È stato sviluppato un nuovo e rivoluzionario miscelatore statico in linea, specificamente progettato per soddisfare i rigorosi requisiti dei sistemi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e di cromatografia liquida ad altissime prestazioni (HPLC e UHPLC). Una miscelazione inadeguata di due o più fasi mobili può comportare un rapporto segnale/rumore più elevato, con conseguente riduzione della sensibilità. La miscelazione statica omogenea di due o più fluidi con un volume interno e dimensioni fisiche minimi rappresenta lo standard più elevato per un miscelatore statico ideale. Il nuovo miscelatore statico raggiunge questo obiettivo utilizzando una nuova tecnologia di stampa 3D per creare una struttura 3D unica che fornisce una miscelazione statica idrodinamica migliorata con la massima percentuale di riduzione dell'onda sinusoidale di base per unità di volume interno della miscela. Utilizzando 1/3 del volume interno di un miscelatore convenzionale, l'onda sinusoidale di base si riduce del 98%. Il miscelatore è costituito da canali di flusso 3D interconnessi con sezioni trasversali e lunghezze di percorso variabili man mano che il fluido attraversa geometrie 3D complesse. La miscelazione lungo molteplici percorsi di flusso tortuosi, combinata con turbolenza e vortici locali, determina una miscelazione a livello micro, meso e macro. Questo miscelatore esclusivo è stato progettato utilizzando simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD). I dati dei test presentati mostrano che un'eccellente miscelazione si ottiene con un volume interno minimo.
Da oltre 30 anni, la cromatografia liquida è utilizzata in numerosi settori, tra cui quello farmaceutico, dei pesticidi, della protezione ambientale, della medicina legale e dell'analisi chimica. La capacità di misurare con una precisione pari o inferiore alle parti per milione è fondamentale per lo sviluppo tecnologico in qualsiasi settore. Una scarsa efficienza di miscelazione porta a un rapporto segnale/rumore insufficiente, che rappresenta un problema per la comunità cromatografica in termini di limiti di rilevabilità e sensibilità. Quando si miscelano due solventi per HPLC, a volte è necessario forzare la miscelazione con mezzi esterni per omogeneizzare i due solventi, poiché alcuni non si mescolano bene. Se i solventi non vengono miscelati accuratamente, può verificarsi una degradazione del cromatogramma HPLC, che si manifesta con un rumore di base eccessivo e/o una forma dei picchi scadente. In caso di miscelazione inadeguata, il rumore di base apparirà come un'onda sinusoidale (in salita e discesa) del segnale del rivelatore nel tempo. Allo stesso tempo, una miscelazione inadeguata può portare a picchi allargati e asimmetrici, riducendo le prestazioni analitiche, la forma dei picchi e la risoluzione dei picchi. L'industria ha riconosciuto che i miscelatori statici in linea e a T rappresentano un mezzo per migliorare questi limiti e consentire agli utenti di raggiungere limiti di rilevabilità (sensibilità) più bassi. Il miscelatore statico ideale combina i vantaggi di un'elevata efficienza di miscelazione, un basso volume morto e una bassa caduta di pressione con un volume minimo e la massima produttività del sistema. Inoltre, con la crescente complessità delle analisi, gli analisti devono utilizzare regolarmente solventi più polari e difficili da miscelare. Ciò significa che una migliore miscelazione è fondamentale per i test futuri, aumentando ulteriormente la necessità di un design e di prestazioni dei miscelatori superiori.
Mott ha recentemente sviluppato una nuova gamma di miscelatori statici in linea PerfectPeakTM brevettati con tre volumi interni: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Queste dimensioni coprono l'intervallo di volumi e caratteristiche di miscelazione necessari per la maggior parte dei test HPLC in cui sono richiesti una miscelazione migliorata e una bassa dispersione. Tutti e tre i modelli hanno un diametro di 0,5" e offrono prestazioni leader del settore in un design compatto. Sono realizzati in acciaio inossidabile 316L, passivato per inerzia, ma sono disponibili anche in titanio e altre leghe metalliche resistenti alla corrosione e chimicamente inerti. Questi miscelatori hanno una pressione di esercizio massima fino a 20.000 psi. Nella figura 1a è mostrata la fotografia di un miscelatore statico Mott da 60 µl, progettato per fornire la massima efficienza di miscelazione utilizzando un volume interno inferiore rispetto ai miscelatori standard di questo tipo. Questo nuovo design di miscelatore statico utilizza una nuova tecnologia di produzione additiva per creare una struttura 3D unica che utilizza un flusso interno inferiore rispetto a qualsiasi miscelatore attualmente utilizzato nel settore cromatografico per ottenere una miscelazione statica. Questi miscelatori sono costituiti da canali di flusso tridimensionali interconnessi con diverse sezioni trasversali e diverse lunghezze di percorso man mano che il liquido attraversa complesse barriere geometriche al suo interno. Nella Figura 1b è mostrato uno schema del nuovo miscelatore, che utilizza raccordi a compressione filettati HPLC 10-32 standard del settore per l'ingresso e l'uscita e presenta i bordi ombreggiati in blu della porta di miscelazione interna brevettata. Le diverse sezioni trasversali dei percorsi di flusso interni e le variazioni di direzione del flusso all'interno del volume di flusso interno creano regioni di flusso turbolento e laminare, causando miscelazione su scala micro, meso e macro. Il design di questo miscelatore esclusivo ha utilizzato simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) per analizzare i modelli di flusso e perfezionare il design prima della prototipazione per i test analitici interni e la valutazione sul campo dei clienti. La produzione additiva è il processo di stampa 3D di componenti geometrici direttamente da disegni CAD, senza la necessità di lavorazioni meccaniche tradizionali (fresatrici, torni, ecc.). Questi nuovi miscelatori statici sono progettati per essere prodotti con questo processo, in cui il corpo del miscelatore viene creato da disegni CAD e i componenti vengono fabbricati (stampati) strato per strato tramite la produzione additiva. In questo caso, viene depositato uno strato di polvere metallica di circa 20 micron di spessore e un laser controllato da computer fonde e fonde selettivamente la polvere in una forma solida. Si applica un altro strato sopra questo strato e si procede alla sinterizzazione laser. Ripetere questo processo fino al completamento del pezzo. La polvere viene quindi rimossa dal pezzo non saldato al laser, lasciando un pezzo stampato in 3D che corrisponde al disegno CAD originale. Il prodotto finale è in qualche modo simile al processo microfluidico, con la differenza principale che i componenti microfluidici sono solitamente bidimensionali (piatti), mentre utilizzando la produzione additiva è possibile creare modelli di flusso complessi in geometria tridimensionale. Questi rubinetti sono attualmente disponibili come pezzi stampati in 3D in acciaio inossidabile 316L e titanio. La maggior parte delle leghe metalliche, dei polimeri e alcune ceramiche possono essere utilizzate per realizzare componenti con questo metodo e saranno prese in considerazione in progetti/prodotti futuri.
Riso. 1. Fotografia (a) e diagramma (b) di un miscelatore statico Mott da 90 μl che mostra una sezione trasversale del percorso del fluido del miscelatore ombreggiato in blu.
Eseguire simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) delle prestazioni dei miscelatori statici durante la fase di progettazione per contribuire a sviluppare progetti efficienti e ridurre i lunghi e costosi esperimenti per tentativi ed errori. Simulazione CFD di miscelatori statici e tubazioni standard (simulazione senza miscelatore) utilizzando il software COMSOL Multiphysics. Modellazione basata sulla fluidodinamica laminare guidata dalla pressione per comprendere la velocità e la pressione del fluido all'interno di un componente. Questa fluidodinamica, combinata con il trasporto chimico dei composti della fase mobile, aiuta a comprendere la miscelazione di due diversi liquidi concentrati. Il modello è studiato in funzione del tempo, pari a 10 secondi, per facilitare i calcoli durante la ricerca di soluzioni comparabili. I dati teorici sono stati ottenuti in uno studio correlato nel tempo utilizzando lo strumento di proiezione a sonda puntuale, in cui è stato scelto un punto al centro dell'uscita per la raccolta dati. Il modello CFD e i test sperimentali hanno utilizzato due diversi solventi attraverso una valvola di campionamento proporzionale e un sistema di pompaggio, con conseguente sostituzione di un tappo per ciascun solvente nella linea di campionamento. Questi solventi vengono quindi miscelati in un miscelatore statico. Le Figure 2 e 3 mostrano simulazioni di flusso rispettivamente attraverso un tubo standard (senza miscelatore) e attraverso un miscelatore statico Mott. La simulazione è stata eseguita su un tubo dritto lungo 5 cm e con un diametro interno di 0,25 mm per dimostrare il concetto di immissione alternata di acqua e acetonitrile puro nel tubo in assenza di un miscelatore statico, come mostrato in Figura 2. La simulazione ha utilizzato le dimensioni esatte del tubo e del miscelatore e una portata di 0,3 ml/min.
Riso. 2. Simulazione del flusso CFD in un tubo da 5 cm con diametro interno di 0,25 mm per rappresentare ciò che accade in un tubo HPLC, ovvero in assenza di un miscelatore. Il rosso pieno rappresenta la frazione in massa di acqua. Il blu rappresenta la mancanza di acqua, ovvero acetonitrile puro. Si possono osservare regioni di diffusione tra i tappi alternati di due liquidi diversi.
Riso. 3. Miscelatore statico con un volume di 30 ml, modellato con il software COMSOL CFD. La legenda rappresenta la frazione in massa di acqua nel miscelatore. L'acqua pura è mostrata in rosso e l'acetonitrile puro in blu. La variazione della frazione in massa dell'acqua simulata è rappresentata da una variazione del colore della miscelazione dei due liquidi.
La figura 4 mostra uno studio di validazione del modello di correlazione tra efficienza di miscelazione e volume di miscelazione. All'aumentare del volume di miscelazione, aumenta anche l'efficienza di miscelazione. A conoscenza degli autori, altre forze fisiche complesse che agiscono all'interno del miscelatore non possono essere considerate in questo modello CFD, con conseguente maggiore efficienza di miscelazione nei test sperimentali. L'efficienza di miscelazione sperimentale è stata misurata come riduzione percentuale della sinusoide di base. Inoltre, una maggiore contropressione si traduce solitamente in livelli di miscelazione più elevati, che non vengono presi in considerazione nella simulazione.
Le seguenti condizioni HPLC e la configurazione di prova sono state utilizzate per misurare le onde sinusoidali grezze e confrontare le prestazioni relative di diversi miscelatori statici. Il diagramma in Figura 5 mostra un tipico layout di un sistema HPLC/UHPLC. Il miscelatore statico è stato testato posizionandolo direttamente dopo la pompa e prima dell'iniettore e della colonna di separazione. La maggior parte delle misurazioni sinusoidali di fondo viene effettuata bypassando l'iniettore e la colonna capillare tra il miscelatore statico e il rivelatore UV. Per valutare il rapporto segnale/rumore e/o analizzare la forma del picco, la configurazione del sistema è mostrata in Figura 5.
Figura 4. Grafico dell'efficienza di miscelazione in funzione del volume di miscelazione per una gamma di miscelatori statici. L'impurità teorica segue lo stesso andamento dei dati sperimentali sulle impurità, confermando la validità delle simulazioni CFD.
Il sistema HPLC utilizzato per questo test era un HPLC Agilent serie 1100 con un rivelatore UV controllato da un PC con software Chemstation. La Tabella 1 mostra le condizioni di ottimizzazione tipiche per la misurazione dell'efficienza del miscelatore mediante il monitoraggio delle sinusoidi basiche in due casi di studio. I test sperimentali sono stati condotti su due diversi esempi di solventi. I due solventi miscelati nel caso 1 erano il solvente A (acetato di ammonio 20 mM in acqua deionizzata) e il solvente B (acetonitrile (ACN) all'80%/acqua deionizzata al 20%). Nel caso 2, il solvente A era una soluzione di acetone allo 0,05% (etichetta) in acqua deionizzata. Il solvente B era una miscela di metanolo all'80% e acqua al 20%. Nel caso 1, la pompa era impostata a una portata compresa tra 0,25 ml/min e 1,0 ml/min, mentre nel caso 2 era impostata a una portata costante di 1 ml/min. In entrambi i casi, il rapporto della miscela di solventi A e B era 20% A/80% B. Il rilevatore è stato impostato a 220 nm nel caso 1 e l'assorbimento massimo dell'acetone nel caso 2 è stato impostato a una lunghezza d'onda di 265 nm.
Tabella 1. Configurazioni HPLC per i casi 1 e 2 Caso 1 Caso 2 Velocità della pompa Da 0,25 ml/min a 1,0 ml/min 1,0 ml/min Solvente A Acetato di ammonio 20 mM in acqua deionizzata Acetone allo 0,05% in acqua deionizzata Solvente B Acetonitrile (ACN) all'80% / acqua deionizzata al 20% Metanolo all'80% / acqua deionizzata al 20% Rapporto solvente 20% A / 80% B 20% A / 80% B Rilevatore 220 nm 265 nm
Riso. 6. Grafici delle onde sinusoidali miste misurate prima e dopo l'applicazione di un filtro passa-basso per rimuovere le componenti di deriva della linea di base del segnale.
La Figura 6 è un tipico esempio di rumore di base misto nel Caso 1, mostrato come un andamento sinusoidale ripetuto sovrapposto alla deriva della linea di base. La deriva della linea di base è un lento aumento o diminuzione del segnale di fondo. Se il sistema non viene lasciato equilibrare per un tempo sufficientemente lungo, solitamente diminuisce, ma subirà una deriva irregolare anche quando il sistema è completamente stabile. Questa deriva della linea di base tende ad aumentare quando il sistema opera in condizioni di forte gradiente o elevata contropressione. Quando questa deriva della linea di base è presente, può essere difficile confrontare i risultati da un campione all'altro, problema che può essere superato applicando un filtro passa-basso ai dati grezzi per filtrare queste variazioni a bassa frequenza, ottenendo così un grafico delle oscillazioni con una linea di base piatta. In Figura 6 è anche mostrato un grafico del rumore di base del mixer dopo l'applicazione di un filtro passa-basso.
Dopo aver completato le simulazioni CFD e i test sperimentali iniziali, sono stati sviluppati tre miscelatori statici separati utilizzando i componenti interni descritti in precedenza con tre volumi interni: 30 µl, 60 µl e 90 µl. Questo intervallo copre l'intervallo di volumi e prestazioni di miscelazione richiesti per applicazioni HPLC a basso contenuto di analiti, dove una migliore miscelazione e una bassa dispersione sono necessarie per produrre linee di base di bassa ampiezza. La figura 7 mostra le misurazioni di base dell'onda sinusoidale ottenute sul sistema di prova dell'Esempio 1 (acetonitrile e acetato di ammonio come traccianti) con tre volumi di miscelatori statici e nessun miscelatore installato. Le condizioni di prova sperimentali per i risultati mostrati in Figura 7 sono state mantenute costanti per tutti e 4 i test secondo la procedura descritta nella Tabella 1 a una portata di solvente di 0,5 ml/min. Applicare un valore di offset ai set di dati in modo che possano essere visualizzati affiancati senza sovrapposizione di segnale. L'offset non influisce sull'ampiezza del segnale utilizzato per valutare il livello di prestazioni del miscelatore. L'ampiezza sinusoidale media senza mixer era pari a 0,221 mAi, mentre le ampiezze dei mixer Mott statici a 30 µl, 60 µl e 90 µl scendevano rispettivamente a 0,077, 0,017 e 0,004 mAi.
Figura 7. Offset del segnale del rilevatore UV HPLC rispetto al tempo per il caso 1 (acetonitrile con indicatore di acetato di ammonio) che mostra la miscelazione del solvente senza miscelatore, miscelatori Mott da 30 µl, 60 µl e 90 µl che mostrano una miscelazione migliorata (ampiezza del segnale inferiore) all'aumentare del volume del miscelatore statico. (offset dei dati effettivi: 0,13 (senza miscelatore), 0,32, 0,4, 0,45 mA per una migliore visualizzazione).
I dati mostrati in Fig. 8 sono gli stessi della Fig. 7, ma questa volta includono i risultati di tre miscelatori statici HPLC comunemente usati con volumi interni di 50 µl, 150 µl e 250 µl. Riso. Figura 8. Grafico dell'offset del segnale del rivelatore UV HPLC in funzione del tempo per il Caso 1 (acetonitrile e acetato di ammonio come indicatori) che mostra la miscelazione del solvente senza miscelatore statico, la nuova serie di miscelatori statici Mott e tre miscelatori convenzionali (l'offset dei dati effettivi è rispettivamente 0,1 (senza miscelatore), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 mA per un migliore effetto di visualizzazione). La riduzione percentuale dell'onda sinusoidale di base è calcolata dal rapporto tra l'ampiezza dell'onda sinusoidale e l'ampiezza senza il miscelatore installato. Le percentuali di attenuazione dell'onda sinusoidale misurate per i Casi 1 e 2 sono elencate nella Tabella 2, insieme ai volumi interni di un nuovo miscelatore statico e di sette miscelatori standard comunemente utilizzati nel settore. I dati nelle Figure 8 e 9, così come i calcoli presentati nella Tabella 2, mostrano che il miscelatore statico Mott può fornire un'attenuazione dell'onda sinusoidale fino al 98,1%, superando di gran lunga le prestazioni di un miscelatore HPLC convenzionale in queste condizioni di test. Figura 9. Grafico dell'offset del segnale del rivelatore UV HPLC in funzione del tempo per il Caso 2 (metanolo e acetone come traccianti) che mostra l'assenza di miscelatore statico (combinato), una nuova serie di miscelatori statici Mott e due miscelatori convenzionali (gli offset dei dati effettivi sono 0, 11 (senza miscelatore), 0,22, 0,3, 0,35 mA e per una migliore visualizzazione). Sono stati valutati anche sette miscelatori comunemente utilizzati nel settore. Tra questi, i miscelatori con tre volumi interni diversi dell'azienda A (denominati Mixer A1, A2 e A3) e dell'azienda B (denominati Mixer B1, B2 e B3). L'azienda C ha valutato solo una dimensione.
Tabella 2. Caratteristiche di agitazione del miscelatore statico e volume interno Miscelatore statico Caso 1 Recupero sinusoidale: test dell'acetonitrile (efficienza) Caso 2 Recupero sinusoidale: test dell'acqua con metanolo (efficienza) Volume interno (µl) Nessun miscelatore – - 0 Mott 30 65% 67,2% 30 Mott 60 92,2% 91,3% 60 Mott 90 98,1% 97,5% 90 Miscelatore A1 66,4% 73,7% 50 Miscelatore A2 89,8% 91,6% 150 Miscelatore A3 92,2% 94,5% 250 Miscelatore B1 44,8% 45,7% 9 35 Miscelatore B2 845,% 96,2% 370 Miscelatore C 97,2% 97,4% 250
L'analisi dei risultati in Figura 8 e Tabella 2 mostra che il miscelatore statico Mott da 30 µl ha la stessa efficienza di miscelazione del miscelatore A1, ovvero 50 µl; tuttavia, il Mott da 30 µl ha un volume interno inferiore del 30%. Confrontando il miscelatore Mott da 60 µl con il miscelatore A2 da 150 µl di volume interno, si è riscontrato un leggero miglioramento dell'efficienza di miscelazione del 92% rispetto all'89%, ma, cosa ancora più importante, questo livello di miscelazione più elevato è stato ottenuto a 1/3 del volume del miscelatore, simile a quello del miscelatore A2. Le prestazioni del miscelatore Mott da 90 µl hanno seguito lo stesso andamento del miscelatore A3 con un volume interno di 250 µl. Sono stati osservati miglioramenti nelle prestazioni di miscelazione del 98% e del 92% anche con una riduzione di 3 volte del volume interno. Risultati e confronti simili sono stati ottenuti per i mixer B e C. Di conseguenza, la nuova serie di mixer statici Mott PerfectPeakTM offre un'efficienza di miscelazione superiore rispetto ai mixer della concorrenza comparabili, ma con un volume interno inferiore, fornendo un rumore di fondo migliore e un rapporto segnale/rumore migliore, migliore sensibilità dell'analita, forma del picco e risoluzione del picco. Tendenze simili nell'efficienza di miscelazione sono state osservate sia negli studi del Caso 1 che del Caso 2. Per il Caso 2, i test sono stati eseguiti utilizzando metanolo e acetone come indicatori per confrontare l'efficienza di miscelazione di 60 ml di Mott, un mixer comparabile A1 (volume interno 50 µl) e un mixer comparabile B1 (volume interno 35 µl). Le prestazioni erano scarse senza un mixer installato, ma è stato utilizzato per l'analisi di base. Il mixer Mott da 60 ml si è dimostrato il migliore nel gruppo di prova, fornendo un aumento del 90% dell'efficienza di miscelazione. Un mixer A1 comparabile ha visto un miglioramento del 75% nell'efficienza di miscelazione seguito da un miglioramento del 45% in un mixer B1 comparabile. È stato condotto un test di riduzione sinusoidale di base con portata su una serie di miscelatori nelle stesse condizioni del test della curva sinusoidale del Caso 1, modificando solo la portata. I dati hanno mostrato che, nell'intervallo di portate da 0,25 a 1 ml/min, la diminuzione iniziale dell'onda sinusoidale è rimasta relativamente costante per tutti e tre i volumi del miscelatore. Per i due miscelatori di volume inferiore, si osserva un leggero aumento della contrazione sinusoidale al diminuire della portata, prevedibile a causa dell'aumento del tempo di residenza del solvente nel miscelatore, che consente una maggiore miscelazione per diffusione. Si prevede che la sottrazione dell'onda sinusoidale aumenti con l'ulteriore diminuzione della portata. Tuttavia, per il volume di miscelatore più grande con la maggiore attenuazione di base dell'onda sinusoidale, l'attenuazione di base dell'onda sinusoidale è rimasta praticamente invariata (entro l'intervallo di incertezza sperimentale), con valori compresi tra il 95% e il 98%. Riso. 10. Attenuazione di base di un'onda sinusoidale in funzione della portata nel caso 1. Il test è stato eseguito in condizioni simili al test sinusoidale con portata variabile, iniettando l'80% di una miscela 80/20 di acetonitrile e acqua e il 20% di acetato di ammonio 20 mM.
La nuova gamma di miscelatori statici in linea PerfectPeakTM brevettati, con tre volumi interni: 30 µl, 60 µl e 90 µl, copre l'intervallo di volume e prestazioni di miscelazione richiesto per la maggior parte delle analisi HPLC che richiedono una miscelazione migliorata e bassi livelli di dispersione. Il nuovo miscelatore statico raggiunge questo obiettivo utilizzando una nuova tecnologia di stampa 3D per creare un'esclusiva struttura 3D che offre una miscelazione statica idrodinamica migliorata con la più alta percentuale di riduzione del rumore di base per unità di volume di miscela interna. Utilizzando 1/3 del volume interno di un miscelatore convenzionale, il rumore di base si riduce del 98%. Questi miscelatori sono costituiti da canali di flusso tridimensionali interconnessi con diverse sezioni trasversali e diverse lunghezze di percorso man mano che il liquido attraversa complesse barriere geometriche al suo interno. La nuova famiglia di miscelatori statici offre prestazioni migliori rispetto ai miscelatori della concorrenza, ma con un volume interno inferiore, con conseguente migliore rapporto segnale/rumore e limiti di quantificazione inferiori, nonché migliore forma dei picchi, efficienza e risoluzione per una maggiore sensibilità.
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