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Le particelle di silice porosa sono state preparate con un metodo sol-gel con alcune modifiche per ottenere particelle macroporose. Queste particelle sono state derivatizzate mediante polimerizzazione a trasferimento di catena di frammentazione per addizione reversibile (RAFT) con N-fenilmaleimide-metilvinilisocianato (PMI) e stirene per preparare la fase stazionaria di intercalazione di N-fenilmaleimide di polistirene (PMP). Le colonne in acciaio inossidabile a foro stretto (100 × 1,8 mm di diametro interno) sono state riempite mediante riempimento in sospensione. È stata valutata la separazione della colonna PMP di una miscela di peptidi composta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) prestazioni cromatografiche) e digestione con tripsina dell'albumina sierica umana (HAS). In condizioni di eluizione ottimali, il conteggio teorico delle piastre della miscela di peptidi è alto quanto 280.000 piastre/m². Confrontando le prestazioni di separazione della colonna sviluppata con la colonna commerciale Ascentis Express RP-Amide, si è osservato che le prestazioni di separazione della colonna PMP erano superiori a quelle della colonna commerciale in termini di efficienza di separazione e risoluzione.
Negli ultimi anni, l'industria biofarmaceutica è diventata un mercato globale in espansione con un aumento sostanziale della quota di mercato. Con la crescita esplosiva dell'industria biofarmaceutica1,2,3, l'analisi di peptidi e proteine ​​è molto desiderata. Oltre al peptide target, durante la sintesi peptidica vengono generate diverse impurità, che richiedono quindi la purificazione cromatografica per ottenere peptidi della purezza desiderata. L'analisi e la caratterizzazione delle proteine ​​nei fluidi corporei, nei tessuti e nelle cellule è un compito estremamente impegnativo a causa dell'elevato numero di specie potenzialmente rilevabili in un singolo campione. Sebbene la spettrometria di massa sia uno strumento efficace per il sequenziamento di peptidi e proteine, se tali campioni vengono iniettati nello spettrometro di massa in un unico passaggio, la separazione non sarà ideale. Questo problema può essere mitigato implementando separazioni mediante cromatografia liquida (LC) prima dell'analisi MS, il che ridurrà il numero di analiti che entrano nello spettrometro di massa in un dato momento4,5,6. Inoltre, durante la separazione in fase liquida, gli analiti possono essere concentrati in regioni ristrette, in tal modo concentrando questi analiti e migliorando la sensibilità di rilevamento della spettroscopia di massa (MS). La cromatografia liquida (LC) ha fatto notevoli progressi negli ultimi dieci anni ed è diventata una tecnica popolare nell'analisi proteomica7,8,9,10.
La cromatografia liquida a fase inversa (RP-LC) è ampiamente utilizzata per la purificazione e la separazione di miscele di peptidi utilizzando silice modificata con ottadecil (ODS) come fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, le fasi stazionarie RP non forniscono una separazione soddisfacente di peptidi e proteine ​​a causa della loro struttura complessa e della natura anfifilica14,15. Pertanto, sono necessarie fasi stazionarie appositamente progettate per analizzare peptidi e proteine ​​con gruppi polari e non polari per interagire e trattenere questi analiti16. La cromatografia in modalità mista, che fornisce interazioni multimodali, può essere un'alternativa alla RP-LC per la separazione di peptidi, proteine ​​e altre miscele complesse. Sono state preparate diverse fasi stazionarie in modalità mista e colonne riempite con queste fasi sono state utilizzate per la separazione di peptidi e proteine17,18,19,20,21. Fasi stazionarie in modalità mista (WAX/RPLC, Le tecniche HILIC/RPLC (intercalazione polare/RPLC) sono adatte alla separazione di peptidi e proteine ​​grazie alla presenza di gruppi sia polari che non polari22,23,24,25,26,27,28. Analogamente, le fasi stazionarie intercalanti polari con gruppi polari legati covalentemente mostrano un buon potere di separazione e una selettività unica per analiti polari e non polari, poiché la separazione dipende dall'interazione tra analita e fase stazionaria. Interazioni multimodali29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al. 30 hanno preparato una fase stazionaria di poliammina con terminazione dodecilica e hanno separato con successo idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni e molti altri analiti. L'intercalante polare ha gruppi sia polari che non polari, quindi può essere utilizzato per separare peptidi e proteine ​​che hanno sia gruppi idrofobi che idrofili. Le colonne con inclusione polare (ad esempio, colonne C18 con inclusione di ammide) sono disponibili in commercio con il nome commerciale di colonne Ascentis Express RP-Amide, ma queste colonne sono utilizzate solo per l'analisi dell'ammina 33.
Nello studio attuale, una fase stazionaria con inclusione polare (polistirene con inclusione di N-fenilmaleimide) è stata preparata e valutata per la separazione di peptidi e digeriti di tripsina di HSA. La fase stazionaria è stata preparata utilizzando la seguente strategia. Particelle di silice porosa sono state preparate secondo la procedura indicata nella nostra precedente pubblicazione con alcune modifiche al protocollo di preparazione. Il rapporto tra urea, polietilenglicole (PEG), TMOS, acqua e acido acetico è stato regolato per preparare particelle di silice con pori di grandi dimensioni. In secondo luogo, un nuovo legante, fenilmaleimide-metil vinil isocianato, è stato sintetizzato e utilizzato per derivatizzare particelle di silice per preparare una fase stazionaria con inclusione polare. La fase stazionaria risultante è stata impaccata in una colonna di acciaio inossidabile (100 × 1,8 mm di diametro interno) utilizzando lo schema di impaccamento ottimizzato. L'impaccamento della colonna è assistito da vibrazioni meccaniche per garantire la formazione di un letto omogeneo all'interno della colonna. Valutare la separazione in colonna impaccata di miscele di peptidi costituite da cinque peptidi; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Enkephalin) e digerito di tripsina di albumina sierica umana (HAS). È stato osservato che la miscela di peptidi e il digerito di tripsina di HSA si separavano con buona risoluzione ed efficienza. Le prestazioni di separazione della colonna PMP sono state confrontate con quelle della colonna Ascentis Express RP-Amide. È stato osservato che sia i peptidi che le proteine ​​erano ben risolti ed efficienti sulla colonna PMP, che si è rivelata più efficiente della colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicole), urea, acido acetico, trimetossi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sierica umana (HSA), cloruro di ammonio, urea, esano metildisilazano (HMDS), metacriloil cloruro (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossido di benzoile (BPO), acetonitrile di grado HPLC (ACN), metanolo, 2-propanolo e acetone acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Una miscela di urea (8 g), polietilenglicole (8 g) e 8 mL di acido acetico 0,01 N è stata agitata per 10 minuti, quindi sono stati aggiunti 24 mL di TMOS in condizioni di ghiaccio. La miscela di reazione è stata riscaldata a 40 °C per 6 ore e poi a 120 °C per 8 ore in un'autoclave in acciaio inossidabile. L'acqua è stata versata via e il materiale residuo è stato essiccato a 70 °C per 12 ore. La massa morbida essiccata è stata macinata finemente in un forno e calcinata a 550 °C per 12 ore. Sono stati preparati e caratterizzati tre lotti per esaminare la riproducibilità in termini di dimensioni delle particelle, dimensioni dei pori e area superficiale.
Modificando la superficie delle particelle di silice con il legante pre-sintetizzato fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PCMP), seguito da polimerizzazione radiale con stirene, è stato preparato un composto contenente gruppi polari. Fase stazionaria per aggregati e catene di polistirene. Il processo di preparazione è descritto di seguito.
N-fenilmaleimide (200 mg) e metilvinilocianato (100 mg) sono stati sciolti in toluene secco e 0,1 mL di 2,2′-azoisobutirronitrile (AIBN) sono stati aggiunti al pallone di reazione per preparare il copolimero fenilmaleimide-metilvinilocianato (PMCP). La miscela è stata riscaldata a 60°C per 3 ore, filtrata ed essiccata in un forno a 40°C per 3 ore.
Le particelle di silice essiccata (2 g) sono state disperse in toluene secco (100 mL), agitate e sonicate in un pallone a fondo tondo da 500 mL per 10 minuti. Il PMCP (10 mg) è stato sciolto in toluene e aggiunto goccia a goccia al pallone di reazione tramite un imbuto contagocce. La miscela è stata portata a riflusso a 100 °C per 8 ore, filtrata e lavata con acetone ed essiccata a 60 °C per 3 ore. Quindi, le particelle di silice legate con PMCP (100 g) sono state sciolte in toluene (200 mL) e 4-idrossi-TEMPO (2 mL) è stato aggiunto in presenza di 100 µL di dilaurato di dibutilstagno come catalizzatore. La miscela è stata agitata a 50 °C per 8 ore, filtrata ed essiccata a 50 °C per 3 ore.
Stirene (1 mL), perossido di benzoile BPO (0,5 mL) e particelle di silice legate a TEMPO-PMCP (1,5 g) sono stati dispersi in toluene e spurgati con azoto. La polimerizzazione dello stirene è stata effettuata a 100 °C per 12 ore. Il prodotto risultante è stato lavato con metanolo ed essiccato a 60 °C per una notte. Lo schema di reazione complessivo è mostrato nella Figura 1.
I campioni sono stati degassati a 393 K per 1 ora per ottenere una pressione residua inferiore a 10-3 Torr. La quantità di N2 adsorbita a una pressione relativa di P/P0 = 0,99 è stata utilizzata per determinare il volume totale dei pori. La morfologia delle particelle di silice nuda e legata al legante è stata esaminata con microscopia elettronica a scansione (Hitachi High Technologies, Tokyo, Giappone). I campioni essiccati (particelle di silice nuda e legate al legante) sono stati posizionati su una colonna di alluminio utilizzando nastro adesivo di carbonio. L'oro è stato placcato sui campioni utilizzando un rivestimento per sputtering Q150T e uno strato di Au da 5 nm è stato depositato sui campioni. Ciò migliora l'efficienza del processo utilizzando basse tensioni e fornisce sputtering a freddo a grana fine. Un analizzatore elementare Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 è stato utilizzato per l'analisi elementare. Un analizzatore di dimensioni delle particelle Malvern (Worcestershire, Regno Unito) Mastersizer 2000 è stato utilizzato per ottenere la distribuzione granulometrica. Particelle di silice nuda e particelle di silice legate al ligando (5 mg ciascuna) sono state disperse in 5 mL di isopropanolo, sonicate per 10 min, agitate per 5 min e posizionate sul banco ottico del Mastersizer. L'analisi termogravimetrica è stata eseguita a una velocità di 5 °C al minuto su un intervallo di temperatura da 30 a 800 °C.
Colonne a foro stretto in acciaio inossidabile smaltate di dimensioni (100 × 1,8 mm di diametro interno) sono state riempite utilizzando il metodo di riempimento in sospensione, applicando la stessa procedura utilizzata nel Rif. 31. Una colonna in acciaio inossidabile (rivestita in vetro, 100 × 1,8 mm di diametro interno) con un raccordo di uscita contenente un fritto da 1 µm è stata collegata a un packer per slurry (Alltech Deerfield, IL, USA). Preparare una slurry di fase stazionaria sospendendo 150 mg di fase stazionaria in 1,2 mL di metanolo e inviarla alla colonna di stoccaggio. Il metanolo è stato utilizzato come solvente per la slurry e come solvente di propulsione. Riempire la colonna in sequenza applicando pressioni di 100 MP per 10 minuti, 80 MP per 15 minuti e 60 MP per 30 minuti. Durante il riempimento, è stata applicata una vibrazione meccanica con due agitatori per colonne GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) per garantire un riempimento uniforme della colonna. Chiudere il packer per slurry e rilasciare lentamente la pressione per evitare danni all'interno della colonna. Scollegare la colonna dall'unità di riempimento della slurry e collegare un altro raccordo all'ingresso e a il sistema LC per verificarne le prestazioni.
Sono stati costruiti una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un iniettore (Valco (USA) C14 W.05) con loop di iniezione da 50 nL, un degasatore a membrana (Shimadzu DGU-14A), una finestra capillare UV-VIS, uno speciale rilevatore µLC (UV-2075) e microcolonne rivestite in vetro. Utilizzare tubi di collegamento molto stretti e corti per ridurre al minimo l'effetto di un ulteriore allargamento della banda della colonna. Dopo il confezionamento, i capillari (50 μm di diametro interno 365) e i capillari di raccordo di riduzione (50 μm) sono stati installati all'uscita da 1/16" del raccordo di riduzione. La raccolta dei dati e l'elaborazione cromatografica sono state eseguite utilizzando il software Multichro 2000. Monitoraggio a 254 nm. Gli analiti sono stati testati per l'assorbanza UV. I dati cromatografici sono stati analizzati da OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina da siero umano, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio) 3 mg miscelati con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) e bicarbonato di ammonio 0,2 M (1 mL). La soluzione è stata agitata per 10 minuti e conservata a bagnomaria a 37 °C per 6 ore, quindi spenta con 1 mL di TFA allo 0,1%. Filtrare la soluzione e conservare a temperatura inferiore a 4 °C.
La separazione delle miscele di peptidi e dei digeriti di tripsina di HSA è stata valutata separatamente su colonne PMP. Controllare la separazione della miscela di peptidi e del digerito di tripsina di HSA mediante la colonna PMP e confrontare i risultati con la colonna Ascentis Express RP-Amide. Il numero teorico di piastre è calcolato come segue:
Le immagini SEM delle particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate tramite leganti sono mostrate nella FIG. 2. Le immagini SEM delle particelle di silice nuda (A, B) mostrano che, a differenza dei nostri studi precedenti, queste particelle sono sferiche e quindi allungate o hanno una simmetria irregolare. La superficie delle particelle di silice legate tramite leganti (C, D) è più liscia di quella delle particelle di silice nuda, il che potrebbe essere dovuto al rivestimento di catene di polistirene sulla superficie delle particelle di silice.
Immagini al microscopio elettronico a scansione di particelle di silice nuda (A, B) e particelle di silice legate tramite ligando (C, D).
Le distribuzioni dimensionali delle particelle di silice nuda e di silice legata al ligando sono mostrate nella Figura 3(A). Le curve di distribuzione dimensionale delle particelle basate sul volume hanno mostrato che la dimensione delle particelle di silice è aumentata dopo la modifica chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione dimensionale delle particelle di silice dello studio attuale e dello studio precedente sono confrontati nella Tabella 1(A). La dimensione delle particelle basata sul volume, d(0,5), di PMP è di 3,36 μm, rispetto al nostro studio precedente con un valore ad(0,5) di 3,05 μm (particelle di silice legate a polistirene)34. Questo lotto aveva una distribuzione dimensionale delle particelle più stretta rispetto al nostro studio precedente a causa dei rapporti variabili di PEG, urea, TMOS e acido acetico nella miscela di reazione. La dimensione delle particelle della fase PMP è leggermente maggiore di quella della fase di particelle di silice legate a polistirene che abbiamo precedentemente studiato. Ciò significa che la funzionalizzazione superficiale delle particelle di silice con stirene ha depositato solo un strato di polistirene (0,97 µm) sulla superficie di silice, mentre nella fase PMP lo spessore dello strato era di 1,38 µm.
Distribuzione delle dimensioni delle particelle (A) e distribuzione delle dimensioni dei pori (B) delle particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate al ligando.
La dimensione dei pori, il volume dei pori e l'area superficiale delle particelle di silice dello studio attuale sono riportati nella Tabella 1 (B). I profili PSD delle particelle di silice nuda e delle particelle di silice legate al ligando sono mostrati nella Figura 3 (B). I risultati sono comparabili al nostro studio precedente. Le dimensioni dei pori delle particelle di silice nuda e legata al ligando sono rispettivamente 310 e 241, il che indica che la dimensione dei pori diminuisce di 69 dopo la modifica chimica, come mostrato nella Tabella 1 (B), e la variazione della curva è mostrata nella Figura 3 (B). Analogamente, il volume dei pori delle particelle di silice è diminuito da 0,67 a 0,58 cm3/g dopo la modifica chimica. L'area superficiale specifica delle particelle di silice attualmente studiate è di 116 m2/g, comparabile al nostro studio precedente (124 m2/g). Come mostrato nella Tabella 1 (B), anche l'area superficiale (m2/g) delle particelle di silice è diminuita da 116 m2/g a 105 m2/g dopo la modifica chimica.
I risultati dell'analisi elementare della fase stazionaria sono mostrati nella Tabella 2. Il carico di carbonio della fase stazionaria attuale è del 6,35%, che è inferiore al carico di carbonio del nostro studio precedente (particelle di silice legate al polistirene, rispettivamente 7,93%35 e 10,21%) 42. Il carico di carbonio della fase stazionaria attuale è basso, poiché nella preparazione dell'attuale SP, oltre allo stirene, sono stati utilizzati alcuni ligandi polari come il fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PCMP) e il 4-idrossi-TEMPO. La percentuale in peso di azoto della fase stazionaria attuale è del 2,21%, rispetto allo 0,1735 e allo 0,85% in peso di azoto negli studi precedenti, rispettivamente. Ciò significa che la percentuale in peso di azoto è maggiore nella fase stazionaria attuale a causa della fenilmaleimmide. Analogamente, i carichi di carbonio dei prodotti (4) e (5) erano del 2,7% e 2,9%, rispettivamente, mentre il carico di carbonio del prodotto finale (6) era del 6,35%, come mostrato nella Tabella 2. La perdita di peso è stata verificata con la fase stazionaria PMP e la curva TGA è mostrata nella Figura 4. La curva TGA mostra una perdita di peso dell'8,6%, che è in buon accordo con il carico di carbonio (6,35%) perché i ligandi contengono non solo C ma anche N, O e H.
Il legante fenilmaleimmide-metilvinilisocianato è stato scelto per la modifica superficiale delle particelle di silice perché ha gruppi fenilmaleimmidici e gruppi vinilisocianato polari. I gruppi vinilisocianato possono inoltre reagire con lo stirene mediante polimerizzazione radicalica viva. Il secondo motivo è quello di inserire un gruppo che abbia un'interazione moderata con l'analita e nessuna forte interazione elettrostatica tra l'analita e la fase stazionaria, poiché la frazione fenilmaleimmidica non ha carica virtuale a pH normale. La polarità della fase stazionaria può essere controllata dalla quantità ottimale di stirene e dal tempo di reazione della polimerizzazione radicalica. L'ultimo passaggio della reazione (polimerizzazione radicalica) è critico e può modificare la polarità della fase stazionaria. È stata eseguita un'analisi elementare per verificare il carico di carbonio di queste fasi stazionarie. È stato osservato che l'aumento della quantità di stirene e del tempo di reazione ha aumentato il carico di carbonio della fase stazionaria e viceversa. Le SP preparate con diverse concentrazioni di stirene hanno diverse concentrazioni di carbonio carichi.Ancora una volta, caricare queste fasi stazionarie in colonne di acciaio inossidabile e verificarne le prestazioni cromatografiche (selettività, risoluzione, valore N, ecc.).Sulla base di questi esperimenti, è stata selezionata una formulazione ottimizzata per preparare la fase stazionaria PMP per garantire una polarità controllata e una buona ritenzione dell'analita.
Sono state inoltre valutate cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) utilizzando una colonna PMP con fase mobile; 60/40 (v/v) acetonitrile/acqua (0,1% TFA) a una portata di 80 μL/min. In condizioni di eluizione ottimali, il numero teorico di piastre (N) per colonna (100 × 1,8 mm id) è 20.000 ± 100 (200.000 piastre/m²). La Tabella 3 riporta i valori N per le tre colonne PMP e i cromatogrammi sono mostrati nella Figura 5A. Analisi rapida su una colonna PMP ad alta portata (700 μL/min), cinque peptidi sono stati eluiti in un minuto, i valori N erano molto buoni, 13.500 ± 330 per colonna (100 × 1,8 mm id), corrispondenti a 135.000 piastre/m (Figura 5B). Tre colonne di dimensioni identiche (100 × 1,8 mm id) sono stati riempiti con tre lotti diversi di fase stazionaria PMP per verificarne la riproducibilità. La concentrazione dell'analita per ciascuna colonna è stata registrata utilizzando le condizioni di eluizione ottimali e il numero di piastre teoriche N e il tempo di ritenzione per separare la stessa miscela di prova su ciascuna colonna. I dati di riproducibilità per le colonne PMP sono riportati nella Tabella 4. La riproducibilità della colonna PMP è ben correlata con valori %RSD molto bassi, come mostrato nella Tabella 3.
Separazione della miscela di peptidi su colonna PMP (B) e colonna Ascentis Express RP-Amide (A); fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni della colonna PMP (100 × 1,8 mm id); analitico L'ordine di eluizione dei composti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) encefalina acida)).
Una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è stata valutata per la separazione di digeriti triptici di albumina sierica umana nella cromatografia liquida ad alte prestazioni. Il cromatogramma in Figura 6 mostra che il campione è ben separato e la risoluzione è molto buona. I digeriti HSA sono stati analizzati utilizzando una portata di 100 µL/min, fase mobile 70/30 acetonitrile/acqua e 0,1% TFA. Come mostrato nel cromatogramma (Figura 6), la digestione HSA è stata suddivisa in 17 picchi corrispondenti a 17 peptidi. È stata calcolata l'efficienza di separazione di ciascun picco nel digerito HSA e i valori sono riportati nella Tabella 5.
Un digerito triptico di HSA (100 × 1,8 mm id) è stato separato su una colonna PMP; portata (100 µL/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua con 0,1% TFA.
dove L è la lunghezza della colonna, η è la viscosità della fase mobile, ΔP è la contropressione della colonna e u è la velocità lineare della fase mobile. La permeabilità della colonna PMP era 2,5 × 10-14 m2, la portata era 25 μL/min ed è stato utilizzato 60/40 v/v ACN/acqua. La permeabilità della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) era simile a quella del nostro studio precedente Rif.34. La permeabilità della colonna riempita con particelle superficialmente porose è: 1,7 × 10-15 per particelle da 1,3 μm, 3,1 × 10-15 per particelle da 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 per particelle da 2,6 μm Per particelle da 5 μm 43. Pertanto, la permeabilità della fase PMP è simile a quella delle particelle core-shell da 5 μm.
dove Wx è il peso della colonna riempita con cloroformio, Wy è il peso della colonna riempita con metanolo e ρ è la densità del solvente. Densità del metanolo (ρ = 0,7866) e del cloroformio (ρ = 1,484). La porosità totale delle colonne SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 e delle colonne C18-Urea 31 che abbiamo precedentemente studiato era rispettivamente 0,63 e 0,55. Ciò significa che la presenza di ligandi ureici riduce la permeabilità della fase stazionaria. D'altra parte, la porosità totale della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è 0,60. La permeabilità delle colonne PMP è inferiore a quella delle colonne riempite con particelle di silice legate a C18 perché nelle fasi stazionarie di tipo C18 i ligandi C18 sono attaccati alle particelle di silice. come catene lineari, mentre nelle fasi stazionarie di tipo polistirene, attorno ad esse si forma uno strato polimerico relativamente spesso. In un tipico esperimento, la porosità della colonna viene calcolata come:
Le figure 7A e B mostrano la colonna PMP (100 × 1,8 mm id) e la colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizzando le stesse condizioni di eluizione (vale a dire 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA). ) del grafico di van Deemter. Miscele di peptidi selezionate (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Enkephalin) sono state preparate in 20 µL/ La portata minima per entrambe le colonne è di 800 µL/min. I valori minimi di HETP alla portata ottimale (80 µL/min) per la colonna PMP e la colonna Ascentis Express RP-Amide erano rispettivamente di 2,6 µm e 3,9 µm. I valori di HETP indicano che l'efficienza di separazione della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è molto migliore rispetto alla colonna Ascentis Express RP-Amide disponibile in commercio (100 × 1,8 mm id). Il grafico di van Deemter in Fig. 7(A) mostra che la diminuzione del valore N con l'aumento del flusso non è significativa rispetto al nostro studio precedente. La maggiore efficienza di separazione della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) rispetto alla colonna Ascentis Express RP-Amide si basa sui miglioramenti nella forma delle particelle, nelle dimensioni e nelle complesse procedure di riempimento della colonna utilizzate nel lavoro attuale34.
(A) Grafico di van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto utilizzando una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O con 0,1% di TFA. (B) Grafico di van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto utilizzando una colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O con 0,1% di TFA.
È stata preparata e valutata una fase stazionaria in polistirene con inclusione di elementi polari per la separazione di miscele di peptidi sintetici e digeriti con tripsina di albumina sierica umana (HAS) nella cromatografia liquida ad alte prestazioni. Le prestazioni cromatografiche delle colonne PMP per le miscele di peptidi sono eccellenti in termini di efficienza di separazione e risoluzione. Le migliori prestazioni di separazione delle colonne PMP sono dovute a diversi motivi, come le dimensioni delle particelle e la dimensione dei pori delle particelle di silice, la sintesi controllata della fase stazionaria e il complesso impaccamento della colonna. Oltre all'elevata efficienza di separazione, un altro vantaggio di questa fase stazionaria è la bassa contropressione della colonna ad alte portate. Le colonne PMP mostrano una buona riproducibilità e possono essere utilizzate per l'analisi di miscele di peptidi e la digestione con tripsina di varie proteine. Intendiamo utilizzare questa colonna per la separazione di prodotti naturali, composti bioattivi da piante medicinali ed estratti fungini nella cromatografia liquida. In futuro, le colonne PMP saranno valutate anche per la separazione di proteine ​​e anticorpi monoclonali.
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