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Particelle di silice porosa sono state preparate con il metodo sol-gel con alcune modifiche per ottenere particelle a pori larghi. Queste particelle sono state derivatizzate con N-fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PMI) e stirene tramite polimerizzazione a trasferimento di catena inverso-frammentazione (RAFT) per produrre poliammidi intercalate con N-fenilmaleimmide. Fase stazionaria in stirene (PMP). Colonne in acciaio inossidabile a foro stretto (diametro interno 100 × 1,8 mm) sono state impaccate con un impaccamento in sospensione. Le prestazioni cromatografiche della colonna PMP sono state valutate per separare una miscela di peptidi sintetici composta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-amminoacido encefalina) e idrolizzato triptico di albumina sierica umana (HAS). In condizioni di eluizione ottimali, il numero teorico di piastre con una miscela di peptidi ha raggiunto 280.000 piastre/mq. Confrontando le prestazioni di separazione della colonna sviluppata con la colonna commerciale Ascentis Express RP-Amide, si è osservato che l'efficienza di separazione della colonna PMP era superiore a quella della colonna commerciale in termini di efficienza di separazione e risoluzione.
L'industria biofarmaceutica è diventata un mercato globale in espansione, con un significativo aumento della quota di mercato negli ultimi anni. Con la crescita esponenziale dell'industria biofarmaceutica1,2,3, vi è una forte necessità di analisi di peptidi e proteine. Oltre al peptide target, durante la sintesi peptidica si formano diverse impurità, pertanto è necessaria la purificazione cromatografica per ottenere la purezza desiderata del peptide. L'analisi e la caratterizzazione delle proteine ​​in fluidi corporei, tessuti e cellule è un compito estremamente impegnativo a causa dell'elevato numero di specie potenzialmente rilevabili presenti in un singolo campione. Sebbene la spettrometria di massa sia uno strumento efficace per il sequenziamento di peptidi e proteine, se tali campioni vengono introdotti direttamente nello spettrometro di massa, la separazione sarà insoddisfacente. Questo problema può essere risolto eseguendo la cromatografia liquida (LC) prima dell'analisi MS, il che ridurrà la quantità di analiti che entrano nello spettrometro di massa in un dato momento4,5,6. Inoltre, gli analiti possono concentrarsi in una regione ristretta durante la separazione in fase liquida, aumentando così la sensibilità di rilevazione della spettroscopia a spettrometria di massa (MS). La cromatografia liquida (LC) ha fatto notevoli progressi nell'ultimo decennio, diventando un metodo ampiamente utilizzato per l'analisi proteomica7,8,9,10.
La cromatografia liquida a fase inversa (RP-LC) è ampiamente utilizzata per purificare e separare miscele di peptidi utilizzando silice ottadecil-modificata (ODS) come fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, a causa della loro struttura complessa e della loro natura anfotera,14,15 le fasi stazionarie RP non possono fornire una separazione soddisfacente di peptidi e proteine. Pertanto, l'analisi di peptidi e proteine ​​con frammenti polari e non polari richiede fasi stazionarie appositamente progettate per interagire e trattenere questi analiti16. La cromatografia mista, che offre interazioni multimodali, può essere un'alternativa alla RP-LC per la separazione di peptidi, proteine ​​e altre miscele complesse. Sono state preparate diverse fasi stazionarie di tipo misto e sono state utilizzate colonne riempite con queste fasi stazionarie per separare peptidi e proteine17,18,19,20,21. Grazie alla presenza di gruppi polari e non polari, le fasi stazionarie in modalità mista (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalazione polare/RPLC) sono adatte per la separazione di peptidi e proteine22,23,24,25,26,27,28. Le fasi stazionarie intercalate polari con gruppi polari legati covalentemente mostrano buone capacità di separazione e una selettività unica per analiti polari e non polari, poiché la separazione dipende dall'interazione tra l'analita e la fase stazionaria. Interazioni multimodali29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al.30 hanno ottenuto fasi stazionarie di poliammine con terminazione beenilica e hanno separato con successo idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni e alcuni altri analiti. Il materiale stazionario polare incorporato presenta gruppi sia polari che non polari, quindi può essere utilizzato per separare peptidi e proteine ​​in parti idrofobiche e idrofile. Le colonne polari in linea (ad esempio, colonne C18 con ammide in linea) sono disponibili con il nome commerciale di colonne Ascentis Express RP-Amide, ma queste colonne sono state utilizzate solo per l'analisi dell'ammina 33.
Nello studio attuale, è stata preparata una fase stazionaria per inclusione polare (N-fenilmaleimmide, polistirene per inclusione) e valutata per la separazione dei peptidi e la scissione dell'HSA triptico. Per preparare la fase stazionaria è stata utilizzata la seguente strategia. Particelle di silice porosa sono state preparate secondo le procedure descritte nelle nostre precedenti pubblicazioni, con alcune modifiche agli schemi di preparazione 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. I rapporti tra urea, polietilenglicole (PEG), TMOS e soluzione acquosa di acido acetico sono stati regolati per ottenere particelle di silice con pori di grandi dimensioni. In secondo luogo, è stato sintetizzato un nuovo legante fenilmaleimmide-metilvinilisocianato e le sue particelle di silice derivatizzate sono state utilizzate per preparare fasi stazionarie per inclusione polare. La fase stazionaria ottenuta è stata impaccata in una colonna di acciaio inossidabile (diametro interno 100 × 1,8 mm) secondo uno schema di impaccamento ottimizzato. L'impaccamento della colonna è facilitato da vibrazioni meccaniche per garantire uno strato uniforme al suo interno. La colonna impaccata è stata valutata per la separazione di una miscela di peptidi composta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptide leucina-encefalina) e idrolizzati triptici di albumina sierica umana (HSA). È stato osservato che la miscela di peptidi e il digerito triptico di HSA si separavano con buona risoluzione ed efficienza. L'efficienza di separazione della colonna PMP è stata confrontata con quella della colonna Ascentis Express RP-Amide. È stato osservato che peptidi e proteine ​​presentano una buona risoluzione ed elevata efficienza di separazione sulla colonna PMP, e l'efficienza di separazione della colonna PMP è superiore a quella della colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicole), urea, acido acetico, trimetossiortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sierica umana (HSA), cloruro di ammonio, urea, esametilmetacriloildisilazano (HMDS), cloruro di metacriloile (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossido di benzoile (BPO), acetonitrile (ACN) per HPLC, metanolo, 2-propanolo e acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Una miscela di urea (8 g), polietilenglicole (8 g) e 8 ml di acido acetico 0,01 N è stata agitata per 10 minuti, a cui sono stati aggiunti 24 ml di TMOS sotto raffreddamento con ghiaccio. La miscela di reazione è stata riscaldata a 40 °C per 6 ore e poi a 120 °C per 8 ore in un'autoclave in acciaio inossidabile. L'acqua è stata decantata e il residuo è stato essiccato a 70 °C per 12 ore. I blocchi morbidi essiccati sono stati macinati finemente e calcinati in forno a 550 °C per 12 ore. Sono stati preparati e caratterizzati tre lotti per testare la riproducibilità delle dimensioni delle particelle, della dimensione dei pori e dell'area superficiale.
Gruppo polare e fase stazionaria per catene di polistirene. La procedura di preparazione è descritta di seguito.
N-fenilmaleimide (200 mg) e metilvinilocianato (100 mg) sono stati sciolti in toluene anidro, quindi sono stati aggiunti 0,1 ml di 2,2′-azoisobutirronitrile (AIBN) al pallone di reazione per ottenere un copolimero di fenilmaleimide e metilvinilocianato (PMCP). La miscela è stata riscaldata a 60°C per 3 ore, filtrata ed essiccata in un forno a 40°C per 3 ore.
Particelle di silice essiccata (2 g) sono state disperse in toluene secco (100 ml), agitate e sonicate per 10 minuti in un pallone a fondo tondo da 500 ml. Il PMCP (10 mg) è stato sciolto in toluene e aggiunto goccia a goccia al pallone di reazione tramite un imbuto gocciolatore. La miscela è stata portata a riflusso a 100 °C per 8 ore, filtrata, lavata con acetone ed essiccata a 60 °C per 3 ore. Quindi, le particelle di silice associate al PMCP (100 g) sono state sciolte in toluene (200 ml), e ad esse è stato aggiunto 4-idrossi-TEMPO (2 ml) in presenza di 100 μl di dilaurato di dibutilstagno come catalizzatore. La miscela è stata agitata a 50 °C per 8 ore, filtrata ed essiccata a 50 °C per 3 ore.
Stirene (1 ml), perossido di benzoile BPO (0,5 ml) e particelle di silice legate a TEMPO-PMCP (1,5 g) sono stati dispersi in toluene e purificati con azoto. La polimerizzazione dello stirene è stata condotta a 100 °C per 12 ore. Il prodotto risultante è stato lavato con metanolo ed essiccato per una notte a 60 °C. Lo schema generale della reazione è mostrato in figura 1.
I campioni sono stati degassati a 393 K per 1 ora fino a ottenere una pressione residua inferiore a 10–3 Torr. La quantità di N₂ adsorbita a pressione relativa P/P₂ = 0,99 è stata utilizzata per determinare il volume totale dei pori. La morfologia delle particelle di silice pura e legata al ligando è stata esaminata utilizzando un microscopio elettronico a scansione (Hitachi High Technologies, Tokyo, Giappone). I campioni secchi (particelle di silice pura e legate al ligando) sono stati posizionati su barre di alluminio utilizzando un nastro di carbonio. L'oro è stato depositato sul campione utilizzando un dispositivo di sputtering Q150T e uno strato di Au spesso 5 nm è stato depositato sul campione. Ciò migliora l'efficienza del processo a bassa tensione e consente una spruzzatura a freddo fine. L'analisi elementare è stata eseguita utilizzando un analizzatore di composizione elementare Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Un analizzatore granulometrico Malvern (Worcestershire, Regno Unito) Mastersizer 2000 è stato utilizzato per ottenere la distribuzione granulometrica. Particelle di silice non rivestite e particelle di silice legate al ligando (5 mg ciascuna) sono state disperse in 5 ml di isopropanolo, sonicate per 10 minuti, agitate per 5 minuti e posizionate su un banco ottico Mastersizer. L'analisi termogravimetrica viene eseguita a una velocità di 5 °C al minuto nell'intervallo di temperatura da 30 a 800 °C.
Colonne in acciaio inossidabile a foro stretto rivestite in fibra di vetro con dimensioni (ID 100 × 1,8 mm) sono state impaccate con il metodo di riempimento a slurry seguendo la stessa procedura descritta nel riferimento 31. La colonna in acciaio inossidabile (rivestita in vetro, ID 100 × 1,8 mm) e un'uscita contenente un frit da 1 µm sono state collegate a una macchina per l'impaccamento di slurry (Alltech, Deerfield, IL, USA). Preparare una sospensione della fase stazionaria sospendendo 150 mg della fase stazionaria in 1,2 ml di metanolo e alimentandola in una colonna reservoir. Il metanolo è stato utilizzato come solvente per lo slurry e come solvente di controllo. Impaccare la colonna applicando una sequenza di pressione di 100 MP per 10 min, 80 MP per 15 min e 60 MP per 30 min. Il processo di impaccamento ha utilizzato due vibratori per colonne gascromatografiche (Alltech, Deerfield, IL, USA) per la vibrazione meccanica al fine di garantire un impaccamento uniforme della colonna. Chiudere il packer per fanghi e rilasciare lentamente la pressione per evitare danni alla colonna. La colonna è stata scollegata dall'ugello per fanghi e un altro raccordo è stato collegato all'ingresso e al sistema LC per testarne il funzionamento.
È stato costruito un MLC personalizzato utilizzando una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un campionatore con un loop di iniezione da 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), un degasatore a membrana (Shimadzu DGU-14A) e una finestra capillare UV-VIS. Il rivelatore era un dispositivo (UV-2075) e la microcolonna smaltata. Utilizzare tubi di collegamento molto stretti e corti per minimizzare l'effetto dell'ulteriore espansione della colonna. Dopo aver riempito la colonna, installare un capillare (50 µm di diametro interno 365) all'uscita della giunzione riducente da 1/16" e un capillare (50 µm) della giunzione riducente. La raccolta dei dati e l'elaborazione del cromatogramma vengono eseguite utilizzando il software Multichro 2000. A 254 nm, l'assorbanza UV degli analiti dei soggetti è stata monitorata a 0. I dati cromatografici sono stati analizzati utilizzando OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina sierica umana, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio) 3 mg miscelati con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) e bicarbonato di ammonio 0,2 M (1 ml). La soluzione è stata agitata per 10 minuti e mantenuta a bagnomaria a 37 °C per 6 ore, quindi raffreddata con 1 ml di TFA allo 0,1%. Filtrare la soluzione e conservare a temperatura inferiore a 4 °C.
La separazione di una miscela di peptidi e digerito triptico di HSA su una colonna PMP è stata valutata separatamente. Verificare l'idrolisi triptica di una miscela di peptidi e HSA separati da una colonna PMP e confrontare i risultati con una colonna Ascentis Express RP-Amide. Il numero di piastre teoriche è calcolato utilizzando la seguente equazione:
Le immagini SEM delle particelle di silice pura e delle particelle di silice legate al ligando sono mostrate in Figura 2. Le immagini SEM delle particelle di silice pura (A, B) mostrano una forma sferica in cui le particelle sono allungate o presentano una simmetria irregolare rispetto ai nostri studi precedenti. La superficie delle particelle di silice legate al ligando (C, D) è più liscia rispetto a quella delle particelle di silice pura, il che potrebbe essere dovuto alle catene di polistirene che ricoprono la superficie delle particelle di silice.
Micrografie elettroniche a scansione di particelle di silice pura (A, B) e particelle di silice legate al ligando (C, D).
La distribuzione granulometrica delle particelle di silice pura e delle particelle di silice legate al ligando è mostrata in Fig. 2.3(A). Le curve di distribuzione granulometrica volumetrica hanno mostrato che la dimensione delle particelle di silice è aumentata dopo la modifica chimica (Fig. 3A). I ​​dati sulla distribuzione granulometrica delle particelle di silice dello studio attuale e di quello precedente sono confrontati nella Tabella 1(A). La dimensione volumetrica delle particelle d(0,5) di PMP era di 3,36 µm, rispetto al valore ad(0,5) di 3,05 µm del nostro studio precedente (particelle di silice legate a polistirene)34. A causa della variazione del rapporto tra PEG, urea, TMOS e acido acetico nella miscela di reazione, la distribuzione granulometrica di questo lotto era più stretta rispetto al nostro studio precedente. La dimensione delle particelle della fase PMP è leggermente maggiore di quella della fase di particelle di silice legate a polistirene che abbiamo studiato in precedenza. Ciò significa che la funzionalizzazione superficiale delle particelle di silice con stirene ha depositato solo uno strato di polistirene (0,97 µm) sulla superficie della silice, mentre nella fase PMP lo spessore dello strato era di 1,38 µm.
Distribuzione delle dimensioni delle particelle (A) e distribuzione delle dimensioni dei pori (B) delle particelle di silice pura e delle particelle di silice legate al ligando.
La dimensione dei pori, il volume dei pori e l'area superficiale delle particelle di silice utilizzate in questo studio sono mostrati nella Tabella 1 (B). I profili PSD delle particelle di silice pura e delle particelle di silice legata al ligando sono mostrati nelle Fig. 3 (B). I risultati erano comparabili al nostro studio precedente34. Le dimensioni dei pori delle particelle di silice pura e legata al ligando erano rispettivamente di 310 Å e 241 Å, indicando che dopo la modifica chimica, la dimensione dei pori è diminuita di 69 Å, come mostrato nella Tabella 1 (B), e la curva di spostamento è mostrata in Fig. L'area superficiale specifica delle particelle di silice nel presente studio è di 116 m²/g, comparabile al nostro studio precedente (124 m²/g). Come mostrato nella Tabella 1 (B), anche l'area superficiale (m²/g) delle particelle di silice dopo la modifica chimica è diminuita da 116 m²/g a 105 m²/g.
I risultati dell'analisi elementare della fase stazionaria sono presentati nella Tabella 2. Il contenuto di carbonio della fase stazionaria attuale è del 6,35%, inferiore rispetto al nostro studio precedente (particelle di silice associate a polistirene, rispettivamente 7,93%35 e 10,21%) 42. Il contenuto di carbonio della fase stazionaria attuale è inferiore, poiché alcuni leganti polari come il metil vinil isocianato di fenilmaleimmide (PCMP) e il 4-idrossi-TEMPO sono stati utilizzati in aggiunta allo stirene nella preparazione di SP. La percentuale in peso di azoto nella fase stazionaria attuale è del 2,21%, rispetto allo 0,1735 e allo 0,85% negli studi precedenti42. Ciò significa che la fase stazionaria attuale presenta un'elevata percentuale in peso di azoto dovuta alla fenilmaleimmide. Allo stesso modo, i prodotti (4) e (5) hanno un contenuto di carbonio rispettivamente del 2,7% e del 2,9%, mentre il prodotto finale (6) ha un contenuto di carbonio del 6,35%, come mostrato nella Tabella 2. L'analisi termogravimetrica (TGA) è stata utilizzata sulla fase stazionaria del PMP per testare la perdita di peso e la curva TGA è mostrata nella Figura 4. La curva TGA mostra una perdita di peso dell'8,6%, che è in buon accordo con il contenuto di carbonio (6,35%), poiché i ligandi contengono non solo C, ma anche N, O e H.
Il legante fenilmaleimmide-metilvinilisocianato è stato scelto per modificare la superficie delle particelle di silice grazie ai suoi gruppi polari fenilmaleimmide e vinilisocianato. I gruppi vinilisocianato possono inoltre reagire con lo stirene mediante polimerizzazione radicalica viva. Il secondo motivo è quello di inserire un gruppo che abbia interazioni moderate con l'analita e nessuna forte interazione elettrostatica tra l'analita e la fase stazionaria, poiché la frazione fenilmaleimmide non ha carica virtuale a pH normale. La polarità della fase stazionaria può essere controllata dalla quantità ottimale di stirene e dal tempo di reazione della polimerizzazione radicalica. La fase finale della reazione (polimerizzazione radicalica) è critica in quanto modifica la polarità della fase stazionaria. È stata effettuata un'analisi elementare per verificare il contenuto di carbonio in queste fasi stazionarie. È stato osservato che aumentando la quantità di stirene e il tempo di reazione aumenta il contenuto di carbonio della fase stazionaria e viceversa. Le fasi stazionarie preparate con diverse concentrazioni di stirene presentano diversi carichi di carbonio. Analogamente, queste fasi stazionarie sono state posizionate su colonne di acciaio inossidabile e ne sono state verificate le caratteristiche cromatografiche (selettività, risoluzione, valore di N, ecc.). Sulla base di questi esperimenti, è stata scelta una composizione ottimizzata per la preparazione della fase stazionaria PMP, al fine di garantire una polarità controllata e una buona ritenzione dell'analita.
La colonna PMP è stata inoltre valutata per l'analisi di cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizzando la capacità della fase mobile. 60/40 (v/v) ACN/acqua (0,1% TFA) a una portata di 80 µl/min. In condizioni di eluizione ottimali (200.000 piastre/m), il numero di piastre teoriche (N) per colonna (100 × 1,8 mm) è 20.000 ± 100. I valori di N per le tre colonne PMP sono riportati nella Tabella 3 e i cromatogrammi sono riportati nella Figura 5A. Analisi rapida ad alta portata (700 µl/min) su una colonna PMP, cinque peptidi eluiti in un minuto, eccellente valore N di 13.500 ± 330 per colonna (diametro 100 x 1,8 mm), equivalente a 135.000 piastre/m (Fig. 5B). Tre colonne delle stesse dimensioni (diametro interno 100 x 1,8 mm) sono state riempite con tre diversi lotti di fase stazionaria PMP per testare la riproducibilità. Gli analiti sono stati registrati per ciascuna colonna separando la stessa miscela di prova su ciascuna colonna utilizzando condizioni di eluizione ottimali, numero di piastre teoriche N e tempo di ritenzione. I dati di riproducibilità per le colonne PMP sono riportati nella Tabella 4. La riproducibilità della colonna PMP è risultata ben correlata con valori %RSD molto bassi, come mostrato nella Tabella 3.
Separazione di miscele di peptidi su una colonna PMP (B) e una colonna Ascentis Express RP-Amide (A), fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni della colonna PMP (100 x 1,8 mm id), ordine di eluizione dei composti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (encefalina dell'acido leucico).
Una colonna PMP (diametro interno 100 x 1,8 mm) è stata valutata per la separazione dell'idrolizzato triptico dell'albumina sierica umana mediante HPLC. Il cromatogramma in Figura 6 mostra che i campioni sono ben separati con un'ottima risoluzione. Le soluzioni di HSA sono state analizzate utilizzando una portata di 100 μl/min, una fase mobile composta da acetonitrile/acqua 70/30 e TFA allo 0,1%. La scissione dell'HSA è stata suddivisa in 17 picchi, come mostrato nel cromatogramma (Fig. 6), corrispondenti a 17 peptidi. Sono state calcolate le efficienze di separazione dei singoli picchi dall'idrolizzato di HSA e i valori sono riportati nella Tabella 5.
Gli idrolizzati triptici di HSA sono stati separati su una colonna PMP (diametro interno 100 x 1,8 mm), portata (100 μl/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua e 0,1% TFA.
dove L è la lunghezza della colonna, η è la viscosità della fase mobile, ΔP è la contropressione della colonna e u è la velocità lineare della fase mobile. La permeabilità della colonna PMP era di 2,5 × 10–14 m², la portata era di 25 µl/min, è stato utilizzato un rapporto 60/40 v/v. ACN/acqua. La permeabilità della colonna PMP (diametro interno 100 × 1,8 mm) era simile a quella del nostro precedente studio Ref.34. La permeabilità di una colonna riempita con particelle superficialmente porose è di 1,7 × 10 0,6 µm, 2,5 × 10–14 m² per particelle da 5 µm43. Pertanto, la permeabilità della fase PMP è simile alla permeabilità delle particelle core-shell con una dimensione di 5 µm.
dove Wx è la massa della colonna riempita con cloroformio, Wy è la massa della colonna riempita con metanolo e ρ è la densità del solvente. Densità del metanolo (ρ = 0,7866) e del cloroformio (ρ = 1,484). La porosità totale della colonna di particelle di silice-C18 (diametro interno 100 × 1,8 mm)34 e della colonna C18-urea31 precedentemente studiata era rispettivamente di 0,63 e 0,55. Ciò significa che la presenza di leganti ureici riduce la permeabilità della fase stazionaria. D'altra parte, la porosità totale della colonna PMP (diametro interno 100 × 1,8 mm) è di 0,60. Le colonne PMP sono meno permeabili delle colonne riempite con particelle di silice legate a C18 perché nelle fasi stazionarie di tipo C18 i ligandi C18 sono legati alle particelle di silice in catene lineari, mentre nelle fasi stazionarie di tipo polistirene si forma un polimero relativamente spesso attorno alle particelle. strato A. In un tipico esperimento, la porosità della colonna viene calcolata come segue:
Nelle figure 7A e B sono mostrati i grafici di Van Deemter per una colonna PMP (diametro interno 100 x 1,8 mm) e una colonna Ascentis Express RP-Amide (diametro interno 100 x 1,8 mm) nelle stesse condizioni di eluizione, 60/40 ACN/H₂O e 0,1% TFA, da 20 µl/min a 800 µl/min su entrambe le colonne. I valori minimi di HETP alla portata ottimale (80 µl/min) erano rispettivamente di 2,6 µm e 3,9 µm per la colonna PMP e la colonna Ascentis Express RP-Amide. I valori di HETP mostrano che l'efficienza di separazione della colonna PMP (diametro interno 100 x 1,8 mm) è molto superiore a quella della colonna Ascentis Express RP-Amide disponibile in commercio (diametro interno 100 x 1,8 mm). Il grafico di van Deemter in Fig. 7(A) mostra che la diminuzione del valore di N non è significativamente maggiore all'aumentare del flusso rispetto al nostro studio precedente. La maggiore efficienza di separazione della colonna PMP (diametro interno 100 × 1,8 mm) rispetto alla colonna Ascentis Express RP-Amide si basa sul miglioramento della forma e delle dimensioni delle particelle e sulla sofisticata procedura di impaccamento della colonna utilizzata nel lavoro attuale34.
(A) Grafico di Van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto su una colonna PMP (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O con 0,1% di TFA. (B) Grafico di Van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto su una colonna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O con 0,1% di TFA.
Una fase stazionaria polare di polistirene intercalato è stata preparata e valutata per la separazione di una miscela di peptidi sintetici e di idrolizzato triptico di albumina sierica umana (HSA) in cromatografia liquida ad alte prestazioni. Le prestazioni cromatografiche delle colonne PMP per le miscele di peptidi sono eccellenti in termini di efficienza di separazione e risoluzione. La migliore efficienza di separazione delle colonne PMP è dovuta a diversi fattori, tra cui la dimensione delle particelle di silice e la dimensione dei pori, la sintesi controllata delle fasi stazionarie e la complessità dei materiali di riempimento della colonna. Oltre all'elevata efficienza di separazione, un altro vantaggio di questa fase stazionaria è la bassa contropressione della colonna a portate elevate. Le colonne PMP sono altamente riproducibili e possono essere utilizzate per analizzare miscele di peptidi e la digestione triptica di varie proteine. Intendiamo utilizzare questa colonna per la separazione di composti bioattivi da prodotti naturali, estratti di piante medicinali e funghi in cromatografia liquida. In futuro, le colonne PMP saranno valutate anche per la separazione di proteine ​​e anticorpi monoclonali.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Ricerca sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per la caratterizzazione delle colonne. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Ricerca sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per la caratterizzazione delle colonne.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. e Petersson, P. Indagine sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per la caratterizzazione delle colonne. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Ricerca sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per le caratteristiche delle colonne. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Ricerca sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per le caratteristiche delle colonne.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. e Petersson, P. Indagine sui sistemi di separazione dei peptidi mediante cromatografia in fase inversa, parte I: sviluppo di un protocollo per la caratterizzazione delle colonne.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
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