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Le particelle di silice porosa sono state preparate con un metodo sol-gel con alcune modifiche per ottenere particelle macroporose. Queste particelle sono state derivate mediante polimerizzazione con trasferimento di catena di frammentazione per addizione reversibile (RAFT) con N-fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PMI) e stirene per preparare l'intercalazione di N-fenilmaleimmide della fase stazionaria di polistirene (PMP). Separazione della colonna PMP valutata di una miscela di peptidi costituita da cinque peptidi (prestazioni cromatografiche Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina enkephalin) e digestione con tripsina dell'albumina di siero umano (HAS). m². Confrontando le prestazioni di separazione della colonna sviluppata con la colonna commerciale Ascentis Express RP-Amide, è stato osservato che le prestazioni di separazione della colonna PMP erano superiori alla colonna commerciale in termini di efficienza di separazione e risoluzione.
Negli ultimi anni, l'industria biofarmaceutica è diventata un mercato globale in espansione con un sostanziale aumento della quota di mercato. Con la crescita esplosiva dell'industria biofarmaceutica1,2,3, l'analisi di peptidi e proteine ​​è altamente richiesta. Oltre al peptide target, durante la sintesi del peptide vengono generate diverse impurità, che richiedono quindi la purificazione cromatografica per ottenere peptidi della purezza desiderata. specie in un singolo campione. Sebbene la spettrometria di massa sia uno strumento efficace per il sequenziamento di peptidi e proteine, se tali campioni vengono iniettati nello spettrometro di massa in un solo passaggio, la separazione non sarà ideale. Sensibilità di rilevamento MS. La cromatografia liquida (LC) è progredita in modo significativo nell'ultimo decennio ed è diventata una tecnica popolare nell'analisi proteomica7,8,9,10.
La cromatografia liquida in fase inversa (RP-LC) è ampiamente utilizzata per la purificazione e la separazione di miscele peptidiche utilizzando la silice modificata con ottadecil (ODS) come fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, le fasi stazionarie RP non forniscono una separazione soddisfacente di peptidi e proteine ​​a causa della loro struttura complessa e della natura anfifilica. interagire con e conservare questi analiti16. La cromatografia in modalità mista, che fornisce interazioni multimodali, può essere un'alternativa alla RP-LC per la separazione di peptidi, proteine ​​e altre miscele complesse. Sono state preparate diverse fasi stazionarie in modalità mista e colonne impaccate con queste fasi sono state utilizzate per separazioni di peptidi e proteine ​​RPLC) sono adatti per separazioni di peptidi e proteine ​​grazie alla presenza di gruppi polari e non polari22,23,24,25,26,27,28. Allo stesso modo, le fasi stazionarie intercalanti polari con gruppi polari legati in modo covalente mostrano un buon potere di separazione e una selettività unica per analiti polari e non polari, poiché la separazione dipende dall'interazione tra analita e fase stazionaria.Interazioni multimodali 29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al.30 ha preparato una fase stazionaria di poliammina con terminazione dodecilica e ha separato con successo idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni e molti altri analiti. s Colonne Express RP-Amide, ma queste colonne sono utilizzate solo per l'analisi dell'ammina 33.
Nel presente studio, è stata preparata e valutata una fase stazionaria incorporata polare (polistirene incorporato con N-fenilmaleimmide) per la separazione di peptidi e digeriti di tripsina di HSA. La fase stazionaria è stata preparata utilizzando la seguente strategia. Le particelle di silice porosa sono state preparate secondo la procedura indicata nella nostra precedente pubblicazione con alcune modifiche al protocollo di preparazione. cond, un nuovo ligando, fenilmaleimmide-metil vinil isocianato, è stato sintetizzato e utilizzato per derivatizzare particelle di silice per preparare una fase stazionaria incorporata polare. La fase stazionaria risultante è stata imballata in una colonna di acciaio inossidabile (100 × 1,8 mm id) utilizzando lo schema di impaccamento ottimizzato. L'impaccamento della colonna è assistito da vibrazioni meccaniche per garantire la formazione di un letto omogeneo all'interno della colonna.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) e digerito di tripsina dell'albumina sierica umana (HAS). La miscela peptidica e il digerito di tripsina di HSA sono stati separati con buona risoluzione ed efficienza. Le prestazioni di separazione della colonna PMP sono state confrontate con quelle della colonna Ascentis Express RP-Amide. Sia i peptidi che le proteine ​​sono stati osservati essere ben risolti ed efficienti sulla colonna PMP, che era più efficiente della colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicole), urea, acido acetico, trimetossi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina di siero umano (HSA), cloruro di ammonio, urea, esano metildisilazano (HMDS), metacriloil cloruro (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossido di benzoile (BPO), acetonitrile di grado HPLC (ACN), M etanolo, 2-propanolo e acetone Acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Una miscela di urea (8 g), polietilenglicole (8 g) e 8 mL di acido acetico 0,01 N è stata agitata per 10 minuti, quindi sono stati aggiunti 24 mL di TMOS in condizioni ghiacciate. La miscela di reazione è stata riscaldata a 40 ° C per 6 ore e poi a 120 ° C per 8 ore in un'autoclave di acciaio inossidabile. La massa morbida essiccata è stata macinata liscia in un forno e calcinata a 550°C per 12 ore. Sono stati preparati e caratterizzati tre lotti per esaminare la riproducibilità nella dimensione delle particelle, nella dimensione dei pori e nell'area superficiale.
Mediante modifica superficiale delle particelle di silice con ligando presintetizzato fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PCMP) seguita da polimerizzazione radiale con stirene, è stato preparato un composto contenente un gruppo polare.Fase stazionaria per inerti e catene di polistirene. Di seguito viene descritto il processo di preparazione.
N-fenilmaleimmide (200 mg) e metil vinil isocianato (100 mg) sono stati sciolti in toluene secco e 0,1 mL di 2,2′-azoisobutirronitrile (AIBN) sono stati aggiunti al pallone di reazione per preparare il copolimero fenilmaleimmide-metil vinil isocianato (PMCP). La miscela è stata riscaldata a 60°C per 3 ore, filtrata ed essiccata in stufa a 40° C per 3 ore.
Particelle di silice essiccate (2 g) sono state disperse in toluene secco (100 mL), agitate e sonicate in un pallone a fondo tondo da 500 mL per 10 min. PMCP (10 mg) è stato sciolto in toluene e aggiunto goccia a goccia al pallone di reazione tramite un imbuto gocciolatore. particelle di silice legate (100 g) sono state sciolte in toluene (200 ml) e 4-idrossi-TEMPO (2 mL) è stato aggiunto in presenza di 100 µL di dibutilstagno dilaurato come catalizzatore. La miscela è stata agitata a 50°C per 8 ore, filtrata ed essiccata a 50°C per 3 ore.
Lo stirene (1 mL), il perossido di benzoile BPO (0,5 mL) e le particelle di silice attaccate a TEMPO-PMCP (1,5 g) sono state disperse in toluene e spurgate con azoto. La polimerizzazione dello stirene è stata condotta a 100°C per 12 ore. Il prodotto risultante è stato lavato con metanolo ed essiccato a 60°C durante la notte.
I campioni sono stati degassati a 393 K per 1 ora per ottenere una pressione residua inferiore a 10-3 Torr. La quantità di N2 adsorbita a una pressione relativa di P/P0 = 0,99 è stata utilizzata per determinare il volume totale dei pori. su una colonna di alluminio utilizzando nastro di carbonio adesivo. L'oro è stato placcato sui campioni utilizzando un dispositivo di rivestimento a sputter Q150T e uno strato Au da 5 nm è stato depositato sui campioni. Ciò migliora l'efficienza del processo utilizzando basse tensioni e fornisce sputtering a freddo a grana fine. è stato utilizzato per ottenere la distribuzione delle dimensioni delle particelle. Particelle di silice nuda e particelle di silice legate con ligando (5 mg ciascuna) sono state disperse in 5 mL di isopropanolo, sonicate per 10 min, vortexate per 5 min e poste sul banco ottico del Mastersizer. L'analisi termogravimetrica è stata eseguita a una velocità di 5 °C al minuto in un intervallo di temperatura da 30 a 800 °C.
Le colonne a foro stretto in acciaio inossidabile smaltato di dimensioni (100 × 1,8 mm d.i.) sono state impaccate utilizzando il metodo di impaccamento con slurry, applicando la stessa procedura utilizzata nel Rif.31.Una colonna in acciaio inossidabile (rivestita in vetro, 100 × 1,8 mm d.i.) con un raccordo di uscita contenente una fritta da 1 µm è stata collegata a un impaccatore per slurry (Alltech Deerfield, IL, USA). colonna in sequenza applicando pressioni di 100 MP per 10 minuti, 80 MP per 15 minuti e 60 MP per 30 minuti.Durante l'impaccamento, è stata applicata una vibrazione meccanica con due agitatori per colonna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) per garantire un impaccamento uniforme della colonna. il sistema LC per verificarne le prestazioni.
Sono stati costruiti una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un iniettore (Valco (USA) C14 W.05) con loop di iniezione da 50 nL, un degasatore a membrana (Shimadzu DGU-14A), una finestra capillare UV-VIS Un rivelatore speciale per dispositivi µLC (UV-2075) e microcolonne rivestite di vetro. 65 e capillari di unione di riduzione (50 μm) sono stati installati all'uscita da 1/16 "dell'unione di riduzione. La raccolta dei dati e l'elaborazione cromatografica sono state eseguite utilizzando il software Multichro 2000. Il monitoraggio a 254 nm Gli analiti sono stati testati per l'assorbanza UV. I dati cromatografici sono stati analizzati da OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina da siero umano, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio) 3 mg miscelati con tripsina (1,5 mg), 4,0 M di urea (1 mL) e 0,2 M di bicarbonato di ammonio (1 mL). 4°C.
La separazione delle miscele di peptidi e del digest di tripsina HSA è stata valutata separatamente su colonne PMP. Controllare la separazione della miscela di peptidi e del digest di tripsina di HSA mediante la colonna PMP e confrontare i risultati con la colonna Ascentis Express RP-Amide. Il numero teorico della piastra è calcolato come segue:
Nella FIG.2. Le immagini SEM delle particelle di silice nuda (A, B) mostrano che, contrariamente ai nostri studi precedenti, queste particelle sono sferiche in cui le particelle sono allungate o hanno una simmetria irregolare.
Immagini al microscopio elettronico a scansione di particelle di silice nuda (A, B) e particelle di silice legate con ligando (C, D).
Le distribuzioni delle dimensioni delle particelle di particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate al ligando sono mostrate nella Figura 3 (A). Le curve di distribuzione delle dimensioni delle particelle basate sul volume hanno mostrato che la dimensione delle particelle di silice è aumentata dopo la modifica chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione delle dimensioni delle particelle delle particelle di silice dello studio corrente e dello studio precedente sono confrontati nella Tabella 1 (A). ) valore di 3,05 μm (particelle di silice legate al polistirene) 34. Questo lotto aveva una distribuzione delle dimensioni delle particelle più stretta rispetto al nostro studio precedente a causa dei rapporti variabili di PEG, urea, TMOS e acido acetico nella miscela di reazione. La dimensione delle particelle della fase PMP è leggermente maggiore di quella della fase delle particelle di silice legata al polistirene che abbiamo studiato in precedenza. sulla superficie della silice, mentre nella fase PMP lo spessore dello strato era di 1,38 µm.
Distribuzione delle dimensioni delle particelle (A) e distribuzione delle dimensioni dei pori (B) delle particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate al ligando.
La dimensione dei pori, il volume dei pori e l'area superficiale delle particelle di silice del presente studio sono riportati nella Tabella 1 (B). I profili PSD delle particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate al ligando sono mostrati nella Figura 3 (B). I risultati sono paragonabili al nostro studio precedente. il cambiamento della curva è mostrato in Fig. 3 (B). Analogamente, il volume dei pori delle particelle di silice è diminuito da 0,67 a 0,58 cm3/g dopo la modifica chimica. L'area superficiale specifica delle particelle di silice attualmente studiate è di 116 m2/g, che è paragonabile al nostro studio precedente (124 m2/g). /g fino a 105 m2/g dopo la modifica chimica.
I risultati dell'analisi elementare della fase stazionaria sono mostrati nella Tabella 2. Il carico di carbonio dell'attuale fase stazionaria è del 6,35%, che è inferiore al carico di carbonio del nostro studio precedente (particelle di silice legate con polistirene, rispettivamente 7,93%35 e 10,21%). sono stati utilizzati vinilisocianato (PCMP) e 4-idrossi-TEMPO. La percentuale in peso di azoto dell'attuale fase stazionaria è del 2,21%, rispetto allo 0,1735 e allo 0,85% in peso di azoto negli studi precedenti, rispettivamente. Ciò significa che la percentuale in peso di azoto è più alta nell'attuale fase stazionaria a causa della fenilmaleimmide. mentre il carico di carbonio del prodotto finale (6) era del 6,35%, come mostrato nella Tabella 2. La perdita di peso è stata verificata con la fase stazionaria PMP e la curva TGA è mostrata nella Figura 4. La curva TGA mostra una perdita di peso dell'8,6%, che è in buon accordo con il carico di carbonio (6,35%) perché i ligandi contengono non solo C ma anche N, O e H.
Il ligando fenilmaleimmide-metilvinilisocianato è stato scelto per la modifica superficiale delle particelle di silice perché ha gruppi polari fenilmaleimmide e gruppi vinilisocianato. I gruppi vinil isocianato possono reagire ulteriormente con lo stirene mediante polimerizzazione radicalica vivente. la polarità della fase stazionaria può essere controllata dalla quantità ottimale di stirene e dal tempo di reazione della polimerizzazione radicalica. L'ultima fase della reazione (polimerizzazione radicalica) è critica e può cambiare la polarità della fase stazionaria. È stata eseguita un'analisi elementare per controllare il carico di carbonio di queste fasi stazionarie. caricare queste fasi stazionarie in colonne di acciaio inossidabile e verificarne le prestazioni cromatografiche (selettività, risoluzione, valore N, ecc.). Sulla base di questi esperimenti, è stata selezionata una formulazione ottimizzata per preparare la fase stazionaria PMP per garantire una polarità controllata e una buona ritenzione dell'analita.
Sono state valutate anche cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina enkephalin) utilizzando una colonna PMP utilizzando una fase mobile;60/40 (v/v) acetonitrile/acqua (0,1% TFA) a una portata di 80 μL/min. In condizioni di eluizione ottimali, il numero teorico di piastre (N) per colonna (100 × 1,8 mm id) è 20.000 ± 100 (200.000 piastre/m²). La tabella 3 fornisce i valori N per le tre colonne PMP e i cromatogrammi sono mostrati nella Figura 5 A. Analisi rapida su una colonna PMP ad alta portata (700 μL/min), cinque peptidi sono stati eluiti entro un minuto, i valori N erano molto buoni, 13.500 ± 330 per colonna (100 × 1,8 mm id), corrisponde a 135.000 piastre/m (Figura 5B). Tre colonne di dimensioni identiche (100 × 1,8 mm id) sono state confezionate con tre diversi lotti di PMP fase stazionaria per verificare la riproducibilità. La concentrazione dell'analita per ciascuna colonna è stata registrata utilizzando le condizioni di eluizione ottimali e il numero di piastre teoriche N e il tempo di ritenzione per separare la stessa miscela di prova su ciascuna colonna. I dati di riproducibilità per le colonne PMP sono mostrati nella Tabella 4. La riproducibilità della colonna PMP si correla bene con valori %RSD molto bassi, come mostrato nella Tabella 3.
Separazione della miscela di peptidi su colonna PMP (B) e colonna Ascentis Express RP-Amide (A);fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni colonna PMP (100 × 1,8 mm id);analitico L'ordine di eluizione dei composti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) encefalina acida)).
Una colonna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) è stata valutata per la separazione dei digeriti triptici dell'albumina sierica umana in cromatografia liquida ad alte prestazioni. Il cromatogramma nella Figura 6 mostra che il campione è ben separato e la risoluzione è molto buona. I digeriti HSA sono stati analizzati utilizzando una velocità di flusso di 100 µL/min, fase mobile 70/30 acetonitrile/acqua e 0,1% TFA. Come mostrato nel cromatogramma (Figura 6), l'HSA la digestione è stata suddivisa in 17 picchi corrispondenti a 17 peptidi. È stata calcolata l'efficienza di separazione di ciascun picco nel digest HSA e i valori sono riportati nella Tabella 5.
Un digerito triptico di HSA (100 × 1,8 mm id) è stato separato su una colonna PMP;portata (100 µL/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua con 0,1% TFA.
dove L è la lunghezza della colonna, η è la viscosità della fase mobile, ΔP è la contropressione della colonna e u è la velocità lineare della fase mobile. studio precedente Ref.34. La permeabilità della colonna impaccata con particelle superficialmente porose è: 1,7 × 10-15 per particelle da 1,3 μm, 3,1 × 10-15 per particelle da 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 per particelle da 2,6 μm Per particelle da 5 μm 43. Pertanto, la permeabilità della fase PMP è simile a quella delle particelle core-shell da 5 μm.
dove Wx è il peso della colonna impaccata con cloroformio, Wy è il peso della colonna impaccata con metanolo e ρ è la densità del solvente. Densità di metanolo (ρ = 0,7866) e cloroformio (ρ = 1,484). 0,63 e 0,55, rispettivamente. Ciò significa che la presenza di ligandi ureici riduce la permeabilità della fase stazionaria. D'altra parte, la porosità totale della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è 0,60. mentre nelle fasi stazionarie di tipo polistirenico, attorno ad esso si forma lo strato polimerico A relativamente spesso. In un tipico esperimento, la porosità della colonna viene calcolata come:
La Figura 7A, B mostra la colonna PMP (100 × 1,8 mm id) e la colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizzando le stesse condizioni di eluizione (ad esempio, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA).) del complotto di van Deemter.Miscele selezionate di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) sono state preparate in 20 µL/ La portata minima per entrambe le colonne è di 800 µL/min. I valori minimi di HETP alla portata ottimale (80 µL/min) per la colonna PMP e la colonna Ascentis Express RP-Amide erano rispettivamente di 2,6 µm e 3,9 µm. I valori HETP indicano che l'efficienza di separazione della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è molto migliore rispetto alla colonna Ascentis Express RP-Amide disponibile in commercio (100 × 1,8 mm id). × 1,8 mm d.i.) rispetto alla colonna Ascentis Express RP-Amide si basa sui miglioramenti nella forma delle particelle, nelle dimensioni e nelle complesse procedure di impaccamento della colonna utilizzate nel lavoro corrente34.
(A) grafico di van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto utilizzando una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O con TFA allo 0,1%. .
Una fase stazionaria di polistirene incorporata polare è stata preparata e valutata per la separazione di miscele di peptidi sintetici e digeriti di tripsina dell'albumina sierica umana (HAS) in cromatografia liquida ad alte prestazioni. Le prestazioni cromatografiche delle colonne PMP per miscele di peptidi sono eccellenti in termini di efficienza e risoluzione di separazione. la contropressione della colonna a velocità di flusso elevate è un altro vantaggio di questa fase stazionaria. Le colonne PMP presentano una buona riproducibilità e possono essere utilizzate per l'analisi di miscele di peptidi e la digestione con tripsina di varie proteine. Intendiamo utilizzare questa colonna per la separazione di prodotti naturali, composti bioattivi da piante medicinali ed estratti fungini in cromatografia liquida. In futuro, le colonne PMP saranno valutate anche per la separazione di proteine ​​e anticorpi monoclonali.
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