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Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica priva di sostanze chimiche basata sulla nanotecnologia che utilizza nanostrutture di acqua artificiale (EWNS). Le EWNS presentano un'elevata carica superficiale e sono ricche di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in grado di interagire con numerosi microrganismi, inclusi patogeni di origine alimentare, e di inattivarli. In questo studio si dimostra che le loro proprietà durante la sintesi possono essere perfezionate e ottimizzate per migliorarne ulteriormente il potenziale antibatterico. La piattaforma di laboratorio EWNS è stata progettata per perfezionare le proprietà delle EWNS modificando i parametri di sintesi. La caratterizzazione delle proprietà delle EWNS (carica, dimensioni e contenuto di ROS) è stata eseguita utilizzando moderni metodi analitici. Inoltre, microrganismi alimentari come Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum e Saccharomyces cerevisiae sono stati inoculati sulla superficie di pomodorini biologici per valutarne il potenziale di inattivazione microbica. I risultati presentati dimostrano che le proprietà dell'EWNS possono essere ottimizzate durante la sintesi, con un conseguente aumento esponenziale dell'efficienza di inattivazione. In particolare, la carica superficiale è aumentata di un fattore quattro e il contenuto di ROS è aumentato. La velocità di rimozione microbica è risultata dipendente dalla carica microbica e variava da 1,0 a 3,8 log dopo 45 minuti di esposizione a una dose di aerosol di 40.000 #/cm3 di EWNS.
La contaminazione microbica è la causa principale delle malattie trasmesse tramite gli alimenti causate dall'ingestione di agenti patogeni o delle loro tossine. Le malattie trasmesse tramite gli alimenti causano circa 76 milioni di malattie, 325.000 ricoveri ospedalieri e 5.000 decessi ogni anno solo negli Stati Uniti1. Inoltre, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) stima che l'aumento del consumo di prodotti freschi sia responsabile del 48% di tutte le malattie trasmesse tramite gli alimenti segnalate negli Stati Uniti2. Il costo delle malattie e dei decessi causati da agenti patogeni di origine alimentare negli Stati Uniti è molto elevato, stimato dai Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in oltre 15,6 miliardi di dollari all'anno3.
Attualmente, gli interventi antimicrobici chimici4, radiativi5 e termici6 per garantire la sicurezza alimentare vengono implementati principalmente in punti critici di controllo (CCP) limitati nella filiera produttiva (solitamente dopo la raccolta e/o durante il confezionamento), piuttosto che in modo continuativo, in modo tale che i prodotti freschi siano soggetti a contaminazione incrociata7. Gli interventi antimicrobici sono necessari per controllare meglio le malattie trasmesse dagli alimenti e il deterioramento degli alimenti e hanno il potenziale per essere applicati lungo tutto il continuum dal produttore al consumatore. Minor impatto e minori costi.
Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica basata sulla nanotecnologia, priva di sostanze chimiche, per inattivare i batteri sulle superfici e nell'aria utilizzando nanostrutture d'acqua artificiali (EWNS). Per la sintesi delle EVNS, sono stati utilizzati due processi paralleli: elettrospray e ionizzazione dell'acqua (Fig. 1a). È stato precedentemente dimostrato che le EWNS possiedono un insieme unico di proprietà fisiche e biologiche8,9,10. Le EWNS hanno una media di 10 elettroni per struttura e una dimensione nanometrica media di 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Inoltre, la risonanza di spin elettronico (ESR) ha mostrato che le EWNS contengono una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente radicali idrossilici (OH•) e superossido (O2-) (Fig. 1c)8. Le EWNS rimangono nell'aria per lungo tempo e possono collidere con i microbi sospesi nell'aria e presenti sulle superfici, rilasciando il loro carico di ROS e causando l'inattivazione microbica (Fig. 1d). Questi studi precedenti hanno anche dimostrato che l'EWNS può interagire e inattivare vari batteri Gram-negativi e Gram-positivi di importanza per la salute pubblica, inclusi i micobatteri, sulle superfici e nell'aria8,9. La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che l'inattivazione era causata dalla rottura della membrana cellulare. Inoltre, studi sull'inalazione acuta hanno dimostrato che dosi elevate di EWNS non causano danni o infiammazioni polmonari8.
(a) L'elettrospray si verifica quando viene applicata un'alta tensione tra un capillare contenente liquido e un controelettrodo. (b) L'applicazione dell'alta tensione provoca due fenomeni diversi: (i) l'elettrospray dell'acqua e (ii) la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ioni) intrappolate nell'EWNS. (c) La struttura unica dell'EWNS. (d) Gli EWNS sono altamente mobili a causa della loro natura nanometrica e possono interagire con agenti patogeni presenti nell'aria.
È stata recentemente dimostrata anche la capacità della piattaforma antimicrobica EWNS di inattivare i microrganismi di origine alimentare sulla superficie degli alimenti freschi. È stato inoltre dimostrato che la carica superficiale dell'EWNS può essere utilizzata in combinazione con un campo elettrico per un rilascio mirato. Ancora più importante, è stato osservato un promettente risultato iniziale di circa 1,4 log di riduzione dell'attività del pomodoro biologico contro vari microrganismi alimentari come E. coli e Listeria entro 90 minuti dall'esposizione all'EWNS a una concentrazione di circa 50.000 #/cm³11. Inoltre, i test preliminari di valutazione organolettica non hanno mostrato alcun effetto organolettico rispetto al pomodoro di controllo. Sebbene questi risultati iniziali di inattivazione promettano la sicurezza alimentare anche a dosi molto basse di EWNS di 50.000 #/cc, è chiaro che un potenziale di inattivazione più elevato sarebbe più vantaggioso per ridurre ulteriormente il rischio di infezione e deterioramento.
In questo articolo, concentreremo la nostra ricerca sullo sviluppo di una piattaforma di generazione di EWNS per perfezionare i parametri di sintesi e ottimizzare le proprietà fisico-chimiche degli EWNS al fine di potenziarne il potenziale antibatterico. In particolare, l'ottimizzazione si è concentrata sull'aumento della carica superficiale (per migliorare la distribuzione mirata) e del contenuto di ROS (per migliorare l'efficienza di inattivazione). La caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche ottimizzate (dimensioni, carica e contenuto di ROS) verrà effettuata utilizzando moderni metodi analitici e utilizzando microrganismi alimentari comuni come E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae e M. parafortuitum.
L'EVNS è stato sintetizzato mediante elettrospruzzatura e ionizzazione simultanee di acqua ad alta purezza (18 MΩ cm–1). L'atomizzatore elettrico 12 viene tipicamente utilizzato per atomizzare liquidi e particelle polimeriche e ceramiche sintetiche 13 e fibre 14 di dimensioni controllate.
Come descritto in dettaglio nelle precedenti pubblicazioni 8, 9, 10, 11, in un tipico esperimento, viene applicata un'alta tensione tra un capillare metallico e un controelettrodo collegato a terra. Durante questo processo, si verificano due fenomeni diversi: 1) l'elettrospray e 2) la ionizzazione dell'acqua. Un intenso campo elettrico tra i due elettrodi provoca l'accumulo di cariche negative sulla superficie dell'acqua condensata, con conseguente formazione di coni di Taylor. Di conseguenza, si formano goccioline d'acqua altamente cariche, che continuano a frammentarsi in particelle più piccole, secondo la teoria di Rayleigh16. Allo stesso tempo, un intenso campo elettrico provoca la scissione e la perdita di elettroni (ionizzazione) di alcune molecole d'acqua, generando così una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS)17. I pacchetti di ROS18 generati simultaneamente sono stati incapsulati in EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra il sistema di generazione di EWNS sviluppato e utilizzato nella sintesi di EWNS in questo studio. Acqua purificata conservata in una bottiglia chiusa è stata alimentata attraverso un tubo in Teflon (diametro interno di 2 mm) a un ago in acciaio inossidabile 30G (capillare metallico). Come mostrato in Figura 2b, il flusso d'acqua è controllato dalla pressione dell'aria all'interno della bottiglia. L'ago è collegato a una console in Teflon che può essere regolata manualmente a una certa distanza dal controelettrodo. Il controelettrodo è un disco di alluminio lucidato con un foro al centro per il campionamento. Sotto il controelettrodo si trova un imbuto di campionamento in alluminio, collegato al resto dell'apparato sperimentale tramite una porta di campionamento (Fig. 2b). Tutti i componenti del campionatore sono elettricamente collegati a terra per evitare l'accumulo di cariche che potrebbe compromettere il campionamento delle particelle.
(a) Sistema di generazione di nanostrutture d'acqua ingegnerizzate (EWNS). (b) Sezione trasversale del campionatore e dell'unità elettrospray che mostra i parametri più importanti. (c) Configurazione sperimentale per l'inattivazione dei batteri.
Il sistema di generazione EWNS sopra descritto è in grado di modificare i parametri operativi chiave per facilitare la regolazione fine delle proprietà EWNS. Regolare la tensione applicata (V), la distanza tra l'ago e il controelettrodo (L) e il flusso d'acqua (φ) attraverso il capillare per regolare finemente le caratteristiche EWNS. I simboli [V (kV), L (cm)] sono utilizzati per indicare diverse combinazioni. Regolare il flusso d'acqua per ottenere un cono di Taylor stabile di un determinato insieme [V, L]. Ai fini di questo studio, l'apertura del controelettrodo (D) è stata impostata a 0,5 pollici (1,29 cm).
A causa della geometria limitata e dell'asimmetria, l'intensità del campo elettrico non può essere calcolata partendo da principi primi. Invece, è stato utilizzato il software QuickField™ (Svendborg, Danimarca)19 per calcolare il campo elettrico. Il campo elettrico non è uniforme, quindi il valore del campo elettrico all'estremità del capillare è stato utilizzato come valore di riferimento per diverse configurazioni.
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le diverse combinazioni sono illustrate nella Tabella Supplementare S1.
L'uscita del sistema di generazione EWNS è stata collegata direttamente a uno Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, modello 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) per misurare la concentrazione del numero di particelle ed è stata utilizzata con un elettrometro per aerosol di Faraday (TSI, modello 3068B, Shoreview, USA). MN) per misurare i flussi di aerosol, come descritto nella nostra precedente pubblicazione9. Sia lo SMPS che l'elettrometro per aerosol hanno campionato a una portata di 0,5 L/min (flusso totale del campione 1 L/min). Le concentrazioni di particelle e i flussi di aerosol sono stati misurati per 120 s. Ripetere la misurazione 30 volte. La carica totale di aerosol viene calcolata dalle misurazioni correnti e la carica media di EWNS viene stimata dal numero totale di particelle di EWNS campionate. Il costo medio di EWNS può essere calcolato utilizzando l'equazione (1):
dove IEl è la corrente misurata, NSMPS è la concentrazione numerica misurata con l'SMPS e φEl è la portata all'elettrometro.
Poiché l'umidità relativa (RH) influisce sulla carica superficiale, la temperatura e l'UR sono state mantenute costanti rispettivamente a 21 °C e al 45% durante l'esperimento.
Per misurare le dimensioni e la durata di vita dell'EWNS sono stati utilizzati il ​​microscopio a forza atomica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e la sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Giappone). La frequenza di scansione dell'AFM è di 1 Hz e l'area di scansione è di 5 µm × 5 µm con 256 linee di scansione. Tutte le immagini sono state sottoposte ad allineamento di primo ordine utilizzando il software Asylum (maschera con un intervallo di 100 nm e una soglia di 100 µm).
Rimuovere l'imbuto di campionamento e posizionare la superficie della mica a una distanza di 2,0 cm dal controelettrodo per un tempo medio di 120 s per evitare la coalescenza delle particelle e la formazione di goccioline irregolari sulla superficie della mica. L'EWNS è stato applicato direttamente alle superfici di mica appena tagliate (Ted Pella, Redding, CA). Immediatamente dopo lo sputtering, la superficie della mica è stata visualizzata tramite AFM. L'angolo di contatto superficiale della mica non modificata appena tagliata è prossimo a 0°, quindi l'EWNS si propaga sulla superficie della mica con una forma a cupola20. Il diametro (a) e l'altezza (h) delle goccioline diffuse sono stati misurati direttamente dalla topografia AFM e utilizzati per calcolare il volume di diffusione a cupola EWNS utilizzando il nostro metodo precedentemente convalidato8. Supponendo che l'EVNS integrato abbia lo stesso volume, il diametro equivalente può essere calcolato dall'equazione (2):
In accordo con il nostro metodo precedentemente sviluppato, è stata utilizzata una trappola di spin a risonanza di spin elettronico (ESR) per rilevare la presenza di intermedi radicalici a breve vita nell'EWNS. Gli aerosol sono stati fatti passare attraverso una soluzione contenente 235 mM di DEPMPO (5-(dietossifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-ossido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Tutte le misurazioni EPR sono state eseguite utilizzando uno spettrometro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) e array di celle piatte. Il software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) è stato utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. La caratterizzazione dei ROS è stata eseguita solo per un set di condizioni operative [-6,5 kV, 4,0 cm]. Le concentrazioni di EWNS sono state misurate utilizzando SMPS dopo aver tenuto conto della perdita di EWNS nell'impattore.
I livelli di ozono sono stati monitorati utilizzando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Per tutte le proprietà EWNS, il valore di misurazione è la media delle misurazioni e l'errore di misurazione è la deviazione standard. È stato eseguito un test t per confrontare il valore dell'attributo EWNS ottimizzato con il valore corrispondente dell'EWNS di base.
La Figura 2c mostra un sistema di passaggio della precipitazione elettrostatica (EPES) precedentemente sviluppato e caratterizzato che può essere utilizzato per indirizzare EWNS11 verso le superfici. L'EPES utilizza una carica EWNS in combinazione con un intenso campo elettrico per "puntare" direttamente sulla superficie del bersaglio. I dettagli del sistema EPES sono presentati in una recente pubblicazione di Pyrgiotakis et al.11. Pertanto, l'EPES è costituito da una camera in PVC stampata in 3D con estremità rastremate contenente due piastre metalliche parallele in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile 304, lucidato a specchio) al centro, distanti 15,24 cm l'una dall'altra. Le schede erano collegate a una sorgente esterna ad alta tensione (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la scheda inferiore era sempre positiva e quella superiore era sempre collegata a terra (flottante). Le pareti della camera sono rivestite con un foglio di alluminio, collegato elettricamente a terra per prevenire la perdita di particelle. La camera è dotata di una porta di caricamento frontale sigillata che consente di posizionare le superfici di prova su rack di plastica, sollevandole dalla piastra metallica inferiore per evitare interferenze ad alta tensione.
L'efficienza di deposizione di EWNS in EPES è stata calcolata secondo un protocollo precedentemente sviluppato e dettagliato nella Figura supplementare S111.
Come camera di controllo, il secondo flusso attraverso la camera cilindrica è collegato in serie al sistema EPES tramite un filtro HEPA intermedio per rimuovere l'EWNS. Come mostrato in figura 2c, l'aerosol di EWNS è stato pompato attraverso due camere collegate in serie. Il filtro tra la sala di controllo e l'EPES rimuove qualsiasi EWNS rimanente, mantenendo gli stessi livelli di temperatura (T), umidità relativa (UR) e ozono.
È stato scoperto che importanti microrganismi trasmessi dagli alimenti contaminano i prodotti freschi, come l'Escherichia coli (ATCC #27325), un indicatore fecale, la Salmonella enterica (ATCC #53647), un agente patogeno trasmesso dagli alimenti, la Listeria innocua (ATCC #33090), un'alternativa al patogeno Listeria monocytogenes, il Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) come alternativa al lievito deteriorante e il Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) come batterio vivo più resistente, acquistati dall'ATCC (Manassas, Virginia).
Acquistate a caso confezioni di pomodorini biologici al supermercato locale e conservateli in frigorifero a 4 °C fino al momento dell'uso (fino a 3 giorni). Selezionate pomodori di una dimensione, circa 1,2 cm di diametro, per fare degli esperimenti.
I protocolli per l'incubazione, l'inoculazione, l'esposizione e il conteggio delle colonie sono stati descritti in dettaglio nelle nostre precedenti pubblicazioni e spiegati in dettaglio nei Dati Supplementari 11. Le prestazioni dell'EWNS sono state valutate esponendo i pomodori inoculati a 40.000 #/cm3 per 45 minuti. In breve, al tempo t = 0 min, sono stati utilizzati tre pomodori per valutare i microrganismi sopravvissuti. Tre pomodori sono stati posizionati in EPES ed esposti a EWNS a 40.000 #/cc (pomodori esposti a EWNS) e altri tre sono stati posizionati nella camera di controllo (pomodori di controllo). Nessuno dei gruppi di pomodori è stato sottoposto a ulteriori trattamenti. I pomodori esposti a EWNS e i controlli sono stati rimossi dopo 45 minuti per valutare l'effetto dell'EWNS.
Ogni esperimento è stato condotto in triplicato. L'analisi dei dati è stata eseguita secondo il protocollo descritto nei Dati Supplementari.
Campioni batterici di E. coli, Enterobacter e L. innocua esposti a EWNS (45 min, concentrazione di aerosol di EWNS 40.000 #/cm³) e non esposti sono stati pellettizzati per valutare i meccanismi di inattivazione. Il precipitato è stato fissato per 2 ore a temperatura ambiente in una soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) con un fissativo di glutaraldeide al 2,5%, paraformaldeide all'1,25% e acido picrico allo 0,03%. Dopo il lavaggio, sono stati fissati con tetrossido di osmio (OsO4) all'1%/ferrocianuro di potassio (KFeCN6) all'1,5% per 2 ore, lavati 3 volte con acqua e incubati in acetato di uranile all'1% per 1 ora, quindi lavati due volte con acqua. Successiva disidratazione di 10 minuti ciascuna con alcol al 50%, 70%, 90% e 100%. I campioni sono stati quindi immersi in ossido di propilene per 1 ora e impregnati con una miscela 1:1 di ossido di propilene e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). I ​​campioni sono stati inclusi in TAAB Epon e polimerizzati a 60 °C per 48 ore. La resina granulare polimerizzata è stata sezionata e visualizzata al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) utilizzando un JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Giappone), un microscopio elettronico a trasmissione convenzionale dotato di una telecamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. Per ogni punto temporale, i lavaggi batterici sono stati piastrati in triplicato, ottenendo un totale di nove punti dati per punto, la cui media è stata utilizzata come concentrazione batterica per quel particolare organismo. La deviazione standard è stata utilizzata come errore di misura. Tutti i punti sono validi.
Il logaritmo della diminuzione della concentrazione dei batteri rispetto a t = 0 min è stato calcolato utilizzando la seguente formula:
dove C0 è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo 0 (vale a dire dopo che la superficie si è asciugata ma prima di essere inserito nella camera) e Cn è la concentrazione di batteri sulla superficie dopo n minuti di esposizione.
Per tenere conto della degradazione naturale dei batteri durante il periodo di esposizione di 45 minuti, è stata calcolata anche la riduzione logaritmica rispetto al controllo a 45 minuti come segue:
Dove Cn è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo n e Cn-Controllo è la concentrazione di batteri di controllo al tempo n. I dati sono presentati come riduzione logaritmica rispetto al controllo (nessuna esposizione a EWNS).
Durante lo studio, diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo sono state valutate in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le varie combinazioni sono illustrate nella Tabella Supplementare S1. Due casi sono stati selezionati per uno studio completo che mostra proprietà stabili e riproducibili (cono di Taylor, produzione di EWNS e stabilità nel tempo). La Figura 3 mostra i risultati relativi a carica, dimensione e contenuto di ROS per due casi. I risultati sono riassunti anche nella Tabella 1. Per riferimento, la Figura 3 e la Tabella 1 includono le proprietà degli EWNS8, 9, 10, 11 non ottimizzati precedentemente sintetizzati (EWNS di base). I calcoli della significatività statistica utilizzando un t-test a due code sono ripubblicati nella Tabella Supplementare S2. Inoltre, i dati aggiuntivi includono studi sull'effetto del diametro del foro di campionamento dell'elettrodo controelettrodico (D) e della distanza tra l'elettrodo di terra e la punta dell'ago (L) (Figure supplementari S2 e S3).
(a–c) Distribuzione dimensionale AFM. (d – f) Caratteristica della carica superficiale. (g) Caratterizzazione di ROS ed ESR.
È inoltre importante notare che, per tutte le condizioni sopra descritte, le correnti di ionizzazione misurate erano comprese tra 2 e 6 µA e le tensioni tra -3,8 e -6,5 kV, con un conseguente consumo energetico per questo modulo di generazione EWNS a terminale singolo inferiore a 50 mW. Sebbene l'EWNS fosse sintetizzato ad alta pressione, i livelli di ozono erano molto bassi, non superando mai i 60 ppb.
La Figura supplementare S4 mostra i campi elettrici simulati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], rispettivamente. I campi secondo gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono calcolati rispettivamente come 2 × 10⁻¹ V/m e 4,7 × 10⁻¹ V/m. Ciò è prevedibile, poiché il rapporto tra tensione e distanza è molto più elevato nel secondo caso.
Le figure 3a e 3b mostrano il diametro dell'EWNS misurato con l'AFM8. I diametri medi dell'EWNS per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono stati calcolati rispettivamente a 27 nm e 19 nm. Le deviazioni standard geometriche delle distribuzioni per i casi [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono rispettivamente 1,41 e 1,45, indicando una distribuzione dimensionale ristretta. Sia la dimensione media che la deviazione standard geometrica sono molto vicine all'EWNS basale, essendo rispettivamente 25 nm e 1,41. La figura 3c mostra la distribuzione dimensionale dell'EWNS basale misurata con lo stesso metodo nelle stesse condizioni.
Nella figura 3d, e sono mostrati i risultati della caratterizzazione della carica. I dati sono misurazioni medie di 30 misurazioni simultanee di concentrazione (#/cm3) e corrente (I). L'analisi mostra che la carica media sull'EWNS è di 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- rispettivamente per [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rispetto all'EWNS di base (10 ± 2 e-), la loro carica superficiale è significativamente maggiore, il doppio di quella dello scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e quattro volte quella dello scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f mostra i dati di base relativi al pagamento dell'EWNS.
Dalle mappe di concentrazione del numero di EWNS (Figure Supplementari S5 e S6), si può osservare che la scena [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta un numero di particelle significativamente maggiore rispetto alla scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. È inoltre opportuno notare che le concentrazioni del numero di EWNS sono state monitorate per un massimo di 4 ore (Figure Supplementari S5 e S6), durante le quali la stabilità della generazione di EWNS ha mostrato gli stessi livelli di concentrazione del numero di particelle in entrambi i casi.
La Figura 3g mostra lo spettro EPR dopo la sottrazione del controllo (fondo) per EWNS ottimizzato a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Lo spettro ROS è anche confrontato con il valore base dell'EWNS in un articolo precedentemente pubblicato. Il numero calcolato di EWNS che reagiscono con la trappola di spin è 7,5 × 104 EWNS/s, un valore simile al valore base dell'EWNS8 precedentemente pubblicato. Gli spettri EPR indicavano chiaramente la presenza di due tipi di ROS, dove predominava O2-, mentre OH• era presente in quantità minore. Inoltre, un confronto diretto delle intensità dei picchi ha mostrato che l'EWNS ottimizzato aveva un contenuto di ROS significativamente più elevato rispetto all'EWNS basale.
La figura 4 mostra l'efficienza di deposizione di EWNS in EPES. I dati sono riassunti anche nella Tabella I e confrontati con i dati EWNS originali. Per entrambi i casi EUNS, la deposizione era prossima al 100% anche a una bassa tensione di 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV sono sufficienti per ottenere una deposizione del 100% indipendentemente dalla variazione di carica superficiale. Nelle stesse condizioni, l'efficienza di deposizione del Baseline-EWNS era solo del 56% a causa della carica inferiore (media di 10 elettroni per EWNS).
La Figura 5 e la Tabella 2 riassumono il grado di inattivazione dei microrganismi inoculati sulla superficie dei pomodori dopo esposizione a circa 40.000 #/cm3 di EWNS per 45 minuti nello scenario ottimale [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e L. innocua inoculati hanno mostrato una riduzione significativa di 3,8 log dopo 45 minuti di esposizione. Nelle stesse condizioni, S. enterica ha mostrato una riduzione logaritmica inferiore di 2,2 log, mentre S. cerevisiae e M. parafortuitum hanno mostrato una riduzione logaritmica di 1,0 log.
Micrografie elettroniche (Figura 6) che illustrano i cambiamenti fisici indotti dall'EWNS nelle cellule di E. coli, Salmonella enterica e L. innocua, che ne portano all'inattivazione. I batteri di controllo mostravano membrane cellulari intatte, mentre i batteri esposti presentavano membrane esterne danneggiate.
L'imaging al microscopio elettronico dei batteri di controllo e di quelli esposti ha rivelato danni alla membrana.
I dati sulle proprietà fisico-chimiche degli EWNS ottimizzati mostrano collettivamente che le proprietà degli EWNS (carica superficiale e contenuto di ROS) sono state significativamente migliorate rispetto ai dati di base degli EWNS precedentemente pubblicati8,9,10,11. D'altra parte, le loro dimensioni sono rimaste nell'ordine dei nanometri, il che è molto simile ai risultati pubblicati in precedenza, consentendo loro di rimanere in aria per un lungo periodo di tempo. La polidispersità osservata può essere spiegata dalle variazioni della carica superficiale, che determinano l'entità dell'effetto Rayleigh, la casualità e la potenziale fusione degli EWNS. Tuttavia, come dettagliato da Nielsen et al.22, un'elevata carica superficiale riduce l'evaporazione aumentando efficacemente l'energia/tensione superficiale della goccia d'acqua. Questa teoria è stata confermata sperimentalmente per le microgocce22 e gli EWNS nella nostra precedente pubblicazione8. Anche la perdita di tempo può influire sulle dimensioni e contribuire alla distribuzione dimensionale osservata.
Inoltre, la carica per struttura è di circa 22-44 e-, a seconda delle circostanze, un valore significativamente più alto rispetto all'EWNS di base, che ha una carica media di 10 ± 2 elettroni per struttura. Tuttavia, è opportuno notare che questa è la carica media dell'EWNS. Seto et al. hanno dimostrato che la carica non è uniforme e segue una distribuzione log-normale21. Rispetto al nostro lavoro precedente, raddoppiando la carica superficiale si raddoppia l'efficienza di deposizione nel sistema EPES, arrivando quasi al 100%11.