestro degli spermatozoi a livello della giunzione utero-vaginale, riducendo così la fertilità. Le loro osservazioni non possono ignorare la possibilità che il trattamento con neuraminidasi possa ridurre il riconoscimento di spermatozoi e ovociti. Forman ed Engel10 hanno riscontrato una riduzione della fertilità quando le galline venivano inseminate per via intravaginale con seme trattato con neuraminidasi. Tuttavia, la fecondazione in vitro con spermatozoi trattati con neuraminidasi non ha influenzato la fertilità rispetto ai polli di controllo. Gli autori hanno concluso che i cambiamenti nel rivestimento glicoproteina-glicolipide attorno alla membrana dello spermatozoo riducono la capacità dello spermatozoo di fecondare, compromettendo il sequestro degli spermatozoi nella giunzione utero-vaginale, il che a sua volta aumenta la perdita di spermatozoi a causa della velocità della giunzione utero-vaginale, ma non influisce sul riconoscimento degli spermatozoi e degli ovuli.
Nei tacchini, Bakst e Bauchan [11] hanno trovato piccole vescicole e frammenti di membrana nel lume del tratto seminale superficiale (SST) e hanno osservato che alcuni di questi granuli si erano fusi con la membrana dello spermatozoo. Gli autori suggeriscono che queste relazioni possano contribuire alla conservazione a lungo termine degli spermatozoi nel SST. Tuttavia, i ricercatori non hanno specificato l'origine di queste particelle, se siano secrete dalle cellule epiteliali del CCT, prodotte e secrete dall'apparato riproduttivo maschile o prodotte dallo spermatozoo stesso. Inoltre, queste particelle sono responsabili dell'agglutinazione. Grützner et al [27] hanno riportato che le cellule epiteliali dell'epididimo producono e secernono una proteina specifica necessaria per la formazione di vie seminali monoporose. Gli autori riportano anche che la dispersione di questi fasci dipende dall'interazione delle proteine ​​dell'epididimo. Nixon et al [28] hanno scoperto che gli annessi secernono una proteina, l'osteonectina acida ricca di cisteina; SPARC è coinvolta nella formazione dei fasci di spermatozoi negli echidna dal becco corto e negli ornitorinchi. La dispersione di questi fasci è associata alla perdita di questa proteina.
Nello studio attuale, l'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica ha mostrato che gli spermatozoi aderivano a una grande quantità di materiale denso. Si ritiene che queste sostanze siano responsabili dell'agglutinazione che si condensa tra e attorno alle teste aderenti, ma a concentrazioni inferiori nella regione della coda. Presumiamo che questa sostanza agglutinante venga escreta dall'apparato riproduttivo maschile (epididimo o dotto deferente) insieme allo sperma, poiché spesso osserviamo la separazione dello sperma dalla linfa e dal plasma seminale durante l'eiaculazione. È stato riportato che, quando gli spermatozoi aviari attraversano l'epididimo e il dotto deferente, subiscono cambiamenti correlati alla maturazione che supportano la loro capacità di legare proteine ​​e acquisire glicoproteine ​​associate al lemma plasmatico. La persistenza di queste proteine ​​sulle membrane spermatiche residenti nel SST suggerisce che queste proteine ​​possano influenzare l'acquisizione della stabilità della membrana spermatica 30 e determinarne la fertilità 31 . Ahammad et al32 hanno riferito che gli spermatozoi ottenuti da varie parti dell'apparato riproduttivo maschile (dai testicoli ai vasi deferenti distali) hanno mostrato un progressivo aumento della vitalità in condizioni di conservazione liquida, indipendentemente dalla temperatura di conservazione; inoltre, la vitalità nei polli aumenta anche nelle tube di Falloppio dopo l'inseminazione artificiale.
I ciuffi di spermatozoi dei polli Sharkasi presentano caratteristiche e funzioni diverse rispetto ad altre specie come echidne, ornitorinchi, topi selvatici, ratti cervo e porcellini d'India. Nei polli Sharkasi, la formazione di raggruppamenti di spermatozoi ne ha ridotto la velocità di nuoto rispetto ai singoli spermatozoi. Tuttavia, questi raggruppamenti hanno aumentato la percentuale di spermatozoi reologicamente positivi e la capacità degli spermatozoi di stabilizzarsi in un ambiente dinamico. Pertanto, i nostri risultati confermano la precedente ipotesi secondo cui l'agglutinazione degli spermatozoi durante la SST è associata alla conservazione a lungo termine degli spermatozoi. Ipotizziamo inoltre che la propensione degli spermatozoi a formare raggruppamenti possa controllare il tasso di perdita di spermatozoi durante la SST, il che potrebbe alterare l'esito della competizione spermatica. Secondo questa ipotesi, gli spermatozoi con bassa capacità di agglutinazione rilasciano per primi SST, mentre gli spermatozoi con elevata capacità di agglutinazione producono la maggior parte della prole. La formazione di gruppi di spermatozoi a poro singolo è benefica e influenza il rapporto genitori-figli, ma utilizza un meccanismo diverso. Negli echidna e negli ornitorinchi, gli spermatozoi sono disposti parallelamente tra loro per aumentare la velocità di avanzamento del fascio. I gruppi di echidna si muovono circa tre volte più velocemente dei singoli spermatozoi. Si ritiene che la formazione di tali gruppi di spermatozoi negli echidna sia un adattamento evolutivo per mantenere la dominanza, poiché le femmine sono promiscue e di solito si accoppiano con più maschi. Pertanto, gli spermatozoi provenienti da eiaculati diversi competono ferocemente per la fecondazione dell'ovulo.
Gli spermatozoi agglutinati dei polli sharkasi sono facili da visualizzare utilizzando la microscopia a contrasto di fase, che è considerata vantaggiosa perché consente di studiare facilmente il comportamento degli spermatozoi in vitro. Il meccanismo con cui la formazione di ciuffi di spermatozoi promuove la riproduzione nei polli sharkasi è anche diverso da quello osservato in alcuni mammiferi placentati che rappresentano un comportamento spermatico cooperativo come i topi selvatici, dove alcuni spermatozoi raggiungono le uova, aiutando altri individui correlati a raggiungere e danneggiare le loro uova. per dimostrare il proprio valore. comportamento altruistico. Autofecondazione 34. Un altro esempio di comportamento cooperativo negli spermatozoi è stato riscontrato nei topi cervo, dove gli spermatozoi sono stati in grado di identificare e combinarsi con gli spermatozoi geneticamente più correlati e formare gruppi cooperativi per aumentare la loro velocità rispetto agli spermatozoi non correlati35.
I risultati ottenuti in questo studio non contraddicono la teoria di Foman sulla conservazione a lungo termine degli spermatozoi nell'SWS. I ricercatori riportano che gli spermatozoi continuano a muoversi nel flusso delle cellule epiteliali che rivestono l'SST per un periodo di tempo prolungato e, dopo un certo periodo di tempo, le riserve energetiche degli spermatozoi si esauriscono, con conseguente diminuzione della velocità, che consente l'espulsione di sostanze a basso peso molecolare. L'energia degli spermatozoi con il flusso di fluido dal lume dell'SST La cavità della tuba di Falloppio. Nel presente studio, abbiamo osservato che metà dei singoli spermatozoi ha mostrato la capacità di nuotare contro i fluidi in flusso e la loro adesione al fascio ha aumentato la loro capacità di mostrare una reologia positiva. Inoltre, i nostri dati sono coerenti con quelli di Matsuzaki et al. 1 che hanno riportato che l'aumentata secrezione di lattato nell'SST può inibire la motilità degli spermatozoi residenti. Tuttavia, i nostri risultati descrivono la formazione di legamenti mobili spermatici e il loro comportamento reologico in presenza di un ambiente dinamico all'interno di un microcanale, nel tentativo di chiarirne il comportamento durante la SST. La ricerca futura potrebbe concentrarsi sulla determinazione della composizione chimica e dell'origine dell'agente agglutinante, il che aiuterà senza dubbio i ricercatori a sviluppare nuovi metodi per conservare il liquido seminale e aumentare la durata della fertilità.
Quindici sharkasi maschi a collo nudo di 30 settimane (omozigoti dominanti; Na Na) sono stati selezionati come donatori di sperma per lo studio. Gli uccelli sono stati allevati presso l'allevamento avicolo di ricerca della Facoltà di Agraria dell'Università di Ashit, Governatorato di Ashit, Egitto. Gli uccelli sono stati alloggiati in gabbie individuali (30 x 40 x 40 cm), sottoposti a un programma di illuminazione (16 ore di luce e 8 ore di buio) e alimentati con una dieta contenente 160 g di proteine ​​grezze, 2800 kcal di energia metabolizzabile, 35 g di calcio ciascuno e 5 grammi di fosforo disponibile per chilogrammo di dieta.
Secondo i dati 36, 37, il seme è stato raccolto da maschi mediante massaggio addominale. Sono stati raccolti 45 campioni di seme da 15 uomini nell'arco di 3 giorni. Il seme (n = 15/giorno) è stato immediatamente diluito 1:1 (v:v) con il diluente per seme avicolo Belsville, contenente difosfato di potassio (1,27 g), glutammato monosodico monoidrato (0,867 g), fruttosio (0,5 g), acetato di sodio anidro (0,43 g), tris(idrossimetil)amminometano (0,195 g), citrato di potassio monoidrato (0,064 g), monofosfato di potassio (0,065 g), cloruro di magnesio (0,034 g) e H₂O (100 ml), pH = 7, 5, osmolarità 333 mOsm/kg38. I campioni di sperma diluito sono stati prima esaminati al microscopio ottico per garantirne la buona qualità (umidità) e poi conservati in un bagno d'acqua a 37°C fino al momento dell'uso, previsto entro mezz'ora dalla raccolta.
La cinematica e la reologia degli spermatozoi vengono descritte utilizzando un sistema di dispositivi microfluidici. I campioni di liquido seminale sono stati ulteriormente diluiti a 1:40 nel diluente per seme aviario Beltsville, caricati in un dispositivo microfluidico (vedi sotto) e i parametri cinetici sono stati determinati utilizzando un sistema di analisi computerizzata del liquido seminale (CASA) precedentemente sviluppato per la caratterizzazione microfluidica. Questo studio ha analizzato la mobilità degli spermatozoi in mezzi liquidi (Dipartimento di Ingegneria Meccanica, Facoltà di Ingegneria, Università di Assiut, Egitto). Il plugin può essere scaricato all'indirizzo: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Sono state misurate la velocità di curva (VCL, μm/s), la velocità lineare (VSL, μm/s) e la velocità media di traiettoria (VAP, μm/s). I video degli spermatozoi sono stati registrati utilizzando un microscopio a contrasto di fase Optika XDS-3 invertito (con obiettivo 40x) collegato a una telecamera Tucson ISH1000 a 30 fps per 3 s. È stato utilizzato il software CASA per studiare almeno tre aree e 500 traiettorie degli spermatozoi per campione. Il video registrato è stato elaborato utilizzando un software CASA artigianale. La definizione di motilità nel plug-in CASA si basa sulla velocità di nuoto dello spermatozoo rispetto alla portata e non include altri parametri come il movimento laterale, poiché questo si è dimostrato più affidabile nel flusso del fluido. Il movimento reologico è descritto come il movimento degli spermatozoi in direzione opposta al flusso del fluido. Gli spermatozoi con proprietà reologiche sono stati divisi per il numero di spermatozoi mobili; gli spermatozoi a riposo e quelli in movimento convettivo sono stati esclusi dal conteggio.
Tutti i prodotti chimici utilizzati sono stati forniti da Elgomhoria Pharmaceuticals (Il Cairo, Egitto), salvo diversa indicazione. Il dispositivo è stato prodotto come descritto da El-sherry et al. 40 con alcune modifiche. I materiali utilizzati per realizzare i microcanali includevano lastre di vetro (Howard Glass, Worcester, MA), resist negativo SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcol diacetone (Sigma Aldrich, Steinheim, Germania) e poliacetone-184, Dow Corning, Midland, Michigan). I microcanali vengono realizzati mediante litografia soft. Innanzitutto, una maschera protettiva trasparente con il design dei microcanali desiderato è stata stampata su una stampante ad alta risoluzione (Prismatic, Il Cairo, Egitto e Pacific Arts and Design, Markham, ON). I master sono stati realizzati utilizzando lastre di vetro come substrati. Le piastre sono state pulite in acetone, isopropanolo e acqua deionizzata e quindi rivestite con uno strato di 20 µm di SU8-25 mediante spin coating (3000 rpm, 1 min). Gli strati di SU-8 sono stati quindi asciugati delicatamente (65 °C, 2 min e 95 °C, 10 min) ed esposti a radiazioni UV per 50 s. È stata effettuata una cottura post-esposizione a 65 °C e 95 °C per 1 min e 4 min per reticolare gli strati di SU-8 esposti, seguita da sviluppo in alcol diacetone per 6,5 min. I waffle sono stati poi sottoposti a cottura intensiva (200 °C per 15 min) per solidificare ulteriormente lo strato di SU-8.
Il PDMS è stato preparato miscelando il monomero e l'indurente in un rapporto in peso di 10:1, quindi degassato in un essiccatore sotto vuoto e versato sul telaio principale SU-8. Il PDMS è stato polimerizzato in forno (120 °C, 30 min), quindi i canali sono stati ritagliati, separati dal master e perforati per consentire il collegamento dei tubicini all'ingresso e all'uscita del microcanale. Infine, i microcanali in PDMS sono stati fissati in modo permanente ai vetrini da microscopio utilizzando un processore corona portatile (Electro-Technic Products, Chicago, IL) come descritto altrove. Il microcanale utilizzato in questo studio misura 200 µm × 20 µm (L × A) ed è lungo 3,6 cm.
Il flusso del fluido indotto dalla pressione idrostatica all'interno del microcanale viene ottenuto mantenendo il livello del fluido nel serbatoio di ingresso al di sopra della differenza di altezza Δh39 nel serbatoio di uscita (Fig. 1).
dove f è il coefficiente di attrito, definito come f = C/Re per il flusso laminare in un canale rettangolare, dove C è una costante che dipende dal rapporto di aspetto del canale, L è la lunghezza del microcanale, Vav è la velocità media all'interno del microcanale, Dh è il diametro idraulico del canale, g è l'accelerazione di gravità. Utilizzando questa equazione, la velocità media del canale può essere calcolata utilizzando la seguente equazione: